INFORME N 04: TCNICAS DE SEPARACIN E IDENTIFICACIN POR CROMATOGRAFA1. OBJETIVOS: Conocer y entender el procedimiento para la separacin e identificacin de los componentes del pigmento de espinaca por medio de la cromatografa de capa fina y de columna. Ahondar en el reconocimiento de las funciones de los solventes que intervienen en el proceso cromatografico. Conocer la importancia del tipo de fase mvil a utilizar.2. FUNDAMENTO TEORICO Cromatografa.La tcnica de a cromatografa se emple por primera vez en 1903, por el cientfico ruso T. Tswett el cual desarrollo esta tcnica para poder separar los pigmentos vegetales.En los aos siguientes se desarrollaron distintos tipos de cromatografa (cromatografa de papel, de capa fina, de reparto, etc...) encontrando variadas y tiles aplicaciones.Hoy en da la cromatografa se aplica en campos tan diversos como la qumica, biologa, medicina, etc tanto en su vertiente analtica como preparativa.La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se hallan en dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de gran desarrollo superficial y la otra una fase mvil que se desplaza a travs del lecho estacionario.Prcticamente no existen restricciones sobre la naturaleza de las fases a utilizar, por lo que se puede realizar la separacin de componentes de cualquier mezcla. Sin embargo, la cantidad de factores que influyen en el proceso de separacin, lo cual puede alterar los resultados.Algunos trminos usados en cromatografa son:Fase mvil, fluido utilizado como portador de la mezcla.Fase Estacionaria, La cromatografa se basa en el hecho de que luego de cierto tiempo todo sistema qumico llegara a un determinado equilibrio entre los dos o ms estados que conforman el sistema. Esto significa que todas las fuerzas que se hallan presentes en el sistema se igualaran. Adems se basa en las propiedades fsico-qumicas de los componentes del sistema, como son la solubilidad.

Fuente: Harris, D: Anlisis Qumico Cuantitativo (2007), Madrid: Editorial Reverte

Tipos de Cromatografa.Segn los mecanismos de separacin:TipoCaractersticas

Cromatografa de AdsorcinLa separacin depende de los equilibrios de adsorcin-desorcin de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria slida y la fase mvil liquida o gaseosa.

Cromatografa de reparto.Est basada en la separacin de una mezcla de substancias mediante el reparto existente entre la fase mvil (liquida o gas) y la fase estacionaria (liquida) soportada en un slido.

Cromatografa por tamao molecular.Conocida como permeacion de gel, consiste en la separacin de molculas basndose en su tamao en lugar de su solubilidad o polaridad.

Cromatografa de cambio inica.Este tipo de separaciones se llevan a cabo con materiales insolubles y de textura porosa, los cuales presentan grupos reactivos asociados a iones capaces de intercambiarse con los del medio (liquido) que los rodea.

Fuente: web del consejo superior de investigaciones cientficas-MNCN

Segn las formas de separacin.TipoCaractersticas

Anlisis por desarrolloEl cromatograma se desarrolla hasta que el frente del disolvente alcanza el final del lecho estacionario.Ej.: Cromatografa de capa fina y papel.

Anlisis por elucin El paso de la fase mvil continua indefinidamente hasta que los componentes separados aparecen en el lecho.

Anlisis frontalSe basa en la diferencia de afinidades del absorbente con las sustancias a separar.Ej: Cromatografa de columna.

Anlisis por desplazamientoEn esta caso el solvente va incorporado en la fase mvil.

Fuente: web del consejo superior de investigaciones cientficas-MNCN

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1 CROMATOGRAFIA DE CAPA FINAOBSERVACIONES La mezcla de silica gel y agua tiene una consistencia gelatinosa y de color blanquecina. Luego de llevarlo a la estufa un determinado tiempo, se forma sobre la placa una fina y muy frgil capa blanca. Se dispusieron de mezclas de ter de petrleo y cetona en proporciones de 3:1 y 5:1, respectivamente, y una solucin de ter de petrleo puro. Al colocar la placa en las distintas mezclas, vimos como el lquido iba ascendiendo y revelando manchas coloreadas en su camino. En la mezcla 5:1 se apreci un mayor rango de colores revelados sobre la placa. Tambin observamos que la mancha amarilla se encontraba siempre por encima de la mancha verde.

DIAGRAMA DE FLUJO

DATOSTabla I (distancias medidas respecto de la posicin de la mezcla original).MezclaDistancia mancha verde del pigmento-clorofila (cm)Distancia mancha amarilla del pigmento carotenoide (cm)Distancia de frente (cm)

ter de petrleo puroNo se observ.0.75.4

ter de petrleo y acetona (3:1).

1.75.85.8

ter de petrleo y acetona (5:1)1.54.65.15

Tabla II: Valores de Rf orientativos para los pigmentos de la espinaca.Pigmento.Rf

-caroteno0.95

Clorofila a0.44

Clorofila b0.32

Xantofila0.16

Feofitina a0.60

Feofitina b0.49

Fuente: Guarnizo, A. Experimentos de Qumica Orgnica, con enfoque en ciencias de la vida (2010), Colombia: Ediciones Elizcom.

CLCULOSCalcularemos el factor de cambio basndonos en los datos obtenidos en el laboratorio, segn:

Rf = Rate factor Factor de cambioAplicando la frmula para la solucin de ter de petrleo puro:Para el carotenoide

Usando los datos de la tabla II, considerando que estos datos solo son orientativos y que se han obtenido bajo ciertas condiciones cromatogrficas, podemos calcular el error experimental, segn:

Repitiendo el mismo clculo para las dems mezclas obtenemos:

Tabla III.MezclaRf clorofilaErrorRf carotenoideError %

ter de petrleo puro-00.1385.87

ter de petrleo y acetona 3:10.299.31.05.26

ter de petrleo y acetona 5:10.2918.980.8935.98

Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio (Tabla II)

DISCUSIN DE RESULTADOS En el experimento que se realiz, la fase estacionaria est dada por el silica gel y la fase mvil la constituye las distintas mezclas que preparamos en los vasos de precipitado. Al colocar la placa dentro del vaso de precipitado vemos que la fase mvil empieza a ascender, esto se da por accin de la capilaridad, una propiedad de los fluidos basada en la tensin superficial y las fuerzas de adhesin y cohesin. Luego de colocar la placa en el vaso debamos cubrirla con una luna de reloj, esto porque los solventes utilizados son muy voltiles. Cuando colocamos la placa en la solucin de ter de petrleo puro observamos que solo apareci una mancha de color amarillo (carotenoide), por la afinidad apolar-apolar con el ter de petrleo que es un solvente no polar, y la fase estacionaria retuvo al pigmento verde (clorofila), gracias a su carcter polar. Luego, cuando colocamos la placa en la mezcla de ter de petrleo y acetona 3:1 pudimos observar una mayor cantidad de manchas, esto porque la combinacin de el ter de petrleo y la acetona aumento el carcter polar (porque la acetona se encuentra en menor proporcin o mayor concentracin) de la fase mvil que pudo arrastrar una mayor distancia a los pigmentos En la mezcla de ter de petrleo y acetona 5:1, pudimos apreciar mejor las manchas de los pigmentos, en el que el carotenoide fue arrastrado una mayor distancia por el solvente no apolar (ter de petrleo) y la clorofila una menor distancia por el solvente polar la acetona, pues esta se encontraba menos concentrada. Pudimos notar, en todos los casos, que el carotenoide (mancha amarilla) siempre se hallaba ms alejada que la clorofila (mancha verde), esto porque en todas las mezclas el ter de petrleo (no polar) se encontraba en mayor proporcin. El error que obtuvimos se debe en primer lugar a los datos referencia que son datos orientativos obtenidos bajo ciertas condiciones cromatografas especiales, muy difciles de repetir. Adems del error humano se debe entre otros factores a la temperatura, impurezas en la placa y las fallas en la superficie de las placas que impeda el libre desplazamiento de la fase mvil.

CONCLUSIONES. La cromatografa de capa fina es una tcnica rpida, verstil y sencilla que nos permite separar componentes de una mezcla. El caroteno tiene un carcter polar mayor que el de la clorofila. El mejor eluyente (fase mvil) que nos proporcion mejores resultados es la mezcla de ter de petrleo y acetona en proporcin 5:1. El componente que se desplace ms rpido sobre la fase estacionaria ser el menos polar. En este experimento tuvimos que usar dos solventes con distinto carcter polar para poder separar los componentes del pigmento de la espinaca.

3.2 CROMATOGRAFA EN COLUMNAOBSERVACIONES Luego de agregar el ter de petrleo en la columna se procedi a eliminar las burbujas que quedaron atrapadas, y como tuvimos varias de estas burbujas el ter de la columna se evaporaba y hacia descender un poco el nivel de ter. La almina se ubic en la parte inferior de la columna de cromatografa y comenz a construirse una columna de esta. Lo mismo ocurri con la arena, solo que esta se ubica por encima de la almina. Cuando la columna se conecta a la lnea de vaco podemos controlar con la llave el descenso del ter, y cada vez que veamos que el ter llegaba a la arena llenbamos con ms ter recirculado conseguido del sistema. Al agregar al sistema un poco de nuestro pigmento de espinaca y seguir recirculando el ter de petrleo, observamos que del color verde oscuro del pigmento que se queda cerca de la arena comienza a desprenderse una coloracin amarilla que la recogemos en un tubo. Luego de que toda la coloracin amarilla descendiera, aadimos 8 mL de una mezcla de ter- acetona en proporcin de 3:1 y la coloracin verde que an quedaba sobre la almina comienza a descender hasta ser recogido en un tubo. La recirculacin esta vez se hace con la mezcla ter- acetona. Observamos al final de esta experiencia, que cuando hacemos descender todo el ter, la columna de almina parece un slido con muchos poros.DIAGRAMA DE FLUJO

DISCUSIN Como la experiencia realizada es un mtodo cromatogrfico de adsorcin, identificamos que la fase mvil vienen a ser la almina ya que adsorbe algunos tipos de pigmentos, dejando pasar los necesarios; y la fase mvil o de arrastre es el ter de petrleo y la mezcla ter- acetona. Los carotenoides de color amarillo son arrastrados por el ter de petrleo (n- hexano) ya que debido al principio de lo semejante disuelve lo semejante, al ser ambas de carcter apolar, dejan de lado a la clorofila que es polar para irse juntas por la fase estacionaria que es la almina. La mezcla ter- acetona tiene un poco de carcter polar gracias a la acetona, y es esta la que arrastra a la clorofila (de color verde) al ser las dos de naturaleza polar. La almina como fase estacionaria acta como una puerta que solo deja pasar a aquellos componentes del pigmento que son solubles en la fase mvil existente, mientras que los otros componentes se quedan adheridos a la almina hasta que algn otro eluyente solubilice a estos. La funcin de la arena que se encuentra sobre la columna de almina es para protegerla al momento de recircular los solventes de la fase mvil; ya que cada vez que se recirculaba, una parte de la arena se levantaba y luego regresaba a su sitio, razn por la cual se hace uso de ese protector.CONCLUSIONES: Se entendi el procedimiento para la separacin por cromatografa en columna. Para poder extraer los carotenoides del pigmento de espinaca se necesita de un solvente apolar mientras que para extraer la clorofila hacemos uso de solventes polares. La almina permite la separacin de los componentes del pigmento mediante la adsorcin. Se comprob la presencia de carotenoides (xantofilas y carotenos) de color amarillo de clorofila que son de color verde.4. BIBLIOGRAFA Costa, J. Diccionario de Qumica Fsica (2005), Madrid: Publicaciones y Ediciones de la Universidad de Barcelona. Durst, H. Qumica Orgnica Experimental, (2007), Barcelona: Editorial Reverte. Guarnizo, A. Experimentos de Qumica Orgnica, con enfoque en ciencias de la vida (2010), Colombia: Ediciones Elizcom. Harris, D. Anlisis Qumico Cuantitativo (2007), Madrid: Editorial Reverte http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/ https://www.uam.es http://www.udea.edu.co/

5. ANEXO

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