-
8/19/2019 Laboratorio 1. Fraccionamiento de tejidos (Versión
Final) - Agroindustrial.pdf
1/4
UNIVERSIDAD DE LOS LLANOSFacultad de Ciencias Básicas e
Ingeniería
Ingeniería AgroindustrialLABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Laboratorio 1. FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES
BIOMOLÉCULAS:
CARBOHIDRATOS, LIPIDOS, PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS.
Elaborado por Daniel Aguilera
1. OBJETIVOS
1.1. Emplear los métodos de solubilidades diferenciales y de
centrifugación para el
fraccionamiento de un tejido animal en sus principales
constituyentes.
1.2. Comparar diferentes tejidos desde el punto de vista de
sus componentes principales.
2. INTRODUCCIÓN
El objetivo del fraccionamiento celular es separar la célula en
sus principales componentes y asípermitir el estudio de un
componente sin la interferencia de otras partes. En términos
generales
primero se debe elegir un tejido adecuado según el interés
teniendo como criterio la facilidad para
su fraccionamiento, la disponibilidad del constituyente de
interés y homogeneidad del tipo de
célula. Para la presente práctica se obtendrán las fracciones de
los diferentes constituyentes de
un tejido de origen animal en términos de sus biomoléculas,
utilizando para ello las técnicas de
centrifugación y propiedades de solubilidad diferencial.
2.1. Solubilidad Diferencial
Debido a las diferencias que existen en las propiedades químicas
entre las biomoléculas de
carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos; estas
presentaran diferente solubilidad en
solventes orgánicos al igual que en ácidos del tipo del
tricloroacético según la temperatura. Por lo
tanto es posible utilizar tales solubilidades diferenciales para
separarlos, una vez los tejidos han
sido triturados y roto sus membranas.
2.1.1. Acción del ácido tricloroacético a baja temperatura
Sobre carbohidratos: A baja temperatura los monosacáridos
son estables en medio ácido,
mientras que al ser tratados en caliente sufren deshidratación
produciéndose los furfurales. En
general se puede decir que los carbohidratos son solubles en
solución de ácido tricloroacético
(ATA) al 10% a temperaturas inferiores a
4 C y no sufren cambios
químicos en estas condiciones.
Sobre lípidos: Por definición, estos compuestos son pocos
solubles en soluciones acuosas y no son
extraídos si se trata el tejido en soluciones acuosas de
ATA.
Sobre proteínas: Estas forman sales insolubles en ácidos
como tricloroacético o perclórico, por lo
tanto no son solubles en soluciones de ATA al 10% en frio.
-
8/19/2019 Laboratorio 1. Fraccionamiento de tejidos (Versión
Final) - Agroindustrial.pdf
2/4
UNIVERSIDAD DE LOS LLANOSFacultad de Ciencias Básicas e
Ingeniería
Ingeniería AgroindustrialLABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Sobre ácidos nucleicos: Al igual que las proteínas, estos ácidos
son insolubles en ATA al 10%. Por
otra parte el ácido desoxirribonucleico (ADN) está unido a
histonas, lo cual lo hace más insoluble
en estas condiciones. En resumen, al tratar un tejido
previamente triturado con ATA al 10% a 4
Cy luego someter a
centrifugación la suspensión resultante, en el sobrenadante se
obtienen los
azúcares, mientras que los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos
quedan en el residuo.
2.1.2. Acción del etanol-éter-cloroformo (2-2-1 v/v)
Si el residuo de la extracción con ácido tricloroacético al 10
%, se trata con solución de etanol-éter-
cloroformo, a la mezcla sólo pasan los lípidos, mientras que las
proteínas y los ácidos nucleicos
quedan en el residuo.
2.1.3. Acción del cloruro de sodio al 10 % en caliente
Si el residuo anterior se suspende en una solución de NaCl al
10% y se calienta en baño de María
(92 C) durante 20
minutos, se desnaturalizan las proteínas y los ácidos
nucleicos – principalmente
el ribonucleico (RNA)- quedan en solución. Por este
procedimiento es posible separar entonces las
proteínas de los ácidos nucleicos. Si el sobrenadante se le
agrega ahora etanol en un volumen
igual al doble de la solución original y se enfría en baño de
hielo por 10 minutos, se obtiene un
precipitado que puede ser separado por centrifugación y el cual
contiene los ácidos nucleicos.
3. CONSULTA PREVIA AL LABORATORIO
3.1. ¿Cuál es el fundamento de la centrifugación? Realice una
breve explicación de sus principios.
3.2. Consulte los diferentes métodos de ruptura de células
3.3. ¿Por qué se recomienda mantener los tejidos que se
fraccionan a bajas temperaturas?
4. REACTIVOS Y MATERIALES
Reactivos*Materiales Equipos y/o
montajesLaboratorio Estudiantes ácido tricloácetico al
10%
etanol-éter-cloroformo (2:2:1)
etanol al 96% NaCl al 10%
hielo
arena lavada
1 mortero de porcelana conmango
2 tubos de centrifuga
1 vasos de precipitado de 50
o 100 mL 2 tubos de ensayo
1 pinza para tubo de ensayo
1 vidrio de reloj
2 pipetas pauster
1 gradilla
4 frascos entre 4 a 7 mL
Hígado de pollo uotro tejido
Cuchillo o escarpelo
Micro espátula o
alambre
Centrifuga
Baño demaría
Balanzas
Nevera
*Los reactivos deben estar refrigerados
-
8/19/2019 Laboratorio 1. Fraccionamiento de tejidos (Versión
Final) - Agroindustrial.pdf
3/4
UNIVERSIDAD DE LOS LLANOSFacultad de Ciencias Básicas e
Ingeniería
Ingeniería AgroindustrialLABORATORIO DE BIOQUÍMICA
5. PROCEDIMIENTO
Cada grupo hará el fraccionamiento químico sobre el tejido según
el siguiente protocolo:
-
8/19/2019 Laboratorio 1. Fraccionamiento de tejidos (Versión
Final) - Agroindustrial.pdf
4/4
UNIVERSIDAD DE LOS LLANOSFacultad de Ciencias Básicas e
Ingeniería
Ingeniería AgroindustrialLABORATORIO DE BIOQUÍMICA
NOTAS:
1. Cada grupo de laboratorio podrá traer hígado de pollo o
seleccionar otra fuente y/o tipode tejido de origen animal para
realizar el procedimiento de fraccionamiento.
2. Las diferentes fracciones obtenidas en esta práctica
deben guardarse, debidamenterotuladas, para las dos sesión de
laboratorio siguientes.
6. CUESTIONARIO PARA EL INFORME1
6.1. ¿Por qué cree usted que se elige un tejido de origen
animal y no uno de origen vegetal?
6.2. ¿Qué otros solventes podría utilizar para separar las
diferentes biomoléculas? Justifique su
respuesta
7. FUENTES BIBLIOGRÁFICAS
7.1. Gerardo Pérez, Yolanda Navarro. Módulo de Bioquímica.
Universidad a distancia. Ministerio
de Educación Nacional. Bogotá. Unisur. 1992
7.2. Guías del Laboratorio de Principios de Bioquímica de la
carrera de Biología. Facultad de
Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Primer semestre
2011.
7.3.
http://course1.winona.edu/lreuter/307/CellFractionation.pdf Última
fecha de acceso:
26/07/2013
7.4. http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/fractionation/fractionation.html
Última fecha de
acceso: 26/07/2013
1Se entregará un solo informe al finalizar las tres sesiones, el
cual debe incluir el cuestionario de
cada práctica.
http://course1.winona.edu/lreuter/307/CellFractionation.pdfhttp://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/fractionation/fractionation.htmlhttp://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/fractionation/fractionation.htmlhttp://course1.winona.edu/lreuter/307/CellFractionation.pdf
