Facultad de Ingeniería y TecnologíaIngeniería Civil en BiotecnologíaFisiología y Biotecnología Vegetal

LABORATORIO Nº6

Medios Nutritivos para Cultivo in vitro: MS y B5

3 de mayo de 2013

INTRODUCCIÓN

La micropropagación, corresponde a una técnica que permite obtener, mediante un ambiente controlado, productos de interés, como embriones somáticos, órganos, además de tejido indiferenciado (callos). El ambiente, concierne a todo aquello que rodea y posibilita externamente al explanto a desarrollarse y dirigir su crecimiento hacia la ruta morfogénica deseada. Los factores ambientales correspondes a la humedad, temperatura, el tipo de luz y el fotoperíodo, los cuales son controlados mediante instalaciones especializadas o cámaras de cultivo. Por otra parte, los elementos como la nutrición, el soporte, el pH y la estimulación (fito-hormonas u otros agentes) son determinados por el medio de cultivo.

El correcto diseño o elección del medio nutritivo y sus suplementos, determinará el establecimiento y desempeño del explanto, es así como una especie vegetal que tiene baja tolerancia a las sales, tendrá menor éxito de desarrollo, en un medio rico en sales como el diseñado por Murashige & Skoog (1962), por tanto podría verse favorecido con un medio bajo en sales como el Woody Plant Medium (WPM). Es así, como cada uno de los componentes del medio de cultivo, son los responsables directos del éxito de la micropropagación.

La organización más eficaz para el uso y almacenamiento de los medios nutritivos es mediante soluciones concentradas o “stock”, las cuales, se separan en 5 grupos: A1, que es preparada con macronutrientes o sales; A2, correspondiente a Calcio; B, con micronutrientes; C, de FeNa-EDTA y D las vitaminas. La razón fundamental de la “separación”, es precisamente para evitar la interacción entre las moléculas, a fin de evitar, por ejemplo, que el fierro, como Fe-Na-EDTA, forme una reacción de precipitación con los sulfatos, presentes en el grupo de macronutrientes. Otra razón, es debido a que las bajas cantidades pesadas para micronutrientes, serían imposibles de obtener por una balanza analítica convencional, con un grado de exactitud adecuado, siendo inviable el pesar las cantidades justas a la concentración final a usar.

Los demás elementos, que no son considerados en el medio nutritivo propiamente tal, pero son de vital importancia, corresponden a la fuente de carbono, siendo la sacarosa (azúcar de uso doméstico), la más usada debido a su bajo costo y rápida metabolización y el soporte mecánico, el agar de uso microbiológico para el que se debe ajustar el pH para garantizar la solidificación del mismo. Cuando se desea estimular el explanto, se pueden utilizar reguladores de crecimiento, los cuales también se incluyen en la preparación del medio de cultivo.

Luego de establecer los elementos esenciales del medio, es necesario considerar el recipiente de acuerdo a los resultados buscados. Tubos de ensayo, frascos de vidrio, placas petri, (muy utilizados), deben ser capaces de soportar presiones de autoclavado, a fin de que no sufran daños estructurales mediante el proceso obligatorio de esterilización. También deben considerarse los elementos de sellado como papel aluminio, papel celofán y parafilm.

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OBJETIVOS

Comparar la distinta composición de los medios nutritivos utilizados en cultivo in vitro de vegetales

Preparar las soluciones madres de los distintos medios nutritivos

MATERIALES

Agua destiladaFrascos o envases plásticos de 1000 ml y 250 mlEtiquetas Cinta adhesiva transparenteRefrigeradorPapel CelofánElásticosSoga de algodónPapel AluminioParafilm

REACTIVOS

Macronutrientes*Micronutrientes*Vitaminas*

* Según medio de cultivo.

METODOLOGÍA

Observe las diferencias con respecto al contenido de nutrientes y vitaminas para cada uno de los medios de cultivo a preparar. Averigüe a que se debe esta diferencia. Calcule como preparar las soluciones madres con la información que se le entregará.

Para cada medio nutritivo prepare los siguientes stocks:

Stock A1: macronutrientesStock A2: calcioStock B: micronutrientesStock C: FeNa EDTAStock D: Vitaminas

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