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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Las poliaminas y su acción sobre laLas poliaminas y su acción sobre lasíntesis de proteínassíntesis de proteínas
Echandi Meza, Guillermo G.
1975
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Echandi Meza, Guillermo G.. (1975). Las poliaminas y su acción sobre la síntesis de proteínas.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1477_EchandiMeza.pdf
Cita tipo Chicago:Echandi Meza, Guillermo G.. "Las poliaminas y su acción sobre la síntesis de proteínas". Tesis deDoctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1975.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1477_EchandiMeza.pdf
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
\FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
LAS PDLIAMINAS
V SU ACCION SOBRE LA SINTESIS DE PRDTEINAS
AUTOR: Lic; Guillermo G. Echandi Meza
DIRECTOR: Dr. Israel D. Algranati
LUGARDE TRABAJO: Instituto de Investigaciones Bioquímicas
"Fundación Campomar"
o?q\
\‘ 15515 PRESENTADA PARA UPTAR AL TITULO DE 00mmb
‘Q' ,ÜRIENTACIUNQUIMICA emmamn
Ü \ 1. 9 7 5
AGRADECIMIEPTDS
Al Dr. Israel D. nlgranati, por su Constante apoyo y dirección en
lc realización dc este trabaja, y sobre todo por 103 conocimientos que a
través de él. he adquirido cn estos tres años de labor a su lado.
A los Dres. Luis F. Laloir y Carlos E. Cardiní por haberme permitida
rcalizar este trabajo en el Instituto dc Investigaciones Bioquímicas.
laboratorio, Nélida González, Sara Goldcnberg,
Carcía-Patronc, Francisco Üarallc y Hanzur Azzam,par
su colaanración y afectuoso estimulo.
A tado; las ¿Lcmhrss del Instituto de InvestigaciOncs Bioquímicas,
par Su ccn;cr2;ig' y crítica constructiva.
A mis amígtü Roberta Causa, Gustavo “ale: y ?2(:r Katara, por las
rwmentcs agradables que humo: compartido cuando el trabaja fiarin nos lo
"c-witió.
A Sara S. Dastéfano, cuyo empeño y dedicaciñ' ¿12; ¡:2Lb1: la
:ranscriïcïc' d: a“:w trabajo.
a . I n nA Salada; ¿13272: y hargaríta Mazzardv.ll 'l 'J l' ÍI I ’
l) Í) CJ H ’J3
(J w LJ‘ -l u
ESPADR'HIS
I N D I C E
Pág.INTRODUCCION
Las poliaminas y su acción en la sintesis proteica 1Interacción de las poliaminas con el DNA 6Interacción poliamines y RNA 8Acción de las poliaminas En la sintesis proteica 1hAcción de las poliaminas en 1a activación del RNAdetransferencia 15Interacción de las poliaminns con los ribosomas 18Relación de las poliaminaa con la unión del nminoaciltRNA al ribosoma 27
QEAETLEÜSJÉEJÜEQE 29
HALEB.I!LL_.E_5_...X_HE_TPEQE 31
Medios de cultivo 31Reactivos 33
CrecimiEnto de las bacterias y método de ayuno 3kPreparación de lisadon bacterianos 35Preparación de extractos bacterianon y distinta:Fracciones subcelulares por molienda 36Análisis de la distribución ribosomal 37Análisis del RNAribosnmal 39Disociación de los ribosomas AD
Unión de las poliaminas (espormidina 1ht!) a los ribosomaa h]Sintesis de RNAy proteinas en células enteras #2Transporte de uracilo y loucinn L3Sintesis de poliFenilalanina cen ácido poliuridilico comoRNAmensajero bhFormación de fecilalanil tRNA Q5
Sintesis de proteinas "in vitro" usando ccmomensajeronatural RNAdel fago MS-2
Formación del complejo de iniciación
RESULTADOS
Requerimienta de putrescína para el crecimientonormal de cultivo: de Escherichia c011 MA- 261previamente sometidos a un ayuno de poliaminas
Efecto del agregado de putrescina sobre 1a distribuciónintracelular de las ribosomas
Especificidad del efecto de 1a pollamina sobre ladistribución de ribcsomaa
Disociación de los ribnsomas
Unión de la espermidina al ribosoma y corrección delperfíl ribosomal "in vitro"
Sintesis "in vivo" de RNAy proteinas
Tranïporte de uracilo y leucina
Sintesis "in vitro" de pnlipéptídos
Sintesis "in vitro" de polipéptidos usando RMAmensajeronatural
Sintesis de polifenilalaniwa can subunidades ribusomalespurificadac. Detección de partículas 30-5 anormales
Formación del complejo de iniciación usando comomensajero el trinucleótido AUG
DISCUSION
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
¿5
A7
Lg
53
B7
9h
98
105
109
ABREVIATURAS
AMP
ATP
AUG
EDTA
GTP
PEP
PH
Poli U.:
PPi
RNA
RNAm
DNA
tRNA
fmet-tRNA :
TEA
UDD-ZGDnm
5' adenosina moncfosfatu
5' adenoaina trifcsfato
trinucleósido difcsfatc adenílil-uridil-guanosina
etilen diaminotetraacéticc
5' guanosina trifosfatc
Fosfoenol pirúvico
piruvato quinasa
ácido poliuridilico
pircfosfato inorgánico
ácido ribcnucleico
ácido ribonucleicn mensajero
ácido desoxirríbonucleico
sobrenadante obtenido despues de centrifugar un extractoa 30.000 x g
sobrenadante obtenido después de centrifugar a 150.000 x g
unidades Svedberg de sedimentación
ácido ribonucleico de transferencia
formilmetíonina unida a la especie iniciadora de ácidoribcnucleicc de transferencia
ácido triclnroacéticu
:unidades de absorción medida a 260 nanometros
I N_T_R G.0 U CIC I Ü N
Las poliaminas y su asción gp la sintesis proteica
Las poliaminas son compuestos ampliamente
distribuidos en 1a naturaleza ( 1 - 4 ) que se encuen
tran presentes en todos los tejidos tanto animales como
vegetales.Aunquesu distribución es universal, exis
ten diferencias tanto cualitativas cemocuantitativas, quedependende los diferentes tipos celulares de los cuales seaislan. En procariotes predominanla putrescina y la esper
midina, mientras que en eucariotes, la espermina y la es
permidina.
Las fórmulas químicas de las poliaminas antes
citadas y la de la cadaverina ( otra poliamina presente en
las células, pero en menorconcentración ) son las siguientes:
Putrescina: NH2- (CH?)4 - NH2
Cadaverina: NH2 - (CH?)5 - NH2
Espermidina: NH2 - (CHZ)3 - NH - (CH2)4 - NH2
Espermina: NH2 - (CH2)3 - NH - (CH2)4-NH-(CH2)3-NH2
Las poliaminas se pueden definir ( 5 ) como
compuestosnitrogenados de carácter no proteico, alifáticosy de bajo P.H.
Se han realizado muchosestudios para deter
minar las vias metabólicas de su biosintesis ( 6, 8 ) .
Hoyse sabe que las poliaminas se sintetizan a partir de
los siguientes tres aminoácidos: ornitina, arginina y metionina. El esquemade biosintesis es el siguiente: ( 6,
7, 8 ).
C02. . ‘7 .Argmma AsmatmaADC
Urea AUH Urea
ODCOrnitina É) Putrescina
(202
AIP C0,
4' f decarboxilación BspermidinaMetíonina ¿-—€>S. Adenosil--—49de la S. Adenosil
metionina metionina :>
Espermína
ADC I Argiuina decarboxilasa
UDC = Ornitina decarboxilasa
AUh - Agmatina ureohídrolasa
Las poliaminas fueron descriptas por primera
vez en 1676, por Leeuwenhock; pero recién en 1924 ( 9 )
Rosenheimdeterminó la estructura correcta y además sinte
tizó "in vitro" tanto a la espermidina comoa la espermina
( 2 ).
Aunqueactualmente se conoce que las polia
minas intervienen en múltiples procesos biológicos, tales
como la sintesis de ácidos nucleicos ( RNA, DNA) y de pro
teinas, la agregación de subunidades ribosomales, la estabi
lización de membranas,etc., su efecto biológico primariotodavia no está bien definido.
A continuación detallaremos algunos aspectOs
de las funciones más conocidas de las poliaminas.
Interacción con la pared y membranacelular.
Los estudios para demostrar 1a función e in
teracción de las poliaminas con las membranasy la pared ce
lular son bastante complejos, pués las poliaminas presentan
una alta solubilidad que hace casi imposible evitar su redistribución al aislar los diferentes componentescelulares (15,18, 19).
En 1955 Mager ( 22 ) trabajando con Pasteurella
tularensis observó que si se hacia crecer dicha bacteria en
un medio hipotónico en presencia de espermidina, se evitaba
la lisis que ocurría normalmente.
Posteriormente Bachrach y Hager ( 23, 25 )
realizaron una serie de experimentos "in vivo" con BacilIUS
subtilis en los que se demostró la presencia de la espermi
dina tanto en la pared como en 1a membranacelular.
Estos investigadores prepararon protoplastos( 26 ) y trozos de pared ( 27 ) de Bacillus subtilis culti
vado en un medio que contenía espermidina 14€, o metionina
14€ (precursor de la espermidina). Se observó la presencia
de espermidina radiactiva tanto en los protoplastos comoen
los trozos de pared celular, siendo mayor la concentración
de espermidina 14€ en los trozos de pared celular.
Estudios "in vitro" incubando trozos de pared
celular y protoplastos con espermidina 14€, demostraron nue
vamente la mayor afinidad de la pared celular por dicha poliamina.
En experimentos realizados con Escherichia
ggli ( 28 ) se observó que la presencia de espermidina eracapaz de evitar la lisis enzimática con lisozima, obteniéndose esferoplastos que poseían la particularidad de ser mu
cho más estables que los obtenidos por otros métodos.
En estos casos la producción de los esferoplas
tos, no se debia a una inhibición enzimática por la espermi
dina, sino a una estabilización de 1a membranacelular. En
este proceso la espermidina interactuaba fuertemente con 1a
membranacelular, de manera tal que no se podia eliminar,
mediante lavados sucesivos de los esferoplastos formados.
Interacción de las poliamings con el DNA
Las caracteristicas catiónicas de las poliaminas sugirió la posibilidad de que dentro de 1a célula es
tas sustancias podrian unirse a los ácidos nucleicos.
Ya en 1957 Hershey ( lO ) habia aislado dos
sustancias que denominó A1 y A2 , que eran inyectadas junto
con el DNAdurante la infección de bacterias por fagos T4.Posteriormente Ames( 11, 12 ) identificó estas sustancias
comoputrescina y espermidina. A raiz de estos hallazgos se
planteó la incógnita sobre 1a función de las poliaminas en
la relación que podrian tener con el DNAdel fago T4. Hoyse sabe, que las poliaminas son capaces de neutralizar el
40%de las cargas negativas del DNAdel fago, permitiendo
el empaquetamientode dicho ácido nucleico dentro de la ca
beza del virus ( 13 ). Experimentos posteriores, en los cua
les se trabajó con fago T ( 12 ) y esferoplastos de Esche4
richia coli ( 15 ) demostraron que la unión de la poliamina
al DNA,se realizaba de una manera inespecifica, y que
Simplemente, como se mencionó anteriormente servia para
neutralizar las cargas de los fosfatos presentes en dichoácido nucleico.
Trabajando con minicélulas de Escherichia coli
5;;3 ( 16 ) que contienen solamente un 3%del DNAtotal de
una bacteria normal, se observó que la concentración de poliaminas unidas al total de los ácidos nucleicos de esta ce
pa mutante era aproximadamente igual a la concentración en
contrada en los ácidos nucleicos de la cepa normal. Estos
experimentos llevaron a 1a conclusión de que las poliaminas
poseen una mayor afinidad por el RNAque por el DNA.
El hecho de que las dobles hélices de los
ácidos nucleicos presenten una absorción a 260 nmmenor
que las de cadenas aisladas, permitió realizar una seriede experiencias ( 20, 21 ) "in vitro", en las cuales se de
mostró nuevamente1a acción estabilizadora de las poliami
nas sobre el DNA.Se sabe, que si un ácido nucleico de doble
hélice se somete a un calentamiento paulatino comienza a
desnaturalizarse y sus cadenas se separan. Esto determina
un aumento de la absorción a 260 nm. Se suele llamar tempe
ratura de fusión (rm) ( 8 ) a la temperatura que provoca
un incremento en 1a absorción equivalente a la mitad del incremento total observado cuando la molécula se ha desnatura
lizado completamente.
Se ha visto ( 17 ) que las poliaminas son capaces de aumen
tar el Tmalrededor de 10 °C por estabilización de las do
bles hélices del DNA.Se ha estudiado el mecanismo de esta
estabilización ( 79 ) y de acuerdo a los resultados se pos
tula que las diaminas ( putrescina y cadaverina ) son capa
ces de formar puentes entre los fosfatos de una mismacade
na del DNA6 entre dos cadenas de una misma molécula del
ácido nucleico. La espermidina y la espermina forman puentesinter e intra moleculares.
El grado de estabilidad que las poliaminas
confieren al DNAdepende del número de grupos aminos presen
tes en la molécula de poliamina. Por esta razón la espermina
es la que produce mayor estabilidad y la espermidina, cada
verina y putrescina, le siguen en orden decreciente.
Interacción poliaminas y RNA
Comose mencionó anteriormente, las poliaminas
se encuentran unidas preferentemente a1 RNA( 16, 29 ) que
parece presentar un mayor número de sitios de unión que elDNA .
Se ha logrado aislar poliaminas unidas a los
tres diferentes tipos de RNA:de transferencia, mensajero
y ribosomal ( 13, 30, 31, 19 ).
También se ha demostrado tanto en células
animales comoen bacterias una intima relación entre los
niveles presentes de poliaminas y de RNA ( 32, 33, 31 ).
Las poliaminas interactúan de manera diferen
te de acuerdo al tipo de ácido nucleico con el que reaccio
nan. Mientras que en la estabilización del DNA,1a confor
mación de éste no se altera apreciablemente. La interacción
de las poliaminas con el RNAproducen un efecto hipocrómico
( 36 ), lo que llevaria a pensar que existe una relación
poliamina-RNAtal que se producen estructuras tipo doblehélice dentro de la molécula del RNA.
Estudios "in vitro", realizados con la RNA
polimerasa DNAdependiente ( 37 ), demostraron que tanto la
velocidad de sintesis, como la cantidad de RNAproducido en
esta reacción enzimática eran aumentadospor las poliaminas.
Se conoce que la RNApolimerasa puede unirse con DNAo RNA
para formar complejos. Por lo tanto, la producción de RNA
usando el DNAcomo molde puede verse seriamente inhibida por
1a presencia de RNAexógeno. Si se estudia el mecanismo de
esta reacción, que involucra nucleótidos trifosfato, DNA,
metales. 1a enzima y RNAexógeno, se observa que el orden
en que se agregua1los reactivos es critico y determina lacantidad de producto formado.
Para obtener una cantidad máximade producto
se debe agregar primero el DNAy la enzima, pues si se
agrega primero el RNA,se produce el complejo RNA-enzima
y se impide la unión de la enzima a su templado,inhibiéndose de esta manera la sintesis de nuevo RNA.
La estimulación de la sintesis de RNApor las
poliaminas ( 37 ) se debe a la interacción de estas sustan
cias con el complejo RNA-enzima,de manera tal que la polia
mina es capaz de disociar el complejo, permitiendo por este
mecanismo que exista una mayor cantidad de enzima disponible
para unirse al DNAy producir RNA.Por otra parte se demos
tró que las poliaminas eran incapaces de disociar el comple
jo DNA-enzima.
Petersen ( 39 ) demostró que la poliamina ac
tuaba en la sintesis de RNApor dos mecanismos diferentes:
aumentando el número de sitios en el DNAcapaces de unirse
a la enzima y determinando la mayor polimerización del RNA,
es decir la formación de cadenas más largas del producto.
La relación entre los niveles de espermidina
y los de RNAfueron claramente demostrados en experimentos
realizados con embrión de pollo e higado de rata ( 41 - 43 ).
Si se trabaja con higados en crecimiento activo, ya sea por ser higados inmaduros de ratas recién nacidas
o por estar en periodo de regeneración después de una hepa
tectomia parcial, se encuentra una relación directa entre
la estimulación de 1a sintesis de RNAy e] aumento de la
sintesis de espermidina ( 44 , 47 ). Si se estudian higa
dos adultos se observan niveles bajos tanto de espermidinacomo de RNA.
.Se considera que la mayor cantidad de espermi
dina en higados en regeneración se debe a un aumento en 1a
actividad de la ornitina decarboxilasa ( esquema hoja nQ 2 ).
Se producen entonces niveles altos de putrescina que estimu
lan a la enzima S-adenosil metionina decarboxilasa provocan
do una acumulación de espermidina ( 45 ).
Aparentemente el aumento de actividad de la
ornitina decarboxilasa está acompañadopor un incremento de
actividad de la RNApolimerasa ( 46 ).
Raina y Cohen ( 48, 50, 51 ) han tratado de
explicar mejor la relación entre los niveles de RNAy de poliaminas. Para ello han utilizado mutantes nutricionales de
Escherichia coli, conocidas comomutantes TAU,pues requie
ren para su crecimiento 1a presencia de timina, uracilo y
arginina en el medio de cultivo. Ademáslas mutantes usadas
eran de dos tipos: "Stringent" y "Relaxed". Se llama cepas
"Stringent" a aquéllas en las cuales al suprimirse del medio
de cultivo un aminoácido esencial para su crecimiento detie
nen tanto la sintesis proteica, comola sintesis de RNA.
Las cepas "Relaxed" son aquéllas en las cuales la eliminación
de un aminoácidoesencial, solamente detiene la sintesis
proteica, manteniéndose normal la sintesis de RNA.Si se estudian los niveles intracelulares de
espermidina y de RNAen cultivos desarrollados en ausencia
de arginina (aminoácidoesencial para estas bacterias) de
cepas TAU"st" y TAU"rel", se observa que, en las cepas
TAU"rel" (donde la sintesis de RNAcontinúa)tanto los ni
veles de espermidina como de RNAson a1tos,mientras que en
las cepas TAU"st" (donde no hay sintesis de RNA)los nive
les intracelulares de espermidina se mantienen muybajos.
Cuando las cepas de Escherichia coli TAU"st"
sometidas a un ayuno de arginina, se cultivan en presencia
de estreptomicina ( 48, 49 ) las bacterias se comportan
como"relaxad'yse observa nuevamente estimulación de la sin
tesis de RNAque es acompañada por un incremento en los ni
veles de espermidina. Resultados similares se obtienen cuan
do se trabaja con cepas TAU"st" ( 48 ) sometidas a ayuno de
arginina, pero desarrollados en presencia de espermidina,en estos casos la presencia de la poliamina en el medio de
cultivo hace que se sintetice nuevamente RNA.Para determinar si los niveles altos de RNA
provocaban acumulación de espermidina, o viceversa, Cohen
utilizó mutantes TAU"rel" cultivadas en ausencia de argi
nina y de uracilo. En estas condiciones se provoca la inhi
¡.4 UI
bición de la sintesis de RNAy se encontró que la sintesis
de espermidina no era afectada. Esto hizo pensar que son los
cambios en los niveles de espermidina los que producen alteraciones de la sintesis de RNA.La conclusión anterior fue
posteriormente ratificada por Cohen, trabajando con mutantes
de Escherichia coli deficientes en potasio ( 34 ).
Estas bacterias en medios ricos en Na‘Fpero
deficientes en K+y purinas ( condición de no crecimiento ),
detienen la sintesis de RNA,pero mantienen inalterada la
Velocidad de sintesis de la espermidina.
Los trabajos efectuados por Raina y Cohen
fueron seriamente criticados por Maasy Srinivasan ( 52 ),
debido a que en las experiencias descriptas por los primeros
los niveles de poliaminas utilizados eran bastante superiores a las concentraciones fisiológicas.
Maas y Srinivasan trabajaron con cepas mutan
tes de Escherichia coli auxótropas para putrescina y demos
traron ( 50 , 51 ) que las poliaminas actuaban en forma in
directa sobre la sintesis del RNA,posiblemente contrarrestando el efecto de algunos inhibidores de dicha sintesis ypermitiendo de esta manera una mayor acumulación del RNA.
Acción de las poliaminas en la sintesis proteica
El hecho de que las poliaminas se encuentran
formando complejos con las distintas clases de RNA,tanto
mensajero comode transferencia y ribosomal llevó a pensar
que estas sustancias, podrian desempeñar un papel muy im
portante en 1a regulación de la sintesis proteica ( 53, 13 ).Experimentosrealizados en varios laboratorios
( 54 - 58 ) demostraron que a concentraciones subóptimas
de Hg*+, las poliaminas eran capaces de aumentar la incor
poración de aminoácidos marcados, cuando se usaba sistemas
libres de células con RNAmensajeros artificiales.
Otros investigadores trabajando con espermi
dina y espermina ( 55 ), demostraron que estas sustancias
eran capaces de producir errores de lectura cuando se usaba
poli U como mensajero.
Posteriormente Takeda ( 60 ) demostró nueva
mente, pero trabajando con mensajeros naturales ( RNAmen
sajero de MS-2 ) que las poliaminas eran capaces de dismi
nuir los niveles óptimos de magnesio, para la sintesis dela proteina capsular del virus.
Hurwitz ( 58 - 59 ) demostró que las concentra
ciones de magnesio intracelulares, eran demasiado bajas con
respecto a los niveles utilizados para la sintesis de pro
¡.1 U1
teinas'ïn vitro". Por esta razón se postuló que "in vivo"+se usan tanto el Mg+ como las poliaminas ( en especial 1a
espermidina ) en 1a biosintesis proteica.
Acción qe las poliaminas en la activación del RNAggtransferencia
La primera etapa en la sintesis proteica es
la activación de aminoácidos y 1a formación de complejos
aminoacil tRNA( 61 ). Esta etapa sumamenteespecifica de
termina en gran parte 1a fidelidad de la copia del mensaje
( que depende de una reacción de reconocimiento entre el
codón del RNAmensajero y el anticodón del tRNA ).
La reacción clásica por 1a cual le sintetizael aa-tRNA os la siguiente: ( 62 - 63 )
a) aa + ATP + Enzima.:::3’ Aminoacil —AMP- enz. + PPi
b) Aminoacil - AMP- enzima + tRNA.;_: Aminoacil -tRNArAHP+enz.
Existen una serie de evidencias que apoyan
este mecanismo,en especial el hecho de poder aislar el
complejo aminoacil-AHP-enzima en columnas de sephadex, y
que este complejo asi aislado pueda transferir su aninoácidoal tRNAcorrespondiente.
Allende y cul. ( 63 ) estudiaron esta reacción
y observaron que tanto para la formación del complejo
AA-AMP+ Enzima. como para 1a transferencia del aminoácido
a1 tRNAera necesaria la presencia de niveles altos de Mg++.
Posteriormente, analizando 1a reacción de trans
ferencia ( b ), ellos demostraron que el Mg++podia ser reem
plazado por espermidina, sin que se alteraran los nivelesde AA - tRNA formado ( bb - 66 ).
En 1972 Eldret ( 64 ) estudió más a fondo esta
reacción, postulando 5 etapas.
1) aa + ATP + Enzima < Ï’anima —ATP - aaA
2) Enz - ATP - aa <r__i_Ï Enz - aa - AMP+ PPi
3) Enz - aa- AMP+ tanan —aa - AMP- tRNA
4) Enz - aa — AMP - tRNA G___7l:;nz -—aa — LRNA + AMP B
5) Enz — aa - tRNA ‘Ïj’Enz o aa — {RNA
La reacción A ocurre rápidamente, mientras
que 1a reacción B es muchomás lenta y por lo tanto limi
tante. Por otra parte ya se sabia que la formación del com
plejo AA- AMP—Enzima podía determinarse indirectamente
por agregado de 32PPi exógeno. De esta manera se detecta
la reacción inversa por formación de ATP(32P), aminoácido
y enzima.
El mecanismopropuesto anteriormente fue seriamente objeta
do por Loftfield ( 74, 67 ), quién propone un mecanismo con
certado en el que reaccionan el aminoácido, la enzima, ATP
y el tRNAsimultáneamente sin formación de complejo
AA- AMP- Enzima intermediario.
Igarashi y Pastuzyn ( 72 - 73 ) demostraron
que en presencia de eSpermidina o espermina es posible ob
tener aminoacil - tRNAen ausencia de MgH y sin la forma
ción del complejo intermediario. Estos hechos apoyaron la
teoria de Loftfield, quién también refirmó su hipótesis con
el siguiente experimento ( 67 ): si se usa una mezcla de
reacción que contiene complejo ( AA- AMP- enzima ) radiac
tivo marcado con 14€ en el aminoácido, espermina, ATP,
aminoácido libre marcadocon tritio, y una cantidad limitan
te de tRNA,1a mayoria del aa- tRNAque se forma proviene
del aminoácido libre o sea de aquél que no está formando
complejo. De esta manera se concluye que en presencia de
poliaminas el mecanismo que predomina es el de tipo concerntado.
Los experimentos de Loftfield son criticados
por otros investigadores ( 68 - 69 - 70 ), quienes argumen
tan que en las experiencias descriptas en presencia de esper
mina y ausencia de magnesio, existia contaminación por el
magnesio complejado por el tRNA. Ellos postulan que las
poliaminas actuarian desplazando al magnesio del tRNAy
permitiendo que el magnesio liberado pueda actuar en 1a
reacción de aminoacilación del tRNA.
Otros experimentos ( 71) indicaron que el
EDTAusado para la eliminación total del magnesio de las
preparaciones de tRNAactuaba inhibiendo la enzima encar
gada de formar el aminoacil tRNA.
Se debe mencionar también que Cohen ( 34 ),
ha demostrado usando bromuro de etidio la presencia en la
molécula de tRNAde sitios de unión limitados y especifi
cos para las poliaminas.
Todos los hechos mencionados parecen señalar
que las poliaminas están unidas al tRNAy participan ( po+siblemente junto con el Mqf en la reacción de activación
de aminoácidos.
Interacción de las poliaminas con los ribosomas
Antes de entrar a analizar 1a relación de las
poliaminas con el ribosoma, creo necesario definir dichas
estructuras dondese realiza 1a sintesis proteica.
Los ribosomas son particulas macromoleculares
formadas por RNAy proteinas ( 88 ). Estas particulas seclasifican de acuerdo a su coeficiente de sedimentación:
en procariotes se aislan ribosomas con coeficiente de se
dimentación 70 S, que pueden disociarse en dos subunidades
más pequeñas de coeficientes 30 S y SO S.
A partir de organismos eucariotes se aislan
ribosomas 80 S que pueden dar lugar a subunidades 40 S y
60 S.
Si se analiza más a fondo la composición de
las subunidades de bacterias se puede determinar sus compo
nentes: La subunidad 30 S está compuesta por una molécula
de RNAde coeficiente de sedimentación de 16 S (PM 0.55 x 106)
( 80 - 82 ) y 21 proteinas ( 83 ). Por otra parte de la sub
unidad SO S, se aislan dos moléculas de RNA, una de S S
( pu a 4 x 104 ) y otra de 23 s, (PM - 1,1 x 106 ) y 34
proteínas ( 84 , 91 ).
Hace algunos años se creía que los ribosomas
desempeñabanun papel pasivo en la sintesis proteica; hoy
se sabe que dichas particulas ademásde servir de soporte
a la sintesis proteica, intervienen en forma activa y directa en 1a regulación de dicha sintesis.
Podemosenumerar las siguientes funciones ri
bosomales en el proceso de traducción:
I) Reconocimiento y unión del RNAmensajero por la
II
III
IV
V
V
)
V
V
subunidad 30 S ( 89 - 91 ). En esta etapa intervie
ne un factor proteico llamado IF 3 ( 93, 94 ), que
confiere especificidad a la unión entre la subparticula ribosomal y el mensajero.Existencia de dos sitios de unión en el ribosoma
( 84, 92 ), para el aminoacil tRNAy el peptidil
tRNA. Estos sitios se denominan A y P respectivamente.Formación de la unión peptidica: Es 1a reacción que
involucra la formación de la unión entre el peptidil
tRNA( unido a1 sitio P ) y el aminoacil tRNA ( unido
a1 sitio A ). En esta reacción el peptidil tRNAcede
el péptido al aminoacil tRNAproduciéndose una cadena
polipeptidica con un aminoácido más y la simultánea
hidrólisis de GTP( 84, 91 ). En 1a formación del
enlace peptidico participa una o más proteinas presentes en la subunidad 50 S, que se conocen con el
nombrede peptidil transferasas ( 96 -97 ).
Control de la fidelidad de lectura del RNAmensajero( 95 ).
Translocación:
Se conoce con este nombre a 1a etapa en la cual el
ribosoma, mediante un cambio conformacional se des
plaza a lo largo del RNAmensajero. De esta manera que
da expuesto un nuevo codón en el sitio A del ribosoma
y el peptidil tRNApasa a1 sitio P, con 1a consecuente
liberación del tRNAdeacilado ( 98 ).
Cuandose analizan extractos bacterianos se.encuentran ribosomas en varias formas: unidos a complejos
polisómicos, como monómoros libres o como sununiaades 30 S
y 50 S.
Los monómerospueden ser de tres tipos: de
terminación, que se forman por asociación de las subunida
des libres, los monosomasde iniciación y los que se produ
cen por la ruptura de los polisomas, y por lo tanto tienen
unidos trozos de RNAmensajero y peptidil tRNA.
La distribución de los diferentes tipos ribo
somales aislados depende del método de extracción ( 99, 100,
105 ) y de la etapa de crecimiento en que se encuentre elcultivo bacteriano ( 101 ).
Los ribosomas participan durante la sintesis
de proteinas de un ciclo que se puede esquematizar de la
siguiente manera ( 101 - 104 ).
I‘J PJ
CICLO RIBUSDMAL
0AA |./ fi (RNA¿5,3 MM” 305\Q\
o lo 505Yte};\éRIVA-n
P - Proteina
DF = Factor de disociación
AF = Factnr de asociación
F1 Factor de iniciación
f2 ; Factor de iniciación
Los monómerosribosomales representan entre
el 15 y el 20 1 del total de la fracción ribosomal y se
encuentran en un equilibrio dinámico con las subunidades.
Este equilibrio está fuertemente desplazado hacia los mo
nómeros. El papel fisiológico de estas particulas es muy
discutido; algunos autores las consideran una reserva que
la célula puede utilizar cuando se requiere una mayor sintesis proteica.
Se ha aislado un nuevo factor a partir de
Bacillus stegígthermophiluï ( 85 - 87 ) que posee 1a capacidad de desplazar el equilibrio 70 52::subunidades ribo
sómicas hacia el monómero.Este factor,que también ha sido
encontrado en células animales ( 134) podria intervenir
activamente en el ciclo ribosomal y se ha demostrado que
contiene poliaminas ( 86 ).Estas sustancias confieren estabilidad a los
ribosomas y aumentan 1a relación monómeros/ subunidades.
En 1960 Cohen ( 30 ) demostró la presencia
de putrescina y espermidina en la fracción ribosomal de
lisados de Escherichia coli. Aproximadamenteel 15%del
total de la poliamina endógena estaba unida al ribosoma,y esta localización no se debia a una redistribución delas sustancias posterior a la lisis celular.
Cohen ( 30 ) también comprobó que cuando los
extractos bacterianos se preparaban en medio acuoso los
monómerosribosomales desaparecian y solamente se encon
traban las subunidades de bajo coeficiente de sedimentación. Cuandolos extractos se obtenían en medios acuosos
pero en presencia de magnesio o de espermidina nuevamente
reaparecian los monómeros.
Stevens ( 106 , 108 ) demostró que contraria
mente a los resultados de Cohen, debia existir un gran in
tercambio entre las poliaminas unidas al ribosoma y el me
dio de extracción. Este intercambio dependía de las carac
teristicas iónicas del medio y aumentaba a mayor fuerzaiónica.
Los estudios de Stevens ( 107 ) con Bacillus
stearothermoghilus cultivados a 45 - 55 y 65 oC indicaron
que la mayor cantidad de poliamina unida a ribosomas pro
venia de los cultivos desarrollados a 65 0C, aún cuando a
esa temperatura la concentración total de poliamina intracelular era la menor. Ademásse encontró que los ribosomas
aislados de los cultivos a 65 oC ( que solamente se diferen
ciaban de los aislados a 45 y 55 oC en la concentración de
poliaminas ) eran muyestables a la desnaturalización térmica.
Cuando los ribosomas aislados de Bacillus
stearothermophilus se dializaban contra soluciones de
naran)a de acridina ( que sv une a los ácidos nuclelcos ),
este colorante se unia a los ribosomas aunque no era capaz
de desplazar la espermidina presente en los mismos. Por
otra parte, si un experimento similar se realizaba con RNA
ribosomal al cual se le habia unido espermidina, el colo
rante era capaz de desplazar a la poliamina. De esta manera
se puede concluir que posiblemente las poliaminas unidas al
ribosoma están protegidas, evitándose su desplazamiento.
Hiess y col. ( 110 - 113 ) estudiaron más a fondo la rela
ción entre los niveles de magnesio y espermidina en los
ribosomas de Escherichia coli. Estos investigadores demos
traron por medio de diálisis que la espermidina es capaz
de desplazar al magnesio del ribosoma sin alterar la carga
neta de la particula. Cuando la eSpermidina reemplaza más
* en el ribosoma, estas particulas pierdendel 70% del "9*
su capacidad de sintetizar polifenil alanina en sistemas" in vitro ". Por lo tanto parece requerirse un minimodel
30%de magnesio para mantener las caracteristicas estruc
turales y funcionales del ribosoma. Por desplazamiento de
más del 70%del MgH en las particulas ribosomales, eÉtas
pierden proteinas, sufren alteraciones del coeficiente desedimentación y se vuelven más sensibles a 1a RNAsa.
Se ha postulado ( 114 ) la presencia de dos
sitios hábiles para la unión de cationes a los ribosomas
de higado de rata, y de tres sitios para los de Escherichia
fl< 111-113).El sitio 1 en los ribosomas de Escherichia
ggli, estaria ocupado únicamente por el ión Hg++y corres
pondería a1 catión necesario para mantener las caracteris
ticas funcionales y estructurales del ribosoma; en el caso
especifico de los ribosomas de Escherichia coli, el magne
sio presente en el sitio I podria ser reemplazado por HnÏ+
Esto no ocurre en los ribosomas aislados de higado derata ( 114 ).
El sitio II podria unir los cationes divalentes y las poliaminas. El sitio III estaria ocupadopor
cationes monovalentes como el Na+, NH+ y sobre todo por4
el potasio ( K+ ). Aunqueeste sitio también podria ser
* y las poliaminas, se considera queocupado por el Hg‘
seria necesario un nivel minimo de iones monovalentes y
en especial de K‘ , para que los ribosomas puedan funcio
nar activamente en 1a sintesis proteica ( 115 - 116 ) .
Medianteel estudio de cultivos de Bacillus thuringiensis,Igarashi ( 117 ) ha realizado las siguientes observaciones:
1) Los ribosonas de Bacillus thuringiensis en desarrollo logaritmico son muchomás activos en sintesis
proteica "in vitro" que las particulas ribosomalesde bacterias en fase estacionaria.
II) La carga catiónica neta de los ribosomas obteni
dos de bacterias en crecimiento logaritimico es
mayorque la carga de las particulas de célulasen fase estacionaria.
III) El incremento de la carga neta catiónica de
ribosomas, durante la fase logaritmica de crecimiento bacteriana se debe a un aumento de la
concentración de poliaminas. En cambio el nivel
de magnesio varia muypoco durante las distintas
etapas del crecimiento. Estos hechos y la posibi
lidad de reemplazar aunque sea parcialmente al
magnesio, indican la importancia de las poliami
nas presentes en los ribosomas y el papel funda
mental que estas sustancias desempeñanen la sin
tesis proteica.
Relacién de la; pgliaminas con la unión del aminoaciltRNA al ribosoma
Takeda y col. encontraron que existe una
intima relación entre los niveles de magnesio y poliaminasy la unión del aminoacil tRNAal ribosoma ( 75 ) . Es
bien conocido que la unión del aninoacil tRNAal ribosoma
requiere niveles altos de magnesio ( 76 —77 ).
El hecho de que las poliaminas ( 75 ) sean
capaces de diSminuir los niveles óptimos de magnesio para
esta reacción de unión al ribosoma, conjuntamente con las
observaciones de Hurwitz ( 58 ),de que los niveles intrace
lulares de magnesio no son suficientes para obtener una ca
pacidad máximade unión, hacen suponer que "in vivo" las
poliaminas puedensustituir parcialmente al magnesio en estareacción.
Tanner demostró trabajando con levaduras ( 78
que en este caso las poliaminas, ademásde estimular esta
reacción de unión a concentraciones subóptimas de magnesio,
eran un requerimiento indiSpensable para qUe dicha reacciónse llevara a cabo.
?9
Objetivos del trabajo
Él aislamiento de mutantes bacterianas en
la sintesis de putrescina ( SO- 51 ) ha permitido esth
diar mejor las funciones que las poliaminas desempeñanen 1a célula.
Nosotros trabajamos con una cepa dobye mu
tante de Escherichia coli K-12 auxótropa para poliaminas,
por lo cual necesita 1a presencia de espermidina o putres
cina en el medio de cultivo para crecer normalmente.
Esta cepa tiene dañadas las enzimas orniti
na decarboxilasa y agmatina ureohidrolasa, por lo cual los
dos caminos metabólicos para la sintesis de putrescina se
encuentran bloqueados ( esquema página 3 ). La actividad
de 1a enzima ornitina decarboxilasa presente en 1a mutante
es aproximadamente un 2 1 de 1a actividad de 1a enzima de
bacterias normales. Por otra parte, la agmatina ureohidro
lasa tiene sólo 4 %de la actividad correspondiente a laenzima normal.
El hecho de que esta mutante necesite la pre
sencia de poliamina en el medio de cultivo para crecer nor
malmente, y ia caracteristica de las poliaminas de actuar enpequeñas concentraciones determina.que esta cepa deba sometersea un proceso de ayuno para disminuir los niVeIes intracelu
30
.lares de poliaminas; solamente después del ayuno las bac
terias requieren poliaminas para su crecimiento.En estas condiciones es posible estudiar el
rol fisiológico de estas sustancias y analizar su participación en distintos procesos metabólicos.
El objeto de este trabajo consiste en relacionar la capacidad de las poliaminas para asociar subuni
dades ribosomales y su posible intervención, tanto en la
biosintesis y ensamblado de los ribosomas, comoen las di
ferentes etapas de la "traducción".
MATERIALES Y METODOS
31
Materiales x métodos
En todos nuestros experimentos se trabajó
con Escherichia coli HA-261que es auxótrofa para Treonina,
Leucina, Serina y Tiamina Esta cepa es además una doble
mutante que tiene dañadas las enzimas Agmatina Ureo-hidrolasa
(AUH‘)y la Ornitina decarboxilasa constitutiva (ODC-), lo
que determina un requerimiento exógeno de putrescina para
crecer normal-ente ( S. Cunninghan, H. Haas. En prensa ).
Medios de cultivo
A) Medio sólido:
Bacto nutrient broth 0,8 g
Na C1 0,5 g
Agar 2 g
Se mezcla,posteriormente se disuelve en 100 m1 de aguadestilada.
B) Medio liquido MMO:Contiene por litro los siguientes
componentes:
Sol. b = 40 m1
Glucosa 20% a 24 m1
Tiamina 0.5 mg / nl = 8 m1
Biotina 0.5 mg / m1 = 20 m1
Sol. de aminoácidos 2,5 mg / m1 a 40 m1
Ornitina 2.5 mg/ml = 40 m1
Sol. a ( sales) z HK2 PO4 = 87,5 g
H2 Kpo4 a 37,5 g
3H2 0 Na3 Citrato a 6,24 g
Se disuelve en 500 m1 de agua destilada
Sol. b ( sales ): Mg (SOA 7H20 1,25 g
(NH4)2 (so)4 12,5 g
Se disuelve en Soo m1 de agua destilada
Sol. de aminoácidos:
Leucina, Treonina, Serina, Hetionina.
Glicina en una concentración de 2,5 mg/ml de c/uno.
C) Medio liquido MMA:Posee los mismos componentes que el
medio MMOexcepto que se le agrega 40 ml de Arginina
( Smg/ml)por litro de medio cultivo en lugar de ornitina.
33
D) Egdio liguido MHOP:
Contiene los mismos componentes que
el medio líquido MMOcon el agregado de 40 m1 de putrescina
( 2,5 mg/ml ) por litro de medio cultivo ( putrescina diclohidrato ).
Reactivos:
Los reactivos utilizados en los di
ferentes experimentos son los siguientes: sacarosa (libre de
ribonucleasa) adquirida en Schwarz-Mann;putrescina diclor
hidrato de Schwarz-Mann;espermidina triclorhidrato y esper
mina tetraclorhidrato de Sigma; cloranfenicol de Parke Davis;
rifampicina de Lepetit; ácido poliuridllico y RNAdel fago
MS-2de Miles; RNAde transferencia de Escherichia coli de
General Biochemicals; las sustancias radiactivas leucina
14€, fenilalanina 14C, uracilo 14C, espermidina 14€, valina1 144C, metionina C y metionina 3H se obtuvieron en New
England Nuclear Corporation.
Crecimiento de las bacterias y método de axuno
A partir de una estria de Escherichia coli
HA-261desarrollada en medio A se inoculó medio liquido
MMO(B) y se dejó crecer. Luego se mantuvo el cultivo en
frio a 0 DC( hielo picado ) durante varias horas, proce
dimiento que produce la eliminación de putrescina de la
célula a1 medio,favoreciéndose de esta manera el ayuno. El
cultivo se diluyó posteriormente 50 veces con medio MMA(C)
y se dejó crecer a 37 9C durante la noche; el crecimiento
en este medio liquido produce un aumento considerable de
la población bacteriana. Nuevamentese realizó una dilución
1 : lO del cultivo anterior con medio fresco MMOdejándose
crecer hasta obtener una población bacteriana de 2 a 3 x lO8células /m1. Este cultivo se utilizó mediante dilución 1 : 3
en MMOy MMOP(D) para preparar los cultivos finales. En
esta etapa y en el medio MMOse puede observar que el nivel
intracelular de poliaminas ha disminuido en forma tal que
la bacteria requiere el agregado exógeno de poliaminas para
crecer normalmente. Se sabe que mediante este método de a
yuno los niveles de putrescina intracelulares disminuyen
100 veces, mientras que los de espermidina se reducen aproximadamente a la mitad (5o -51).
Todos los cultivos se efectuaron a 37 QCdu
rante 1a noche, con buena aereación. El crecimiento bacte
riano se determinó espectrofotométricamente a una longitudde onda de 550 nm.
Pregaración de 1159995bacterianos
Los lisados bacterianos, se prepararon a
partir de cultivos en crecimiento logaritmico. Las célulasse cosecharon después de un enfriamiento lento, ( 15 minu
tos a temperatura ambiente y 15 minutos en hielo picado )
de manera tal que se completa 1a sintesis proteica, acumu
lándose de esta forma los monómerosde terminación, e im
pidiéndose una nueva reiniciación por 1a baja temperatura.
Las bacterias se sedimentaron por centrifu
gación a 3.500 xg durante 10 minutos y se resuspendieron
en 0,2 m1 de sacarosa 25% en buffer Tris-HCI IOmMpH 7,8
óOmHKCl ( la sacarosa usada es libre de ribonucleasa).
Se agregó posteriormente 50 pl de una mezcla ( 1 : 1 ) de
lisozima ( Sigma 10 mg/ml en buffer 0,25 mHTris-HCl
pH7,8) y_8mMEDTA.dejándose a 0 QC durante S minutos; se
agregó lueqo Spl de acetato de magnesio 1My se congeló y
descongeló dos veces en nieve carbónica-acetona. Después
de dejar descongelar en agua fria se agregó 25p1 de deoxi
colato de sodio ( 25 mg/nl ) en buffer lOmHTris HCI pH7.2,
manteniendo por 10 minutos a 0 QC, y luego se añadió QPI
de DlAsa t 2,5 mg/mi ) . Después de 5 minutos a 0 QC, se
agregó 0,2 mi de buffer 20 mHTris HCl pH 7,8 , lOmHaceta
to de magnesio, SOmHKCl y se centrifugó a 7.000 xg.
Se tomaron alícuotas de los sobrenadantes a los que se le:
midió la concentración ribosomal por espectrofotometria deabsorción a 260 nm.
Pregaración gg extractos bacterianos y distintggifraccionggsubcelulares Eor molienda.
Cultivos bacterianas en crecimiento logaritmico se cosecharon por enfriamiento lento; las células se
sedimentaron por centrifugación a 3,500 xg y se lavaron
una vez con buffer lOmMTris-HCI pH7,8-,60mM NH4C1, 5mm
acetato de magnesio*y6mMmercaptoetanol ( buffer de molie!da). Todas las operaciones se realizaron a 0-4 QC. La
ruptura celular se hizo mecánicamente, moliendo las bac
terias durante 5 periodos de 1 minuto cada uno con el
doble de su peso de alúmina, y resuspendiendo 1a mezcla
con buffer de molienda ( 3 a 4 m1/grano de peso húmedo
de bacterias ). Luego se centrifugó a 20.00039 durante
15 minutos, recogiendo el sobrenadante a1 que se le agregó
DNAsa( 3pg/m1 ), dejando en reposo por 5 minutos. Se cen
trifugó nuevamente a 30.000xg durante 20 minutos con lo quese obtuvo 1a fracción sobrenadante llamada ( 5-30 ). El
sobrenadante ( 8-30 ) se sometió a una diálisis durante
5 horas contra 1000 volúmenes de buffer de molienda.
Los sobrenadantes ( 5-150 ) se obtuvieron
a partir de los ( 8-30 ) dializados sometiéndolos a una
centrifugación a 150.000xg durante 240 minutos. El sobre
nadante se recogió en dos fracciones: una correspondiente
a los 2/3 superiores y la otra al 1/3 inferior. El sedimen
to que contiene los ribosomas se resuspendió cuidadosamente
en 0,2 m1 de buffer de molienda.
Las fracciones 8-30, 5-150 y los ribosomas
resuspendidos se conservaron congelados a -709C. De esta
manera se mantienen activos durante por lo menos variassemanas.
Análisis de 1a distribución ribosomal
Gradientes analíticos
Los extractos celulares obtenidos por los
métodos de lisis o de molienda, se analizaron por ultra
centrifugación en gradientes lineales de sacarosa de 15
a 40% ( P/V ) en buffer Tris HCl, pH 7,8, 20 mM, acetato
de magnesio lOmM, KCl SOmH.Se sembraron aproximadamente
0,6 UDO260nmen un volumen total de 0,2ml de los extrac
tos celulares sobre los gradientes de 4,6 m1y se centri
fugó durante 90 minutos a 45.000rpm en un rotor Spinco
SH65. Los gradientes se analizaron por absorción a 2S4nm
en un espectofotómetro ultravioleta con celda de flujo con
tinuo ( ISCO);el cantenido de los tubos de centrífuga se
hace pasar por la celda inyectando sacarosa al 50%en el
fondo del gradiente.Para distinguir monómerosde terminación de
los monosomasse usaron gradientes de sacarosa de 15 a 40%
en una solución buffer de igual composición que la descrip
ta anteriormente pero que contenía SOmMde NaCl en lugar
de KCl.
Gradientes preparativos
79
Para obtener cantidades relativamente grandes
de subunidades se utilizó gradientessacarosa de 10 a 30% ( sacarosa Mann
"buffer" similar a] de molienda pero
de magnesio. Se sembró 0,2 m1 de una
lineales de 12 ml de
libre de RNAsa) en un
con 0,1 mMde acetato
muestra que contenía
aproximadamente 40 UDO260nm de una suspensión de ribosomas
previamente dializados durante 4 horas contra 1000 volúmenes
de "buffer" de molienda con 0,1 mMde acetato de magnesio para
lograr la disociación completa, y se centrifugó los gradientes a 35.000xg durante 360 minutos en un rotor sw-40 Spinco.
Posteriormente los gradientes se fraccionaron por aspiración
desde el fondo usándose para esto una bomba Desaga. Se re
cogieron fracciones de aproximadamente 0,3 m1que se analizaron midiendo su absorción a 260 nm.
Las fracciones correspondientes a cada subuni
dad se juntaron y se dializaron contra 1.000 volúmenes de
"buffer" de molienda durante 24 horas y luego se guardaron a
Todas las diálisis se efectuaron a 4
Análisis del RNAribosomal.
Subunidades purificadas obtenidas de
9C.
cultivos
C'J
bacterianas desarrollados en medios MMOy HHOP ( 0,3 UDO
260nm de particulas SOSo 0,2 UDO260nm de 308 ) se trata
ron con sodio dodecil sulfato ( SDS) a concentración final
de 2% y EDTA15 nn, durante 3 minutos a 37 9C;de esta ma
nera se puede liberar el RNAribosomal ( 125 ). Las mues
tras se sembraron luego sobre gradientes lineales de saca
rosa 15 a 40%en buffer Tris lmH, acetato de magnesio lun
y se centrifugaron 240 minutos a 45.000rpm en un rotor
SW50-1. Los gradientes se analizaron midiendo la absor
ción a 254 nmpor pasaje a través de una celda de flujo
continuo comoya se ha descripto.
Disociación de los ribosomas
Para estudiar el estado de los ribosomas adiferentes condiciones iónicas se analizaron los extractos
celulares por ultracentrifugación en gradientes de sacarosay se calculó el porcentaje de disociación en base a la relación de alturas o áreas de los picos correSpondientes alas particulas SOSy 703.
14Union de las poliaminas ( espermidina C)a los ribosomas
En estos experimentos se utilizó la técnica
de equilibrio de diálisis, trabajando con tubos de diálisisVisking previamente lavados ( 120 ).
Muestras de 0,4ml que contenían 4 a 5 UDO260nm
de ribosomas en buffer 10 mn Tris-Hcl pH 7,8, 50m! KCl SmH
acetato de magnesio y2mHmercaptoetanol se dializaron duran
te 24 horas a 4 OCcontra 30m1 del mismo buffer al que se1habia agregado espermidina 4C ( 0,5 pCi ) 1mm. La unión
14€ a1 ribosoma se determinó tomandode la espermidina
muestras de SOpl de 1a solución externa y del interior de
la bolsa de diálisis ( por triplicado ), las que se contaron en un espadrómetro de centelleo liquido,previo agregado de
agua(0,2m1)y 3 ml de solución de Bray.
La cantidad de poliamina unida se determinó
a partir de la diferencia entre la radiactividad dentro yfuera de la bolsa de diálisis considerando que una unidad
de densidad óptica a 260nmde ribosoma 705 equivale a
Z3 picomoles ( 1?? )
La determinación del RNAse hizo por el
método del OrcinOI ( 123) y la de proteinas por el de
Lowry ( 124 ).
Sintesis de RNAy proteinas en células enteras
Un cultivo de Escherichia coli HA-261
previamente sometido a un ayuno de putrescina se cen
trifugó a 3.000xg durante 10 minutos a 15 QC.
El sedimento de células se resuspendió en
medio MMOlibre de leucina y se reinició el crecimientobacteriano hasta alcanzar una concentración de 108 célu
las por m1 .
Se tomaron alícuotas de 10m1que fueron
incubadas en presencia o ausencia de putrescina, con el
agregado correspondiente de precursores radiactivos.Para los estudios de cinética de síntesis
de RNAse añadiá uracilo 14C ( 14PM,O,1 pci/m1 ) y leucina
5 pM. Después de diferentes periodos de tiempo se tomaron
muestras de lml y se precipitaron con ácido tricloroacéticoal 6% ( concentración final ) frio, dejando a 0 QCdurante
30 minutos. El material insoluble se recuperó por filtración en nillipore, lavándose varias veces con TCAfrio a1
5%. Los filtros millipore se secaron y se determinó 1a
radiactividad en un contador de centelleo liquido ( Previo
agregado de una mezcla centelladora que tiene 1a siguiente
composición: 4g de omnifluor en un litro de tolueno ).
h?
En 1a cinética de sintesis proteica se
14€ ( 5 pH, 0,1 pCi/ml ) y se procedióagregó Leucina
camoen el caso anterior, pero calentando durante lS
minutos a 90 QCdespués de la precipitación con TCA,
con el fin de producir la hidrólisis de los aminoaciltRNA.
Transporte de uracilo y leucina
Cultivos bacterianas que fueron sometidos
a un ayuno de poliaminas se incubaron en medio MMOo en
medio HHOPque contenían ZOQPg/mlde rifanpicina y
u4uH, 0,1 PCi/nl ) de uracilo 14€ para medir el transportede uracilo.
Cultivos paralelos de estas bacterias también previamente ayunados se incubaron en medio HHOo en
medio MHOPlibres de leucina. con cloranfenicol ( 200 pg/ml
y leucina 14€ ( S PM, 0,1 Pci/nl) para medir el transportedel aminoácido radiactivo. En todos los casos los precurso
res marcados se agregaron después de preincubar los culti
vos durante S minutos a 37 QCcon los correspondientesantibióticos.
lol;
Posteriormente se tomaron alícuotas de 1 m1
1adistintos tiempos y se filtraron inmediatamente por
millipore, lavándose luego con 5 m1de medio de cultivo
a temperatura ambiente. Se secaron los filtros y se determinó la incorporación a las células totales en un con
tador de centelleo liquido.
Sintesis de polifenilalanina con ácido oiiuridilico,__.__, _ .7 _________JL___________
como RNAmensajero.
Para los experimentos en que se determinó
la sintesis de polifenilalanina se utilizó una mezcla dereacción de 0,1 ml con la siguiente composición: buffer
Tris-HCI pH 7,8 so mM, ATP lmM, GTP 0.02mM psp SmM,
piruvato quinasa 3 Pg, cloruro de amonio 70m", 40 lPg deRNAde transferencia, 0,05 pCi de fenilalanina 14€,
0.01mM, 50 Pg de poli U, acetato de magnesio y S-30 enlas cantidades indicadas para cada experiencia. El 5-30
en algunos experimentos fue sustituido por ribosomas y
5-150. En todos los casos antes de agregar el poli U,
se preincubaron las mezclas de reacción a 37 QCdurante
3 minutos. Después del agregado del RNAmsintético se con
tinuó la incubación a 37 QCdurante los tiempos indicados
para cada experimento. La reacción se detuvo por el agre
gado de TCA( concentración final 6% ) frio, luego se ca
lentó durante 15 minutos a 90 QC, se filtró a través de
millipore y se lavó tres veces con TCAa1 5%frlq,y 1aradiactividad insoluble se determinó en un contador de
centelleo liquido.
Formación de fenilaignil tRNA
Para medir la formación de fenilalanil tRNA,
se usó una mezcla de reacción similar a 1a descripta ante
riormente en la cual se omitió el poli U., determinándose1a radiactividad insoluble en TCAa1 6%frio.
Sintesis de Egoteinas "in vitro" usando cono mensajeronatural RNAdel fago MS-2
La sintesis proteica con mensajero natural
se realizó en una mezcla de reacción de 50 pl con lasiguiente composición: buffer Tris HCl 50 mM,pH 7,8,
UI
cloruro de amonio 60 mH, PEP SMN, ATP ImM, GTP 0,02 mn
piruvato quinasa 30 pg/ml 19 aminoácidos ( 0,025 mH )
de cada uno, 0,5 pCi de valina 14€ ( 0,061 mn J,
0,25 UDO 260 nm de RNA del fago MS-Z y 1 UDO 260 nm
de sobrenadante S-3O previamente preincubado como sedescribe a continuación.
La preinCubación se realizó de 1a siguientemanera: 100 UDO260 nm de fracción 5-30 de cultivos bac
terianas ayunados y desarrollados en medio MMOo HMOPse
incubaron a 34 QCdurante 7 minutos con 0,02 volúmenes
de Tris-HCI 2M, pH 7,8 y 0,1 volumen deuna mezcla de ener
gia que contenía PEP SOmM,piruvatoquinasa 300 Pg/ml,ATP 10 mMy GTP 0,2 mn. Después de esta preincubación
se agregó 0,5 volúmenes oe sobrenadante 5-150 proveniente
de un cultivo bacteriano desarrollado en presencia de poliamina. Las concentraciones de acetato de magnesio usa
das fueron las indicadas para cada experimento. La reac«
ción de sintesis proteica se detuvo por el agregado de
TCAal 6%en frio, luego se calentó durante 15 minutos
a 90 QC, y se filtró a través de millipore lavándose 3veces con TCAa1 5%frio. La radiactividad insoluble se
determinó en un contador de centelleo líquido.
Formación del complejo de iniciación
La formación del complejo de iniciación se
realizó en dos etapas; en 1a primera de ellas, cuya fina3H tRNA se usóíidad es la formación del formilmetionil
una mezcla de reacción de 50 P1 cuya composición es 1a
siguiente: Tris-acetato lOOmM, pH 7,2, ATP 3mm, acetato
de magnesio lOmM, KCl 10 mM, tRNA de Escherichia coli 0,16 mg,
leucovorina 5 pg, sobrenadante 5-150 ( obtenido de cultiá
vos en medio MMOP) equivalente a 0,26 mg de proteina y
4 PM de metjonina 3H ( 2 PCi ) . Esta mezcla se incubó
a 37 QCdurante 20 minutos, luego se enfrió a.09 y se
agregó una mezcla de 50 y] que contenía 1 UDO260 nm de
sobrenadante 5-30 ( proveniente de cultivos bacterianos
ayunados y desarrollados en medio MMOo MMOP) preincubado
comose describió para 1a sintesis proteica con mensajero
natural, cloruro de amonio 100 mM,acetato de magnesio
8 mM, GTP 0,2 mM y 0,1 UDO260 nm del trinucleótido
AUG.
Después de incubar a 25 9C durante 20 minu
tos, se detuvo 1a reacción por el agregado en frio de 3 m1 de
buffer Tris-acetato lOOmM,pH 7,2, acetato de amonio 50 mMy
acetato de magnesio 20 mM. Posteriormente se filtró a
través de millipore, se lavó tres veces con el buffer an
terior y se determinó la radiactividad fijada a1 milliporeen un contador de centelleo liquido.
Formaciégqgeiugomglgig_deiniciación a partir de fornil14metionil C tRNApurificado.
Para 1a formación del complejo de iniciación
a partir de fornil netionil 14C tRNApurificada se uti
lizó una mezcla de reacción de 0,1 m1 que contenía los
siguientes reactivos: acetato de magnesio6nH, buffer
Tris-HCl 40mH, pH 7,2, cloruro de amonio SO mn, GTP 0,2mM,
AUG0.1 uno 260 nm, 2.200 cpm de 14c formil metionil
tRNA( SScpm/p.mol)y ribosomas en las cantidades indica
das para ceda experimento. Se incubó a 24 QCpor 20 minu
tos y 1a reacción se detuvo por el agregado en frio de
lml de buffer Tris-HCI 0,1 H pH 7,2, acetato de magnesio
ZOHH,KCl 50 mn, procediéndose luego como en el caso an
terior.
ULTADÜS
Requerimientos de putrescina para el crecimiento normal
de cultivos de Escherichia coli MA-261previamente some
tidos a un ayuno de poliaminas.
Varios investigadores han demostrado,
trabajando con diferentes cepas auxótrofas para poliami
nas, que en las bacterias sometidas a un ayuno de estas
sustancias los niveles intracelulares de putrescina seencontraban disminuidos 100 veces, mientras que los de es
permidina se reducian a la mitad ( 119 ). En estas con
diciones las bacterias dependen de] agregado exógeno de
poliaminas para crecer normalmente. La cap: MA-261de
Escherichia coli posee un comportamiento similar y por
lo tanto el agregado de putrescina a1 medio de cultivo
provoca, después de un periodo de 60 minutos, un incremento en 1a velocidad de crecimiento de dicha bacteria.
Fig. l.El tiempo de generación en varios experi
mentos fué de 180 a 300 minutos en cultivos en ausencia
de putrescina ( MMO), mientras que en presencia de estasustancia fué de 60 a 90 minutos.
Cuando los cultivos de esta misma cepa bac
teriana previamente sometidos a un ayuno de poliaminas se
desarrollaron en el medio HHOsuplementado con putrescina
( HHOP), espermidina, espernina o Hg, se obtuvieron las
curvas de crecimiento que muestra la Fig. 2. Se puede
observar que el tiempo de generación minimo se obtiene
con putrescina y le siguen en orden creciente los correspondientes a medios de cultivo con espermidina, espermina,
y magnesio.
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Figura 1.- Efectn "n la adición degutrescina son a el crecimiento qLïscr;.zric:i:asii .“A “51-:- Las :Ï'zlulzs sometidas al ayuno de pal-laminas: st-‘eincubaran c 3'71”3ÏÏ'T-ciio’fiïïfl. Después de l hora se separó una alícuota del cultivo que 21.- :1..-; '.:1:'ïtar.'accn putrescina.( 100 g/rnl.) y ambas fraccicnes se íncubarcn nueva:'=t2. Abscrción óptica a 550 nm en medio HHO,o , y gn medio HHÜP,o
0,5
0,4 r
(L1 '
(208
4550nm
9s N‘va
0A95 '
F
4 ,6
hora: H3. zFig. 2.- Efecto del agregado de varias poliaminaa o Mg++sobre el crecimientode E.coli MA-261. Células sometidas a un ayuno de poliamina, ae incobaron a 370 Cen presencia de 8 mM(concentración final) de MgH o 0,8 mM(concentración final)de la poliamina indicada en cada caso.a Medio MMO+ putreacina, tiempo de duplicación 9O minutos; o Medio MMO+ eapermidina, tiempo de duplicación 132 minutos;
a Medio MMO+ espermina, tiempo de duplicación 150 minutos; A» Medio MMO+ Mg++,
tiempo de duplicación 2h5 minutos: O Phdio MMO,tiempo de duplicación 250 minutos.El crecimiento bacteriano ae midió por absorción óptica a 550 nm.
b
ha
Efecto del agregado de putrescina Segre la distribución
intracelular gs los ribosomas
Se ha demostrado que las poliaminas desem
peñan funciones muyimportantes en el metabolismo celular
( 5 - 19). En experimientos ¡in vitro " se encontró la
propiedad de estas sustancias de disminuir los niveles
óptimos de magnesio para la sintesis de proteinas ( 59 ),
que en algunos casos era netamente estimulada ( 126 ).
Las poliaminas son capaces de producir"in vitro" 1a asociación de las subunidades ribosomales
( 105 ). Por otra parte se sabe que se encuentran for
mandoparte del factor de asociación aislado en Bacillus
stearothermoghilus ( 86 ).Estos descubrimientos nos llevaron a estu
diar el efecto sobre la distribución intracelular de los
monómeros70 S y las subunidades ribosomales del agregado
de putrescina a cultivos previamente ayunados. En estasexperiencias los cultivos bacterianoa ayunadosse desarro
llaron durante varias horas en medio HBO;luego se tomó
una alícuota que corresponde a la mitad del cultivo original y se la suplemento con putrescina; amboscultivos
".'
se continuaron incubando durante 30 minutos. Posterior
mente las células se cosecharon enfriando lentamente y
los lisados bacterianos obtenidos se analizaron por cen
trifugación en gradientes de sacarosa; la Fig.3A muestra
el perfil ribosomal de los cultivos desarrollados en ausencia de putrescina ( MMO); en estos casos se observa
un desplazamiento del equilibrio ríbosomal a favor de las
subunidades, con una disminución apreciable del pico co
rrespondiente al monómero70 S y un aumento del pico co
rreSpondiente a la subunidad SOS. El pico de particulas
30 S aparece ligeramente disminuido y algo difuso, lo cual
puede indicar que durante el ayuno de putrescina los me
canismos de sintesis y/o ensamblado de la subunidad peque
ña están dañados. La Fig. 3 B corresponde a un cultivo
sometido a un ayuno y luego desarrollado durante 30 minutos
en presencia de putrescina.En este caso se produce un rápido cambio en
la distribución ribosomal, desplazandoel equilibrio afavor del monómero,con la consiguiente disminución de
los picos de subunidades. Ademásse normaliza el perfil
correspondiente al pico de la subunidad pequeña.
Si tomamos como parámetro el área de los
picos 50 s y 70 S, 1a relación 70 S/ SO S en la Pig_3A(medio
MMO) es de 1,54,mientras que en la Fig. 38(medio HMOP)es
de ¿,89. El contenido total de ribosonas observado en los
gradientes correspondientes a células ayunadas ( MMO), es
menor que para células cultivadas en medio HMOP,pero se
compensa por una mayor absorción a 260 nn del sobrenadante
( dato no mostrado en las figuras ) .Cuandodos cultivos desarrollados en 1a
misma forma que los descriptos para los experimentos an
teriores, se cosecharon por enfriamiento rápido en presen
cia de cloranfenicol,tratamiento que provoca 1a detenciónde la sintesis proteica con 1a conservación de los poli
ribosonas, se encontró un número mayor de polisonas en
lisados celulares provenientes de cultivos desarrolladosen presencia de putreacina ( MHOP), manteniéndose una
relación nonómero/subunidades semejante a 1a observada
en 1a(Fig. 3); (Fig. 4A y B).
Los perfiles obtenidos en 1a Fig. 3 indi
can un efecto directo de las poliaminas sobre 1a distribución "in vivo" de las diferentes particulas ribosomales.Estas diferencias observadas en los perfiles de la Fig. 3podrian deberse a alguno de los siguientes artificios:
A. 795- 505 4395 “3. i705 505. 3'05í . ' . '
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o; ! .s x 1 LJ ! { I J4 3 2 1 __ 4 3 2 1
ml des e el memsco 1273.3Figur 3,- Efectn de la: palíaminas sabre el gggfil ribosomal.a
Cc pués de cnsechar las bacteria: se lisaron según se ha descripto an matelas y métcdcs. Las extractas cnlulares se analizaron por centrífugacíón
¿‘ “arrecppndiente a unen gradientes de sacarosa. A, cs el perfíl ribosomlisado preparado a parti: de bacterias cultivadas en medio MMOyhg,-correspnnde a células que han crecido en medio MMOal que se agregó pútrescina
’1
(Ad- '
durante 1an_últ1mos,30 minutos de la incubación.
A 705 50 30 B 705 50 30l li I i;03'
4254nm
5) Na
4 3 2 1 4 J 2 1
ml desde el menisco 1+Fig. h.- Efecto_gg¿_egregadode putrescina sobre 1a distribución intragglglgrde Eolisomas. Después de cosechar las células por enfriamiEnto rápido en presencia de cloranfenicol, las células bacterianas se lisaron según se ha descriptoen materiales y métodos. Los extractos celulares oe analizaron por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa. fi es el perfil ribosomal correspondiente a unlioado preparado a partir de bacterias cultivadas en medio MMO;g_correcponde acélulas ayunadaa que se han desarrollado en medio MMCPdurante 3 horas.
I)
VII
III)
La sensibilidad de las bacterias cultivadas en me
dios MMOo HHOPfrente al método de lisis puede ser
muydistinta, determinando una diferencia de extracción tanto de los monómeroscomo de las subunidades
ribosonales en ambostipos de bacterias.
Tanto los nonómeros de terminación como los monoso
mas aparecen en el mismopico del perfil ribosomal.
Si el contenido de ambostipos de particulas fuera
diferente en los lisados provenientes de cultivosdesarrollados en presencia o ausencia de putrescina,esto podria explicar las distintas distribucionesde ribosonas en ambosextractos.
La dimerización de las subunidades 30 S da lugar a
particulas con coeficiente de sedimentación de 50 S.Por lo tanto los diferentes perfiles en los extractos de los cultivos en presencia o ausencia de pu
trescina se pueden deber a una distinta dimerización
de las subunidades 30 S en ambos lisados, que produ
ciría contaminaciones de distinto grado en los picoscorrespondientes a particulas 50 S.
Para descartar la primera posibilidadse realizaron estudios cuantitativos del RNAtotal extrai
do de bacterias desarrolladas en presencia o ausencia de
poliamina. Se encontró que en ambos casos se podia extraer
entre un 80 a 90 1 del RNAtotal. Dado que la mayoria del
RNAcelular corresponde al RNAribosomal, la diferencia
observada en 1a Fig. 3 no puede ser atribuida a una extracción selectiva de las subunidades o monómerosribosomales.
El antibiótico trimetoprim inhibe lasintesis proteica a nivel de la iniciación ( 121 ) produciendo 1a acumulación de monómerosde terminación. Cuan
do los cultivos bacterianas desarrollados en presencia o
ausencia de putrescina se cosechan luego de estar en con
tacto con trimetOprim durante 15 minutos, se observa que
los perfiles ribosomales de células asi tratadas, no sediferencian de los correspondientes a extractos bacterianos cosechados por el método de enfriamiento lento ( Fig.3 );
este hecho nos indicaria que la mayoria de los monómeros
encontrados en amboscasos corresponden a particulas de
terminación. Se ha demostrado que es posible distinguirlos monómeros de terminación de.bs monosomascuando se
üusan gradientes de sacarosa en los cuales el K sc susti
tuye por Na * ( 127 ). A1 realizar los análisis en
gradientes de Na* ( Fig. 5 ) se encontró que el porcen
taje de los ribosomas de terminación en el pico de 70 S
era de un 82 1 para los lisados provenientes de cultivos
ayunados y de 87 % para los que se habian desarrollado
en presencia de putrescina. Estos hechos apoyan la idea
de que 1a diferencia de perfiles de la Fig. 3 no se
debe a diferentes tipos de monómeros70 S.
El análisis de las subunidades purificadas a partir de extractos bacterianas procedentes decultivos desarrollados en presencia o ausencia de polia
mina nos permitió estudiar detalladamente una posible contaminación de la subunidad ribosomal 50 S con dimeros de
30 S. Se realizó un análisis de estas subunidades puri
ficadas en gradientes de sacarosa y se encontró que en
amboscasos ( células cultivadas con o sin putrescina )
las subunidades 50 S poseían un 95 % de pureza, aún después
de ser incubadas a 55 QC durante 5 minutos en presencia
de 2 mnditiotreitol que es un tratamiento que produce
la disociación de los dimeros de 30 S. ( M. Garcia Patrone,
dato no publicado ). Para confirmar estos resultados se
sometieron ambos tipos de subunidades SOS a un tratamien
to con SUSal 2 % de concentración fina1,con lo que se
produce la liberación del RNAcorrespondiente a cada par
tícula; posteriormente se analizaron por centrifugaciónen gradientes los RNAobtenidos y se encontró que en am
bos casos la subunidad 50 S presentaba un pico de RNAde
23 S acompañado por otro más pequeño de 16 S.
La aparición de este pico de RNAde 16 S
se podria explicar por la actividad de endonucleasa presente en la subunidad 50 S ( 128 ). Por otro lado aun
que este pico de RNAde 16 S tenga su origen en una con
taminación por dfneros de 30 S, el hecho de que ambos ti
pos de subunidades 50 S(provenientes de cultivos ayunados
o no) posean la misma cantidad de RNA16 S sugiere que
aún en el caso de una contaminación por dineros, ésta no
alteraria el perfil ribosomal que se observa en 1a F19. 3AyB.
Á254nm
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‘ ¿flan Qor ceng;ifugg:ión_eñ oracionteg_ge_5pgpg__.L[T "
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A 705 505 305 B 705 505 305
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CT
Especificidad del efecto de la poliamina sobre la distribución de ribosomas.
Se investigó si los perfiles ribosomales de los cultivos desarrollados en medio MMOeran ca
racterísticos de la falta de polianina o podrian obtenerse por el ayuno de otras sustancias tales comoglucosa o
fuentes de nitrógeno.
En estos experimentos los cultivos de
sarrollados en presencia de putrescina se lavaron varias
veces con medio HMOPsin glucosa, y luego se volvieron a
incubar a 37 QCdurante 30 ninutos en medio HHOPsin glu
cosa. Los lisados obtenidos a partir de estas células presentaban un perfil similar al de los correspondientes almedio HMOPcompleto ( Fig. 68 y 6C ) .Un cultivo paralelo
desarrollado en ausencia de poliamina ( MMO), dió unadistribución ribosomal caracteristica de la ausencia de
esta sustancia ( Fig. 6A ). Iguales resultados se obtuvieron cuando las bacterias se sometieron a un ayuno de
nitrógeno.
Figura 6.- Eagecificidad dei efecjg_gg puliaminas gpbre le distgibuciónribosomal. Los lisadou de bacterias desarrolladas en distintas condiciones se analizaron comose indicó en materiales y métodos. Las bacterias Fueron cultivadas en los siguientes medios: fl, en MMO;g, en MMDP;E, en MHÜP,pero las células se levarOn y reincubarun durante 30 minutosEn el mismo medio libre de glUCDSr.
6h
Ghia
/'='70.85053Q“¡3."/051105;30:;C.703
1.1,.J.J.J.J.J0/.-—,_í
A254 nm
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l''g'._.0.)u
_|
27'1,
N _.
sx
¿x
La
43
¡nl(!CSC:'Cclmcmsco
Disociación de los ribosomas
La sensibilidad a la disociación de los
ribosomas obtenidos a partir de bacterias desarrolladas
en presencia o ausencia de putrescina se estudió a concen
traciOnes decrecientes de magnesio. En la Fig. 7 se puede
observar que las particulas ribosomales provenientes de
los cultivos en medio MMOestán más disociadas que las
obtenidas de bacterias desarrolladas en medio HMOP. Por
otro lado, las curvas de disociación para ambos tipos de
partícula son paralelas, indicando que los monómeros70 S
obtenidos de cultivos en presencia o ausencia de poliami
nas poseen igual sensibilidad a la disociación por la disminución de los niveles de magnesio.
DlSOC/AC/ON (Vo)(hO
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Fígurñ .- gpiggl}}f"d de 101 rihanomas a_g1Fereñteg_gggpggfifgpiofig_ “e “"’*.Después de aJurtnr 11 canccntrnción de MgH a los niveles indicados, .3: extra:tqs obtenidos a partir de bacterias cultivadas un medio MMO( Q ) o HPC? C O )se analizaron y :e :aiculñ los respectivos porcentajes de dinociaciñ*
Unión de la espermidina al ribosqmg y corrección del
perfil ribosomal " in vitro ".
La unión de espermidina radiactiva a
particulas ribosomales aisladas de cultivos desarrolladosen presencia o ausencia de poliamina se realizó por equi
librio de diálisis. El númerode moléculas unidas resultó sercbl mismoorden ( 920 i 35 moleculas/ ribosoma )
para ambostipos de particulas ribosomales.
Después de una diálisis de 24 horas
contra una solución que contenía espermidina l nn. las
subunidades se asociaron parcialmente, especialmente en
el caso de las provenientes de cultivos en medio MMO.
Deesta manera los perfiles ribosomales de las bacterias
ayunadas o no tienden a igualarse ( Fig. 8 ).
Además, después de la diálisis ambos
tipos de particulas 70 S se vuelven más resistentes a
la disminución de la concentración del magnesio ( Fig. 9 )
Figura 8.- Efecto de diálisis contrisoluciones de esgermidina sobre ladistribfln ribosola_1_.Las muestras se sometieron a equilibrio de diálisiprocediendo como se ha descripto en materiales y métodos. A y _B_son los perfiles de los ribosomas de terminación en gradientes de sacarosa antes dediálisis, y Q y ¡_D_después de diálisis. A y E corresponden a las muestraspreparadas con bacterias cultivadas en medio MMOy g y Q a los extractosde células desarrolladas en medio MMUP.
(¡Ba
A.ms505305a705sosaïs C.705505305D,70553653’03“
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igura 9.- gpjggiljgggL;@L¿pgnyiggggpasdquqgíjgïguéiigig_contra egpa;nídina.aa muestras se sometieron a un equilibrio de diálisis centra espermidina 1mM
luego se ajustó ln cancentrución de Mg++a distintos valores. Después denálisis por centrifugación en gradientes de sacarosa se determinaron los porentaJea de disociación. Loa simbolos aon loa mismosusados en la Fig. 7.
70
Sintesis " in vivo " de RNAz proteinas
Se estudió las cinéticas de sintesis
de RNAy proteinas en cultivos bacterianos desarrollados
en medio HHOy IHOP , a los cuales se agregó los precur
sores radiactivos respectivos ( uracilo o leucina ).
En la rig. 10 A correspondiente a la
cinética de sintesis de RNA,se puede observar un incre
mento de dicha sintesis para amboscultivos. Aunquela
sintesis del RNAfue mayor a tiempos largos en las bac
terias desarrolladas en presencia de putrescina, el agregado de esta sustancia provocó en los cultivos bacterianos un retardo de 1a sintesis de RNAdurante los primeros30 minutos.
En los cultivos desarrollados en HBO
no se observó este efecto.
La cinética de sintesis proteica nuestra un comportamiento diferente a la del RNA;en estos
casos Pig. lo B ) el agregado de la putrescina produce
un incremento innediato en la sintesis proteica.Estos resultados sugieren un efecto
independiente de las poliaminas sobre el proceso de la
Figura 10.- Efectn___delag;g_ggp_q_gg putrescina sobre la sintesis de RNA!Erotelnas en bacterias ayunadas. E1 procedimiento experimental se ha indicada an materiales y métodos. g , cinética de la sintesis de RNA;_B_,cinéticade la sintesis proteica. o y o , incorporaCIOnesEn células cultivadas enmedio MMOy MMÜP,respectivamente.
incorporacion de [MC]Uma/o (CmeÏOG)N On.CxO Q o
IL, obNLOI _
¿L \o¡ __x.)
Co; _gs
(u;tu)L>z,-'w:v_:¡
ov¿a
7’?
traducción. Para confirmar estos resultados se estudiaron
los cinéticas de sintesis de RNAyproteinasen presencia
de rifampicina ( 100 pg/ml ). Este antibiótico produce1a inhibición de la sintesis del RNA. En estas condicio
nes de trabajo se pudo observar que nientras los niveles
de RNAse encuentran inhibidos en mas de un 90 i para
amboscultivos ( Fiq. ll A ) la sintesis de proteinas dis
minuye solamente entre 10 a 30 1 ( Pig. ll B ).
Ademas, el agregado de putrescina al
nedio de cultivo provoca el inmediato increnento de la
sintesis proteica. El periodo que transcurre antes de ladetención de 1a sintesis proteica en presencia de rifampicina es relativamente largo ( 30 minutos ); esto nos
podria indicar una demora de acción de 1a droga o que la
cepa es poco sensible al antibiótico. Aunasi, se debe
señalar que el grado de inhibición de la incorporacióndel uracilo a las células bacterianas producido por elantibiótico, es mayoren los cultivos que fueron suple
nentados con la putrescina, mientras que en el mismocaso
( HHOP) 1a sintesis proteica es marcadamente superior.
70'3)incorpora cion a’c[MCjU/‘acz’lo (cpm Xxx ' R) (.o
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Transporte de uragilogy leucigg
Las diferencias que observamos en los
experimentos anteriores ( durante la primera hora posterior al agregado de la putrescina ) no se deben a un nú
Iero diferente de bacterias, ya que el aumentode la sin
tesis del DNAy de la velocidad de crecimiento inducidas
por la polianina comienza después de ese periodo ( Fig. l ).
sin embargo, estas diferencias podrian
atribuirse a una modificación en el transporte de los
precursores radiactivos por la presencia o ausencia de
la polianina. Las Figs. 12 A y B demuestran que el trans
porte de uracilo y de leucina es similar para los cultivosdesarrollados en presencia o ausencia de poliamina. Estu
dios realizados por otros autores indican que la diferencia de incorporación del uracilo durante el periodo inicial ( Fig. 10 A ) parece deberse a una expansión del
" pool " endógeno de esta sustancia despues del agregado
de la putrescina ( 129 ).
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Firmrn 12.- gfgítg_@_1_9m_cg¿1_dpde pglipflina mpg-cnc} 'ÏTCÏTTPÑFÉLÉE“391.34_‘._c_n.-cinn.El transporte de Ieucina (fi) y de uracilo (.2) se midió segun lo 1.1::cado en materiales y métodos. Los valores correspondientes a los medias :'..".u(O)y MNOP(O ) se expresaron como_la radionctividad incorporada por 108 célglas. '
Sintesis 'in vitro" de Eoligétidos:
Los experimentos de sintesis "in vitro" de
polipetidos, demostraron que el agregado de putrescina a
cultivos previamente sometidos a un ayuno de esta sustancia
produce un efecto independiente a nivel de le traducción.
En estos experimentos se midió la incorporación de fenila
lanina usando al poli U como¡NAmensajero. Los resultados
indicaron que las fracciones 8-30 provenientes de cultivosdesarrollados en presencia de putrescina presentaban una
actividad 3 a 4 veces mayorque la correspondiente a extractos de bacterias cultivadas en ausencia de esta sustancia
(rig. 13). Esta diferencia de actividad para ambossobrena
dantes 3-30 no se debe a distintos requerimientos de magne
sio, ya que en ambos sistemas el óptimo de magnesio oscila
entre 13 y 15 ml (Pig. 14). Cuandose siguió la cinótica
de incorporación de fenilalanina (tig. lS) se pudo ver quelos sobrenadantes 3-30 provenientes de cultivos desarrollados en medio IHOpresentaban una reducida actividad inicial
que luego alcanzaba un valor maximoen tiempos relativamente cortos no ocurriendo lo mismocon los sobrenadantes 8-30
aislados de celulas cultivadas en presencia de putrescina.El retardo observadoen la sintesis de polipétidos en extrac
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C[MC]/'-(:I7l'/C(ÍÜJ
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O n. I 1 l íS O 0.2 0.4 0.6 0.8
unidades A260 Fíg. 4aF'mura 13.- Incorpcrnqíïïg f'erúlolanina En efiractns de Bacterias ayunadas- "uglemcnto_dz.1_:;Epfjhpnyïflgfi. Las mezclas de reacción contenían las cantidades indicadas de extr..cto 5-30 y los demás componentes ocscríptos en materiales y métodos. La concentración de acetato de '-ï._',»Fu: r1: 15 mMy el tiempode incubación de 30 minutos. Los simbolos O y o corresponden ¡a extractosde bocteriao cultivadas en medios MMOy MMDP,respectivomente.
77
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Mgficoncn. mM) Pía/1‘}Figurn lh.- Elpjgg}p_ggbppllfenllelanlna En amb?gigggïgjgp_gggterlanos aglgg¿¿tas concentraciones de Mg++. Ée usaron D,h unidades de absorción ópticamedida u 260 nmde cada extracto 5-30 y las concentraciones indicadas de acetatode Mg. Los demás detalles experimentales y los símbolos fueron descriptos enmateriales y métodos y en le leyenda de la Flg. 13.
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EÏ O 20 40 60 ó’O
Tiempo(mín) 52‘45Figura 15.- Cinética de incorporación de fenilalanina e" gïjractos de¿a3¿g;¿gg_gïgggggs o suplemeníggp: con putrcggigg. Las mezclas de reacpiónr9 han descripto en materiales y métodos. En todos los casos se utilizaronC,h unidades de absorción óptica medida a 260 nmde los extrattos 5-30 yuna cancentración de Hg*+ de 15 mM. Los tiempos de reacción son los indicados en cada caso y lun simbolos los mismos utilizados en la Fig. 13.
79
tos de bacterias desarrolladas en medio MMOparece indicar
que las células con bajos niveles de poliaminas presentan
alguna deficiencia en los procesos de iniciación de la sintesis proteica. Por otra parte se ha descartado la potibilidad de que la reducida velocidad de sintesis de polifenilalanina en los extractos de bacterias desarrollados en au
sencia de putrescina se deba a un menor nivel de activación
de los aminoácidos. En nuestro caso esto no ocurre, pués,
ambossistemas preparados a partir de bacterias cultivadas
en ausencia o presencia de putrescina mostraron similares
cinéticas de activación (Fig. 16).Para estudiar con más detalle el efecto del
ayuno de poliaminas sobre la sintesis "in vitro" de poli
péptidos,se centrifugaron las fracciones 8-30 provenientesde cultivos desarrollados en presencia o ausencia de putrescina con el fin de separar ribosomas de los factores solu
bles presentes en la fracción sobrenadante denominada5-150.
Combinandoluego ribosomas y fracción 5-150 de ambos siste
maspara realizar la sintesis "in vitro" de polipétidos,se podria detectar cuál de estos componenteses defectuoso
en los extractos de bacterias con bajos niveles de poliami
nas. Los resultados de la Tabla I muestran que la capacidad
de sintetizar polipétidos depende en la mayoria de los casos, del origen de los ribosomas ( I y III ). En algunos
C; k4
experimentos el sobrenadante 5-150 obtenido de las bacterias
desarrolladas en presencia de poliaminas aumentóla activi
dad de los ribosomas de células sometidas al ayuno de estassustancias ( II J.
Los resultados anteriores parecen indicar
que el ayuno de putrescina provoca una alteración en alguno
de los componenteso factores ribosomales, que en ciertas
condiciones podrian liberarse parcialmente al sobrenadante.
/
\I
(C/Pfiï-A
(I.n¡uo:
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C 20 30 40
H8. 46F__.____i-'um 16-- 213_ét1.53_11.0-.ESIEPEAÉK.dpieJ'HpiwL-¿Rí .crirP-__.__ctm de bas»;¿jgs ayunndgg_9_5gp}ggp3}ppgj_Epg_fly};gpg}na.
).‘3.
Ï’cmpo (mín)
Las mezcla: utilizadas se ha:durcripto pn materiales y métodos. Se usaron 0,4 unidades de nbcorción ópticaa 260 nm de los extractos 5-30 y unn concentración de lan Hg++ de JS mM.Símbolos cnmn en 1a Fig. 13.
gnk4
-EEL
Síntesis de polifonilalanina con pggpnïaciongg_gs_5}kgggygg_ymigggcigneg
sobrenadantes (5-150) obtenidos de bacterias culgiyagag_enuggpgncia q
Presencia de ngtrescina
Experimento Ribosomas S lSU Síntesis de polipéptidos
MMO MMOP MMO MMOP picomoles de fenilalaniuaincorporada
+ - + - 2396
+ - — + 26,7I
— + + — 46,2
_ + _ + 46,6
+ - + - 25,0
+ - - + 46,4II
- + + - 70,5
— + — + 97,8
+ - + - 48,4
+ - - +III
- + + - 143,5
- + - + 136,0(
Las mezclas de reacción contenían 0,2 unidades ópticas medidas a260 nmde suspensiones de ribosomas y lSlpg de proteínas de sobrenadanteS 150 obtenidos a partir dc extractos de bacterias desarrolladas en losmedios MMOo MMUP. La concentración de Mg++ fué de 14 mMy la de los demás camponentes como se describió en Materiales y Métodos. El tiempo deincubación fué de 30 minutos. El blanco de la reacción (realizado enausencia de ácido poliuridílico) fué restado en cada caso.
"U
¿111M 11
bíntesis de polifenilalanina con sistemas rcconstituídos a partir de;subunidades ribosomales purificadas obtenidas dc bacterias cultivadasen presencia o ausencia de putrescina.
subunidades 305 subunidades SOS Síntesis de polipéptidos
de bacterias desarrolladas enmedio de cultivo
“MU HMDP MMO MMO? (cpm)
+ - + - 1724
+ _ — + 1909
Expt. 1- + + - 4817
- + — + 5970
+ - + - 1771
+ - — + 1492Expt. 2
_ + + — 7956
- + - + 7550
La mezcla de reacción contiene 0,05 UDO260 nm de 1a subunidadribosomal 308 y 0,10 UDO260 nm de 1a SOS, que se obtuvieron a partir decultivos desarrollados en presencia o ausencia de putrescina según seindica para cada experimento. El sobrenadante (8-150) equivalente a15pg de proteínas se obtuvo de los cultivos desarrollados en presencia deputreacina. La concentración de Mg++que se u36 para estos experimentosIué de 13 mHy las incubaciones se realizaron a 37° durante 30 minutos.El blanco de la reaccián (incorporación obtenida en ausencia de poli U)fue restado en cada caso.
Todos los otros detalles de la reacción están descriths enMateriales y rEtodos.
Sintesis "in vitro" de poiipétidos usando RNAmensajeronatural
Los resultados obtenidos para la sintesis"in vitro" de polifenilalanina fueron confirmados cuando
se utilizó comomensajero natural el RNAdel fago HS-2.En estos experimentos (Pig. 17), las fracciones 5-30 ais
ladas de bacterias cultivadas en medio suplementado con
putrescina ( HMOP), mostraron una actividad 4 veces mayor
que 1a correspondiente a 1a de bacterias ayunadas. Se obser
vó además que para ambos extractos la concentración de mag
nesio que da máxima actividad es de aproximadamente 9 mH.
BG
Figura 17.- Efecto qggln corcentración del Mg++ sobre la incquoracióngp valina inducida, por el RNAm¿lil Fago M°-_2_g_t_1__gg(g_g_g_ggg_b_ggt_erl_aíai_
dacarrollados en Érggggg¿g_p_gyggf5¿g_gp_ggggggg¿gg. La mezcla dereacción ae ha descripto en materiales y métodos. Símbolos ycorrespOndena los extracto: nbtenidos a partir de cultivos desarrolladosen medio MMOy HHDP. respectivamente.
063
l..-____|l|co(o .NN
(2...0?x“¡C/3)Dll/[DA[DM]9p¿19390.10chow!
Sintesis de polifenilalgnina con subunidades ribosomales
purificadas. Detección de particulas 30-8 anormales.
Los experimentos descriptos de sintesis
"in vitro" de polipétidos usando RNAmensajeros artificia
les o naturales y fracciones 8-30 provenientes de bacterias
sometidas o no a un ayuno de putrescina, demostraron que
dicho ayuno provocaba una disminución de la capacidad sin
tética de polipétidos. Las actividades de los sistemas reconstituidos con ribosomas y fracciones sobrenadantes 5-150
indicaron que la disminución de la actividad dependía fun
damentalementede las particulas ribosomales. Estos hechos
y la aparición de particulas 30-5 anormales en los perfilesde ribosomas obtenidos por centrifugación en gradientes de
sacarosa de los extractos de bacterias ayunadas ( Fig. 3 ),
sugirió la posibilidad de que la disminución de la actividad en los extractos de células cultivadas en ausencia de
putrescina podria deberse a algún daño en 1a subunidad ri
bosomal mas pequeña.
Para confirmar esta hipótesis, se purificaron subunidades ribosomales a partir de extractos obtenidos
de bacterias desarrolladas en presencia o ausencia de putrescina ( Fig. 18 ). Posteriormente se realizaron una
505
0,6 P
305
3050
A260nm
0,2
A A A L A 1
10 20 30 10 20 30
H3. 48."u!¿u rrí dp_d_e_:_.I‘_1_b_0¿ï_f.)f_"._21g. ¡.131 tr;._c;gn_t_r¿f¿g
numero de fracción
Figura 18.- Purif’ícaqió: f1}?__' ___
nacía};Espgjtjjgshriaypghrprza. Suspe'vqínñcr ¿Enríhnsnma: prnueüurimn 759Lsacterí°s áultívadns rn: medi.“ HMCy Er-ÍMDPrn sametínrorï a una nahtríf‘ugvcíór
en gradiefirm de 'zacarn'ïa 3"“ '21 Fi" c'e uhtcncr Pubuniclade'ï rizos-anales puriFícadart (ver detalle on mntrrízles- 2/ métodos). n: ÜGI‘Fílcorres arndierte aa _ i
extractos: de ‘tívcr‘ riennrrallmlnzz e: medir: MMO; perfil de extractos decubacterias Cultivarfas e.'. medi-J HHDF.
89
serie de experimentos de sintesis de polifenilalanina en
sistemas reconstituidos mezclandosubunidades purificadasobtenidas de ambosextractos; en todos los casos se utili
só la mismafracción sobrenadante 5-150 proveniente de bac
terias desarrolladas en presencia de putrescina. Los datos
de la Tabla II indican claramente que el nivel de actividad
esta dado por el tipo de subparticulas 30-5 utilizado, noocurriendo lo mismocon la subunidad 50-8. Cuando el siste
ma incluye la subunidad 30-S_preparada de bacterias desarro
lladas en presencia de putrescina la actividad es 3 a 5
veces mayor que cuando se utiliza partícula 30-5 de células
ayunadas y no depende del tipo de subunidad SO-S usado.
Estos resultados podrian deberse a una dife
rencia en las concentraciones de poliaminas de los ribosomas aislados en varias condiciones de cultivo. Para descar
tar esta posibilidad ae midió la sintesis de polifenilalanina en los mismossistemas descriptos, utilizando diferentes concentraciones de magnesio y en presencia o ausencia
de espermidina. La Fiq. 19 muestra que el agregado "in vitro"
de espermidina no modifica la eficiencia de los ribosomas
obtenidos de bacterias ayunadas o desarrolladas en presen
cia de putrescina. En ambossistemas la espermidina causa
un desplazamiento similar del óptimo de magnesio, que dis
minuye hasta aproximadamente 9 a 10 mM.
Los análisis por ultracentrifuqación engradientes de sacarosa de los ribosomas aislados a partir
de bacterias desarrolladas en presencia o ausencia de pu
trescina, indicaron que 1a subnnidad ribcuzmal más pequeña
de células ayunadas daba picos asimétricos y que dicha
asimetría se acentuaba a medida que disminuia la concen
tración de magnesio en los gradientes (Fig. 20-A-B-C).
De esta manera aparecía un pico doble correspondiente a
las subunidades 30-8 deficientes cuando el nivel de magne
sio se hacia 0.1mM.A1 mismo tiempo los perfiles correspon
dientes a ribOSOmasde bacterias desarrolladas en presencia
de putrescina (F19. 20 D-B-F ) no presentan ningún tipo de
asimetria aún a concentraciones muybajas de maqnesio.
Cuandose analizaron en gradientes de saca
rosa las subunidades aisladas y purificadas obtenidas de
las bacterias cultivadas en los medios MMOy MHOPse pudo
observar que sólo 1a subunidad 30-5 de las células desarro
lladas en ausencia de putrescina era anormal, presentando
nuevamente un doble pico (Fig. 21 B). Esta heterogeneidad
de 1a particula 30-S puede deberse a 1a presencia de subuní
dades defectuosas o de precursores de las particulas maduras. Los perfiles correspondientes a todas las otras subuni
dades fueron perfectamente simétricos ( Fig. 21 A-C-D),
91
Figura 19.- Efecto de lr: concentracion“_d_gl__l'f1uï_y_lg_pdiciónde eegermidirlgEtre la sintesis de polifenijiglggija en 91912231133libres ¿golea obtení
afirtir de :u_l_tivo:;bocieíííngïpegar;o_1_lpg_g_s;__e_n_¿{931039ausemíade Eutrescina. La mezcla de rencciñn contiene particulas ribosomeles 3D Sy 50 S purificadas, en 113 cantidades. indicador- en materiales y metndor.Sbrenadante 5-150 ( 15 ug .de proteinns) obtenido de cultivos desarrollados:en presencia de putreecina y todos lor: reactivos necesarios para la sintesisde polifenilalanina (Materiales y Métodos). Simbolos: : o y o , correspondena la mezcla de subunidades rihosomleo de bacterias desarrolladas en presenciao ausencia de putrescinn respectivamente A y A corresponden a los mismosSistemes con la adición de 0.5 mMespernidína.
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5 nm Hg’*, B y E a 1 mH Mg++ y c y F a 0.1 m: ug*'.
93
- Figura 21-- amiga-12.22.c?.n.t.r_1f.q99céán9_n_ar39_1_ep_t_e_s_.erïáaasuíiaggygynidades rngpgma¿gs_pgg}f}cgggswggtgniggga partir de cultivcg_gggtg¿LB___y__"°5a unadoig. 22531391355199.sugessnség 515.129.229.612? A v B son103 perfiles correspondientes a las subunidades SDS y 30 S respectivamenteaisladas de cultivos desarrollados en ausencia de putrescina; C y D corresponden a los perfiles de las nuburidrdes preparadas a partir de los cultivnñsuplementadns con putrencina.
0.4
¿254nm
.LZ'Í'ÏÏ.)
M
..._L'a
"“"'=-<—O.
(J (r.
m.’ desde el mcmsco
Formación del compieig de iniciación usando comomensajeroel trinucleótido AUC.
Los extractos de bacterias cultivadas en
ausencia de putrescina mostraron la presencia de una sub
unidad 30-5 deficiente. Ademáslos experimentos de cinética
de sintesis de polifonilalanina con los mismosextractos
indicaron que dicha reaCFión era especialmente lenta en los
primeros minutos ( Fiq. 15 ). Estos hechos nos hicieron
estudiar la iniciación de 1a sintesis proteica en los extractos de ambostipos de bacterias.
Comose observa en 1a Tabla III la formación
del complejo de iniciación fue aproximadamente 3 a 6 veces
mayor con los ribosomas aislados de las bacterias desarro
lladas en presencia de putrescina. Estos experimentos, juntocon los anteriores, demuestran que los bajos niveles intracelulares de poliaminas provocan una deficiencia tanto estructural comofuncional de 1a subunidad ribosomal 30-5.
TABLA {Li
Formación del complejo de iniciación usando como RNAmel tripleteAUGy extractos o rihosomas bacterianos aislados de cultivosdesarrollados en presencia o ausencia de putrescina.
Medio de cultivo a Cantidad de Formación delpartir del cual se extracto utilizado complejode iniaislaron las ciación F-metfracciones (uno 260 nm) 3H-tRNA-Rib-AUG
5-30 cpm
b l MMO l 1.300"P mov 1 7.100
Medio de cultivo a Cantidad de Formación del _partir del cual se ribosomas complejo de iniaislaron los utilizados Ïiación F-ietribOSOmas (UDO 260 nm) C-tRNA-rib-AUG
cpm
[IMD l 312 59
Exp 2
MMO? 1 1052 300
Exp. l: La mezcla de reacción se realizó en dos etapas comose hadescripto en materiales y métodos, y contiene 1 UDO ' de los extractos bacterianos 5-30 preincubados y los demás componentes necesarios para la formación del complejo de iniciación. Las incubarciones se realizaron a 34° C y 25° C en la primera y segunda etaparespectivamente. El blanco de la reacción (realizado en ausencia deAUC)fue restado en todos los casos.
Exp. 2: La mezcla de reacción contiene las cantidades indicadas deribosomas obtenidos a pa Sir de cultivos desarrollados en presencia oausencia de putrescina, C formilmetionil-tRNA y los demás componentesya descriptos en materiales y métodos. Las incubaciones se realizaron a 24° C durante 20 minutos. El blanco de la reacción (realizado en ausencia de AUC)fue restado en todos los casos.
y?)
Las particulas ríbosomales 30-5 de ambostipos de bacterias
desarrolladas en medios MMOy MMOPse sometieron a un tra
tamiento con SDSpara liberar el RNAribosomal. Los produc
tos de estas reacciones se analizaron por ultracentrifuga
ción en gradiente de sacarosa, y se pudo observar que el
RNAcorrespondiente a la subunidad 30-S de bacterias culti
vadas en ausencia de putrescina presentaba un perfil total
mente difuso (Fig. 228). Este resultado puede indicar una
alteración de la estructura secundaria o una degradacióndel RNAribosoma].
En el caso de la subunidad 30-5 de bacterias
desarrolladas en medio MMOPno se observa este fenómeno,
apareciendo un pico nítido que corresponde a1 RNAribosomal
16-5 ( Píg. 22 o).
¿19922.22- - Bailey.riel-BE¿A_.r.1.h.o.39mal0.0.rr_e_s_pp.n_d.1_enie_¿lasflpenmyi911212199282_92t?24929 peris}: .de. .c.u_1_'_c._1y.r.1.9__.d.252r.r9315999_33_mesengegausencia gg_pgliam}gag. Subunidadenpurificadaa preparadas de bacteriascultivadas an presencia o ausencia de putreacina, ae trataron con sodiododecil sulfato al 2 % comose ha descripto en materiales y métodos; lasmezclas obtenidas que contiEren el RNAliberada ne analizaron por centriFugacion en gradientes de aacarosa. A y B corresponden al RNAobtenidoa partir de nubunidades 50 S y 30 2 respectivamente, de los Cultivosdesarrollados en medio MMO;C y D corresponden al RNAobtenido de subunidades 50 S y 3D S respectivamente, de cultivos suplementadoa con putrescine.
97
4254 nm
A.235165B.235165¿¿34
11lllL
432í432
mldésdcelrncmsco
DISCUSION
98
=Laspoliaminas son sustancias que desempeñan funciones de vital
importancia en el metabolismocelular. Intervienen en múltiples
reacciones que forman parte de los procesos biosintéticos de ma
cromoléculas tales como DNA,RNAy proteinas, asi como también
en la estabilización de estructuras celulares tales comomembra
nas, ribosomas, etc. Sin embargo, aún no se conoce si alguna
de estas funciones es primaria y las otras secundarias, derivadas
de ella,o si los efectos mencionadoston independientes entre si.
El aislamiento de mutantes de Escherichia coli que requieren putres
cine o espermidina para crecer normalmente permite estudiar un
sistema en el cual se puede analizar, tanto "in vivo" como"in
vitro', el efecto del agregado de poliaminas a cultivos previa
mente sometidos a un ayuno de estas sustancias. De esta manera
hemostratado de localizar el efecto biológico causado por la
deficiencia de poliaminas en las celulas bacterianas.
Los resultados obtenidos "in vivo" (Fig. 10) para la sintesis
de RNAy de proteinas indican que el agregado de putrescina a
cultivos previamente sometidos a un ayuno de esta sustancia, pro
voca una estimulación inmediata de la sintesis proteica (medida
por la incorporación de leucina radiactiva a polipéptidos), aún
cuando la velocidad de crecimiento se mantiene inalterada duran
te l a 2 horas. Estos resultados no se observan al analizar la
sintesis de RNA(incorporación de uracilo radiactivo), que se
encuentra disminuida en los primeros 30 minutos posteriores al
agregado de putrescina; después de este periodo sobreviene una
estimulación (Fig. 10). El tiempo de latencia que se observa
antes de un real aumento en la sintesis del RNAprovocado por
el agregado de putrescina al medio de cultivo es de dificil in
terpretación, ya que para amboscultivos (en ausencia o presen
cia de putrescina) el transporte del precursor radiactivo es i
déntico (Fig. 12). Por otra parte. se ha demostrado (129 ) que
el agregado de polisminas a cultivos bacterianas en crecimiento
puede producir un incremento del "pool" endógeno de uracilo; es
te hecho de expansión del 'pool' podria explicar la disminución
de la incorporación por un fenómenode dilución del precursor
radiactivo. Los resultados mencionadossugieren que el efecto
estimulatorio sobre la sintesis de proteinas producido por el
agregado de putrescina, es independiente de la sintesis del RNA
ya que ésta no parece aumentar en el periodo inmediatamente pos
terior al agregado de poliaminss. Cuandose realizaron experi
mentos similares en presencia de rifampicina se observó que el
agregado de putrescina en presencia del antibiótico provocaba
una estimulación inmediata de la sintesis proteica, aún cuando
la sintesis del RNAse habia inhibido más del 90%, confirmandcse
de esta manera que el efecto estimulante que ejercen las polis
minas sobre la sintesis proteico es independiente de la sintesis
del RNA. Si se analizan detalladamente los experimentos reali
zados en presencia de rifampicina se observa que la-sintesis
IDO
proteica se detiene después de un periodo relativamente largo
(Fig. ll B). Este hecho podria indicar que existe alguna demo
ra para que el antibiótico pueda ejercer su acción o bien que
nuestra cepa bacteriana no es del todo sensible a la droga. Aun
que se considere cualquiera de estas posibilidades los resulta
dos indican que en los cultivos desarrollados en presencia de
putrescina la rifampicina produce una mayor inhibición de la sin
tesis del RNAy simultáneamente aparece aumentada la sintesis
proteica.
Los estudios realizados sobre la sintesis de polipéptidos uti
lizando sistemas libres de células con mensajeros naturales o
artificiales (Figs. 13 yl7) han permitido analizar el proceso
de traducción de una manera completamente independiente de la
transcripción. Asi se pudo demostrar una mayor actividad en
las fracciones (8-30) aisladas de las bacterias cultivadas en
presencia de poliamina. En todos estos experimentos se utili
zaron iguales cantidades de RNAexógeno para la sintesis poli
peptidica, y los resultados confirmaron los obtenidos en los
experimentos "in vivo". Cuandose analizaron las cinéticas de
incorporación de Fenilalanina se encontró que ambosextractos
presentaban un comportamiento diferente. En la fracción 5-30
obtenida de bacterias desarrolladas en ausencia de putrescina
la sintesis de polipéptidos se iniciaba con un retraso en los
primeros minutos de 1a reacción y luego se detenia rápidamente.
Amboaefectos no fueron observados en los extractos de bacterias
cultivadas en presencia de poliaminas e indicarian posibles al
teraciones tanto a nivel de la iniciación comode la elongación
de la sintesis proteica. La diferencia de actividad para ambos
extractos no se debe a un distinto nivel en la activación de los
aminoácidos (Fig 16). Por lo tanto debe reflejar alguna modifi
cación producida en los ribosomas y/o factores solubles por los
bajos niveles intracelulares de poliaminas. Los valores obteni
dos para la sintesis de polipéptidos en sistemas reconstituidos
con ribosomas y fracciones sobrenadantes 5-150 demostraron que
la diferencia de actividad provocada por la presencia o ausencia
de poliamina en los medios de cultivos, se debe a algun daño que
se localiza a nivel de las particulas y/o de los factores solu
bles unidos a ellas (Tabla I). Los valores de sintesis de poli
fenilalanina en sistemas en los que se utilizaron mezclas de su
bunidades purificadas que provenían de cultivos bacterianas de
sarrollados en presencia o ausencia de putrescina, indicaron cla
ramente que la disminución de la actividad de sintesis proteica
se debia a una diferencia localizada a nivel de la subunidad 30-8
aislada de los cultivos sometidos a un ayuno de poliaminas (Ta
bla II). Las particulas 50-5 obtenidas de las mismascélulas
tenian una capacidad sintética normal. Estos experimentos y los
de formación del complejo de iniciación ( Fmet- tRNA- ribosoma )
( Tabla III ) demostraron que en ausencia de poliaminas se pro
102
ducen subunidades 30-5 funcionalmente deficientes. Estas subuni
dades también presentan anormalidades estructurales que se han
podido detectar por estudios de sedimentación en gradientes de
sacarosa. Cuandolos extractos de bacterias cultivadas en pre
sencia o ausencia de putrescina se sometieron a ultracentrifuga
ción en gradientes de sacarosa que contenían diversas concentra
ciones de magnesio se pudo observar que a bajos niveles de este
cstión divalente la subunidad ribosomal pequeña aislada de las
células desarrolladas en medio MMOaparecia como un pico asimé
trico o doble en los perfiles ribosomales (Fig. 20). Estos mis
mosresultados se obtuvieron a1 analizar por centrifugación en
gradientes de sacarosa cada una de las subunidades ribosomales
purificadas (Fig. 21). E1 RNAribosomal de las particulas 30-8
defectuosas también mostró anormalidades al ser analizado en
gradientes de sacarosa. Los perfiles correspondientes eran di
Fusos, lo que indicaba que el RNA16-5 estaba parcialmente degra
dado o tenia alterada su estructura secundaria. Estos resultados
no se observaron con los RNAaislados de las subunidades 30-8
puras obtenidas a partir de los cultivos desarrollados en presen
cia de putrescina. Los estudios descriptos parecen indicar que
las poliaminas intervienen directamente en el ensamblado de las
subunidades ribosomales determinando posiblemente la correcta
interacción del RNAribosomal y las proteinas. Asimismoestabi
lizarian la estructura secundaria del RNAribosomal, lo que con
tribuiría a protegerlo de la acción ds las nucleasas.
En muchoslaboratorios se han realizado gran cantidad de experi
mentos con el fin de lograr el ensamblado ds las subunidades ri
bosomales a partir de sus componentes estructurales (RNAy pro
teínas). Nomura y col. ( 130 ) incubaron a LU OCdurante 30
minutos una mezcla de reacción que contenía RNAribosomal 16-5
y las 21 proteínas purificadas de la subunidad 30-5. En estas
condiciones lograron 1a reconstrucción de esta partícula riboso
mal, que resultó activa en una serie de reacciones tales como
1a síntesis proteica con mensajerosartificiales y naturales,
la unión del aminoacil-tRNA.etc. Hopylov y col. ( 131 )demos
traron que la estructura secundaria del RNAribosomal cumple una
función decisiva en el ensambladode las partículas ribosomales,
pues de ella depende que se produzca o no la unión de las proteí
nas al RNA. Nierhaus y col. ( 132 ) lograron reconstruir la
partícula ribosomal 50-5 utilizando para esto las dos especies
del RNA( 23 S y S S ) y las 3h proteínas estructurales: esta
reacción se realizó en dos etapas: durante la primers de ellas
se incuba la mezcla 20 minutos a AUDCy en ls segunda se eleva
la temperatura a 50 DCdurante 90 minutos en presencia de altas
concentraciones de magnesio. Los experimentos realizados por
Hosoksua y col. ( 133 ) en la reconstrucción de la subunidad
50-5 demostraron el papel Fundamental que pueden desempeñar las
poliaminas en el ensamblado de dicha subunidad. A diferEncia
10h
de los experimentos realizados por Nierhaus estos investigadores
lograron el rearmado de la subunidad 50-8 incubando a AUQCen
una sola etapa a partir de una mezcla de reacción que contenía
todos los componentesestructurales y concentraciones óptimas
de cationes inorgánicos. En estas condiciones más cercanas a
las fisiológicas, el agregado de poliaminas producía particulas
ribonucleoproteicas de coeficiente de sedimentación similar s1
de las subunidades 50-5 purificadas; por el contrario la Falta
de poliaminas en este sistema llevó invariablemente a la Forma
ción de particulas de bajo coeficiente de sedimentación. En to
dos los estudios mencionados, asi comotambién en los descriptos
en este trabajo se destaca el papel fundamental que desempeña
la estructura secundaria del RNAen el ensamblado de las subuni
dades ribosomales. Posiblemente en los experimentos "in vitro"
la temperatura elevada permite que el RNAadopte la configuración
adecuada para la reacción del ensamblado de las subunidades, mien
tras que "in vivo" cumplirisn la mismafunción las concentracio
nes de cationes inorgánicos y de poliaminas. Por lo tanto el
ayuno de estas sustancias provoca en las bacterias alteraciones
de los mecanismos biosintéticos y/o de ensamblado de 1a subunidad
30-5, de tal manera que se producen particulas ribosomales anor
males.
En bacterias normales los ribosomas que en un instante dado no
participan de la sinÏÉsis proteica se encuentran en equilibrio
con lao subunidades 30-5 y 50-5 libres. Este equilibrio está
fuertemente desplazado hacia las particulas 70-5 debido posible
mente a la gran afinidad mutua que poseen las dos subunidades
ribosomales. Cuandolas necesidades fisiológicas determinan un
mayor flujo de subunidades a los agregados poliribosómicos para
aumentar la sintesis proteica, 1a acción del factor disociante
permite la utilización de los monómerosribosomalea desplazando
el equilibrio hacia las subunidades.
Por otra parte alguros estudios realizados en B. stearothermophilus
( ao ) permitieron aislar un factor asociante de subunidades ri
boaomalea que contiene poliaminas comocomponentes activos. Este
hecho, que confirma las ya conocidas propiedades asociantes de
las poliaminas ( 105), sugirió la posibilidad de que estos catio
nes orgánicos participen en 1a regulación del equilibrio
'70523081" 505.
Las investigaciones descriptas en este trabajo. utilizando cepas
bacterianas deficientes en la biosintesis de poliaminas permitie
ron confirmar esta hipótesis. Cuandoestas bacterias son someti
das a un ayuno de poliaminas, el nivel intracelular de estas sus
tancias disminuye hasta valores muybajos, y no sólo aparecen
particulas 30 S deficientes, sino que también disminuye notable
mente la afinidad mutua de las subunidades ribosomales por lo
que el equilibrio entre monómeroay subparticulas se desplaza
hacia la disociación. Cuandose agrega poliaminas a los cultivos
de las bacterias deficientes se provoca un cambio rápido de la
distribución ribosomal ( Fig. 3 ) produciéndose un aumento en
la cantidad de monómeros70 S y una normalización de las par
ticulas 30 S. El perfil ribosomal de las bacterias deficientes
cuyos cultivos han sido suplementados con putrescina, se vuelve
prácticamente idéntico a la distribución obtenida en la cepa
silvestre de E.coli. Por otra parte cuando los ribosomas obte
nidos de cultivos desarrollados en ausencia de putrescina se
dializan contra soluciones "buffer" que contienen una concentra
ción fisiológica de espermidina, parte de las subunidades se
asocian y se observa una distribución de ribosomas similar a la
obtenida de bacterias cultivadas en presencia de polisminas
(Fig. 6). Ademáslos ribosomas sometidos al tratamiento de diá
lisis se vuelven más resistentes a la disminución de los niveles
de Mg++ (Figs. 7 y 9). La alteración del perfil ribosomal pro
ducido por el ayuno de putrescina es especifica de esta deficien
cia, comolo demuestran los experimentos en los que se elimina
de los medios de cultivo la glucosa o la fuente de nitrógeno,
manteniendo en ambos casos la presencia de poliamina.
Enestas condiciones se obtiene los perfiles característicos del
medio MMÜPcompleto ( Fig. 6 ).
Experimentos recientes han demostrado que ambas subunidades ri
bosomales son capaces de unir espermidina; sin embargo sólo una
pequeña cantidad de la políamina unida a la partícula 3D S es
activa en la asociación de las subunidades (H. Garcia-Patrona
y I. D. Algranati). De acuerdo con estos resultados se ha pos
tulado la existencia de dos sitios de unión para la espermidina
en la particula 30 5. E1 sitio A correspondería a 1a poliamina
que es activa en la asociación, y el sitio B uniria espermidina
que no interviene en la asociación. La partícula 50 S presenta
sitios de unión del tipo B. Es factible suponer que el agrega
do de poliaminas a un cultivo de bacterias deficientes,previa
mente sometidas a un ayuno, aumenta rápidamente los niveles en
dógenos de estas sustancias, permitiendo un correcto ensamblado
de las particulas ribosomales y la saturación de los sitios es
pecificos de unión. Esto lleva a la asociación de subunidades
y al restablecimiento de un equilibrio normal entre monómeros
70 S y subparticulas ribosomales.
197
CONCLUSIONES
Se han postulado múltiples funciones biológicas para las polia
minas. Los resultados aqui presentados demuestran que, además
de las funciones ya conocidas ( 5 ), estas sustancias ejercen
un efecto directo sobre la sintesis proteica, que es indepen
diente de cualquier otro efecto que pueda ocurrir a nivel de la
transcripción de los RNAmensajeros. La acción de las poliami
nao en el proceso de traducción está íntimamente vinculado con
el ensambladoy/o biosintesis de las subunidades ribosomales
(en especial 1a partícula 30 S).
En las cepas bacterianas auxótrofas para poliaminas, los bajos
niveles de putrescina y espermidina producen la aparición de
aubunidades 30 S estructural y Funcionalmente anormales, y el
desplazamiento hacia 1a disociación del equilibrio existente en
tre monómeros70 S y subparticulas ribosómicas.
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