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Prof. Ramss Salas Asencios
POLIMORFISMOS GENTICOS Y MARCADORES MOLECULARES
Polimorfismo significa literalmente muchas formas. As pues, el
polimorfismo gentico, cromosmico o de secuencia del ADN es el
responsable de la gran variabilidad existente entre los individuos
de una misma especie. La diversidad del genoma entre especies es
obvia, mientras que la diversidad del genoma dentro de una misma
especie hace que cada individuo sea nico e irrepetible. Esta
diversidad es la responsable de fenmenos a gran escala como la
evolucin de las especies y de otros de trascendencia menor --pero
no menos importantes-- como las caractersticas diferenciales entre
individuos.
Los polimorfismos pueden encontrarse en las regiones
codificantes del genoma (regiones que codifican para una protena),
recibiendo el nombre de polimorfismos gnicos. Tambin podemos
encontrarlos en las regiones no codificantes (regiones que no
codifican para ningn producto gnico, pero que pueden tener una
funcin reguladora o simplemente estructural); entonces reciben el
nombre de polimorfismos genticos.
Cuando los polimorfismos slo afectan a un nico nucletido
(unidades monomricas de la secuencia del ADN), se denominan SNP
(single-nucleotide polimorphism).
En trminos cientficos, el polimorfismo se define como la
existencia simultnea en una poblacin de genomas con distintos
alelos para un locus determinado. Los alelos son variaciones de la
secuencia del ADN presentes en una posicin definida (locus) dentro
de un cromosoma. Consecuentemente, en una clula diploide cada locus
est ocupado por dos alelos, uno de origen materno y otro de origen
paterno, situados en la misma ubicacin en ambos cromosomas
homlogos.
Existen numerosos mecanismos moleculares bien conocidos que
pueden originar los polimorfismos, como la recombinacin homloga, la
segregacin de cromosomas, las mutaciones, las duplicaciones y las
transposiciones.
La causa ltima de la existencia de los polimorfismos es la
mutacin del ADN. Generalmente, el trmino mutacin se suele atribuir
a situaciones poco frecuentes y que estn asociadas a una patologa,
mientras que el trmino polimorfismo se asocia a una variacin comn
en una poblacin ms o menos estable y no es causa directa de ninguna
patologa. Sin embargo, no existe una diferencia exacta entre ambos
trminos, ya que cualquier mutacin en la secuencia de un gen que se
detecte en la poblacin genera un polimorfismo, afecte o no la
estructura y funcin del organismo.
Cualquiera de estas variaciones puede tener lugar en clulas
germinales o reproductoras, con lo que se transmitir a la
descendencia, dando lugar, en el peor de los casos, a lo que
conocemos como enfermedades congnitas. Cuando los polimorfismos
afectan a las clulas somticas, las clulas no reproductoras no se
transmiten a la descendencia, es decir, no son hereditarias (es el
caso de la mayora de los cnceres). Los polimorfismos fisiolgicos
que no se asocian a una patologa son de inters en estudios
familiares y en la identificacin de individuos, as como en
investigaciones criminales o biolgicas de paternidad. Tambin son de
inters en la expresin diferencial de protenas fisiolgicas y para el
anlisis de ligamiento que conduce al mapeo gentico.
Los polimorfismos patolgicos asociados a una patologa son de
inters en el mundo de la medicina para el diagnstico presintomtico
y prenatal de enfermedades gnicas, para la deteccin de individuos
portadores o para determinar la compatibilidad en trasplantes.
Tambin son de inters para definir riesgos a presentar determinadas
enfermedades como Alzheimer o diabetes, y condicionar la respuesta
a frmacos.
Los polimorfismos que generan variaciones fenotpicas pueden
influir de forma leve en la susceptibilidad a presentar distintas
enfermedades. Consecuencias funcionales
Los polimorfismos pueden tener distinta trascendencia desde el
punto de vista funcional, dependiendo de si afec-
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tan a una regin codificante del genoma, a una regin reguladora o
a una regin no codificante.
Los polimorfismos en regiones codificantes reciben el nombre de
polimorfismos gnicos. Esta clase de polimorfismos pueden tener --o
no-- un efecto sobre el fenotipo. Los polimorfismos gnicos, sin
efecto fenotpico, son los ms comunes y son los responsables de la
diversidad gentica normal entre individuos (p. ej., los
polimorfismos existentes en protenas plasmticas como las
inmunoglobulinas).
Pero cuando un polimorfismo gnico (es decir, que afecta a una
regin del ADN codificante) da como resultado una alteracin
fenotpica, que en ciertos casos es perjudicial, ya que puede
modificar las caractersticas bioqumicas, fisiolgicas e incluso
morfolgicas de la clula, pudiendo originar procesos patolgicos. Slo
en casos excepcionales, esta variacin o mutacin puede ser
beneficiosa, dando lugar a una ventaja adaptativa al individuo,
siendo ste el motor de la evolucin de las especies.
La mayor parte de las mutaciones del genoma tienen lugar en las
regiones ms abundantes del ADN. Son regiones que no codifican
ninguna protena y no tienen ninguna funcin especial conocida.
Consecuentemente, no dan ningn tipo de alteracin fenotpica, pero
son de un gran inters para la bsqueda de genes relacionados con
enfermedades y para la identificacin gentica de individuos. Estas
regiones son las responsables de la exclusividad del perfil gentico
de un individuo. stos son los polimorfismos que se utilizan para la
identificacin de individuos y que han dado lugar al trmino conocido
como huella gentica (fingerprint).
MARCADORES GENTICOS
Un marcador es un carcter o un gen que debido al ligamiento
puede usarse para indicar la presencia de otro gen; es decir,
cualquier caracterstica A (sea un gen, una protena, etc.) que est
asociada a la presencia o expresin de una caracterstica B (como
vigor, altura, resistencia a enfermedades, etc.) puede considerarse
como un marcador, pues la presencia de A necesariamente implica la
de B.
La importancia de los marcadores radica en que ofrecen la
posibilidad de estudiar poblaciones de organismos y seleccionar
aquellos que presentan rasgos de inters para el hombre. En
ocasiones, el uso de marcadores permite seleccionar los individuos
aun antes de que expresen el rasgo de inters. Gracias al empleo de
mar-
cadores ha sido posible mejorar muchas especies que son la base
de la alimentacin del mundo. Hay dos tipos principales de
marcadores: los marcadores morfolgicos y los marcadores
moleculares.
Marcadores morfolgicos
Los marcadores morfolgicos fueron el primer tipo que el hombre
utiliz. Se consideran marcadores morfolgicos a los caracteres de un
individuo que se expresan en un ambiente especfico y que el hombre
identifica con un objetivo determinado. Por ejemplo, en los rboles
de pino podemos usar como marcadores morfolgicos el peso o tamao de
la semillas, pues se ha visto que dicha caracterstica se asocia en
la mayora de las poblaciones con la supervivencia, el crecimiento y
la reproduccin.
Este tipo de marcadores son muy utilizados para estimar la
variacin morfolgica existente en una poblacin. Sin embargo, hay
varias limitaciones para su uso, de las que la principal es
precisamente que se basan en las caractersticas morfolgicas o
expresadas en el individuo (fenotipo), las cuales en muchos casos
son fuertemente influenciadas por el ambiente en que se
desarrollan, adems de que generalmente slo se pueden identificar y
medir en individuos completos o adultos.
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Marcadores morfolgicos o fenotpicos para sndrome de Down
Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares corresponden a cualquier gen cuya
expresin permite un efecto cuantificable u observable
(caractersticas fenotpicas), que adems puede detectarse fcilmente.
Este tipo de marcadores pueden evaluarse desde que los individuos
estn en sus primeros estadios de desarrollo, y se pueden aplicar
usando a todo el individuo o slo parte de l. Se habla de marcadores
genticos cuando se transmiten segn las leyes bsicas de la herencia
mendeliana, por lo que es importante destacar que no todos los
marcadores moleculares pueden considerarse como genticos. Existen
dos tipos de marcadores moleculares: los marcadores bioqumicos y
los marcadores de ADN.
1. Marcadores bioqumicos
Los marcadores bioqumicos incluyen a las protenas y las
isoenzimas o aloenzimas y constituyen la primera generacin de
marcadores moleculares. Las protenas son los productos primarios de
los genes y se forman mediante los procesos de transcripcin y
traduccin, por lo que se ven menos influidos por el ambiente. Las
isoenzimas fueron descubiertas por Hunter y Markert en 1957 y son
diferentes variantes moleculares de una misma enzima presentes en
una especie, las cuales desempean la misma actividad pero pueden
tener diferentes propiedades.
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Prof. Ramss Salas Asencios Estos marcadores tienen la ventaja de
que la tcnica es relativamente barata, accesible y no destructiva
debido a que utiliza pequeas cantidades de material. Adems, el
control gentico de la mayora de las isoenzimas es bien conocido,
por lo que es posible realizar inferencias genticas a partir de los
patrones de bandas observados en los geles. Por otro lado, las
isoenzimas tienen base gentica codominante (es decir, que en un
individuo diploide es posible visualizar la expresin de ambos
alelos); son selectivamente neutrales y estn libres de efectos
deletreos (cuando los alelos tienen efectos negativos que
imposibilitan la reproduccin del genotipo que los posee), efectos
pleiotrpicos (cuando un gen controla la expresin de ms de un
carcter en un individuo) y/o epistticos (dominancia de un gen sobre
otro).
Desde su descubrimiento, las isoenzimas han jugado un papel
importante en muchas reas de la biologa; sin embargo, su utilizacin
ha sido muy limitada debido a ciertas desventajas: 1) presentan
problemas tcnicos; 2) no permiten cubrir todo el genoma, pues slo
representan una estrecha fraccin del contenido gentico; 3 )
nicamente detectan la variacin de los genes que codifican para la
expresin de una caracterstica del individuo; 4 ) se dificulta la
precisin de los datos obtenidos debido al polimorfismo en el tejido
de las isoenzimas (por ejemplo, el polimorfismo detectado en una
hoja no es el mismo que el que se obtiene usando la semilla de un
mismo rbol). Tambin tienen polimorfismo ontogentico, lo cual
implica que los resultados obtenidos sern muy diferentes al
trabajar con material proveniente de un individuo joven y de otro
adulto; adems, las isoenzimas son especficas para determinados
sustratos.
Marcadores de ADN
Los marcadores de ADN constituyen la nueva generacin de
marcadores moleculares y solucionaron el problema de la carencia de
marcadores que tenan las isoenzimas, pues son capaces de generar
una cantidad virtualmente infinita de marcadores. Existen varias
tcnicas para identificar marcadores de ADN, las que se pueden
agrupar en tres categoras: las de hibridacin tipo Southern, las de
reaccin de polimerizacin en cadena (PCR) y las que combinan PCR o
sus productos de ADN con la hibridacin tipo Southern (Southern
Blot).
La hibridacin consiste en la formacin de una molcula de doble
cadena mediante el apareamiento o unin de bases complementarias de
dos molculas de una sola cadena. La hibridacin tipo Southern
explora las variaciones en la longitud o tamao de los fragmentos de
ADN ocasionadas por la restriccin del genoma mediada por una enzima
particular (endonucleasa). Esta tcnica comprende las siguientes
etapas: primero se extrae el ADN del material que deseamos
estudiar; luego se le adicionan enzimas de restriccin
(endonucleasas), las cuales cortan el ADN en fragmentos de
diferente longitud; estos fragmentos son separados en geles de
agarosa, para despus realizar por capilaridad o al vaco la
transferencia de los fragmentos a una membrana de papel de
nitrocelulosa o de nylon (transferencia tipo Southern). Finalmente,
se hibridizan los fragmentos de la membrana con sondas marcadas
(radiactiva o no radiactivamente) para visualizar y detectar las
bandas hibridadas.
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Prof. Ramss Salas Asencios Dentro de esta tcnica se encuentran
los marcadores RFLP (polimorfismo de la longitud de los fragmentos
de restriccin) y los VNTR (secuencias adyacentes que se repiten en
nmero variable).
La tcnica de PCR, o reaccin en cadena de la polimerasa, es una
tecnologa utilizada para multiplicar (sintetizar) in vitro
fragmentos especficos de ADN con la finalidad de detectar una
secuencia o gen de inters en el genoma del individuo en estudio. Se
basa en la amplificacin de fragmentos de ADN a partir de secuencias
de nucletidos denominadas cebador (primer), que son capaces de
reconocer una secuencia blanco para la cual es complementaria. En
forma general,
los principales pasos del PCR son los siguientes: se extrae el
ADN del material a analizar, se separa la molcula del ADN en dos
hebras (desnaturalizacin), se induce el alineamiento o
reconocimiento del cebador con las secuencias blanco
complementarias o molde del ADN, y por medio de la enzima Taq
polimerasa se lleva a cabo la extensin o alargamiento de la molcula
iniciadora (cebador). Este proceso se realiza en un termociclador,
que se encarga de realizar los cambios de temperatura necesarios
para que se desarrollen las etapas o ciclos anteriormente
mencionados. Los ciclos se repiten la cantidad de veces que sea
necesario, hasta obtener la cantidad de copias de ADN que se
requieran.
Dentro de esta metodologa se encuentran los marcadores llamados
RAPD (ADN polimrfico amplificado al azar), PCR iniciada con
microsatlites (MP-PCR), AFLP (polimorfismo de longitud de
fragmentos amplificados) y DAF (amplificacin de huellas del ADN),
entre otros.
Son muy ventajosos los marcadores de ADN ya que no son afectados
por el ambiente, estn presentes en cualquier estadio del individuo,
permiten una deteccin temprana, son universales, muy abundantes, se
requiere poca cantidad de ADN para los anlisis y el ADN es muy
estable y especfico para cada individuo (huella gnica).
Sin embargo, son relativamente costosos, necesitan personal
entrenado, equipos sofisticados y un estricto control de la
contaminacin.
Deteccin de los polimorfismos
Para la deteccin de los polimorfismos existen distintas tcnicas.
La forma ms directa es la secuenciacin del ADN, pero debido a su
complejidad se utilizan otras tcnicas mucho ms simples y rpidas,
como el anlisis de los RFLP (polimorfismos en la longitud de los
fragmentos de restriccin) y los VNTR (polimorfismos en el nmero de
repeticiones en tndem).
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Prof. Ramss Salas Asencios Los RFLP se basan en la deteccin de
aquellas variaciones de secuencia del ADN, que tienen como
consecuencia un cambio en una secuencia reconocida por una enzima
de restriccin. Los fragmentos que se obtienen, mediante estas
enzimas de restriccin, sern de diferente tamao en funcin de los
alelos que presente.
Un ejemplo de estos marcadores es el polimorfismo en
un solo nucletido del gen de la -globina, lo que permite el
diagnstico prenatal de la anemia falciforme.
Por otro lado, los VNTR son regiones de ADN repetitivo, tambin
no codificante, son repeticiones en tndem conocidos como ADN
satlite, minisatlite o microsatlite, en funcin de su tamao. Son
polimorfismos en los que el nmero de repeticiones en tndem es
variable. Estos marcadores proporcionan mucha informacin para el
anlisis de ligamiento gentico, como los mapas genticos, y para la
identificacin de individuos en pruebas forenses y de
paternidad.
Los RFLP y los VNTR se utilizan para la deteccin de
polimorfismos que no tienen efecto fenotpico, como el diagnstico de
paternidad biolgica y el seguimiento de rboles genealgicos. Tambin
se utilizan en la identificacin de sospechosos en procedimientos
penales, por comparacin con el ADN procedente de diversos restos
biolgicos, como la sangre, el semen, la saliva, etc. Y en la
identificacin post mortem de
individuos en casos judiciales o catstrofes.
Asimismo, se utilizan con finalidades clnicas como la
identificacin de biopsias, la posibilidad de transplantes, la
inestabilidad gentica de tumores, etc. Tambin se pueden utilizar
mdicamente para la deteccin de la susceptibilidad frente a procesos
patolgicos, especialmente en la prevencin de enfermedades
complejas.
Finalmente, en el caso de los polimorfismos que tienen un papel
directo con la aparicin de un fenotipo patolgico, son de inters
para realizar un diagnstico o el estudio de los mecanismos
moleculares de la enfermedad.
Los polimorfismos SNP, o de un solo nucletido, son responsables
de una gran parte de la diversidad del genoma humano. Aunque la
mayora de ellos no originan directamente enfermedades, en ocasiones
se localizan muy cerca de mutaciones o polimorfismos involucrados
en procesos patgenos, que los hace tiles como marcadores
genticos.
Anlisis del ADN para establecer relaciones familiares
El anlisis de RFLP y VNTR permite realizar el seguimiento de la
herencia de determinados alelos y, de esa forma, obtener las
relaciones familiares entre varias personas. Incluso se pueden
realizar estudios evolutivos y antropolgicos, como el seguimiento
de las grandes migraciones humanas en la historia y las relaciones
con los antecesores de la especie humana.
Por otro lado, una de las grandes aplicaciones de estos estudios
familiares es el estudio de relacin de una determinada enfermedad
gentica con un polimorfismo determinado. Esta tcnica se utiliza en
enfermedades humanas como la fibrosis qustica y la Corea de
Huntington.
Huella gentica
Los VNTR son secuencias repetitivas que aparecen en mltiples
zonas del genoma, organizando bloques dispersos de repeticiones en
tndem. Estos puntos repetitivos dispersos se pueden detectar
simultneamente en todos los locus en que se encuentran mediante
sonadas de ADN. Cada individuo posee una combinacin nica de estas
secuencias repetitivas; el patrn resultante recibe el nombre de
huella gentica. Slo los gemelos univitelinos poseen huellas
indistinguibles.
La huella gentica se puede utilizar en estudios para establecer
relaciones de parentesco, en las pruebas de paternidad, en la
identificacin de recin nacidos y en casos de criminologa, entre
otros.
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Prof. Ramss Salas Asencios El principio bsico de las huellas
dactilares de ADN es muy simple. Si examinamos un nmero de
polimorfismos suficiente, la probabilidad de que otro individuo
tenga los mismos alelos en cada secuencia es extremadamente baja.
El ADN dejado en la escena de un crimen, en forma de saliva,
sangre, etc. puede ser tipificado por VNTR. Despus se comparan los
alelos de ambas muestras y, si coinciden, se implica al
sospechoso.
El debate surge ante la posibilidad de que alguien ms pueda
tener los mismos alelos que el sospechoso incriminando, pero debido
al alto grado de variabilidad en los VNTR esta posibilidad es muy
pequea, con una probabilidad de error de 10
-9. Debemos tener en cuenta
que estas pruebas no solamente incriminan a un culpable, sino
que pueden beneficiar a personas injustamente acusadas.
Se ha publicado que en aproximadamente un tercio de los casos
criminales en que se ha utilizado la huella gentica como mtodo de
identificacin, el sospechoso ha sido puesto en libertad ya que su
ADN no coincida con el de la prueba inculpatoria.
Anlisis de polimorfismos con fines diagnsticos
El anlisis de polimorfismos puede ser utilizado para detectar la
predisposicin de presentar una enfermedad, e incluso detectarla
antes de su desarrollo. Esto es de gran inters en el diagnstico
prenatal de enfermedades congnitas. As pues, la enfermedad de
origen gentico es la ilustracin ms obvia de una variacin gentica
que afecta a la salud.
La identificacin precoz de este tipo de enfermedades puede
permitir el inicio de un tratamiento preventivo y ms eficaz para
atenuar las manifestaciones clnicas de la enfermedad en cuestin. La
fibrosis qustica es una enfermedad que no se puede evitar pero si
se detecta precozmente se pueden prevenir las infecciones o tratar
la insuficiencia pancretica que agrava la enfermedad.
ASO (Allele Specific Oligonucleotide, Oligonucletido Especifico
de Alelo). Una tcnica bastante utilizada en los primeros aos del
diagnstico molecular, aunque hoy en da ha cado en cierto desuso. Se
basa en el diseo de sondas especficas para el alelo mutado y para
el alelo nativo, utilizando oligonucletidos. El tamao de las sondas
hace que su Tm (temperatura de desnaturalizacin) sea lo
suficientemente distinta para que en determinadas condiciones de
hibridacin la sonda especfica del alelo normal hibride solamente
con ADN normal, y la sonda especfica del alelo mutado hibride
especficamente con ADN genmico que contiene la mutacin. El ADN de
los pacientes (puede ser tanto ADN genmico como un exn amplificado
mediante PCR) se deposita en membranas de nylon haciendo un
"dot-blot", y esas membranas se hibridan con cada una de las sondas
(oligonucletidos marcados con radioactividad o con fluorescencia).
El anlisis de la hibridacin de cada sonda permite identificar si la
muestra contiene un solo alelo mutado (heterocigoto), dos alelos
mutados (homocigoto para la mutacin), o ninguno (homocigoto
sano).
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Prof. Ramss Salas Asencios Hibridizacin in situ con
Fluorescencia (FISH)
La FISH es una tecnologa reciente que utiliza sondas de DNA
marcadas con un fluorforo para detectar o confirmar anomalas gnicas
o cromosmicas que generalmente estn ms all de la capacidad de
resolucin de la citogentica de rutina. En primer lugar, la muestra
de DNA (cromosomas metafsicos o ncleos en interfase) se
desnaturaliza, proceso que separa las hebras complementarias de la
estructura en doble hlice del DNA. A la muestra desnaturalizada se
le aade entonces la sonda de inters, marcada con un fluorforo, que
se asociar al DNA de la muestra en el sitio diana, en el proceso
denominado hibridacin, donde se vuelve a formar una doble hlice. La
seal emitida por la sonda se observa mediante un microscopio de
fluorescencia y as la muestra de DNA se puede clasificar segn la
presencia o ausencia de la seal.
a) FISH de metafase
La FISH puede usarse sobre clulas en metafase para detectar
microdeleciones especficas ms all de la capacidad de resolucin de
la citogentica de rutina, o para identificar material extra de
origen desconocido. Puede tambin ser de ayuda en casos donde es
difcil determinar mediante la citogentica de rutina si un cromosoma
tiene una delecin simple o si est implicado en una reorganizacin
sutil o compleja. Adems, la FISH de metafase puede detectar algunos
de los reordenamientos especficos que se observan en ciertos tipos
de cncer.
El nmero de sndromes de microdelecin diagnosticados por FISH est
aumentando con rapidez. La sensibilidad de estos ensayos es en
todos los casos mejor que la de la citogentica de rutina, pero
depende del sndrome en concreto. En algunos, la sonda es especfica
para el gen defectuoso, como en el Sndrome de Williams, donde el
96% de los pacientes con diagnstico confirmado poseen una delecin
en el gen de la elastina. En otros sndromes como el de
Prader-Willi/Angelman, la etiologa es heterognea y las
microdeleciones slo existen en una parte de los casos (60%).
FISH de interfase
La FISH se puede usar sobre clulas en interfase para determinar
el nmero de copias de uno o varios cromosomas, as como para
detectar algunas reorganizaciones especficas que son caractersticas
de ciertos tipos de cncer. La ventaja principal de la FISH de
interfase es que se puede realizar muy rpidamente si es preciso,
normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las
clulas.
Un buen ejemplo es el ensayo de aneuploida, que se realiza sobre
clulas del fluido amnitico cuando hay una fuerte indicacin clnica
de una de las trisomas ms comunes. Se desnaturalizan los ncleos de
la muestra, se hibridan con sondas especficas para los cromosomas
13, 18, 21, X e Y, y habitualmente en 24 horas se dispone de los
resultados. La prueba de aneuploida suele incluir tambin una
citogentica de rutina para confirmar los resultados o detectar
cualquier anomala no detectada por la FISH de interfase.
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GENTICA FORENSE
La Gentica Forense nace a principios de siglo, cuando Karl
Landsteiner describe el sistema ABO de los hemates y Von Durgen y
Hirschfeld descubren su transmisin hereditaria. Esta ciencia surgi
como una rama de la Criminalstica cuyo objetivo era la
identificacin gentica tanto en casos de investigacin criminal como
en estudios biolgicos de la paternidad. Inicialmente, las
investigaciones se centraban en el estudio de antgenos
eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), protenas sricas, enzimas
eritrocitarias y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores
poda incluirse o excluirse una persona como posible sospechoso por
poseer una combinacin gentica igual o diferente a la del vestigio
biolgico hallado en el lugar de los hechos.
Aunque la Ciencia posea las herramientas necesarias para el
estudio del ADN, su aplicacin en la resolucin de casos judiciales
no se produjo hasta 1985, cuando el Ministerio del Interior
Britnico solicit la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor de Gentica
de la Universidad de Leicester. Los primeros casos de Criminalstica
fueron resueltos gracias a la tcnica de los RFLPs (Fragmentos de
Restriccin de Longitud Polimrfica). Jeffreys descubri la existencia
de unas regiones minisatlites hipervariables dispersas por el
genoma humano que al ser tratadas con enzimas de restriccin
generaban fragmentos de longitud variable. Estudios posteriores
realizados el mismo Jeffreys demostraron que las diferencias en el
tamao de estos fragmentos se deban a que estas regiones consistan
en un determinado nmero de repeticiones en tndem de una secuencia
central, el cual variaba de unos individuos a otros.
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Prof. Ramss Salas Asencios El primer locus de ADN polimrfico fu
descubierto por Wyman y White en 1980 usando una sonda de ADN
arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de ms de 15
longitudes diferentes en una pequea muestra de individuos.
Posteriormente se encontraron otros loci hipervariables como en la
secuencia del gen de la insulina humana, en el oncogen ras, en el
pseudogen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina. Estos
loci hipervariables constaban de repeticiones en tndem de una
secuencia de oligonucletidos (11 a 60 pb), de manera que las
diferentes longitudes de los fragmentos originados dependan del
nmero de dichas repeticiones y se les denomin VNTR (Variable Number
of Tandem Repeat).
Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio que stos
podan ser aplicados a la medicina forense y sustituir a los
marcadores clsicos.
En un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hizo
por medio de la tcnica llamada hibridacin con sondas oSouthern
blot. Esta tcnica consta bsicamente de las siguientes etapas:
1. Digestin del ADN con enzimas de restriccin tras conseguir
extraer un ADN de alta molecularidad.
2. Separacin de los fragmentos obtenidos por medio de una
electroforesis en gel de agarosa.
3. Denaturacinde los fragmentos separados y cortados. 4.
Transferencia de las cadenas simples a una
membrana de nitrocelulosa o nylon y fijacin de las mismas por
medio de calor (80C).
5. Prehibridacin con sondas de ADN inespecfico para bloquear los
lugares de unin inespecficos que pudiera haber en la membrana.
6. Marcaje de la sonda con nucletidos radioactivos (32
P normalmente). 7. Hibridacin de la sonda marcada y
desnaturalizada
con los fragmentos de ADN fijados a la membrana, y lavado de la
membrana para eliminar el exceso de sonda o aquellas que hayan
hibridado mal.
8. Revelado en placa radiogrfica e interpretacin de los
resultados.
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Prof. Ramss Salas Asencios El tipo de sondas utilizadas puede
ser de dos tipos:
Sondas Mono-locus (SLP): son especficas para una regin de un
determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucletidos y
presentan mayor variabilidad que las sondas multi-locus. Como
resultado se observan una o dos bandas por individuo, segn sea
homocigoto o heterocigoto. El patrn de bandas obtenido con estas
sondas se denomina perfil unilocus de ADN o DNA profiling.
Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatlites
presentes en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10
a 15 nucletidos que se repiten mltiples veces y tras el revelado se
observan de 10 a 20 bandas por persona. Este patrn de mltiples
bandas se conoce como huella gentica multilocus o DNA
fingerprint.
Este material no es propiedad intelectual del docente. Es
compilacin de diversas pginas Web y tiene slo uso interno dentro
del Curso de Gentica UCSUR.
