Las enzimas como herramientas analíticasherramientas analíticas

Dr. José Luis Cárdenas López

Las enzimas como herramientas analíticas

• Enzimas endógenas

• Enzimas exógenas• Enzimas exógenas

• Desarrollo de biosensores

Biosensores

José Luis Cárdenas López2014

Biosensores

…medir frescura en pescado

• Los metodos convencionales para medir frescura son tardados y difíciles de llevar a cabo en la industria de manera rutinaria

• “Biosensores” instrumentos analíticos compuestos de un elemento biológico de reconocimiento (enzima, anticuerpo, receptor, microbio) acoplado a un transductor químico o físico

Componentes de un biosensor

enzima (a) convierte el sustrato en producto, el t ransductor (b) lo convierte en una señal eléctrica. Se amplifica l a respuesta (c), se procesa (d) y se despliega (e).

• El elemento biológico está inmovilizado en o cerca de la superficie del transductor

• El transductor convierte el evento bioquímico en una señal eléctrica que se puede conectar a una computadora o sistema automáticosistema automático

• Dada la especificidad y sensibilidad de los sistemas biológicos y la capacidad de cómputo de los microprocesadores, prometen revolucionar los metodos de análisis

Tipos de biosensores

• Electroquímicos (electrodos)• Masas (cristales o dispositivos de onda

acústica)• Ópticos (optrodos)• Ópticos (optrodos)• Térmicos (termosistores o sensores de

calor)• Inmunosensores• Los más usados: los electrodos

Potenciométrico

(a) membrana semi-permeable que rodea el biocatalizador,esta encerrada (b) y proxima a la membrana de

vidrio activado(c) de un electrodo de pH (d) el potencial electrico(e) d

e

h

el potencial electrico(e) Se genera entre el electrodo interno deAg/AgCl (f) en un bano de HCl diluido(g) y la referencia externa (h).

a

bc

d

g

f

Tres tipos de electrodos selectivos a iones

• Electrodos de vidrio para cationes (electrodos normales de pH): el elemento sensible es una membrana delgada hidratada de vidrio que genera un potencial eléctrico debido a la competencia concentración-dependiente entre los cationes por los sitios de enlace específicos. La selectividad de la membrana se determina por la composición del vidrio

Electrodos de vidrio para pH cubiertos de membranas • Electrodos de vidrio para pH cubiertos de membranas permeables a gases selectivas para CO2, NH3 or H2S. La difusión del gas a través de las membranas causan un cambio en pH de una solución sensible entre la membrana y el electrodo

• Electrodos de estado sólido donde el la membrana de gases se reemplaza por una membrana específica para iones conductores hecha de sulfuro de plata y haluros de plata. El electrodo de yodo es útil para la determinacion de I- en la rx de peroxidasa y también responde a iones cianuro

Amperométrico

Se aplica un potencial entre el cátodo de platino y el ánodo de plata. Se genera una corriente (I) que se acarrea entre los electrodos por una solución saturada de KCl. El electrodo está separado de la enzima (glucosa oxidasa, GOD) por una membrana delgada, permeable solo al oxígeno

• Muchas enzimas producen o consumen especies cargadas que pueden ser monitoreadas por potenciómetros, amperómetros, medidores de amperómetros, medidores de conductividad

• Los electrodos amperométricos se basan en la detección de Oxígeno o H2O2acoplados a un sistema de oxidasas o un microorganismo aerobio�usado en la industria de bebidas

Masas o cristales• Cristales Piezo-eléctricos (cuarzo) vibran

bajo la influencia de un campo eléctrico. La frecuencia de oscilación depende de su grosor y cortes, teniendo cada cristal una frecuencia resonante característica

• Esta cambia al adsorber o desorber otras • Esta cambia al adsorber o desorber otras moléculas en su superficie

• Se puede detectar esas diferencias con un transductor

Biosensor de formaldehido

• Usando formaldehído dehidrogenasa inmobilizada cubriendo un cristal de cuarzo

• Sensible a formaldehído gaseoso• Sensible a formaldehído gaseoso

Térmicos

La muestra (a) pasa a través de una caja aislada (b) al intercambiador de calor (c) dentro de una caja de aluminio (d). Fluye a un termosistor(e) y a un bioreactor empacado (f, 1ml volumen), que contiene el biocatalizador, donde ocurre la rx. El cambio en T es determinado por el termosistor (g) y la solución sale (h). Un dispositivo electronico determina la diferencia en resistencia entre los termosistores (l)

Los termistores, detectan cambios en temperatura, funcionan cambiando su resistencia eléctrica con la temperatura en la relación

Por lo tanto,

R1 y R2 resistencias de los termosistores a temp absolutasT1 and T2 respectivamente y B es una constante para el termosistor.

Reactante EnzimaSalida de calor-∆∆∆∆H (kJ mol -1)

Colesterol Colesterol oxidasa 53

Esteres Quimiotripsina 4 - 16

Glucosa Glucosa oxidasa 80

Peróxido de

HidrógenoCatalasa 100

Hidrógeno

Penicilina G Penicilinasa 67

Péptidos Tripsina 10 - 30

Almidón Amilasa 8

Sacarosa Invertasa 20

Urea Ureasa 61

Ácido Úrico Uricasa 49

Biosensores Amperométricos para

enzimas flavo-oxidasas

(a) Primera generación. Electrodo utilizando el H2O2 producido en la rx (E0 = +0.68 V).

(b) Segunda generación electrodo utilizando un mediador (ferrocene)para mediador (ferrocene)para transferir los electrones por la rx. (E0 = +0.19 V).

(c) Tercera generación usando directamente los electrones producidos en la rx (E0 = +0.10 V)

Ópticos• Cambios en la absorción de luz entre

reactantes y productos de la reacción o bien medir la producción de luz por un proceso de luminiscencia

• Tiras de papel • El mas común es un kit para diabetes. Incluyen • El mas común es un kit para diabetes. Incluyen

tiras con peroxidasa y un cromógeno ( o-toluidina o 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). El H2O2producido por la oxidación aeróbica de la glucosa oxidará el cromógeno a una coloración intensa

• peroxidasacromogeno(2H) + H2O2 �colorante + 2H2O

Medidor de glucosa

luciérnagas

Luciferasa de luciérnagas

• EC 1.13.12.7 para detectar presencia de bacterias en alimentos o muestras clínicas

• ATP liberado al lisar las bacterias reacciona con la D-luciferina y el O2 y produce luz amarillala D-luciferina y el O2 y produce luz amarilla

luciferasaATP + D-luciferin + O2 �oxyluciferin + AMP + pyrophosphate + CO2 + light (562

nm)

• La luz se detecta con un espectrofotómetro • La luciferasa de las luciérnagas es cara

(inmobilizar)

ELISA

Principios de ELISA

• (i) Anticuerpos inmobilizados en un tubo, Una mezcla de conjugados antígeno-enzima mas una concentración no conocida de antígeno se ponen en el tubo y se dejan equilibrar.

• (ii) Después de un período el antígeno y el • (ii) Después de un período el antígeno y el conjugado antígeno-enzima se distribuirán entre los estados unidos y no unidos dependiendo de sus concentraciones.

• (iii) Se lava el material no unido. La cantidad de conjugado antígeno-enzima se puede determinar por la velocidad de la Rx enzimatica subsecuente

Inmunosensores

• (a) el biosensor reemplaza el método de detección colorimétrico

• (b) detección directa del antígeno unido a la superficie recubierta de anticuerpos del la superficie recubierta de anticuerpos del biosensor

Aplicaciones

• Análisis proximal• Etiquetado nutricional• Determinación de pesticidas• Toxinas y antinutrientes• Toxinas y antinutrientes• Cambios en el procesamiento• Contaminación microbiana• Inactivación de enzimas• Demanda biológica de oxígeno

Glucosa y lactato, Yellow springs

• Detección electroquímica• Muy rápido (<1 min) y preciso• Volumen de muestra muy pequeño• Hospitales

Otro biosensor exitoso

En productos marinos…

• El elemento biológico mas empleado: las enzimas

• El uso de enzimas directamente tiene inherentes algunos problemas, cofactores, inherentes algunos problemas, cofactores, inestabilidad, etc. lo que hace a los biosensores una alternativa viable

• Los primeros se experimentaron en los 80’s por Watanabe, en la determinación de frescura (para Hx) xantina oxidasa inmovilizada en una sonda de oxígeno

Biosensor de frescura

• La enzima se inmovilizó en una membrana preparada de triacetato de celulosa

• El Hx se oxida a acido úrico y H2O2 por la enzima inmovilizada, la respuesta y corriente de enzima inmovilizada, la respuesta y corriente de oxigeno se disminuye debido al consumo de oxígeno

• Una relación lineal se obtiene entre la [Hx] y la disminución de oxígeno en un rango específico.

• Se puede usar 100 veces el sensor y se puede tener 30 días a 5oC

“Freshometer”

Frescómetro

Otros biosensores para frescura

• Método para frescura, electrodo de xantina oxidasa, inmovilizada en membrana de seda con alambre de cobre y disco de platino

• Sensible a Hx, medir frescura (Shen, 1996)• Otro para Hx /(Hx+IMP+HXR), electrodo • Otro para Hx /(Hx+IMP+HXR), electrodo

amperométrico usando xantina oxidasa inmovilizada, detectando H2O2 y urea, durante la oxidación de Hx, inyectando nucleósido fosforilasa y fosfato se obtiene HXR y nucleosidasa para IMP, obteniendo valores de K comparables a los instrumentales (Luong, 1992)

• Para bases volátiles, un electrodo selectivo para iones de amoniaco que también puede ser usado para TMA (Pivarnik, 1998)

• Biosensor de poliaminas, usando • Biosensor de poliaminas, usando putrescina oxidasa inmovilizada en electrodos de H2O2 , detecta consumo de oxígeno y correlaciona con concentraciones de histamina, cadaverina y putrescina a ciertos niveles. Estable por 2 meses a 5oC, 60 ensayos

Otros biosensores• Octopina en escalopas , se forma de la Arg y el

ac pirúvico, se acumula 1% en 5 días de enhielado de la escalopa. Sensor de octopina basado en octopina deshidrogenasa y piruvato oxidasa. El ac pirúvico se oxida por la pox a oxidasa. El ac pirúvico se oxida por la pox a acetil fosfato, se mide el consumo de hidrógeno y esto correlaciona con el contenido de octopina (indicador de frescura en escalopas) (Shin, 1998)

• Urea en músculo de elamobranquios (Sheppard, 1996)

Detección amperométrica de urea

• Glicerol y triglicéridos . Un biosensor amperométrico usando glicerol deshidrogenasa (GDH) y lipasa, la oxidación del glicerol produce NADH, el oxidación del glicerol produce NADH, el cual se mide con un electrodo de Ag /AgCl, la GDH se inmoviliza en un electrodo de carbono (Laurinavicius, 1996)

Disponibilidad comercial

• A pesar de estar bien estudiados en las ultimas dos decadas, no han sido totalmente aceptados todavía en la industriaindustria

• Las técnicas de HPLC para calcular los índices K siguen siendo el estandar

• Los medidores de glucosa para los diabéticos son los biosensores mas exitosos hasta el momento

• KV101 “Frescómetro” Japón, se usa para Macarela, Sardina y Herring

• “Microfresh”• Sigma (USA) produce uno para • Sigma (USA) produce uno para

estimación de etanol