LAS AMILOIDOSIS HUMANAS: CUANDO LAS PROTENASMUESTRAN SU LADO OSCURO

Las protenas son esenciales para la vida debido a que ejecutan la mayora de las funciones que le dan soporte. Para cumplir estas funciones, las protenas deben plegarse en su correspondiente estructura nativa y conservar este estado, aun en las condiciones de estrs fsico, qumico y funcional que enfrentan tanto en el interior como en el exterior de la clula. Se ha demostrado que numerosas enfermedades humanas y de los animales, reunidas bajo el trmino de amiloidosis, estn asociadas a alteraciones del plegamiento de un grupo particular de protenas que se depositan en el espacio extracelular en forma de agregados fibrilares insolubles. Los factores y condiciones que determinan este comportamiento patolgico son muy diversos, como diversas en secuencia y estructura son las protenas implicadas. Sin embargo, los agregados fibrilares que forman, denominados amiloides, comparten numerosas propiedades biofsicas y estructurales.Este trabajo trata de los fundamentos de la agregacin amiloide de las protenas y de las caractersticas generales de esta clase de agregados. Se analizan las condiciones y factores relacionados con su formacin y se describen los elementos bsicos de los diferentes modelos estructurales propuestos para explicar las propiedades de las fibras amilolides.

IntroduccinLas protenas, protagonistas fundamentales de la vida: propiedades estructurales generalesLas protenas son polmeros lineales constituidos por subunidades o bloques menores denominados aminocidos. Aunque en la naturaleza se han identificado cientos de aminocidos diferentes, slo veinte de estos, todos -aminocidos de la serie L, forman parte de las protenas[1]. La caracterstica distintiva de una protena es su estructura primaria, que es el orden lineal o secuencia de sus aminocidos; sta representa un cdigo esencialmente unidimensional en el que, sin embargo, est contenida la informacin necesaria para que la molcula adopte la estructura tridimensional estable y funcional [2,3]. Tanto en las protenas como en los cidos nucleicos se convierte la informacin unidimensional de la estructura primaria en un tipo de informacin cualitativamente diferente, que es la contenida en la estructura tridimensional de la molcula y que apreciamos en forma de sus propiedades funcionales [2-5]. Sin embargo, es en las protenas donde este fenmeno, denominado plegamiento, alcanza el ms alto grado de complejidad, caracterstica que se sustenta en la mayor diversidad estructural de sus elementos constituyentes y que se corresponde con la gran diversidad de sus funciones [1-3,6]. Las protenas son las molculas efectoras por excelencia y ejecutan todas las funciones que requieren carcter informacional, con excepcin de la de almacenar y transferir informacin sobre la secuencia de otras protenas, funcin privativa de los cidos nucleicos [1].Algunas protenas pueden plegarse de forma correcta in vitro si se establecen las condiciones adecuadas de pH, temperatura, fuerza inica, balance redox, concentracin de ligandos especficos, entre otras [2, 3, 6,7]. El plegamiento in vitro de las protenas ha sido extensamente estudiado mediante el empleo de una amplia variedad de mtodos espectroscpicos y bioqumicos, as como mediante simulaciones computacionales [8-10]. Estos estudios han permitido identificar las fuerzas que estabilizan la estructura nativa de las protenas y describir, en lo general, sus mecanismos de plegamiento [7-14].Notablemente, se ha observado que muchas protenas tienden a formar agregados cuando se intenta plegarlas in vitro. Dado que los agregados que forman carecen generalmente de actividad, se concluye que estn formados por molculas que no estn plegadas, o que poseen un plegamiento diferente del nativo, lo cual sugiere una relacin entre los estados de plegamiento no nativo y la proclividad a la agregacin [15,16]. La agregacin de las protenas no ocurre nicamente en las condiciones in vitro, ni es una propiedad de un grupo particular de estas molculas. Abundante evidencia experimental indica que es un fenmeno frecuente, que puede ocurrir tanto dentro como fuera de la clula y que puede afectar, en mayor o menor medida, a casi cualquier protena [17]. La tendencia de las protenas a agregarse ha jugado un papel relevante en la evolucin y su huella puede observarse a nivel de la estructura de las protenas mismas y en los numerosos sistemas y grupos de factores, presentes en todos los tipos celulares, cuya funcin primaria es la de evitar la formacin y/o acumulacin de agregados proteicos en el interior de la clula, as como fuera de esta [17-20].El anlisis comparativo de la secuencia de cientos de protenas y los estudios estructurales y biofsicos han aportado evidencias que sugieren que, a travs de la evolucin, estas molculas han incorporado elementos de secuencia y/o motivos estructurales cuya funcin es la de protegerlas de la agregacin [18,21]. El efecto protector de estos elementos puede ejercerse tanto durante el plegamiento como luego de que la molcula ha adquirido su estado nativo. En algunas protenas se ha demostrado que la sustitucin de ciertos aminocidos se asocia a la acumulacin de intermediarios estables con plegamiento no nativo que muestran tendencia a la agregacin. Estas especies pueden ser componentes de la va cintica normal o encontrarse fuera de ella, y su acumulacin puede responder tanto a variaciones de las constantes cinticas del plegamiento como de sus equilibrios termodinmicos [14,22,23]. Estos hallazgos pueden interpretarse en trminos de cmo las protenas evolucionaron no slo para plegarse en forma funcional y estable, sino tambin para asegurar que este estado se alcance a travs de una va que no represente riesgo de acumulacin de formas no nativas con propiedades potencialmente perjudiciales para la clula [24]. Por otra parte, se han identificado motivos estructurales comunes en las protenas con estructura de tipo a los que se les atribuye funcin inhibidora de la agregacin, debido a su potencial capacidad para impedir o desfavorecer las interacciones intermoleculares que pueden causarla [18,21,25].Los sistemas de control del plegamientoTodos los organismos vivos poseen complejos sistemas multiproteicos, presentes en los diferentes compartimientos celulares donde ocurre sntesis de protena, los cuales controlan y asisten el plegamiento de estas molculas y eliminan a las que no consiguen plegarse correctamente, as como a las que habiendo alcanzado previamente su estado nativo, lo han perdido por el efecto de condiciones ambientales adversas [19,20,26]. Estos sistemas de control del plegamiento de las protenas se caracterizan por ser redundantes y muy dinmicos, pudiendo responder a los cambios en el microambiente intracelular, ajustando la concentracin de varios de sus componentes de acuerdo a la demanda de la clula. Aunque varias de las protenas que componen estos sistemas son expresadas constitutivamente a alta concentracin an en condiciones fisiolgicas, la expresin de otras es inducida intensamente cuando la cantidad de molculas de protenas que no pueden alcanzar su plegamiento nativo tiende a incrementarse.Esto ltimo ocurre bajo ciertas condiciones de estrs celular. Este complejo proceso de ajuste de ciertos componentes en respuesta a condiciones de estrs celular se denomina respuesta a las protenas no plegadas [27,28].Uno de los componentes fundamentales de los sistemas de control del plegamiento son las chaperonas moleculares [20]. Esta clase de protenas, muy conservadas entre las diferentes especies, unen reversiblemente a las molculas de protena de reciente sntesis y, mediante mecanismos diversos que pueden requerir la hidrlisis de ATP, las ayudan a plegarse en su estado nativo [29-31]. Algunas chaperonas pueden revertir el plegamiento de las molculas que estn plegadas incorrectamente, dndoles una nueva oportunidad de iniciar el proceso y potencialmente alcanzar su estado nativo funcional [32].Adems de las chaperonas moleculares, los sistemas de control del plegamiento se componen de varias proteasas muy especializadas cuya distribucin intracelular semeja a la de las chaperonas.Estas proteasas, cuya funcin est coordinada con la de las chaperonas, degradan a las molculas de protenas plegadas incorrectamente, generalmente una vez que chaperonas especficas las han desplegado convenientemente [33]. La va fundamental de eliminacin de las protenas incorrectamente plegadas en el compartimiento citoplasmtico es el complejo del proteosoma. Este sistema degrada a las protenas que han sido marcadas para tal fin mediante la unin covalente a su estructura de un nmero variable de molculas de ubiquitina [33,34]. La va del proteosoma es tambin el destino de algunas de las protenas sintetizadas en los ribosomas unidos al retculo endoplsmico y que por alguna razn no alcanzaron su estado nativo [19,26,35].Las enfermedades por plegamiento anormal de las protenasLa existencia en todos los organismos vivos de complejos sistemas de control del plegamiento es evidencia de que las protenas enfrentan condiciones hostiles en el medio intracelular, que con frecuencia impiden que se plieguen exitosamente. Tambin sugieren la magnitud de los riesgos que entraa para las clulas la acumulacin de molculas plegadas incorrectamente [6,14,18,36].El plegamiento incorrecto puede ser causado por mutaciones en la protena que, como se mencion antes, pueden modificar la cintica del plegamiento o disminuir la estabilidad del estado nativo [37,38]. Adicionalmente, pueden acumularse molculas con plegamiento incorrecto en ciertas condiciones de estrs celular que cursan con el incremento sostenido de la sntesis de protenas y/o provocan la disminucin de la capacidad funcional de los sistemas de control del plegamiento [36,39]. Los estados de plegamiento incorrecto generalmente se asocian a la prdida parcial o total de la funcin de la protena involucrada, lo cual puede ser causa de enfermedad; como en los errores congnitos del metabolismo [36,40,41]. Adems, como se coment antes, estos estados se relacionan con frecuencia a la acumulacin de agregados en los diferentes compartimientos celulares, as como en el espacio extracelular. En ciertas circunstancias, las protenas pueden formar agregados que son muy diversos, tanto por su morfologa al microscopio electrnico como por su orden interno. Estas diferencias se reflejan en sus propiedades bioqumicas y en su capacidad para interactuar, con muy diversas consecuencias, con diferentes estructuras y componentes celulares [6,14,17,18,24,36].En los ltimos 20 aos se ha acumulado abundante evidencia que indica que numerosas enfermedades humanas tienen su causa, o estn relacionadas de alguna forma, con alteraciones del plegamiento de protenas especficas y su acumulacin en forma de agregados insolubles. Tanto la prdida de la funcin debido al plegamiento incorrecto como la ganancia de propiedades citotxicas, una vez agregadas, son dos mecanismos patognicos fundamentales de estas enfermedades, que se renen bajo el trmino de enfermedades por plegamiento incorrecto de las protenas [17,24,36]. Al lector interesado en ampliar sus conocimientos sobre este grupo de enfermedades se le recomienda leer tres magnificas revisiones recientemente publicadas [42-44].Dentro de este grupo de enfermedades, las amiloidosis han sido extensamente estudiadas debido a que muchas de ellas representan problemas de salud de primer orden para los humanos [45]. A continuacin describiremos en sus caractersticas generales, a este grupo de enfermedades.Amiloidosis: caractersticas generalesLas amiloidosis son un grupo de enfermedades degenerativas del hombre y los animales, clnica y bioqumicamente muy heterogneas, que se caracterizan por la deposicin extracelular de agregados fibrilares insolubles de naturaleza proteica. A este grupo pertenecen enfermedades muy relevantes de la patologa humana como la diabetes mellitus tipo II, las enfermedades de Parkinson y Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob -variante en humanos de la encefalopata espongiforme bovina-, la polineuropata familiar amiloidtica, la amiloidosis asociada a la dilisis renal crnica y la amiloidosis derivada de las cadenas ligeras (AL), entre otras [45,46].La heterogeneidad clnica de las amiloidosis deriva de la amplia y diversa distribucin tisular de los depsitos amiloides. En las variantes localizadas, como el trmino lo indica, estos se limitan a un nico rgano o tipo de tejido; por ejemplo, en la diabetes mellitus tipo II y la enfermedad de Alzheimer los rganos afectados son el pncreas y el cerebro, respectivamente. En contraste, varios rganos estn involucrados en las variantes sistmicas, como la amiloidosis AL [45,46].La deposicin amiloide se asocia a la aparicin de un conjunto de signos y sntomas que reflejan el grado de disfuncin del rgano u rganos involucrados, condicin que generalmente se profundiza con el tiempo si no se modifica mediante acciones teraputicas. La distribucin y cuanta de los depsitos varan notablemente de un tipo de amiloidosis a otro, e incluso, pueden diferir entre pacientes afectados por la misma variante, lo cual determina considerable heterogeneidad en la evolucin clnica de los pacientes afectados por estas entidades. Muchas amiloidosis afectan rganos vitales, como el corazn, los riones, el hgado y el cerebro, por lo que su evolucin suele ser generalmente fatal [45,46].Los precursores de amiloideEl componente fundamental de los depsitos en cada tipo de amiloidosis son agregados fibrilares insolubles de una protena particular o sus fragmentos. Al presente, se han identificado veinticuatro protenas diferentes cuya agregacin fibrilar se asocia a alguna forma clnica de amiloidosis. A estas protenas se les denomina precursores de amiloide y es notable que no compartan similitud de funcin, secuencia ni estructura (Tabla I) (45-48). Algunos, como la transtiretina, o prealbmina, la cual est asociada a diversas formas de amiloidosis, tanto de aparicin espordica como hereditaria [49], son protenas con plegamiento estable en condiciones fisiolgicas (Figura 1). En contraste, otros, como el pptido insular amiloide, o amilina, asociado a la diabetes mellitus tipo II, carecen de plegamiento estable, aun en condiciones fisiolgicas. A esta clase singular de protenas se les denomina pptidos desordenados en condiciones nativas [50].Los precursores de amiloide tambin difieren en la proporcin de elementos de estructura secundaria que caracteriza su plegamiento. Por ejemplo, la insulina, slo posee estructura secundaria de tipo -hlice, mientras otros, como la 2-microglobulina, son molculas todo-; un tercer grupo, como la lisozima y la anteriormente mencionada transtiretina, se caracterizan por una proporcin diferente de ambas formas de plegamiento [45-49] (Figura 1). Caractersticas generales de los amiloidesAl margen de la diversidad estructural de los precursores, los amiloides poseen propiedades de apariencia microscpica y sub-microscpica, as como tintoreales y espectroscpicas comunes, lo cual sugiere que comparten elementos estructurales fundamentales [47]. Al microscopio ptico los depsitos tisulares de amiloide tienen aspecto hialino y homogneo y producen una caracterstica birrefringencia verde manzana cuando son observados al microscopio de luz polarizada, una vez teidos con Rojo Congo [51]. La unin del colorante rojo Congo a los amiloides determina un cambio en sus propiedades pticas, lo cual puede usarse para cuantificar los agregados mediante espectroscopia convencional [52] (Figura2A). Otra caracterstica comn de los amiloides es la de unir al colorante tioflavina T, lo cual modifica las propiedades de fluorescencia de esta molcula [53] (Figura 2B). Al microscopio electrnico, los depsitos de amiloide estn compuestos por manojos de fibras no ramificadas, de aspecto recto y rgido, de longitud variable, pero con dimetro en el orden de los 75 a los 120 [54] (Figura 2C).

Estructura tridimensional de precursores de amiloide. A) Transtiretina o prealbmina (PDB 1G1O). B) Lisozima (PDB 1LYY). C) 2 microglobulina (PDB 2F8O) y D) Insulina (PDB 2C8Q). Las regiones plegadas en hebras y hlice se representan en forma de cintas, en color amarillo y rojo, respectivamente. El resto de la molcula, incluyendo las regiones plegadas en asa, se representa como cordones. Ntese que las molculas se representan con diferente escala.El carcter insoluble y la talla de las fibras amiloides ha impedido hasta el presente dilucidar su estructura interna a nivel atmico, pues no son aplicables en su anlisis los mtodos estructurales convencionales como la difraccin de rayos X de monocristales y la resonancia magntica nuclear (RMN) en fase lquida. Los estudios de difraccin de rayos X de fibras alineadas, obtenidas tanto de muestras ex vivo como producidas in vitro, dan un patrn comn aunque poco informativo que se caracteriza por reflexiones perpendiculares, situadas alrededor de los 4.7 en la direccin meridional y alrededor de los 10-12 en la direccin ecuatorial. Este patrn denominado cruzado, indica que las fibras amiloides estn formadas por hojas extensas orientadas paralelamente al eje longitudinal de la fibra, mientras las hebras que las forman se disponen perpendicularmente a ste eje. Las reflexiones meridionales en 4.7 corresponden al espaciado de las hebras adyacentes, mientras que las reflexiones ecuatoriales a los 10-12 corresponden a la separacin cara-cara de las hojas y slo se presentan si la unidad estructural menor de la fibra posee dos o ms de estas hojas [55] (Figura 3). El estudio, mediante diversos mtodos bioqumicos y espectroscpicos, incluyendo la RMN en fase slida, de los agregados fibrilares producidos in vitro por varios precursores ha aportado informacin que soporta este modelo estructural de la fibra amiloide [56-59].Propiedades espectroscpicas y morfolgicas de los agregados fibrilares obtenidos in vitro. Espectro de absorcin de luz de rojo Congo (A) y de emisin de fluorescencia de tioflavina T (B) en presencia de agregados fibrilares () y de la forma soluble () de un dominio variable recombinante de cadena ligera. Ntese en (A) el incremento de la absorcin del colorante en presencia de las fibras, con el caracterstico corrimiento del mximo de absorcin de 500 nm a 550 nm. En (B) es evidente el aumento de la emisin de fluorescencia de tioflavina T unido a las fibras, con un mximo en 482 nm. En (C) se muestra micrografa electrnica de los agregados fibrilares analizados en (A) y (B).Adems del pptido o la protena precursora respectivos, otras protenas y compuestos de naturaleza no proteica estn generalmente asociados a las fibras amiloides, por lo que son parte integral de los depsitos. A estas sustancias, entre las que destacan la polipoprotena E, la protena srica del amiloide (SAP, por sus siglas en ingls) y los glicosaminoglicanos, entre otros, se les denomina molculas accesorias y se les han atribuido diversas funciones. Se cree que algunos pueden actuar como moduladores de la cintica de agregacin, aportando sitios de anclaje en la matriz extracelular para los agregados fibrilares. Otros, pueden estabilizar de los agregados, incrementando su resistencia a la accin de las proteasas extracelulares. Tambin se ha sugerido que pueden contribuir a su citotoxicidad [60].La amiloidognesis como consecuencia del plegamiento anormal de las protenas Las evidencias aportadas por numerosos estudios acerca de los factores y condiciones que modifican la fibrilognesis in vitro de las protenas globulares, unido al conocimiento sobre las caractersticas clnico-biolgicas de los pacientes con amiloidosis, han dado lugar a la hiptesis conformacional. El postulado fundamental de esta hiptesis refiere que la agregacin amiloide implica la ganancia de un estado de plegamiento total o parcialmente diferente del nativo, el cual puede ser alcanzado a travs de vas diferentes dependiendo de la protena implicada [6, 18, 24,45-48]. En soporte de esta hiptesis, se ha demostrado que la fibrilognesis de ciertas protenas puede promoverse in vitro si se les somete a condiciones que desestabilizan su estructura nativa, como la adicin de sustancias de efecto desnaturalizante (cloruro de guanidinio y urea), altas temperaturas, pH extremos, protelisis parcial, presencia de iones metlicos, etc. [64-68]. Adems, e han identificado numerosas mutaciones que estn asociadas a formas prematuras y/o de evolucin ms grave de ciertas amiloidosis, las cuales, como regla general, desestabilizan de la estructura nativa de la protena precursora. Se propone que estas mutaciones favorecen formas de plegamiento no nativo que pueden ser proclives a la agregacin fibrilar [14,17,24,69-71]. Como cabra esperase, las mutaciones que estabilizan el plegamiento nativo de la protena precursora, as como la unin de ligandos especficos o la presencia de ciertos solutos que ejercen el mismo efecto, por lo general disminuyen su tendencia a agregarse en forma fibrilar in vitro [72-75].El estudio sistemtico del efecto de las mutaciones sobre las propiedades biofsicas de los precursores de amiloide permiti reconocer la relacin entre la estabilidad termodinmica y la amiloidognesis. Algunas observaciones sugieren que las mutaciones tambin podran promover la agregacin a travs de su influencia en otras propiedades de la molcula como la solubilidad, las propiedades cido-bsicas, la distribucin de cargas de su superficie y la propensin de ciertas regiones a adoptar estructura secundaria de tipo [76]. En algunas formas de amiloidosis los agregados fibrilares estn compuestos exclusiva o mayoritariamente por fragmentos de la protena precursora. Por ejemplo, en la amiloidosis AL, si bien la cadena ligera monoclonal puede estar formando parte de los depsitos fibrilares, es ms frecuente encontrar que el componente fundamental de estos son fragmentos de la protena que incluyen el dominio variable (VL), o este ms una porcin del dominio constante (CL) [77]. Se ha demostrado, mediante experimentos en un modelo in vivo, que el potencial fibrilognico de las cadenas ligeras reside en el VL y que los fragmentos que incluyen este dominio poseen generalmente mayor propensin a la agregacin fibrilar in vitro que la molcula ntegra [78]. Estos hallazgos sugieren que, en el caso de la amiloidosis AL, la escisin del precursor podra ser un evento importante en el mecanismo de agregacin. Sin embargo, al presente no se demostrado inequvocamente el origen de estos fragmentos, o si resultan de la accin de alguna proteasa sobre el precursor.Otro caso en el que la protelisis del precursor parece jugar un papel trascendental es en la enfermedad de Alzheimer. Acorde a la hiptesis de la cascada amiloide [79], el complejo proceso patolgico que da lugar a esta enfermedad se inicia con la deposicin extracelular amiloide de los pptidos A, fundamentalmente el A42. Estos depsitos forman el ncleo de la placa senil, lesin que caracteriza la neocorteza y el hipocampo de los pacientes afectados por esta enfermedad neurodegenerativa. Los pptidos Ase producen durante el procesamiento proteoltico secuencial de la protena precursora APP, por las y secretasas, complejos proteicos asociados a la membrana de las clulas de los mamferos [80]. APP es una protena de membrana de 695 residuos de aminocidos que es escasamente amiloidognica in vitro, en contraste con la alta tendencia de los pptidos Aa formar agregados fibrilares [81]. Se propone que el incremento en la concentracin local de los pptidos A, particularmente el A42, el de mayor potencial fibrilognico, inicia la cadena de eventos que causan la enfermedad [79,80]. En apoyo de esta hiptesis, se ha observado que mutaciones cerca de los sitios de procesamiento de la APP y/o en los genes de las presenilinas 1 y 2, componentes catalticos del complejo de la secretasa , se asocian al incremento en la produccin del pptido A42 y causan una forma hereditaria, autosmica dominante, de la enfermedad de Alzheimer [82-84]. Similarmente, los individuos con sndrome de Down, causado por trisoma del cromosoma 21, donde se localiza en gen de APP, sufren de enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, debido a la sobreexpresin del precursor [85]. En algunas formas de amiloidosis de aparicin espordica, la protena precursora no posee mutacin alguna ni ha sufrido escisin proteoltica, lo cual indica que este tipo de modificaciones no son la nica causa de agregacin amiloide. En algunas de estos estados, es la alteracin de la va normal de catabolismo del precursor y el subsecuente incremento de su concentracin sistmica, lo que parece exacerbar su propensin a la agregacin fibrilar [46].Consideraciones finalesAunque se ha avanzado en la comprensin de los factores que se asocian a la agregacin amiloide de las protenas, an no se han esclarecido en detalle el, o los mecanismos moleculares de formacin de las fibras y tampoco se ha determinado la estructura a nivel atmico de estos agregados. Esta carencia de informacin ha dificultado el desarrollo de estrategias teraputicas eficaces que modifiquen el carcter crnico y el pronstico sombro que tpicamente acompaa a este grupo de enfermedades. Los aspectos clnicos y moleculares de las amiloidosis y los fenmenos asociados a la amiloidegnesis son, en el presente, campos muy activos de investigacin cientfica. Esto se debe, como se menciona, a que la evolucin de la mayora de estas enfermedades es irremediablemente mortal, o cuando no, provocan un alto grado de invalidez. Ambas caractersticas las convierte en una prioridad para los sistemas de salud y estimulan la inversin de cuantiosos recursos en su investigacin. Algunas de estas enfermedades, como la diabetes mellitus tipo II, la enfermedad de Alzheimer y la encefalopata espongiforme bovina son adems causa de prdidas econmicas de consideracin. Por otra parte, el reconocimiento de las alteraciones del plegamiento como parte fundamental del mecanismo molecular de amiloidognesis y el reto que el mismo estado amiloide -como forma alternativa de plegamiento- implica para la conceptos tradicionales en el campo, han atrado la atencin de muchos investigadores interesados en desentraar las causas que llevan a una protena a adoptar un plegamiento diferente del nativo, condicin ltima que se supone es la favorecida por la evolucin.