Compilación de artículos realizada por:

Leidy Esmirna Mota Rosa2008-2

UNAD 2011-04-10

A PESAR DE TODA LA CIENCIA…. DIOS SIGUE ESTANDO AL

CONTROL.

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FENOTÍPICA DEL GÉNERO

PSEUDALLESCHERIA Y GÉNEROS AFINES Autores: Felix Gilgado Barbadilla Directores de la Tesis: Josepa Gené Díaz, José Francisco Cano Lira, Josep Guarro

Artigas Lectura: En la Universitat Rovira i Virgili ( España ) en 2008 ISBN: 978-84-691-1010-2 Depósito Legal: T.2218-2007

Pseudallescheria es un género de ascomicetos caracterizado por ser polimórfico, ya que pueden

presentar hasta tres formas morfológicamente diferentes, una forma sexual o teleomorfo y dos

formas asexuales o anamorfos (sinanamorfos). Estas dos formas asexuales se clasifican en los

géneros anamórficos Scedosporium y Graphium. Pseudallescheria boydi es la especie más

importante del género debido a que es considerado un hongo patógeno emergente capaz de

producir infecciones graves especialmente en pacientes inmnusuprimidos. Hasta la presente

tesis, el anamorfo de P. boydii era Scedosporium apiospermum.

En los últimos años, P. boydii ha sido objeto de diversos estudios moleculares que han

mostrado su elevada variabilidad intraespecífica. Otros trabajos han puesto de relieve su

variabilidad en cuanto a la respuesta a los antifúngicos así como la diferente virulencia que

existe entre sus cepas. Todo ello hacía suponer que en lugar de una sola especie nos hallábamos

frente a un complejo de especies. Por esta razón decidimos realizar un estudio molecular y

morfológico utilizando numerosas cepas tanto clínicas como ambientales y de diferentes países.

Gran parte de las cepas ambientales fueron aisladas por nosotros con la utilización del medio

selectivo DRBC con benomilo. El análisis de secuencias parciales del gen de la ß-tubulina (dos

loci) y la calmodulina y las regiones ITS del ADNr demostraron que P. boydii es un complejo

de especies. El análisis combinado de las secuencias de los 4 loci nos permitió la distinción de

8 especies filogenéticas agrupadas en 4 clados diferentes. Los clados 1 y 2 fueron descritos

como las nuevas especies Scedosporium aurantiacum y Pseudallescheria minutispora,

respectivamente. El clado 5 consistió en 4 subgrupos incorporando las cepas tipos de P. boydii

Pseudallescheria angusta, Pseudallescheria ellipsoidea y Pseudallescheria fusoidea. En el caso

de los clados 3 y 4 fueron considerados únicamente como especies filogenéticas en este primer

estudio. Posteriormente, para facilitar la identificación de estas 8 especies filogenéticas en

laboratorios de microbiología clínica, se estudiaron las características morfológicas macro- y

microscópicas mas representativas de todas ellas así como su respuesta a 59 pruebas

fisiológicas. Para incrementar la robustez de los diferentes clados, aumentamos el número de

nuevos aislados y de éstos se secuenció la región TUB del gen de la ß-tubulina, el cual

previamente demostró ser el marcador molecular más informativo de los 4 evaluados. La

combinación de estos estudios permitió distinguir fenotípicamente las mencionadas especies

filogenéticas. La nueva especie Scedosporium dehoogii (previamente clado 3) fue descrita y

Scedoporium apiospermum (previamente clado 4) y P. boydii fueron consideradas como dos

especies diferentes. El nuevo nombre Scedosporium boydii fue propuesto para denominar al

anamorfo de la última especie. Scedosporium dehoogii pudo ser separada del resto porque no

crece a 40ºC y presenta conidioforos no ramificados. Aunque S. apiospermum fue

morfológicamente indistinguible del anamorfo de P. boydii ambas especies pudieron ser

separadas por su respuesta a las pruebas de la D-ribosa y por la presencia o ausencia de

teleomorfo.

Durante la búsqueda de nuevos aislados utilizando el medio DRBC suplementado con

benomilo, aislamos un hongo interesante de suelo de Argentina que presentaba una morfología

similar a la de Scedosporium. Un estudio más detallado a nivel genético y morfológico nos

permitió ver que este hongo era diferente a las especies conocidas de éste y otros géneros

relacionados, por lo que propusimos el nuevo género Parascedosporium. Su carácter distintivo

es el desarrollo simpodial de los conidios a partir de células conidiógenas denticuladas. Este

aislado resultó ser morfológicamente idéntico a Graphium tectonae, por lo que propusimos la

nueva combinación Parascedosporium tectonae. El análisis filogenético de las secuencias de 4

regiones de los 3 genes ya trabajados en el primer estudio confirmó nuestra propuesta.

En esta tesis también evaluamos la actividad in vitro de 11 antifúngicos (anfotericina B,

albaconazol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, posaconazol, ravuconazol, voriconazol,

terbinafina, micafungina y flucitosina) utilizando el método de microdilución del CLSI contra

84 aislados pertenecientes a las 8 especies que constituyen el complejo P. boydii. Encontramos

diferencias significativas entre las especies, siendo Scedosporium aurantiacum la más

resistente. En general, el voriconazol fue el antifúngico más activo, seguido del posaconazol.

Otro objetivo de la presente tesis fue comparar la virulencia de alguna de las diferentes especies

del complejo utilizando un modelo murino con animales inmunocompetentes e

inmunosuprimidos. Se seleccionaron 2 inóculos diferentes, 5x104 conidia/mL (para los

animales inmunosuprimidos) y 1x106 conidia/mL (para los animales inmunocompetentes). S.

aurantiacum y S. dehoogii fueron significativamente las especies más virulentas, causando la

muerte del 80% y 70% de los ratones inmunocompetentes, respectivamente, mientras que el

resto de las especies sólo consiguió entre un 0% y un 20% de mortalidad.

Finalmente, debido a que ninguna de las cepas estudiadas de la especie más común del

complejo, S. apiospermum, había desarrollado la forma sexual, consideramos interesante

determinar si se trataba de una especie heterotálica. Para ello, realizamos cruzamientos con 15

cepas de S. apiospermum en todas las combinaciones posibles, incluyendo cruzamientos

consigo misma. Algunos cruzamientos entre distintas cepas produjeron ascomas fértiles,

mientras que los cruzamientos con subcultivos de una misma cepa resultaron autoestériles. Las

cepas pudieron separarse en dos diferentes mating types. Corroboramos el bi-alelismo del

sistema de cruzamiento heterotálico mediante cruzamientos entre las ascosporas de la progenie

F1 de un cruzamiento positivo. Todos estos datos confirmaron que S. apiospermum es una

especie heterotálica.

Revista Cubana de Pediatríaversión impresa ISSN 0034-7531

Rev Cubana Pediatr v.74 n.2 Ciudad de la Habana abr.-jun. 2002

Artículos originales

Centro Nacional de Genética Médica. Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana

Caracterización molecular de fenilcetonúricos cubanos

Lic. Enna Gutiérrez García,1 Dra. Bárbara Barrios García,2 Lic. Reinaldo Gutiérrez Gutiérrez3 y Dra. Astrea Damiani Rossel4

Hasta el momento se han descrito más de 500 mutaciones en el gen de la fenilalanina

hidroxilasa humana (PHA), distribuidas a lo largo de sus 13 exones, y es el 7 el que posee

un número mayor. El hecho de que la fenilcetonuria sea causada por mutaciones puntuales,

hace necesario la utilización de un método que permita el análisis rápido de cada individuo.

En este estudio se analizó el ácido desoxinucleótico (DNA) genómico de 28 pacientes

fenilcetonúricos (PKU) y a sus padres, provenientes de diferentes partes de Cuba. Se realizó

amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en los 13 exones, antes

de efectuar el método de electroforesis en geles de gradientes desnaturalizantes (DGGE) y

secuenciación. Se hallaron 16 mutaciones diferentes en el 91 % del total de cromosomas

independientes de los pacientes, y fueron las mutaciones más frecuentes la E280K y la

R261Q, que es originaria de Galicia. Se comprobó la herencia mendeliana en los padres. Las

mutaciones más frecuentes en Cuba no coinciden con las de España y América Latina.

DeCS: FENILCETONURIAS/diagnóstico; FENILALANINA HIDROXILASA/análisis. FENILALANINA

HidROxilasa/genética; MUTACION; ADN; REACCION EN CADENA POR POLIMERASA;

ENFERMEDADES HEREDITARIAS; BIOLOGIA MOLECULAR.

El gen de la PAH se encuentra localizado en la región q22-q-24.1 del cromosoma 12; tiene

aproximadamente 90 kilobases (kb) de longitud y 13 exones, con intrones de tamaños entre

1 kb y 24 kb, exones entre 57 pares de bases (pb) y 197 pb. Los exones, del 6 al 13, están

conformados también por aproximadamente 847 pb de ácido ribonucloico (ARN) mensajero,

todo compactado en un fragmento de 16 kb del gen, mientras que los exones del 1 al 5

(509 pb) están separados de grandes intrones, el más pequeño de los cuales tiene 4,5 kb. El

ARNm maduro tiene 2,4 kb de longitud. La región codificante tiene 22 sitios CPG,5 de los

cuales están ubicados en el exón.1

Hasta el momento se han descrito más de 500 mutaciones en el gen de la PHA, distribuidas

a lo largo de los 13 exones, aun que es en el exón 7 donde se ha hallado un mayor número

de ellas. Las más frecuentes son las 233, que producen sustitución de un aminoácido. Se

han descrito 50 deleciones, 45 mutaciones que producen un procesamiento erróneo del pre

ARNm, 22 además de la sustitución de un aminoácido por un codón de parada, y 5

inserciones, se han encontrado 24 polimorfismos, que no causan afección.

Aproximadamente el 10 % de estas mutaciones han sido descritas en regiones llamadas

“Islas CpG” (CpG Island), que son regiones altamente susceptibles de sufrir cambios por la

presencia de dobletes CpG.2

Las hiperfenilalaninernias (HFA), se producen por mutaciones en el gen que codifica para la

enzima fenilalanina hidoxilasa, que actúa sobre la conversión de fenilalanina a tirosina;

como consecuencia se acumula la fenilalanina en el organismo y se produce, como signo

clínico principal, retardo mental, el grado de retardo mental va a estar de acuerdo con la

mutación que es la que define que la enzima tenga más o menos actividad; cuando los

casos son más severos, se conocen como fenilcetonuria. Se pueden diagnosticar mediante

pruebas que detecten la presencia de fenilalanina en la sangre, como el método

microbiológico de Guthrie,3 que consiste en la toma de sangre capilar de los niños al

nacimiento y se compara el nivel de crecimiento inducido por la muestra con los niveles

estándar en una cepa de la bacteria Bacillus subtilis que requiere fenilalanina para su

crecimiento.

El pesquisaje neonatal es el mejor método para la detección temprana de las HFA. En Cuba,

a partir de 1984 en el marco del programa de diagnóstico y prevención de enfermedades

hereditarias, comienza a realizarse el pesquisaje de PKU mediante la mencionada prueba.4

Se han diagnosticados 28 niños con PKU y 56 con HFA persistente en toda Cuba.

Todos los casos detectados se encuentran bajo tratamiento dietético para evitar el retraso

mental, aunque en la actualidad en muchos países desarrollados, el tratamiento se realiza

de forma más individualizada, conociendo la mutación al nivel del gen y así poder

correlacionar genotípofenotipo, para poder darle el tratamiento más acorde con la mutación

que presenten los pacientes. Con este objetivo es que se decidió realizar este trabajo, para

conocer las mutaciones de los casos de PKU y de HFA y así poder ofrecer una mejor

atención a los pacientes detectados por el Programa Nacional de Detección Precoz de la

Fenilcetonuria.

Métodos

En este estudio analizamos DNA genómico obtenido a partir de sangre periférica de 28 PKU

y 42 familiares de éstos procedentes de diferentes provincias de nuestro país, 20 de los

cuales se detectaron neonatalmente por el Programa de Fenilcetonuria, el resto fueron

casos que se diagnosticaron tardíamente, pues nacieron antes de existir dicho Programa.

Para realizar el DGGE se amplificaron mediante la técnica de reacción en cadena de PCR,

según Pérez B y otros los 13 exones de la PHA, con sus correspondientes secuencias

intrónicas adyacentes, y posteriormente se aplicaron en geles desnaturalizantes de

ureaformamida de 0 a 80 %, tras la generación de heteroduplex, lo que permitiría detectar

todas las variaciones de secuencia presentes en estos fragmentos del gen de todas las

variaciones de secuencia presentes en estos fragmentos del gen de la PHA. Tras el análisis

por DGGE,6 aquellos exones con patrones de bandas aberrantes se secuenciaron

directamente en un secuenciador automático ALF express DNA. Sequencer, utilizando un kit

de reactivos Promega. En algunos casos por la reproducibilidad del método, el patrón de

bandas obtenido en la DGGE nos permitió determinar directamente la mutación, al comprar

los patrones obtenidos con las mutaciones detectadas anteriormente, y no fue necesario

secuenciar dicho exón.

Resultados

En la tabla 1, se puede observar el total de mutaciones por exones. En ésta se aprecia que

el mayor número corresponde al exón 7.

Tabla 1. Mutaciones por exones

Exón No. de mutaciones 7 28 10 6 11 4 12 1 3 7 5 1 6 2 2 1

Total de cromosomas independientes estudiados: 56.

Total de mutaciones identificadas: 51 % de mutaciones encontradas: 90

En la tabla 2, se pueden ver las 16 mutaciones diferentes encontradas en los diferentes

exones del gen de la PHA. Se observa que las más frecuentes fueron la E280k y la R261Q.

Tabla 2. Tipos de mutaciones hallados

Mutación Cantidad FenotipoE280 K 11 SeveroR261Q 9 Severo I65T 3 Moderado IVS-10 4 Severo R252W 3 Severo R68S 4 Moderado R243X 2 Severo IVS-12 1 Severo F39L 1 ModeradoL248V 1 Moderado S349 1 Severo R15Q 1 Severo V38M 4 Moderado R76X 2 Severo 40SW 3 SeveroA403V 1 Benigno

Total de mutaciones diferentes: 16.

Resultaron ser las más frecuentes en Cuba la E280K(19,3 %) y la R261 Q(16 %).

Discusión

En el estudio se identificaron el 91 % de las mutaciones de los 28 PKU estudiados, para un

total de 51 cromosomas indepen-dientes de un total de 56. La mayoría de las mutaciones

se verificaron en el exón 7, con un total de 28 (tabla 1), para coincidir con lo que está

reportado en la literatura médica.7

Se hallaron 16 mutaciones diferentes y fueron las más frecuentes la E280k y la R261 Q, la

cual es originaria de Galicia (tabla 2), también se puede observar en la tabla, el fenotipo

que producen estas mutaciones. En el estudio molecular, de 42 padres de los PKU se

comprobó el carácter de la herencia mendeliana de las mutaciones encontradas. En la

distribución de las mutaciones por provincias, se destacan. Holguín, y fue la mutación más

frecuente la E280K (45,4 %) y la Habana co la R261 Q (27,7 %).

De los PKU cubanos analizados (28), 20 de ellos fueron detectados por el Programa de

Fenilcetonuria, neonatalmente, de un total de 23, con posibilidades de diagnóstico. Las

mutaciones más frecuentes en Cuba (E280 K y R261Q) difieren de las de España (IVS-10,

A403V, V388M, I65 T,8 y América Latina (IVS10, V388, 165T, R243Q, R408W e IVS-12,9 lo

cual puede ser porque las migraciones hacia Cuba, se originaron de parte de España

diferentes a las de América Latina. Se encontró el 20 % de consanguinidad en los padres de

los casos analizados, lo cual también puede ser parte de la explicación de la alta frecuencia

de las 2 mutaciones mencionadas anteriormente. Se demostró la herencia mendeliana de

las mutaciones halladas en el estudio de 84 cromosomas de los 42 padres estudiados.

Resultó interesante que una de las madres estudiadas, presenta fenilcetonuria atípica, y es

homocigótica para la mutación V388M, que en homocigosis, produce un fenotipo

intermedio. También se halló que el caso número 33 era efectivamente portador de 2

mutaciones que producen hiperfenilalaninemia benigna (A403V/R68S), pues la primera se

considera una mutación para HPA benigna, y la segunda como una mutación que produce

un fenotipo suave que, sin embargo, al estar en heterocigosis compuesta produce HPA

benigna, lo que coincide con el diagnóstico realizado al nacimiento por los niveles de

fenilalanina en plasma (4,9 mg %). En estos momentos se está trabajando en la correlación

genotipo-fenotipo, para ajustar el tratamiento y así mejorar la atención a estos pacientes.

Agradecimientos

Expresamos nuestro agradecimiento al Centro de Biología Molecular de la Universidad

Autónoma de Madrid, por su colaboración y apoyo en la realización de este trabajo. Un

agradecimiento especial para las doctoras Magdalena Ugarte, Lourdes Desviat, y Belén

Pérez

Referencias bibliográficas

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consortium database: update 1996. Nucleic Acids Res 1997;25(1):139-42.

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dinucleotides are mutations hot spot in phenylketonuria. Genomics 1989;5:935-9.

3. Guthrie R, Susie A. A simple method for detecting phenylketonuria in large

populations of newborn infants. Pediatrics 1963;32:338-43.

4. Heredero L, Atencio G, Vega JL, Gutiérrez E. Programa para el diagnóstico

precoz de la fenilcetonuria en Cuba (informe preliminar). Reb Cubana Pediatr

1986;58:27-33.

5. Pérez B, Desviat L, Cornejo V, Ugarte M. Mutations and polymorphisms in

phenylalanine hydroxylase gene in Chile. Am J Hum Genet 1995 (Suppl);57:A971.

6. Gulberg P, Guttler F. Broad range DGGE for single-step mutation scanning of

entire gene: application to human phenylalanine hydroxylase gene. Nucleic Acids

Res 1994;22(5):880-1.

7. Dworniczak B, Kalaydjieva L, Pankoke S, Aulehla-Scholz C, Allen G, Horst J.

Analysis of exon 7 of the human phenylalaninc hydroxylase gene: a mutation hot

spot. Hum Mut 1992;1(2):138-46.

8. Eisensmith R, Okano Y, Dsovich M, Wang T, Guttler F, Lou. Multiple origins for

phenylketonuria in Europe. Am J Hum Genet 1992;51:1355-65.

9. Pérez B, Desviat L, Cornejo V, Ugarte M. Mutations and polymorphisms in

phenylalanine hydroxylase gene in Chile. Am J Hum Genet 1997(Suppl);57:A971.

Recibido: 21 de febrero de 2002. Aprobado: 19 de marzo de 2002.

Lic. Enna Gutiérrez García. Avenida 31, No. 3102, esquina a 146, municipio Playa. Ciudad de

La Habana, Cuba. mailto:rey@infomed.sld.cu Fax.7-53-33-1502

1 Licenciada en Ciencias Biológicas. Investigadora Agregada. Centro Nacional de Genética

Médica.

2 Doctora en Ciencias Biológicas. Profesora Titular. Centro Nacional de Genética Médica.

3 Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. Investigador Aspirante. Centro Nacional de

Genética Médica.

4 Doctora en Medicina. Especialista de II Grado en Nutrición. Instituto de Nutrición.

©  2011  1999, Editorial Ciencias Médicas

Calle 23 # 177 entre N y O - Edificio Soto, Piso 2

Vedado, Ciudad de La Habana, CP 10400

Cuba

Caracterización molecular de un nuevo begomovirus del tomate en el Valle del

Cauca y búsqueda de fuentes de resistencia para el mejoramiento de la variedad Unapal

MaravillaMartínez Ascanio, Ana Karine (2008) Caracterización molecular de un nuevo begomovirus del tomate en el

Valle del Cauca y búsqueda de fuentes de resistencia para el mejoramiento de la variedad Unapal Maravilla. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia.

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En los últimos años, el Valle del Cauca ha sufrido la incidencia de begomovirus en plantaciones de tomate

causando el abandono de muchas áreas de cultivo. El control de estos virus ha estado enfocado hacia el

control del vector pero las medidas implementadas no son totalmente efectivas. Por esta razón, el desarrollo

y uso de variedades de tomate resistentes a los begomovirus se plantea como la mejor alternativa de control

de estos patógenos. En este trabajo se caracterizó molecularmente al virus transmitido por la mosca blanca

Bemisia tabaci al tomate en el Valle del cauca, como una variante del Virus del mosaico amarillo del tomate

(Tomato yellow mosaic virus = ToYMV). Se evaluaron, como posibles fuentes de resistencia a este virus, las

líneas de tomate FLA 496-11-6-1-0, FLA 478-6-3-1-11, FLA 456-4 y FLA 653-3-1-0. Plantas de 20 días de

edad fueron confinadas en jaulas individuales con 10 individuos virulíferos de B. tabaci (biotipo B) por planta,

en condiciones de invernadero. La infección por el virus se confirmó por el desarrollo de los síntomas y las

pruebas moleculares de PCR e hibridación dot blot. Las características agromorfológicas se evaluaron en

campo en un diseño de bloques completos al azar con tres repeticiones. Las líneas FLA 653-3-1-0, FLA 496-

11-6-1-0 y FLA 478-6-3-1-11 desarrollaron síntomas muy leves, el ADN viral fue apenas detectable para

algunos individuos y presentaron características del fruto y rendimientos deseables, indicando que son

buenas fuentes de resistencia

02/2011 -

Caracterización molecular de los tumores de mama detectados entre

mamografías de cribadoUn equipo multidisciplinar del Hospital del Mar ha llevado a cabo un estudio caso-control para

caracterizar los tumores que aparecen en los intervalos entre dos mamografías de rutina.

Estos tumores, que reciben el nombre genérico de cánceres de intervalo, agrupan tanto

errores de interpretación de la mamografía (falsos negativos) como tumores de rápido

crecimiento (verdaderos cánceres de intervalo). El presente estudio se ha centrado en la

caracterización de los verdaderos cánceres de intervalo, reportando una mayor frecuencia de

un patrón molecular de biomarcadores que se asocia a un peor pronóstico. Por otro lado,

también se ha visto que, a igualdad de edad de las mujeres, estos tumores se presentaban

más frecuentemente en mujeres con elevada densidad mamaria.

Referencias

"Phenotypic characterization and risk factors for interval breast cancers in a population-based breast cancer screening program in Barcelona, Spain". Domingo L, Sala M, Servitja S, Corominas JM, Ferrer F, Martínez J, Macià F, Quintana MJ, Albanell J, Castells X. Cancer Causes Control (2010) 21: 1155-1164.

Los programas de detección precoz del cáncer de mama tienen el objetivo de disminuir la mortalidad por esta enfermedad a partir de la detección precoz de los tumores, es decir, cuando estos aún se encuentran en estadios poco avanzados. Desde hace más de 15 años, en España se han ido poniendo en marcha programas de cribado que invitan a las mujeres de entre 50 y 69 años (en algunas provincias a partir de los 45 años) a hacerse una mamografía cada 2 años. Gracias a los esfuerzos realizados, se ha conseguido una buena tasa de participación (alrededor del 70%), punto clave para poder conseguir un impacto importante en la disminución de la mortalidad. Se calcula que aproximadamente por cada 1000 mujeres participantes, 4 serán diagnosticadas de cáncer de mama, y que de estos tumores cerca del 70% estarán en estadios poco avanzados (tumor in situ y de estadio 1), asociados a un buen pronóstico. Aunque la mayoría de los tumores se detectan en las pruebas de cribado, un número reducido pueden aparecer durante el intervalo entre dos mamografías de rutina, estos tumores reciben el nombre genérico de cánceres de intervalo, y agrupan tanto errores de interpretación de la mamografía (falsos negativos) como tumores de rápido crecimiento (verdaderos cánceres de intervalo).

Los resultados del presente estudio demuestran que en el momento del diagnóstico, la mayoría de cánceres de intervalo estaban en estadios avanzados (60% en estadios 2 y 3), aumentando el porcentaje hasta el 76.5% en el grupo de los verdaderos cánceres de intervalo. Por otro lado, a nivel molecular los cánceres de intervalo también presentaron características de mayor agresividad: mientras que el 7.5% de los tumores detectados en el cribado eran triple negativos (combinación de biomarcadores asociada a un peor pronóstico y menor respuesta a las terapias adyuvantes existentes ), entre los cánceres de intervalo el porcentaje era del 17.1%, y entre los verdaderos intervalos, del 28%. Estas diferencias apuntan a que los cánceres de intervalo, más allá de presentarse en estadios más avanzados, lo que puede explicarse por la

detección por sintomatología clínica, parecen compartir características de mayor agresividad que los harían menos susceptibles de ser detectados en las pruebas de cribado. Aunque todavía queda lejos poder llegar a definir un grupo de mujeres con características comunes que las hagan más susceptibles de presentar estos cánceres, los datos han rebelado que a igualdad de edad, más de la mitad de las mujeres con cáncer de intervalo presentaba elevada densidad mamaria (53.9%), y cerca del 30% reportaba antecedentes personales de patología mamaria.

Estos resultados aportan nuevos datos en el actual debate del equilibrio entre riesgos y beneficios derivados de los programas de detección precoz del cáncer de mama. La caracterización de los cánceres de intervalo y la determinación de características comunes entre las mujeres que los presentan pueden ayudar a mejorar la eficiencia del cribado, a partir de la elección de intervalos óptimos de cribado o el uso de diferentes tecnologías para grupos específicos de mujeres.

Los resultados obtenidos a partir de este estudio animan a los investigadores a continuar profundizando en el estudio de determinantes que condicionan la aparición de los cánceres de intervalo, habiendo iniciado este último año un nuevo proyecto que agrupará información de diferentes programas de detección precoz del Estado Español. Con este trabajo se pretende poder disponer en menos de 3 años de información que pueda ser útil tanto para mejorar la información que reciben las mujeres participantes, como para ayudar en la toma de decisiones al planificar las estrategias de cribado más adecuadas en función del nuevo conocimiento.

Laia Domingo Torrell

Servei d'Epidemiologia i AvaluacióHospital del Mar-IMIM

ldomingo@parcdesalutmar.cat

03/2011 -

Diagnóstico genético pre-implantacional con una técnica rápida de hibridación genómica

comparadaEn esta tesis doctoral se ha desarrollado una nueva variante de la Hibridación Genómica Comparada (CGH), que reduce drásticamente el tiempo de hibridación. Esta técnica, aplicada al Diagnóstico Genético Preimplantacional, ofrece un análisis completo de todos los cromosomas y permite obtener los resultados mucho más rápido y con la misma eficiencia que con la CGH convencional, de modo que los embriones cromosómicamente normales seleccionados pueden ser transferidos al útero materno en el mismo ciclo de la fecundación in vitro sin tener que criopreservarlos.

Referencias

"Hibridació Genòmica Comparada ràpida: aplicació al Diagnòstic Genètic Preimplantacional". Tesis doctoral de Mariona Rius i Mas (2010). Directores: Joaquima Navarro Ferreté, Jordi Benet Català i Maria Oliver Bonet.

El Diagnóstico Genético Preimplantacional (PGD) permite seleccionar, dentro de un programa de fecundación in vitro (FIV), embriones libres de alteraciones cromosómicas para la transferencia al útero materno. Actualmente, la metodología más frecuentemente utilizada para esta finalidad es el análisis de un blastómero de los embriones en el tercer día de su desarrollo mediante la Hibridación in situ Fluorescente (FISH), que sólo permite estudiar de manera rutinaria nueve de los 24 tipos diferentes de cromosomas existentes. Una técnica alternativa menos utilizada es la Hibridación Genómica Comparada (CGH), que permite hacer un análisis citogenético completo de todo el cariotipo. Se basa en establecer una

hibridación competitiva entre un DNA control con cariotipo 46, XY y un DNA problema, en proporción 1:1 y marcados con fluorescencias verde y roja, respectivamente, sobre metafases de linfocitos euploides. Los resultados se evalúan con un programa informático que integra los valores de las fluorescencias hibridadas y permite determinar si hay ganancias o pérdidas de material cromosómico en el DNA estudiado. Esta metodología, sin embargo, es bastante compleja y requiere un tiempo mayor que la duración del ciclo de FIV para obtener los resultados, de manera que los embriones analizados se han de criopreservar y transferir en otro ciclo adicional, que en muchos casos afecta la viabilidad de los embriones biopsiados.

El objetivo de esta tesis doctoral ha sido desarrollar y aplicar una metodología de CGH rápida en que el tiempo de hibridación se ha reducido de 72 horas a 12 horas, de forma que no sea necesaria la criopreservación de los embriones analizados.

Para su puesta a punto, se han analizado fibroblastos aislados de líneas celulares con alteraciones cromosómicas conocidas, el resultado de CGH rápida de los cuales ha confirmado en todos los casos la presencia de estas alteraciones.

Una vez desarrollado el protocolo de CGH rápida, se ha adaptado y validado para el análisis de blastómeros, empleando embriones descartados de casos de PGD mediante FISH con nueve sondas para los cromosomas 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22 , X e Y (FISH-9-cr). Este análisis ha puesto de manifiesto que las discordancias entre los resultados de la CGH rápida y los de la FISH-9-cr son debidas principalmente a la existencia de mosaicismo, es decir, a la presencia de diferentes líneas celulares con respecto a su cariotipo en un mismo embrión, pero también a errores de la FISH.

La CGH rápida también se ha utilizado para hacer el análisis de 22

embriones de pacientes de edad materna avanzada descartados del PGD con FISH-9-cr. Este estudio ha revelado la presencia de aneuploidías o errores cromosómicos numéricos (el 38,5% de los cuales no se habrían detectado mediante la FISH) y de errores cromosómicos estructurales (en el 31,8% de los embriones), así como de mosaicismo (en el 77,3% de los embriones) en los diferentes blastómeros analizados.

Una vez demostrada su fiabilidad, la técnica se ha aplicado clínicamente para el cribado de aneuploidías en casos de edad materna avanzada, de abortos de repetición y de fallos repetidos de implantación, en los que se ha obtenido una tasa de implantación de los embriones transferidos del 60%.

Previa comprobación de que la CGH rápida era capaz de detectar desequilibrios parciales de cromosomas con un límite de resolución de 10-20Mb, esta metodología se ha aplicado en el PGD de portadores de translocaciones cromosómicas Robertsonianas (tres casos, cuatro ciclos de FIV-PGD), recíprocas (dos casos, tres ciclos de FIV-PGD) y un caso de una doble translocación (tres ciclos de FIV-PGD), en los que se ha obtenido un elevado éxito de diagnóstico y dos embarazos. En los casos de translocaciones, la CGH rápida permite estudiar la segregación de los cromosomas implicados en la reorganización, al tiempo que el resto de cromosomas de la célula.

La variante de CGH desarrollada, pues, permite estudiar todos los cromosomas de la célula y detectar tanto alteraciones numéricas como estructurales en un solo procedimiento que, debido a la reducción del tiempo de hibridación, es compatible con la transferencia en fresco los embriones seleccionados. Por lo tanto, su implementación puede incrementar la tasa de implantación de los embriones transferidos después

del PGD.

Análisis de CGH del cariotipo de un embrión femenino. La pérdida del cromosoma 3 y la ganancia del cromosoma 18 quedan reflejadas con la integración de las fluorescencias.

Análisis de CGH del cariotipo de un embrión femenino. La pérdida del cromosoma 3 y la ganancia del cromosoma 18 quedan reflejadas con la integración de las fluorescencias.

Mariona Rius i Mas

Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología

mariona.rius@uab.cat

Agricultura técnica en Méxicoversión impresa ISSN 0568-2517

Agric. Téc. Méx v.32 n.2 México may./ago. 2006

Caracterización molecular de genotipos comerciales y elite de papa (Solanum tuberosum

L.) en México*Fermín Orona–Castro1, Víctor Pecina–Quintero2, Mario Alberto Rocha–Peña3, Mateo Armando Cadena–

Hinojosa4, Octavio Martínez de la Vega5 e Isidro Humberto Almeyda–León3,

1 Campo Experimental Edzná, INIFAP. Km 17 carretera Cayal–Edzná, Nhoyaxxhe, Campeche.2 Campo Experimental Río Bravo, INIFAP.

3 Campo Experimental General Terán, INIFAP.4 Campo Experimental Valle de México, INIFAP.

5 Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad–Irapuato.

* Recibido: Junio de 2005 Aceptado: Mayo de 2006

 

Durante el 2003, se caracterizaron 13 variedades comerciales y tres líneas elite de papa mediante las técnicas de RAPD y SSR. Con la técnica de RAPD se evaluaron 40 iniciadores y se seleccionaron tres (Alpha ADN2, Alpha ADN23 y Alpha ADN30); Alpha ADN2 se usó individualmente, mientras que Alpha ADN23 y Alpha ADN30 se usaron de manera combinada. Con la técnica de SSR se evaluaron seis pares de iniciadores y se seleccionaron cuatro (M1F/M2R, M3F/M4R, M5F/M6R y M7F/M8R). Las relaciones genéticas entre genotipos se calcularon por el método de Similitud Genética. La matriz de distancias generada se utilizó para producir un dendrograma por medio de análisis de conglomerados (UPGMA). Todos los materiales fueron diferenciados por el patrón de fragmentos obtenidos con las dos técnicas utilizadas; con la técnica de RAPD se observaron un total de 26 fragmentos, de los cuales 69.23% fueron polimórficos y en SSR se obtuvieron un total de 49 fragmentos, de los cuales 83.67% fueron polimórficos. Se observó una gran similitud genética entre los materiales ya que la máxima distancia genética entre los diferentes grupos fue de 0.19. Las relaciones genéticas más cercanas fueron entre las variedades Sancal y NAU–6 con un valor de 88% en los

intervalos de confianza de Felsenstein. Se identificaron ambos grupos de genotipos, unos estrechamente relacionados y otros, como la variedad Monserrat, genéticamente distintos. Esta información permitirá diseñar los cruzamientos adecuados en el programa de mejoramiento.

KasmeraISSN 0075-5222 versión impresa

 Kasmera v.35 n.2 Maracaibo dic. 2007

Caracterización Molecular y Detección de Betalactamasas de Espectro Extendido en Cepas de E. coli y K. pneumoniae Aisladas

en las Unidades de Cuidados Intensivos de un Hospital

Universitario Perozo-Mena, Armindo1; Castellano-González, Maribel2; Ginestre-Pérez, Messaria2 y Harris, Belinda3 La producción de Betalactamasas de Espectro Extendido por cepas de E. coli y K. pneumoniae, es un grave problema de salud pública ya que causa la pérdida de la eficacia terapéutica a los antibióticos ß-lactámicos. En este trabajo se investigó la presencia de betalactamasas de espectro extendido en cepas de E. coli y K. pneumoniae aisladas de pacientes de las unidades de cuidados intensivos de un hospital universitario. Se estudiaron 41 cepas de E. coli y 59 de K. pneumoniae, aisladas de los cultivos bacteriológicos realizados en el Centro de Referencia Bacterológica del Sevicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM). Para la detección de betalactamasas de espectro extendido se utilizaron los métodos normalizados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). El 39,02% de las cepas de E. coli y el 52,54% de las de K. pneumoniae fueron betalactamasas de espectro extendido positivas, en estas cepas se observó resistencia acompañante a quinolonas, aminoglicósidos, cloranfenicol, tetraciclina y trimetoprima/sulfametoxazol. El estudio epidemiológico mediante Electroforesis de Campo Pulsado, mostró una gran diversidad genética entre los aislamientos, esta policlonalidad indica que la diseminación dentro del ambiente hospitalario no se da por transmisión de una cepa entre pacientes, sino que se da por transferencia de plásmidos entre diferentes cepas producto de la alta presión selectiva ejercida por la mala utilización de cefalosporinas de tercera generación.

Caracterización molecular de los receptores de gonadotrofinas de lubina (Dicentrarchus labrax)

Veure els fitxers associats amb aquesta Tesi Autor dos Santos Rocha, Ana María

URL http://www.tdx.cat/TDX-0624109-140349

Título Caracterización molecular de los receptores de gonadotrofinas de lubina

(Dicentrarchus labrax)

ISBN V-2219-2009 / 978-84-370-7248-7

Data de defensa 11-06-2008

En los vertebrados, las gonadotrofinas (FSH y LH) son hormonas esenciales en el control de

la gametogénesis y esteroidogénesis gonadal. Sus acciones están mediadas por la activación

de sus respectivos receptores. A pesar de su importancia en la función reproductora, en

teleósteos se dispone de muy poca información relativa a estos receptores. En este trabajo se

investigaron las características moleculares, estructurales y funcionales de los receptores de

gonadotrofinas (FSHR y LHR) de un teleósteo marino, la lubina (Dicentrarchus labrax).

Además, se evaluó la especificidad de unión al ligando de estos receptores. Usando un

método de RT-PCR cuantitativo, se midieron los perfiles de expresión de los receptores de

gonadotrofinas durante la primera maduración gonadal de machos y hembras de lubina.

Asimismo, se investigaron posibles relaciones entre estos perfiles, los de la proteína

responsable de la respuesta aguda de la esteroidogénesis (StAR) y los perfiles plasmáticos de

esteroides sexuales. Estudios recientes realizados en diversas especies de peces sugieren que

el receptor de TSH (TSHR), que comparte características estructurales con los receptores de

gonadotrofinas, podría estar directamente implicado en la fisiología gonadal. Por ese motivo,

en este trabajo se investigó una posible participación del TSHR en la función reproductora de

la lubina.

Los resultados obtenidos contribuyen a entender en qué momento del ciclo reproductor las

células germinales en crecimiento son sensibles a las señales procedentes de la hipófisis

(gonadotrofinas). Además, se ha demostrado que, a diferencia de otros peces, las

interacciones entre los receptores de gonadotrofinas de lubina y sus respectivos ligandos son

específicas. Asimismo, podemos decir que en la lubina, los receptores de gonadotrofinas se

expresan en momentos diferentes del ciclo reproductor. Esto apoya la idea de que la FSH y la

LH poseen diferentes acciones en el control de la función gonadal. Desde de un punto de vista

aplicado, estos conocimientos podrían ser de gran importancia en la manipulación del ciclo

reproductor de esta especie de gran valor económico. Por lo tanto, estos estudios son

relevantes tanto por su componente de investigación básica como por las posibles

aplicaciones que pueden derivarse.

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL BANCO DE GERMOPLASMA DE GUAYABA Psidium spp. DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN DE

CORPOICA PALMIRAANTONY RUEDA L1. JAIME E. MUÑOZ2. RAUL SAAVEDRA O3. JUAN DIEGO PALACIO4. ENRIQUE

BRAVO5

A pesar, de ser el cultivo de la guayaba Psidium spp. en Colombia un producto

promisorio tanto en el mercado nacional como internacional, posee una serie de

problemas tecnológicos que le ocasionan perdidas a los agricultores. Como la

solución del problema esta cimentada en la oferta de tecnología y variedades, se

requiere hacer una adecuada caracterización de los recursos fitogenéticos

representados en los bancos de Germoplasma. Debido a esto, se desarrolló este

estudio, encaminado a caracterizar molecularmente el banco de germoplasma de

guayaba existente en el centro de investigación de Corpoica en Palmira, para

determinar la diversidad genética y relaciones entre las diferentes accesiones del

banco. Para ello se realizó la extracción de ADN con el kit extracción de QIAGEN, de

las 27 accesiones del banco de guayaba y se generaron marcadores moleculares

RAPD (Ramdon Amplified Polymorphic DNA), mediante la utilización de 6 primers

polimórficos, que generaron un total de 43 loci polimórficos. El análisis de similaridad

y de correspondencia múltiple permitió detectar; un material replicado, un gran grupo

(20 accesiones) que reúne las accesiones colectadas en el continente Americano, así

como la separación de las accesiones de guayaba colectadas en Africa y Surinan, la

guayaba coronilla, la peruana y manzana formando un grupo individual cada una.

Este estudio permite apreciar el relativo alto grado de diversidad genética al interior

del banco de germoplasma de guayaba de Corpoica Palmira.

Isoenzimas y AFLPs como marcadores moleculares para el estudio de las alteraciones fenotípicas de

las naranjas Valencia (Citrus sinensis Osbeck) afectadas por el virus de la tristeza (VTC), en la

República Dominicana.Atharva V. Rosa y Guarina Delmonte

atharva23@hotmail.com y guarinad@hotmail.com

Instituto de Innovación en Biotecnología e Industria (IIBI). P. O. Box 329-2. Santo Domingo. República Dominicana.

El objetivo de esta investigación es evaluar la incidencia a nivel nacional del virus de la tristeza

de los cítricos (VTC) en las plantaciones de naranja Valencia (Citrus sinensis Osbeck) , así

como; conocer el comportamiento isoenzimático de éste cultivo cuando está siendo afectado

por esta enfermedad y realizar una Caracterización Molecular de los cultivares estudiados.

Hasta la fecha, se han tomado muestras de 68 localidades de 17 provincias, de las Regiones

Este, Norte y Sur del país. Se ha hecho la extracción y detección del virus a 224 cultivares

(utilizando la Técnica de ELISA de Doble Anticuerpo). También se han trabajado unas 128

muestras para detección con el InmunoPrint, de Plant Print, que utiliza los anticuerpos

monoclonales 3DF1 y 3CA5. Se han estado validando varios protocolos de extracción y

tinción, de algunas Isoenzimas en particular, tales como: la Glutamato Oxalacetato

Transaminasa (GOT), Alcohol Deshidrogenasa (ADH), Fosfatasa Ácida (APS), Fosfatasa

Alcalina (LAP) y Esterasa (EST). También se validó un protocolo de extracción y tinción de

Proteínas Generales. Se han adelantado algunos trabajos concernientes a la extracción de ADN,

que incluyen la validación de algunos protocolos, de los cuales se han obtenido excelentes

resultados tanto cualitativos, como cuantitativos. Es pertinente destacar que este proyecto acaba

de finalizar su primer año de ejecución y que lo presentado en este resumen son los avances

obtenidos hasta la fecha, los resultados concretos de estos avances serán detallados al finalizar

la investigación.

CARACTERIZACIÓN DE LA DIVERSIDAD DEL PASTO NATIVOBouteloua curtipendula Michx. Torr. MEDIANTE MARCADORES DE

AFLPNATIVE GRASS Bouteloua curtipendula Michx. Torr. DIVERSITY

CHARACTERIZATION USING AFLP MARKERS

Carlos Morales-Nieto1, Adrián Quero-Carrillo2, Olivier Le-Blanc3, Alfonso Hernández-Garay2,Jorge Pérez-Pérez2 y Sergio González-Muñoz2

1INIFAP-CIRNOC. Campo Experimental La Campana. Avenida Homero No. 3744 Colonia ElVergel. 31100. Chihuahua, Chihuahua, México (morales_nieto_c_r_@hotmail.com). 2Ganadería.

Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo. Estado de México. 3IRDCIMMYT.Texcoco, México-Montpellier, Francia.

RESUMEN

El pasto Banderita (Bouteloua curtipendula) Michx. (Torr.), es una especie nativa de México, pero no se ha hecho un uso planificado de su riqueza genética. Para determinar relaciones genéticas en 90 poblaciones nativas de Banderita, de varios Estados de México, se analizó la expresión de marcadores de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y su consistencia, mediante cinco combinaciones de iniciadores,

diseñados con base en las secuencias de EcoRI y MseI. Las distancias genéticas se estimaron utilizando el coeficiente de Jaccard, estableciéndose grupos funcionales mediante análisis de componentes principales (ACP) y de conglomerados (AC). Hubo 281 bandas iniciales que mostraron 36.6% de polimorfismo, utilizándose las 104 más consistentes para el análisis. Los coeficientes de Jaccard variaron de 0.0 a 0.82. El número de bandas polimórficas fluctuó desde 11 para EcoRI-AGG+MseI-CTA, hasta 29 para EcoRI-ACA+MseICAC. El ACP estableció dos grupos basados en polimorfismo genético que fueron consistentes con los del AC. Los dos primeros componentes principales explicaron 21.8% de la variación total. El ACP proporcionó evidencias para integrar germoplasma de poblaciones de zonas semiáridas de México. El dendograma generado por el método de ligamiento promedio no ponderado entre agrupamientos (UPGMA) dividió las 90 poblaciones en dos grupos. La variabilidad genética en las poblaciones se debió al origen del germoplasma y a movimientos de semilla por diferentes factores. Las poblaciones nativas de Banderita, en México, mantienen elevados niveles de variación genética, y en este estudio se ha obtenido información útil para su uso y conservación eficiente.

Palabras clave: Bouteloua curtipendula, componentes principales, pastos forrajeros.

COMPARACIÓN DE RAPD Y AFLP COMO MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE VID BASADOS EN EL ESTUDIO DE FRAGMENTOS GENÓMICOS ANÓNIMOS1

Claudio Narváez R.2,3, Jorge Valenzuela B.3, Carlos Muñoz Sch.3 y Patricio Hinrichsen R.3

 1 Recepción de originales: 05 de mayo de 1999.2 Parte del trabajo de tesis para optar al título de Bioquímico de la Universidad de Chile.3 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación La Platina, Casilla 439-3, Santiago, Chile.E-mail: phinrich@inia.clAGRICULTURA TÉCNICA (CHILE)60(4):320 - 340 (OCTUBRE -DICIEMBRE, 2000)

INTRODUCCIÓN

Chile es uno de los principales exportadores de uva de mesa del hemisferio sur. Además, la producción y exportación de vinos varietales, tanto de las grandes viñas tradicionales como en las denominadas "viñas boutique", ha tenido un aumento sostenido en los últimos años. La conservación y ampliación de estos mercados, así como el de la producción de plantas de vivero, dependerá fundamentalmente de la calidad del producto ofrecido. Un aspecto significativo en este sentido es la capacidad de certificación de origen de los vinos, así como la certificación genética y fitosanitaria de las plantas.

Tradicionalmente, los métodos para identificar genotipos, así como para estimar las relaciones filogenéticas existentes entre ellos, se han basado en el estudio de características morfológicas. En viticultura esta metodología se denomina ampelografía, la que recurre a la observación directa de la planta, sus estructuras y órganos visibles (forma, tamaño y color de planta, hojas y racimos, etc.) y características agronómicas relevantes (Galet, 1979). Sin embargo, estas características pueden ser alteradas por enfermedades, variar en función de la etapa del crecimiento o el ambiente agroclimático. Más aún, estas evaluaciones son subjetivas y están condicionadas al criterio y experiencia individual de cada ampelógrafo. Esto ha llevado a que en numerosas ocasiones existan genotipos mal indexados, especialmente cuando se trata de cultivares que presentan fenotipos muy similares. Por otra parte, la identidad genética de un cultivar puede modificarse debido a mutaciones somáticas perpetuadas durante su reproducción vegetativa (Vignani et al ., 1996 ), y aunque conserven el nombre original, pueden presentar diferencias tanto fenotípicas como genotípicas (sinonimia). También la sinonimia se aplica a cultivares que aunque genéticamente diferentes, se han manejado como si fueran un único tipo. Alternativamente, la dispersión geográfica de un mismo genotipo o cultivar suele conllevar su redenominación, es decir, varios nombres para un mismo genotipo (homonimia) (Vignani et al ., 1996 ; Cervera et al. , 1998 ). Los marcadores moleculares superan estas complicaciones, pues con ellos se reconoce directamente las diferencias genéticas entre individuos, obteniéndose un "perfil molecular" o "fingerprinting" característico para cada variedad e independiente de las condiciones de crecimiento de las plantas (Morell et al., 1995 ). Además, permiten obtener mejores estimaciones de la diversidad genética de una población determinada (Johns et al ., 1997 ), así como información sobre frecuencias alélicas, nivel de heterocigocidad de una población y subdivisión de poblaciones, entre otras, en un período de tiempo menor al ocupado mediante estrategias convencionales (Waugh y Powell, 1992).Para esto, un marcador molecular debe reunir ciertas características tales como: alto grado de polimorfismo, herencia codominante, distribución frecuente y uniforme en todo el genoma, facilidad de estudio, rapidez en los resultados, y costo de desarrollo bajo o proporcional a la cantidad de información reunida. Además, debe poseer un nivel de reproducibilidad adecuado para comparar resultados entre distintos laboratorios. Desafortunadamente, no existe un único marcador que cumpla con estas características, por lo cual es necesario probar diferentes técnicas para aprovechar sus características específicas. En el contexto del "fingerprinting" de cultivares, la primera metodología molecular aplicada a plantas fue el análisis de polimorfismos en el largo de fragmentos de restricción (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) (Helentjaris et al. , 1985 ). En vides, el RFLP se aplicó por primera vez usando sondas heterólogas de minisatélites (Striem et al. , 1990 ). Bowers et al . (1993) desarrollaron un "fingerprinting" de las variedades para vino cultivados en California, EE.UU., probando cinco sondas, pero que revelaban un número reducido de formas alélicas cada una. Por otra parte, Bourquin et al . (1993) identificaron 111 alelos diferentes usando una combinación de dos enzimas de restricción y 38 sondas. Los resultados de este trabajo agruparon a los cultivares franceses estudiados de forma similar a lo determinado por ampelografía.RFLP, sin embargo, corresponde a una metodología técnicamente compleja y de alto costo, por lo que se han desarrollado nuevos métodos basados en la amplificación de secuencias genómicas mediante una reacción de amplificación en cadena (PCR, Polymerase Chain Reaction). Con esta aproximación, se realiza un análisis con una pequeña cantidad de ADN y con protocolos comparativamente sencillos, de los cuales existen numerosas variantes descritas

en forma genérica por Staub et al . (1996) . En este trabajo se usaron dos de estos métodos: la amplificación de fragmentos usando partidores de diseño aleatorio (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al. , 1990 ) y la amplificación de fragmentos genómicos digeridos por enzimas de restricción (AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism) (Vos et al. , 1995 ). Estas metodologías también son conocidas como marcadores "masivos", ya que permiten generar una gran cantidad de información en breve plazo, sin requerir del conocimiento previo de las secuencias genómicas amplificadas. Ambos recurren al uso de partidores de diseño aleatorio, de manera que reconocen secuencias "anónimas", dispersas a lo largo de todo el genoma.El método de RAPD ha sido descrito en detalle por numerosos autores (Williams et al ., 1990 ; Hinrichsen et al ., 1996 ). RAPD difiere de otros métodos de análisis por PCR en que se usa un único partidor de pequeño tamaño (10 mer) y se hace el apareamiento del PCR a bajas temperaturas. Las ventajas del método son su simplicidad y bajo costo, aunque tiene el inconveniente de ser un marcador de tipo dominante, es decir, no es posible discernir sobre la heterocigocidad de los loci observados. Además, la reacción es muy sensible a las condiciones de amplificación y a la calidad y concentración del ADN, las cuales influirían en la reproducibilidad del método. En cambio, el análisis por AFLP (Vos et al ., 1995 ), que es esencialmente la combinación de una digestión con enzimas de restricción y de amplificación por PCR, presenta un grado de reproducibilidad mucho mayor. AFLP, por su parte, también es un marcador de tipo dominante y su nivel de complejidad técnica es más alto que RAPD, lo que representa una desventaja. De esta manera, en cada especie o grupo de especies en estudio, es necesario hacer un análisis comparativo antes de decidir qué metodología usar para resolver un determinado problema de análisis genético. En vides existen numerosos ejemplos de aplicación de RAPD, tanto para diferenciar cultivares como para mapeo genético (Ye et al. , 1993 ; Weeden et al ., 1994 ; Lodhi et al ., 1995 ). Aunque algunos autores han mostrado reservas respecto de la utilidad de RAPD para realizar estudios genéticos en vides, básicamente por su escasa reproducibilidad (Büscher et al ., 1993 ; Xu et al. , 1995), existen antecedentes que sugieren que esta metodología podría usarse para este fin (Collins y Symons, 1993; Gogorcena et al. , 1993 ; Jean-Jaques et al. , 1993 ; Qu et al. , 1996 ; Stavrakakis et al. , 1997 ; This et al. , 1997 ). Además, estudios recientes han demostrado un alto nivel de reproducibilidad (Vidal et al ., 1998 ). RAPD también ha sido usado para identificar progenitores, como en el caso del cultivar Müller-Thurgau, uno de los más cultivados en Europa central (Büscher et al ., 1994 ). También ha sido aplicado para diferenciar cultivares genéticamente muy relacionados, como Sultanina vs. Sultanina Seedless, uno derivado del otro por una mutación (Bakalinsky et al., 1993; Striem et al., 1994 ), o un grupo de 14 cultivares de tipo Moscatel (Stavrakakis y Biniari, 1998). Con AFLP, una técnica de desarrollo más reciente, los estudios en vid son escasos, aunque ya se ha publicado un estudio que demuestra su potencial para diferenciar clones de determinados cultivares (Cervera et al ., 1998 ). Así también, Sensi et al . (1996) compararon los resultados obtenidos con AFLP y otra técnica de análisis genómico, encontrando buena correlación.El propósito de este trabajo fue comparar el comportamiento de estas dos metodologías, RAPD y AFLP, considerando aspectos como la facilidad para detectar polimorfismos en esta especie y la capacidad de diferenciar cultivares, y clones de un mismo cultivar. Cabe recordar que en las bases de datos de la vid existen entre 5.000 y 8.000 entradas, de las cuales muchas serían homonimias (Alleweldt, 1988). Además, se han establecido las relaciones genéticas (similitud o distancia genética) entre un número de cultivares de un jardín de variedades, muchos de ellos

posibles progenitores a usarse en un programa de mejora genética. De este modo, en un esquema concebido a más largo plazo, estos marcadores podrán ser usados para asistir el proceso de selección de segregantes analizando directamente su ADN.

MATERIALES Y MÉTODOS

Variedades analizadas

Se usaron 57 cultivares de vid (55 Vitis vinifera L. y 2 híbridos interespecíficos) que son parte de una colección de genotipos (jardín de variedades) mantenidos en el Centro Experimental La Platina de INIA. En el Cuadro 1 aparecen ordenados de acuerdo a su uso e indicando qué tipo de análisis se hizo en cada caso. Además, se analizó una colección de 48 clones de Cabernet Sauvignon seleccionados por tener diferente largo de racimo (Muñoz et al ., 1985 ). Las hojas se almacenaron a -80°C hasta que se extrajo el ADN. Para este propósito, se ha determinado que el mejor tejido de esta especie leñosa son hojas recién brotadas de plantas en activa proliferación después de la dormancia invernal.Cuadro 1. Variedades de vid analizadas.Table 1. Vitis cultivars considered in this study.

MuestraNº Identificación Variedad Tipo

de Vid* RAPD AFLP

ConcentraciónADN (m g mL-

1)

1 PC-57 Pinot Chardonnay VB + + 190

2 PC-35 Pinot Chardonnay VB + + 120

3 G-36 Gewürztraminer VB + + 380

4 G-59 Gewürztraminer VB   + 147

5 WR-31 White Riesling VB + + 70

6 WR-40 White Riesling VB   + 185

7 Ch-16 Chasselas Musqué Vrai VB + + 318

8 To-62 Torontel VB + + 92

9 S-34 Sauvignon VB + + 201

10 SB-55 Sauvignon Blanc VB   + 235

11 SB-12 Sauvignon Blanc VB + + 457

12 SG-48 Sauvignon Gris VB + + 81

13 Sau-8M95 Sauvignonasse VB   + 224

14 Se-14 Semillón VB + + 199

15 CS-61 Cabernet Sauvignon VT + + 154

16 CS-66 Cabernet Sauvignon VT   + ND

17 CS-65 Cabernet Sauvignon VT   + 44

18 PN-18 Pinot Noir VT + + 424

19 PN-45 Pinot Noir VT + + 123

20 C-13 Carmenère VT + + 249

21 Z-15 Zinfandel VT + + 377

22 PB-17 Portugais Bleu VT + + 435

23 RC-42 Ruby Cabernet VT + + 95

24 A-19 Aurora VT + + 201

25 Si-20 Silvaner VT + + 38

26 V-21 Verdot VT + + 111

27 SV-28 Sabat Vongie VT + + 149

28 PS-22 Petite Siraz VT + + 144

29 BS-5 Black Seedless MN + + 266

30 R-9 Ribier MN + + 410

31 E-10 Emperor MN + + 531

32 B-29 Beauty MN + + 66

33 Ex-32 Exótica MN + + 62

34 SF-54 San Francisco MN + + 70

35 MN-51 Moscatel Negra MN + + 123

36 Pe-23 Perlón MN + + 243

37 RS-4 Red Seedless MR + + 214

38 BR-49 Big Red MR + + 100

39 Bl-53 Blush MR + + 170

40 RS-50 Ruby Seedless MR   + 267

41 RS-11 Ruby Seedless MR + + 270

42 Q-41 Queen MR + + 93

43 F-44 Flora MR + + 272

44 MR-37 Moscatel Rosada MR + + 31

45 TS-47 Thompson Seedless MB + + 266

46 TS-64 Thompson Seedless MB   + 99

47 P-60 Perlette MB + + 119

48 Su-26 Superior MB + + 143

49 Pi-52 Pizutello MB + + 159

50 IP-30 Italia Pirovano MB + + 231

51 Cal-39 Calmería MB + + 127

52 Ce-43 Centenial MB + + 285

53 Pa-24 Patagonia MB + + 115

54 25 N.N. NN + + 84

55 K-38 Kaiji V. vinifera + + 189

56 Pl-33 Plima Híbrido + + 409

57 FF-27 Fue Fuji Híbrido + + 60

*VB: Vino blanco; VT: Vino tinto; MN: Mesa negra; MR: Mesa roja; MB: Mesa blanca; NN: genotipo identidad desconocida

Extracción de ADNLas extracciones de ADN se basaron en el método descrito por Lodhi et al . (1994) con algunas modificaciones desarrolladas en el laboratorio. Las muestras de ADN concentrado se centrifugaron para eliminar un sedimento de formación espontánea y luego se determinó la concentración de ADN en un fluorímetro DyNA Quant 200 (Hoefer Pharmacia Biotech) usando el reactivo Hoechst 33258 como tinción específica del ADN (compuesto que emite a 480 nm).

Partidores de PCR y adaptadoresLos partidores de RAPD fueron adquiridos en Operon Technologies, Inc. (Alameda, California, EE.UU.), excepto algunos obtenidos de Wako Corp. (Osaka, Japón). La síntesis de los partidores y adaptadores de AFLP se encargó a IDT (Coralville, Iowa, EE.UU.).

Reacción de RAPDLa mezcla de reacción del PCR contenía entre 5 y 10 ng de DNA, 0,2 mM de cada dNTP, 3 mM MgCl2, 0,4 m M de partidor de Operon Technologies, tampón de PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl y 0,01% de gelatina) y 0,5 U de Taq ADN polimerasa (Gibco-BRL, EE.UU.), en un volumen total de 12,5 m L. Se usó un termociclador Perkin-Elmer con el siguiente programa de amplificación: a) tres ciclos de: desnaturación a 95ºC por 1 min; alineamiento a 37ºC por 1 min; extensión a 72ºC por 80 s; b) 37 ciclos de : denaturación a 94ºC por 35 s; alineamiento a 40ºC por 40 s; extensión a 72ºC por 80 s; c) elongación por 7 min a 72ºC. La separación de los fragmentos de ADN amplificados y su registro fotográfico se hizo como lo describió Hinrichsen et al . (2000) .

Reacción de AFLPEl protocolo de AFLP se desarrolló como fue descrito originalmente (Vos et al ., 1995 ), con algunas modificaciones descritas en Protocolos del CIAT (González et al., 1995 ). Se digirieron 250 ng de ADN con 2,5 U de EcoRI y de MseI, en tampón NEB#2 (New England Biolabs, NEB, Hartford, Connecticut, EE. UU.). Para la ligación de los adaptadores, se usaron 2,5 pmol de adaptador EcoRI, 25 pmoles de adaptador MseI y 100 U de T4 ADN ligasa en tampón de T4 ADN ligasa (NEB). Las mezclas de digestión y ligación se combinaron e incubaron toda la noche en un termociclador con un programa de temperaturas de 30 s a 10°C y 30 s a 30°C (Lund et al ., 1996 ). Esta mezcla se diluyó 10 veces para la reacción de PCR+1, la que se realizó en un volumen de 25 m L y contenía 1,5 ng m L-1 de los partidores PM1 y PE1, 0,8 mM de dNTPs, 2 mM de MgCl2 y 0,5 U de Taq ADN polimerasa en buffer de PCR 1X. Se usó el siguiente programa de temperaturas: a) desnaturación a 94°C por 3 min; b) 35 ciclos de 94°C por 3 min, 55°C por 30 s y 72°C por 60 s; y c) elongación a 72°C por 7 min. Para la amplificación selectiva (PCR+3), el producto del PCR+1 se diluyó 20 veces, usándose una alícuota de 5 m L que se mezcló con 5 ng del partidor EcoRI+3 (excepto cuando se realizó tinción de plata, 30 ng de éste) y 30 ng del partidor MseI+3, además de dNTPs 0,8 mM, MgCl2

2 mM, tampón de PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM de KCl, 0,01% de gelatina) y 0,5 U de Taq polimerasa, en 20 m L de volumen final. El partidor EcoRI+3 se marcó en el extremo 5’ con g -33P-ATP (3000 Cimmol-1, 10 mCi mL-1, de Amersham, Reino Unido) usando 0,4 U de T4-polinucleótido quinasa (Promega, Madison Wisconsin, EE.UU.). La reacción se incubó a 37°C por 2 h y luego se calentó a 70°C por 10 min para inactivar la enzima. Para la reacción de PCR, el perfil térmico fue el siguiente: a) desnaturación por 3 min a 92°C ; b) 1 ciclo de 92°C por 30 s, 65°C por 30 s y 72°C por 1 min; c) los siguientes 11 ciclos se baja en cada uno 0,7 grados durante el alineamiento, hasta llegar a 56°C (efecto "touchdown") ; d) 23 ciclos a 94°C por 30 s, 56°C por 30 s y 72°C por 60 s; y e) elongación por 7 min a 72°C.

Separación electroforética de los productos de la reacción de AFLPLos productos del PCR+3 se separaron en un gel del tipo de secuenciación de poliacrilamida (PAA) al 6% y 7,5 M de urea, preparado en TBE 1X. Uno de los vidrios se trató con RepelSilane EC (Pharmacia Biotech), lo que facilita separar el gel del vidrio después de la corrida electroforética. Paralelamente, el otro vidrio fue tratado con BindSilane (Promega), reactivo que favorece la unión del gel sobre el vidrio y permite realizar la tinción de plata sobre éste. La electroforesis se corrió en TBE 1X. Los productos de PCR+3 se diluyeron a la mitad con tampón de carga (95% de formamida, 1 mg mL-1 de xilen cianol, 1 mg mL-1 de azul de bromofenol y 10 mM EDTA) y se calentaron durante 3 min a 95°C. Se colocaron en hielo inmediatamente, y se mantuvieron a 4ºC hasta que se cargaron en el gel. El gel se pre-corrió

por 25 min antes de cargar las muestras. La corrida se realizó a 70-80 W (temperatura óptima de 50°C) por 2,5 a 3 h o hasta 5 cm antes de caer el xilen cianol desde el gel. Cuando se usó marcación con 33P, el gel se transfirió a un papel filtro Whatman 3MM, se cubrió con celofán tipo AlusaplasTM y se secó a 65°C por 1 h al vacío. Se expuso sobre una placa autorradiográfica Kodak X-Omat AR en un cassette de exposición por 2 a 4 días, dependiendo de la actividad del radioisótopo. Para la tinción de plata, se siguió el protocolo descrito por Bowers et al. (1996) .

Análisis estadísticoLos polimorfismos detectados fueron escrutados como presencia (1) o ausencia (0) de una banda. Con estos datos se prepararon matrices binomiales, las que fueron usadas para calcular valores de similitud genética entre cada par de genotipos usando el coeficiente de Jaccard, incluído en el paquete estadístico NTSYS-pc versión 2.00 (Applied Biostatistics Inc., Setauket, Nueva York, EE. UU.). Este coeficiente asigna un mayor peso estadístico a las bandas presentes, lo que es deseable en marcadores de tipo dominante como RAPD y AFLP (Powell et al ., 1996 ; Johns et al ., 1997 ). Los dendrogramas fueron preparados aplicando el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages) (Rohlf, 1997).

RESULTADOS Y DISCUSIÓNPara enfrentar el problema de la identificación genética de los numerosos cultivares de vid descritos (Alleweldt, 1988), se ha recurrido en los últimos años al uso de distintos marcadores moleculares. Las metodologías que se usaron en este trabajo (RAPD y AFLP) identifican diferencias entre dos o más genotipos que corresponden en última instancia a cambios en la secuencia del ADN. Estas diferencias se manifiestan como la presencia o ausencia de una determinada banda de ADN, dado por la posibilidad de unión de un partidor al templado de ADN genómico de la vid. Cada una de estas técnicas presenta ciertas ventajas y desventajas comparativas que se evalúan y discuten más adelante.

Análisis mediante RAPDDado que RAPD es muy sensible a las condiciones de la reacción, se determinó la concentración óptima de ADN a usar en los análisis. Se ensayó entre 0,3 y 30 ng de ADN por reacción, encontrándose que entre 1,0 y 10 ng los patrones fueron perfectamente reproducibles. Sobre 30 ng por reacción, se perdió la regularidad en los patrones de amplificación; bajo 1 ng la intensidad de las bandas fue muy débil. De esta manera, se hizo todo el estudio usando 5 ng de ADN en cada reacción. Otras condiciones, como la concentración de MgCl2 y otras sales en el buffer, cantidad de enzima, temperatura de alineamiento, etc., fueron las estándares que han sido usadas en otras especies en nuestro laboratorio (e.g., Sagredo et al ., 1998 ). Cabe destacar que es importante optimizar las condiciones de la reacción para evitar que las diferencias en los patrones de bandas se deba a problemas de la reacción, en lugar de reflejar diferencias genéticas. El análisis de RAPD requiere de una selección de aquellos partidores que entreguen la mayor información posible en la especie o género que se estudie, en este caso, el género Vitis. Para ello se usaron tres cultivares diferentes y se ensayaron 80 partidores comerciales, correspondientes a las series OPA, OPB, OPI y OPF, de los cuales fueron elegidos 18 en base a que presentaban un patrón de varias bandas en un amplio rango de tamaño (200 a 3.000 bp) y de fácil lectura (Cuadro 2). Esta lista de partidores en ningún caso es definitiva, ya que a posteriori se demostró la alta heterocigocidad en esta especie. Esto significa que

potencialmente muchos de los 80 partidores podría identificar alguna diferencia en el grupo de 48 cultivares.

Cuadro 2. Partidores de RAPD seleccionados, Nº de bandas totales amplificadas y Nº y fracción de bandas polimórficas.

Partidor Secuencia nucleotídica (5’-3’)

N° de bandas totales

Bandas Polimórficas

Nº Fracción

OPA-13 CAGCACCCAC 19 6 0,316

OPB-04 GGACTGGAGT 26 8 0,301

OPB-07 GGTGACGCAG 21 5 0,238

OPB-12 CCTTGACGCA 21 5 0,238

OPB-17 AGGGAACGAG 20 5 0,25

OPF-04 GGTGATCAGG 21 10 0,476

OPF-06 GGGAATTCGG 12 5 0,417

OPF-08 GGGATATCGG 12 4 0,333

OPF-09 CCAAGCTTCC 19 5 0,263

OPF-12 ACGGTACCAG 10 5 0,5

OPF-18 TTCCCGGGTT 13 2 0,154

OPF-14 TGCTGCAGGT 19 4 0,21

OPI-04 CCGCCTAGTC 14 6 0,423

OPI-07 CAGCGACAAG 29 7 0,241

OPI-10 ACAACGCGAG 28 10 0,357

OPI-13 CTGGGGCTGA 17 4 0,235

OPI-14 TGACGGCGGT 22 5 0,227

OPI-20 AAAGTGCGGG 21 7 0,333

Total 344 103  

Promedio bandas 19,1 5,7  

Polimorfismo (%) 29,9

Un ejemplo de las reacciones de RAPD se muestra en la Figura 1, correspondiente al análisis con el partidor OPB-04; destacan en la figura 8 bandas polimórficas de un total de ±26 amplificadas. Sobre un total de 344 bandas amplificadas por los 18 partidores seleccionados, 103 fueron polimórficas, es decir, RAPD reveló un 29,9% de polimorfismo entre los cultivares analizados, lo que es muy alto comparado a otras especies.Figura 1. Patrones electroforéticos de genotipos de vid analizados por RAPD con el partidor OPB-04. Las flechas indican las bandas polimórficas.Figure 1. Electrophoretic patterns of Vitis genotypes analyzed by RAPD using OPB-04 primer. Arrows indicate polymorphic bands.

La reproducibilidad de los patrones de amplificación de RAPD se verificó en un estudio adicional. Para ello, se analizaron 48 clones de Cabernet Sauvignon, correspondientes a plantas individuales provenientes de Talca, Cauquenes y dos grupos del valle de Santiago (colección de clones mantenido en INIA, Centro Regional de Investigación La Platina); originalmente estos clones fueron seleccionados por tener diferente longitud del racimo (Muñoz et al. , 1985 ). Este estudio, realizado con siete partidores informativos en vides, indicó que los patrones de RAPD tienen una adecuada reproducibilidad para una misma variedad, aún cuando se usen diferentes extracciones de ADN (Figura 2). Además, el patrón genético de cualquier clon analizado es representativo del conjunto de individuos de la misma variedad, existiendo sólo variaciones menores que probablemente corresponden a mutaciones somaclonales, ya que las plantas de vid son propagadas vegetativamente.Figura 2. Reproducibilidad de RAPD revelada por la homogeneidad genética de clones de Cabernet Sauvignon. Se muestran los resultados con cinco partidores de RAPD diferentes sobre cuatro genotipos.

Excepcionalmente, se encontraron partidores que mostraron algunas diferencias entre los clones analizados, como E-41 (Figura 2). En este caso, los fragmentos polimórficos podrían corresponder a (i) el locus genético correspondiente al gene o genes responsables de las diferencias observadas entre los clones de Cabernet, lo que es poco probable dado que no hay una correlación entre largo de racimo y un determinado alelo, o más bién (ii) secuencias hipervariables (como mini- o microsatélites) que darían cuenta de bandas de tamaño variable. Si las diferencias encontradas a nivel genético están o no relacionadas con las diferencias morfológicas identificadas originalmente en los clones de Cabernet Sauvignon (largo de racimo), es materia de un estudio posterior, que comenzaría con la caracterización de los fragmentos de tamaño variable, amplificados en forma reproducible.Las bandas polimórficas de RAPD permitieron diferenciar todos los cultivares estudiados, lo que se verificó haciendo un dendrograma (Figura 3). Esta representación gráfica permite estimar las relaciones genéticas entre los genotipos, los que formaron grupos escasamente relacionados entre sí, con un porcentaje de similitud entre 28 y 90%. En los agrupamientos obtenidos se observó que algunas variedades genéticamente cercanas, como Sauvignon Gris y Sauvignon Blanc, quedaron asociadas directamente, con un índice de similitud superior al 95%. Este resultado tiene sentido, dado que se sabe que estos dos cultivares se diferencian sólo en los genes que participan en la síntesis de antocianinas. Una situación diferente sucedió con dos muestras de Pinot Chardonnay (PC-57 y PC-46) que mostraron un nivel de similitud de sólo 57,4%, quedando además en grupos genéticos diferentes. Esto demuestra que se trataría de material indexado incorrectamente, es decir, uno de los dos genotipos (o ambos) no correspondería al cultivar (verificado posteriormente mediante polimorfismo de los respectivos alelos de microsatélites; manuscrito en preparación).Figura 3. Dendrograma basado en polimorfismos de RAPD que ilustra la similitud genética entre los cultivares analizados.

El porcentaje de similitud más alto encontrado en este análisis de RAPD (aparte de los clones de Cabernet Sauvignon, no incluídos en el dendrograma) fue entre PC-57 y un clon de Gewürstraminer (G-36) con 90,2%, rango considerado propio de diferencias entre clones de una misma variedad (Cervera et al. , 1998 ). Los cultivares Patagonia (Pa-24) y Perlette (Per-23) presentaron también un coeficiente de similitud alto (78,8%), lo que indica una alta similitud genética entre ellos.De los tres cultivares japoneses incluídos en este estudio, Plima (Pl-33) fue el más divergente (Figura 3), mientras que Kaiji (K-38) y Fue Fuiki (FF-27) se incluyeron en el gran grupo constituído por todos los demás cultivares de V. vinifera. Esto coincide con sus pedigríes, ya que Kaiji –uva de mesa- es 100% V. vinifera (Flame Tokay x Neo Muscat), mientras que Fue Fuiki -cepa de vino- tiene tres de cuatro ancestros de esta especie y sólo uno, Creveling, es V. labrusca; sus ancestros son (Mills [Muscat Hamburg x Creveling] x Angelo Pirovano [Chasselas Rose x M. Hamburg]). Plima, en cambio, fue obtenida por el cruzamiento de Steuben x Himrod, dos cultivares pertenecientes al complejo Vitis labruscana (híbridos de V. vinifera, V. labrusca y otras especies americanas) (Akihiko Sato, National Institute of Fruit Trees Science (NIFTS), Akitsu, Japón, comunicación personal). Este resultado es destacable, dado que se verifica una correspondencia entre la genealogía y la información que entrega el análisis molecular.

Análisis mediante AFLPLos productos de una reacción de AFLP en la que se usó la combinación PE 1C/PM 1D se presentan en la Figura 4. La calidad del ADN usado en esta serie de reacciones de AFLP fue apropiada, observándose un patrón general de bandas amplificadas comparable entre cultivares. Este aspecto es relevante si se considera que se deben cumplir exitosamente varias etapas

(digestión, ligación, amplificaciones), las que podrían verse afectadas por la presencia de compuestos fenólicos propios de especies leñosas como la vid (Pandey et al. , 1996 ). En forma reiterada, algunas muestras no presentaron productos de amplificación. Estas muestras no fueron incluídas en los análisis posteriores. El uso de cuatro combinaciones de partidores EcoRI y MseI generó 86 bandas polimórficas, que representan aproximadamente un 30% de los fragmentos amplificados (Cuadro 3), porcentaje muy similar al determinado para RAPD. Para AFLP, de manera similar que para RAPD, es necesario determinar las condiciones óptimas para cada especie, incluída la selección de partidores más informativos. De esta manera, este 30% de informatividad del método podría ser bastante mayor si se seleccionaran partidores como PE1A/PM1C, que por sí solo reportó 32 polimorfismos (53%).

Figura 4. Patrones de AFLP de cultivares de vid usando la combinación de partidores descrita en el texto. Las flechas del lado izquierdo señalan la posición de 16 bandas informativas.

Cuadro 3. Partidores de AFLP usados, número y fracción de bandas polimórficas detectadas.

Combinación de partidores

Secuencia adicional (Eco/Mse)

Nº total de

bandas

Bandas polimórficas

Nº Fracción

PE1C/PM1B AGT/GCG 60 18 0,30

PE1A/PM1C AAC/GAC 60 32 0,53

PE1C/PM1D AGT/GGT 65 16 0,25

PE1H/PM1B AGA/GCG 105 20 0,19

Total 290 86  

Promedio de bandas por gel 72,5 21,5  

Bandas polimórficas (total) (%) 29,6

Los productos de AFLP fueron visualizados por marcación radiactiva del partidor con g -33P. También se probó la tinción con plata, sin embargo el contenido de información se reduce por la menor sensibilidad del método. Por ejemplo, usando la misma combinación de partidores (PE1A/PM1C, ver Cuadro 3), la tinción de plata reveló 22 bandas, de las cuales sólo 8 fueron polimórficas (36%); por el contrario, la marcación con g -33P reveló 60 bandas totales, 32 de ellas informativas (más del 50%). Esto pudiera ser de importancia en el estudio de clones de una variedad, en donde las diferencias entre genotipos son usualmente de difícil detección. Este resultado no es concluyente, pues otros autores no han encontrado diferencias en términos de la eficiencia de la identificación de bandas (Chalhoub et al ., 1997 ) comparando el uso de isótopos radiactivos con tinción argéntica. Cervera et al. (1998) han demostrado recientemente que en AFLP es posible enriquecer patrones de bandeo mediante la combinación de dos partidores EcoRI en una misma reacción, obteniéndose la suma de ambos. Este resultado se ha reproducido bajo nuestras condiciones, combinando los partidores PE1C y PE1I con PM1B (Figura 5). En general, se verificó la sumatoria de ambos patrones, correspondientes a las reacciones por separado, aunque en algunos casos se observó la pérdida de polimorfismos, probablemente por comigración de bandas informativas de un patrón con bandas no discriminatorias del otro.

Figura 5. Efecto de la combinación de dos partidores EcoRI sobre el número total de bandas de amplificación de AFLP. En este caso, se muestra una porción del gel correspondiente a la combinación de partidores PE1C y PE1I con PM1B.

Basados en los polimorfismos de AFLP se preparó un dendrograma (Figura 6) que presenta el resultado del agrupamiento de acuerdo a los índices de similitud obtenidos para cada par de cultivares. Los agrupamientos obtenidos destacaron la escasa diferencia propia de clones de un determinado cultivar. Por ejemplo, los clones de Cabernet Sauvignon (Figura 7) mencionados previamente mostraron mínimas diferencias, no cuantificadas, uno de los cuales es CS-61, incluido en el dendrograma. El otro "clon" incluído (CS-66), que tiene algo menos de 80% de similitud, no corresponde a un auténtico Cabernet Sauvignon, de acuerdo a resultados de microsatélites (manuscrito en preparación). Otros pares de clones, como Ruby Seedless (RuS-50 y RuS-11) o Sauvignon Blanc (SB-12 y SB-55) exhibieron similitudes genética superiores o próximas al 90% (Figura 6).

Figura 6. Dendrograma basado en polimorfismos de AFLP.

Figura 7. Diferencias entre clones de Cabernet Sauvignon de racimo largo y corto. Los carriles corresponden a: 1, Talca; 2, Peumo; 3, Pt-78; 4, Pt-79; 5, clon de EE.UU. Las fotos corresponden a fragmentos de dos reacciones de AFLP, según se indica. Las flechas destacan las bandas polimórficas.

Estos resultados coinciden con lo informado por Cervera et al. , (1998) . Un valor menor que 90% sugeriría que se trata de variedades diferentes como ocurre para el caso de los genotipos Thompson Seedless (TS-47 y TS-64) y Gewürztraminer (G-59 y G-36), que presentaron índices de similitud de 46,51% y 25,93%, respectivamente. Estos resultados también concuerdan con lo detectado por otros sistemas de marcadores, e.g., RAPD y microsatélites, y demostrarían que se trata de plantas erróneamente indexadas debido probablemente a su gran similitud ampelográfica. De forma similar a RAPD, AFLP no agrupó ningun conjunto de cultivares en un cluster en particular. Esto tiene relación con el origen muy diverso de los cultivares, o en otras palabras, que esta especie tiene una base genética muy amplia. Por otra parte, haciendo un análisis por tipo de variedades separadas en aquellas de vino y de mesa, no se reconocieron bandas polimórficas asociadas con alguno de estos dos grupos.Los cultivares Perlón y Patagonia, Exótica y Moscatel Negro, y Sauvignon (S-34) y Semillón (Se-14), mostraron coeficientes de similitud de 80,6; 82,9 y 78,9%, respectivamente, y por tanto están muy cerca del rango de las variaciones genéticas propias de clones. Cabe mencionar que dichos pares de cultivares presentan características morfológicas muy similares entre sí, lo que sugeriría una posible situación de sinonimia. Además, se debe destacar que las agrupaciones entre Patagonia y Perlón, Sauvignon (S-34) y Semillón, Exótica y Moscatel negro, así como el de Gewürztraminer (G-36) y Pinot Chardonnay (PC-57), coinciden con las agrupaciones basadas en datos de RAPD. Esto es especialmente relevante porque se confirma el resultado obtenido mediante RAPD.De los cultivares de origen japonés, Plima (Pl-33) se aleja del resto del grupo, lo cual es consistente con la mayor diferencia genética que se asocia a diferentes especies. En esto hay coincidencia entre AFLP y RAPD, al igual que para el cultivar Kaiji (K-38), que se mantiene consistentemente agrupado con cultivares de V. vinifera (Fue Fuji no fue analizada por AFLP). Estos resultados se reflejan en haber encontrado siete bandas polimórficas que sólo aparecieron en Pl-33, mientras que en K-38 sólo se observaron dos bandas exclusivas.

Diferenciación de clones de Cabernet SauvignonUtilizando mezclas de ADN de cinco clones de Cabernet Sauvignon de cuatro poblaciones provenientes de Talca, Peumo y dos cuarteles de INIA, Centro Regional de Investigación La Platina (Pt-78 y Pt-79), se hicieron reacciones de AFLP con 23 combinaciones de partidores. Con 11 de ellas se reconocieron diferencias entre los clones de Pt-78 y Peumo respecto de los clones de Talca y Pt-79. También se usó ADN de un clon de Cabernet Sauvignon proveniente de EE.UU., que no presentó diferencias con las mezclas de ADN de clones de Talca y Pt-79.

En la Figura 7 se muestran las diferencias obtenidas con dos combinaciones de partidores. A pesar que las diferencias son evidentes, se requiere hacer un estudio que sea más representativo de las poblaciones de clones comparadas, de manera de eliminar la posibilidad de que tales diferencias entre poblaciones sólo sean diferencias obtenidas para los clones incluídos en este análisis ("apertura de los grupos"). Actualmente se trabaja en la caracterización de estas bandas (clonamiento y secuenciación) para verificar si se trata de marcos de lectura abiertos, señales de regulación génica, o secuencias no codificantes. Si se detectara un gen de función conocida, quedaría abierta la posibilidad de utilizarlo para mejoramiento genético del cultivo vía transformación genética. Sin embargo, esto implicaría la identificación y caracterización del gen, determinación de su carácter dominante o recesivo, aislamiento del gen y clonamiento en vectores de transformación apropiados, etc., todas etapas de alta dificultad técnica que se justificarían sólo si el carácter codificado fuera de alto interés.

Comparación entre los métodos de análisis molecular en videsUn aspecto de gran interés es determinar cuál sería la mejor herramienta para "fingerprinting". Desde este punto de vista, es necesario realizar estudios comparativos entre las diferentes técnicas disponibles. Sin embargo, este aspecto está escasamente cubierto en la literatura. Incluso en cultivos anuales, que han recibido tradicionalmente una mayor atención, existen pocos antecedentes. Una excepción es el trabajo realizado por el grupo de Rafalski en soya (Powell et al. , 1996 ), donde se demuestra la importancia de realizar estos estudios para elegir un marcador apropiado para cada propósito. En especies de propagación agámica no existen estudios de esta naturaleza, y este trabajo constituye un importante aporte en este sentido. A diferencia de lo descrito por Powell et al. (1996) , donde se demostró que AFLP tiene una mayor capacidad que RAPD para detectar diferencias entre genotipos, en este trabajo se ha encontrado valores equivalentes (en torno al 30%) de bandas polimórficas para ambas metodologías, lo que puede explicarse porque en el caso de RAPD se realizó una selección de los partidores más informativos, aumentando así la eficiencia del método de una forma arbitraria. Esta elevada heterogeneidad genética entre cultivares podría explicarse, en parte, por los orígenes muy diversos de los progenitores (en muchos casos desconocidos, especialmente en el caso de los cultivares de vino), aunque la gran heterocigocidad detectada parece ser condición propia de la especie (Vitis vinifera L.) o del propio género Vitis.Un método alternativo a los presentados en este trabajo para hacer diferenciación genética son los microsatélites (SSR), que son secuencias repetidas dispersas en el genoma en muy alto número de copias, compuestas de 1-6 nucleótidos repetidos en tandem hasta 60 veces (Tautz 1989). Su análisis se basa también en PCR, usando partidores complementarios a secuencias vecinas al microsatélite. Dado que es usual observar loci de SSR con más de 10 alelos y frecuencia de heterocigocidad esperada superior a 0,6 (Morgante y Olivieri, 1993), ellos son excelentes candidatos para ser usados en la tipificación genética de cultivares de vid. Actualmente se trabaja paralelamente en vid con los tres tipos de marcadores, de tal manera de generar un volumen de información apropiado para poder justificar plenamente el uso de una u otra metodología, según si se quiera diferenciar cultivares o clones en esta importante especie (Hinrichsen et al. , 2000 ).

CONCLUSIONES

Se ha optimizado el uso de marcadores moleculares de tipo RAPD y AFLP para el análisis genético de vides.

Ambos métodos permitieron diferenciar todos los cultivares analizados. Para algunos cultivares se analizó más de una planta o clon, demostrándose que ambas

técnicas tienen un alto grado de reproducibilidad. Sin embargo, en una serie de casos se encontraron diferencias genéticas sustanciales entre plantas supuestamente de la misma variedad, lo que se explicaría por errores de indexación derivado de una alta similitud ampelográfica.

AFLP sería una buena alternativa para diferenciar clones, dado que tiene una alta reproducibilidad y entrega mayor información por cada reacción que RAPD.

No se evidenció la existencia de "grupos genéticos" discretos. En cambio se revelaron profundas diferencias entre cultivares, lo que coincide con la alta heterocigocidad descrita en esta especie.

RESUMEN

Hasta hace un tiempo, los cultivares de vid sólo podían ser diferenciados en base a observaciones ampelográficas. Actualmente se dispone de numerosos métodos moleculares basados en PCR que permiten un exhaustivo análisis genético de las plantas analizando directamente su genoma y evitando de esta manera la interferencia de efectos ambientales. En este trabajo se presentan los resultados de la aplicación de dos de estos métodos, RAPD y AFLP, para estudiar la diversidad genética existente en un grupo de más de 50 cultivares de vid. Usando 18 partidores de RAPD se identificaron 103 bandas informativas, correspondiente a un 29,9% de polimorfismo. Por su parte, usando cuatro combinaciones de partidores de AFLP se obtuvieron 86 bandas informativas (29,6% de polimorfismo). Ambos métodos mostraron un adecuado grado de reproducibilidad, evaluada sobre una colección de clones de Cabernet Sauvignon. Los dendrogramas preparados en base a estos datos graficaron la capacidad de ambos métodos para diferenciar todos los cultivares estudiados. En el caso de los clones de Cabernet Sauvignon, AFLP permitió identificar una serie de diferencias que podrían estar asociadas a diferencias en el largo de los racimos que presentan estos clones. La comparación de ambos métodos, principalmente en cuanto a su capacidad para diferenciar cultivares y clones, sugiere que AFLP es el método más adecuado para ambos propósitos. Sin embargo, ambos métodos podrían ser implementados, dado que bajo condiciones controladas muestran apropiados niveles de polimorfismo y reproducibilidad.

Palabras claves: ADN, genoma, polimorfismo, vides, Vitis vinifera, Vitis labrusca.

AGRADECIMIENTOSEspeciales agradecimientos a María Herminia Castro por el apoyo técnico y a Margarita Barticevic por los antecedentes sobre filogenia de cultivares japoneses. 

LITERATURA CITADAAlleweldt, G. 1988. The genetic resources of Vitis. Genetic and geographic origin of grape cultivars, their prime names and synonims. 2nd edition. Federal Research Centre for Grape Breeding Geilweilerhof. Siebeldingen, Germany. 546 p.Bakalinsky, A.T.; Wilson, D. and Arulsekar, S. 1993. DNA fingerprinting of grape rootstocks. Am. J. Enol. Vitic. 44:468 (Abstract).Bourquin, J.C.; Sonko, A.; Otten, L. and Walter, B. 1993. Restriction fragment length polymorphism and molecular taxonomy in Vitis vinifera L. Theor. Appl. Genet. 87:431-438.

Bowers, J.E.; Bandman, E.B. and Meredith, C.P. 1993. DNA fingerprint characterization of some wine grape cultivars. Am. J. Enol. Vitic. 44: 266-274.Bowers, J.E.; Dangl, G.S.; Vignani, R. and Meredith, C.P. 1996. Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.). Genome 39: 628-633.Büscher, N.; Zyprian, E. and Blaich, R. 1993. Identification of grapevine cultivars by DNA analyses: Pitfalls of random amplified polymorphic DNA techniques using 10mer primers. Vitis 32:187-188.Büscher, N.; Zyprian, E.; Bachmann, O. and Blaich, R. 1994. On the origin of the grapevine variety Müller-Thurgau as investigated by the inheritance of random amplified polymorphic DNA (RAPD). Vitis 33: 15-17.Cervera, M.T.; Cabezas, J.A.; Sancha, J.C.; Martinez de Toda, F. and Martinez-Zapater, J.M. 1998. Application of AFLPs to the characterization of grapevine Vitis vinifera L. genetic resources. A case study with accessions from Rioja (Spain). Theor. Appl. Genet. 97:51-59.Chalhoub, B.A.; Thibault, S.; Laucou, V.; Rameau, C.; Höfte, H., and Cousin R. 1997. Silver staining and recovery of AFLPTM amplification products on large denaturating polyacrylamide gels. BioTechniques 22: 216-220.

Análisis de la diversidad genética de accesiones de Theobroma cacao L. del banco de conservación a cargo de Corpoica

Autor(es):Inés Sánchez, Luz Angela Zárate, Gerardo Gallego y Joe Tohme

Resumen

Se estudió la diversidad genética presente en el banco de germoplasma de Theobroma cacao L. que se conserva en la Estación Experimental ‘La Suiza’ de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria –Corpoica– en el departamento de Santander. A tal fin se caracterizaron 100 genotipos de cacao mediante isoenzimas, RFLPs, RAPDs y SSR, utilizando 25 microsatélites publicados previamente en el GenBank. El porcentaje de amplificación obtenido fue del 100% lo que permitió identificar 168 alelos. Los niveles de polimorfismo variaron entre 2 y 14 alelos por locus con un promedio de 6,72. Las tasas de similaridad y distancia genética de Nei y Li entre los 100 genotipos se obtuvieron mediante el programa Ntsys v2.1® y se construyó un dendrograma con el algoritmo Upgma. Los valores obtenidos fueron superiores a 0,45 y en el dendrograma se identificaron dos grupos genéticos principales y varios subgrupos internos. Los resultados obtenidos se consideran un avance importante en el conocimiento de la diversidad genética de accesiones de Theobroma cacao L. conservadas en bancos de germoplasma y son de gran utilidad para desarrollar e implementar programas de mejoramiento y conservación del cacao basados en información genética relativa a características fenotípicas que favorezcan una mejor calidad, mayor producción y rentabilidad del cultivo en Colombia.

Palabras clave: banco de germoplasma, diversidad genética, microsatélites, Theobroma cacao L.

PATRONES GENÉTICOS DE LOS CULTIVARES DE VIDES DE VINIFICACIÓN MÁS COMÚNMENTE USADOS EN CHILE BASADOS EN MARCADORES DE MICROSATÉLITES1

Claudio Narváez H. 2, M. Herminia Castro P. 2, Jorge Valenzuela B. 2 y Patricio Hinrichsen R.2

1Recepción de originales: 18 de febrero de 2000Investigación financiada parcialmente por FONDECYT, Proyecto N° 19710186 2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación La Platina, Casilla 439 Correo 3, Santiago, Chile. E-mail: phinrich@inia.clAGRICULTURA TÉCNICA (CHILE) 61(3):249 -261 ( JULIO - SEPTIEMBRE, 2001)

RESUMEN

La industria chilena del vino se ha modificado substancialmente en las últimas décadas, predominando la plantación de los denominados "cultivares finos" sobre los tradicionales, como la cepa País. Por otra parte, la globalización de los mercados ha resaltado la necesidad de certificar la identidad genética y pureza de los cultivares, que hasta hace poco tiempo se realizó exclusivamente mediante ampelografía. El análisis directo del ADN ha permitido el desarrollo de nuevas y poderosas herramientas analíticas, como las secuencias de mini- y microsatélites, actualmente usadas como marcadores moleculares para diferentes fines. En este trabajo se presenta la caracterización genética de los cultivares de vides de vinificación más comúnmente usados en Chile. Para este propósito, se ha usado un conjunto de 12 marcadores de microsatélites para caracterizar 20 cultivares de vino tinto y blanco, generando patrones alélicos únicos para cada uno de ellos. La heterocigocidad esperada (He) para cada marcador fue bastante alta y diversa, entre 0,27 y 0,87 (promedio 0,70), y fue tan diversa como el número de alelos detectados con cada marcador, desde sólo cuatro para VVMD-25, VVMD-34 y VVS-29, hasta 10 para VVMD-28. El número de genotipos identificado con cada marcador fue moderado en algunos casos, cuatro en VVMD-34, y hasta 15 con VVMD-28. La combinación de un pequeño número de estos marcadores (por ejemplo, VVMD-5 más VVMD-28) fue suficiente para obtener una completa diferenciación de los cultivares. Considerando estos

antecedentes, se propone una combinación de marcadores para ser usada en certificación genética de cepas viníferas.

Palabras claves: variedades de uva vinífera, ADN, polimorfismo, Vitis vinifera, Vitis labrusca.

Validación de métodos de detección y diagnóstico de patógenos y

costes de la especificidad y sensibilidadAntonio Olmos Castelló, Edson Bertolini y Mariano Cambra Álvarez

Centro de Protección Vegetal y Biotecnología. Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

(IVIA). Carretera Moncada-Náquera km 5, 46113 Moncada, Valencia

La validación de métodos o protocolos de detección y diagnóstico de agentes fitopatógenos no es frecuente y en muchas ocasiones tampoco se realiza de un modo apropiado. En ellos se incluyen reactivos (anticuerpos, iniciadores y sondas) y técnicas que tampoco suelen ser validados antes de ser usados a gran escala o comercializados. Nos referimos a detección cómo la comprobación de la presencia de un agente patógeno o alguna de sus dianas o metabolitos, en plantas asintomáticas o en sus órganos y productos, en vectores, suelo o substrato, aire o agua. Cuando nos refiramos a diagnóstico llevará implícita la presencia de síntomas. La falta de validación de técnicas de detección y diagnóstico en Fitopatología es una realidad que contrasta con la habitual exigencia de su realización en Patología Clínica y Veterinaria. Validar una técnica significa compararla con otra ya establecida o de referencia (“gold standard technique”) para confirmar su validez mediante una serie de parámetros y además, se debe disponer de una población similar de muestras positivas (que contengan el agente patógeno) y negativas. Los análisis se realizarán mediante la técnica bioquímica, física, biológica, serológica o molecular de interés. La presencia de síntomas típicos de la enfermedad a diagnosticar también es importante para la valoración final. La detección y el diagnóstico en

Fitopatología, como ocurre en otros campos, manejan en general dos variables dicotómicas o binarias. Por un lado la variable enfermedad, que tiene dos posibles valores: presencia o ausencia, y por otro lado la variable prueba diagnóstica con dos posibles resultados: positivo o negativo. La combinación de estas variables da lugar a cuatro resultados con los que se pueden calcular los parámetros de la calidad de la detección o del diagnóstico que ofrece la técnica.

Palabras Claves: fitopatógenos, anticuerpos, iniciadores y sondas.

USO DE MARCADORES BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES EN ESTUDIOS DE DIVERSIDAD GENÉTICA.1

Viviana Becerra V.2:y Mario Paredes C.2

1Recepción de originales: 19 de mayo de 1999.2Instituto de investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Quilamapu, Casilla 426, Chillán, Chile. E-mail vbecerra@inia.clAGRICULTURA TÉCNICA (CHILE)60(3):270 - 281 (JULIO - SEPTIEMBRE, 2000)

INTRODUCCIÓN

La conservación y utilización de los recursos genéticos es de importancia estratégica para la humanidad. Las regiones centro y sud americana son consideradas como los centros de mayor diversidad biológica del mundo; de hecho varias especies de importancia agrícola, agroindustrial, medicinal y farmacológica se han originado en estas regiones.Desde siempre, las diferentes especies vegetales han estado sometidas a una activa interacción con el medio ambiente, lo cual ha generado un gran número de genotipos adaptados a diferentes condiciones locales, ampliando la diversidad genética. Sin embargo, en las últimas décadas esta diversidad genética se ha visto severamente reducida por las exigencias del mercado y la disminución de los suelos cultivados. Ante esta situación, uno de los desafíos actuales es buscar la manera de incentivar la conservación y uso racional de los recursos genéticos. Actualmente existe un gran número de colecciones de germoplasma que contienen genotipos con un alto valor agronómico, susceptible de ser usado en los programas de mejoramiento genético. Sin embargo, en muchas ocasiones el conocimiento de la organización genética y la relación existente entre el material disponible es escaso, lo que impide su utilización en fitomejoramiento. Inclusive dentro de estas colecciones existen materiales ingresados como accesiones diferentes que resultan ser duplicaciones del mismo material, lo cual conlleva a una sobreestimación de la diversidad existente.Históricamente, los estudios relacionados con diversidad genética en plantas han estado relacionados con datos arqueológicos, botánicos, lingüísticos, históricos y morfológicos. Vale decir, desde el punto de vista agronómico y comercial, la caracterización del germoplasma se ha basado fundamentalmente en características de alta y de baja heredabilidad, medidas a través del fenotipo. Sin embargo, las principales limitantes de esta caracterización son la influencia

ambiental, el tiempo requerido para colectar los datos y el reducido número de genes involucrados en este proceso.En la década de los 50 la electroforesis comenzó a ser utilizada en estudios de diversidad genética. Básicamente la electroforesis es una técnica que separa moléculas por su movilidad diferencial a través de un solvente en un campo eléctrico. Actualmente, los avances en biología molecular han incorporado nuevos marcadores, de naturaleza molecular y de mayor sensibilidad para detectar cambios en el genotipo de los individuos, situación que ha permitido grandes avances en este tipo de estudios.Los objetivos del presente artículo son describir las principales técnicas bioquímicas y moleculares usadas en estudios de diversidad genética, y analizar sus principales ventajas y desventajas.

I. MARCADORES BIOQUÍMICOS.

a) Proteínas de reserva en semilla.En la actualidad existen diversos métodos analíticos para el estudio de las proteínas de reserva tales como: centrifugación, cromatografía, análisis de amino ácidos y electroforesis. A su vez, la electroforesis ha sido desarrollada en geles de almidón de una dimensión, en geles de poliacrilamida con o sin Sodium Dodecil Sulfate (PAGE), punto isoeléctrico (IEF) y poliacrilamida de dos dimensiones. Entre estas formas, la de mayor uso en estudios de diversidad ha sido la electroforesis en poliacrilamida vertical (PAGE- SDS) por presentar una buena resolución de las proteínas.El uso de proteínas de almacenamiento en sistemática y diversidad genética se basa en el hecho que las proteínas de diferentes individuos, poblaciones y especies son homólogas, y que al separarse en un gel producirán bandas similares o diferentes. Debido a que las proteínas de reserva carecen de actividad enzimática, ellas son detectadas en el gel por medio de técnicas generales de teñido. Estudios genéticos han demostrado que los patrones de bandas de las proteínas de reserva son heredados como características discretas y en forma codominante, observándose en algunos casos un efecto maternal (Leonard et al. , 1988 ). El número de genes que controlan estas características es reducido y varía de acuerdo a la especie (Gepts, 1990). Como marcador bioquímico las proteínas de reserva tienen una baja influencia ambiental, aunque se han reportado algunas excepciones (Gayler y Sykes, 1985) además, permite un análisis rápido de decenas de muestras por ser un método simple y de bajo costo comparado con otras técnicas. Sin embargo, los distintos patrones electroforéticos detectados pueden tener una base molecular compleja que puede incluir sustituciones, inserciones y pérdidas nucleotídicas. También las diferencias pueden ser causadas por modificaciones pre y post transcripción y/o traducción. Hasta ahora ha sido difícil relacionar los cambios fenotípicos de los patrones de bandas con el tipo de cambio a nivel molecular. Por otro lado, la cantidad de diversidad genética mediante polimorfismo proteico puede ser subestimada por la no detección de mutaciones silenciosas. El polimorfismo de las proteínas de reserva en semillas ha sido utilizado para identificar y distinguir genotipos cultivados y silvestres en numerosas especies, tales como: frejoles (Phaseolus vulgaris) (Gepts y Bliss, 1986), trigo (Triticum aestivum) (Meachman et al , 1978 ), cebada (Hordeum vulgare) (Nebo et al , 1983 ), arveja (Pisum sativum)(Casey et al, 1986 ) y maíz (Zea mays) (Wilson, 1985). En algunas especies, como es el caso del frejol, esta técnica fue tan eficaz que mediante el estudio de un locus fue posible determinar por primera vez la organización de la diversidad genética de la especie (Gepts, 1990), situación que ha sido

comprobada más tarde con el uso de isoenzimas y Fragmentos de Restricción polimórficos (RFLP) (Koenig y Gepts, 1989; Becerrra y Gepts, 1994).

b) Isoenzimas.Con el avance tecnológico ocurrido en los años 70, el uso de geles de almidón y la tinción histoquímica de las proteínas, se demostró dentro de un organismo la existencia de las isoenzimas, formas moleculares múltiples dentro de un organismo que catalizan una misma reacción. El efecto de una modificación alélica puede ser detectado con certeza, debido a un cambio de movilidad electroforética. Esta sensibilidad electroforética hizo que la técnica haya revolucionado los estudios de diversidad genética en diversas especies.Para estos estudios se han utilizado varias estructuras de la planta, tales como hojas, raíces o botones florales, de las cuales se obtiene un extracto crudo proteico. La técnica consiste en la separación de las enzimas del extracto crudo, en un soporte permeable (almidón, PAGE) bajo la acción de un campo eléctrico y seguido de un teñido histoquímico. La separación se realiza mediante la carga eléctrica neta, peso molecular, punto isoeléctrico y/o combinación de estos criterios (separación multidimensional). De este modo se separan enzimas codificadas por genes diferentes o productos de diferentes alelos de un mismo gen.Las principales características de las isoenzimas incluyen la simplicidad, mínima cantidad del material en estudio, bajo costo y una cobertura del genoma de 10-20 loci por especie, ausencia de epistasis e influencias ambientales. La expresión alélica es de tipo codominante, lo que permite establecer comparaciones entre especies, poblaciones de una misma especie, y detectar la presencia de híbridos e introgresión de genes (Paredes y Gepts, 1995).Entre sus desventajas se incluye un nivel bajo de polimorfismo al presentar pocos alelos por locus, especialmente cuando la base genética es estrecha. Por ejemplo, en lechuga (Lactuca sp) el número de polimorfismos fue tan bajo que no permitió diferenciar entre cultivares (Kesseli et al. , 1991 ). Otro aspecto a considerar es que las proteínas, siendo un producto del ADN, pueden ser afectadas cualitativa y cuantitativamente en su nivel de expresión por factores ambientales. Para aumentar la eficiencia de la técnica ante este factor, deben ser identificados los estados de desarrollo de la planta durante los cuales la proteína es estable. Además, al igual que con las proteínas de reserva, las isoenzimas pueden o no reflejar los cambios genéticos que ocurren en el ADN, además sólo un set de genes estructurales están representados en estas proteínas, vale decir, sólo parte del genoma se puede evaluar. Las isoenzimas han sido a menudo usadas para investigar problemas de sistemática, evolución o para medir los niveles de variación genética entre y dentro de las poblaciones (Paredes y Gepts, 1995), en la identificación de cultivares (Arulsekar et al. , 1985 ). Varios estudios de diversidad genética se han realizado en diferentes especies de cultivos anuales y perennes, tales como lentejas (Lens culinaris) (Rodríguez et al. , 1999 ), frejoles (P. vulgaris) (Paredes y Gepts, 1995), nogal (Junglans regia) (Arulzekar et al. , 1985 ) y vid (Vitis sp.) (Arulsekar y Parfitt, 1986).

II. MARCADORES MOLECULARES

El polimorfismo basado en proteínas ha sido de gran utilidad en las investigaciones realizadas en plantas, pero con el desarrollo de las tecnologías basadas en ADN, la investigación en esta área se ha visto favorecida con la disponibilidad de una mayor cantidad de marcadores, aquellos basados en Fragmentos de Restricción Polimórficos (RFLP) y en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Ambas técnicas han derivado en múltiples técnicas como son

la Amplificación de ADN al Azar (RAPD), Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificados (AFLP), minisatélites (VNTR) y microsatélites (SSR), entre otros.

a) Fragmentos de Restricción Polimórficos (RFLP)Los RFLPs permiten estudiar el genoma con una mayor cobertura al incluir secuencias codificadoras y no-codificadoras del ADN (exones e intrones). Esto permite detectar con mayor eficiencia cambios genéticos puntuales, comparado con las proteínas (Wang et al. , 1992 ). Las principales ventajas de los RFLPs radican en la presencia de un número ilimitado de ellos, no son afectados por el medio ambiente, no presentan efectos pleiotrópicos y pueden ser evaluados en cualquier etapa de desarrollo de la planta.La técnica está basada en la digestión del ADN total de un individuo con diferentes enzimas de restricción. Esta restricción produce cantidades equimolares de fragmentos para una molécula de ADN dada. Los fragmentos resultantes son separados por electroforesis en geles de agarosa y transferidos por capilaridad a una membrana de nylon (Southern Blot). Esta membrana es hibridada con una sonda (radioactiva o no). El producto de la hibridación es visualizado por medio de una autoradiografía de rayos-X, de acuerdo al peso molecular de la banda.Básicamente, los RFLPs son causados por rearreglos del ADN, tales como pérdidas, inserciones o sustituciones de secuencias o nucleótidos únicos, lo que significa la ganancia o pérdida de sitios de restricción. Esto es detectado a través de diferencias en el peso molecular de los fragmentos homólogos de restricción del ADN genómico al hibridar con la sonda seleccionada.Los RFLPs se heredan en forma Mendeliana simple, y si la sonda empleada representa una copia única, ella es considerada como un locus y las variaciones en patrones son analizados como alelos (bialélicos o multialélicos) (Doebley y Wendel, 1989). La expresión de estos marcadores es codominante, vale decir, todas las formas alélicas del gen son distinguibles, permitiendo detectar los híbridos y estudiar el flujo de genes entre poblaciones. El nivel de polimorfismo que esta técnica puede detectar depende en gran medida de la naturaleza de las sondas empleadas, enzimas de restricción utilizadas y de la complejidad en cuanto al tamaño del genoma de la especie en estudio. Dentro de las principales desventajas de los RFLP están la clonación de las sondas, detección de RFLP en las membranas y el uso de radioactividad; tareas consideradas laboriosas, lentas y caras. Aunque últimamente, el desarrollo de la técnica no-radioactiva ha simplificado esta metodología (Foolad et al. , 1995 ).El uso de los RFLP en plantas representa una buena alternativa para realizar diversos estudios relacionados con los tres genomas que existen en ellas, el nuclear (ADNn), mitocondrial (ADNmt) y el de cloroplasto (ADNcp). La aplicación de esta técnica ha sido de gran utilidad en estudios filogenéticos, diversidad genética (Becerra y Gepts, 1994) e identificación de cultivares con propósitos de protección varietal. El uso de uno u otro genoma dependerá de los propósitos del estudio. El ADN nuclear ha sido mayormente usado para estudios de diversidad genética de individuos emparentados por su mayor tasa de mutación en comparación al ADN mitocondrial y el de cloroplasto. Es así como el ADNmt ha sido usado mayormente en estudios de filogenia en animales. En plantas, el uso de este genoma en estudios filogenéticos es discutido debido a la presencia de rearreglos del ADN y a la detección de ADN foráneo dentro de sus secuencias nucleotídicas (Palmer, 1992). Sin embargo, en maíz este ADN ha sido usado, detectándose una variabilidad considerable (Weissinger et al. , 1983 ). Debido a su alta tasa de rearreglos este organelo pareciera ser más útil que el uso del cloroplasto para estudiar diversidad en las especies.

Por otro lado, se ha detectado diversidad de ADNcp entre especies, por lo que el uso de este organelo es importante en estudios de filogenia (Palmer et al. , 1983 ). Durante la evolución del cloroplasto han ocurrido considerables sustituciones de bases, lo que ha producido cambios en los sitios de restricción, en lugar de rearreglos dentro del genoma como ha ocurrido con las mitocondrias. Dentro de las especies el ADNcp ha sido usado principalmente para comparar entre genotipos cultivados y silvestres. En algunos casos, el uso de este ADN ha sido bastante exitoso, como es el caso de la cebada (Hordeum vulgare) (Clegg et al., 1984 ), maíz (Zea mays) (Doebley, 1992) y cebolla (Allium sativum) (Havey, 1991). Sin embargo, en otras especies no ha sido eficiente, como es en el caso del sorgo (Sorghum sp.).

b) Fragmentos polimórficos de ADN Amplificados al Azar (RAPD).Recientemente, se ha desarrollado una serie de técnicas basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (White et al., 1989 ). El principio de esta técnica se basa en la amplificación al azar de fragmentos de ADN usando un partidor, ADN genómico molde, nucleótidos, cloruro de magnesio y Taq ADN polimerasa. Esta reacción es sometida a diferentes condiciones cíclicas de temperatura, lo que permite la amplificación in vitro de múltiples fragmentos de ADN a partir de una cadena molde. Estos productos son polimorficos cuando se ha producido una pérdida, inserción o cambio de un solo nucleótido en la cadena molde (ADN genómico). A partir del PCR se han generado una serie de técnicas, tales como la de Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificado al Azar (RAPD). Esta técnica usa partidores aleatorios de 10 mers (Williams et al. , 1990 ) para amplificar el ADN. Los productos de la amplificación son separados mediante electroforesis y las bandas visualizadas, de diferente peso molecular representan diferentes loci. En algunas especies, la técnica da la opción de usar dos o más partidores dentro de la misma reacción para aumentar el número de bandas, logrando una mayor cantidad de información por reacción. Los productos de la reacción dependerán del genoma en estudio, del partidor y de las condiciones de la reacción. Los resultados de RAPD obtenidos en plantas indican su herencia dominante, su habilidad para detectar regiones de ADN altamente variables (5-10 loci por partidor), su tremenda potencialidad en el mapeo de genes, identificación de razas, estudios de hibridación inter e intraespecífica y en el estudio de la variación genética en poblaciones altamente emparentadas.Las principales ventajas de esta técnica son la rapidez en la obtención de resultados, el costo, el no uso de radioactividad, menor inversión en equipos y la cantidad reducida de ADN requerida. Sin embargo como desventaja aparece la inconsistencia de los datos. Diferentes condiciones de laboratorios con pequeñas alteraciones en los parámetros de amplificación, pueden dar origen a resultados diferentes. Esta desventaja se puede reducir logrando un alto grado de estandarización de las condiciones de reacción y de amplificación, usando un control interno para asegurar la reproducibilidad de los productos de la amplificación, además del registro de las bandas nítidas y consistentes.La técnica del PCR también ha sido ampliamente usada para estudiar diversidad genética de cultivares y su relación con sus ancestros silvestres (Demeke et al. , 1992 ; Vierling y Nguyen, 1992; Sharma et al ., 1995 ).

c) Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificados (AFLP)Recientemente otra técnica basada en el método de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ha sido desarrollada (Vos et al. , 1995 ). En esta técnica se combinan los principios de los RFLP y PCR, donde una submuestra de fragmentos producidos por la restricción del ADN bajo

estudio son amplificados selectivamente en cascada. Los AFLPs usan como partidores oligonucleótidos complementarios a las secuencias que han sido ligadas a cada extremo del ADN digerido. El polimorfismo es detectado por la presencia o ausencia de fragmentos y son normalmente, al igual que RAPD, de herencia dominante.Con esta técnica se puede detectar una variación considerable del genoma, lo cual se refleja en el número de productos amplificados con una sola combinación de partidores. La eficiencia en detectar polimorfismo puede ser varias veces mayor que la obtenida con RAPD y RFLP. Esta metodología ha sido ampliamente usada en diversas especies para medir diversidad genética, tales como: lechuga (Lactuca sativa) (Hill et al. , 1996 ) y lenteja (Lens culinaris) (Sharma et al. , 1996) entre otras. En el futuro esta técnica tendrá una gran utilización en la saturación de mapas genómicos y en la identificación de fragmentos ligados a genes de interés comercial (Colwin et al. , 1995 ).El procedimiento comienza con la digestión del ADN genómico de los individuos con enzimas de restricción que reconocen 4 y 6 bases de reconocimiento, lo cual genera fragmentos de tamaño preferentemente pequeño. Luego se ligan adaptadores de secuencia conocida a cada extremo y para el proceso de amplificación se usan partidores complementarios a estos adaptadores, manteniendo el sitio de restricción más un cierto número de nucleótidos (3 generalmente) que deben agregarse al extremo 3’. Finalmente, el proceso implica dos alternativas de detección de las bandas, la primera es la marcación radioactiva de los productos amplificados en la última etapa de amplificación, su separación en geles de poliacrilamida, secado del gel y su visualización en autoradiografías. La segunda alternativa usa la tinción directa del gel con nitrato de plata. Los resultados entre ambas alternativas son comparables, siendo esta última de menor costo y fácil aplicación. Una de las mayores ventajas de esta técnica es que en una sola reacción se puede identificar alrededor de 50 loci en un tiempo corto (Tohme et al. , 1996 ).Se han realizado comparaciones de los diversos marcadores utilizados a medida que se han ido desarrollando. Por ejemplo: al comparar resultados de este marcador con RFLPs y otros marcadores en lechuga (Lactuca sativa) (Hill et al. , 1996 ) los genotipos fueron agrupados en forma similar. En soya (Glycine max) los AFLPs detectaron alrededor de 12 veces el número de loci polimórficos (Voguel et al. , 1994 ) comparados con RAPDs. Es así como en el caso puntual de estudios de diversidad genética del frejol, la técnica de AFLP detectó una diversidad de 0,31 (1= igualdad genética) entre genotipos silvestres y cultivados (Tohme et al. , 1996 ), mayor a la detectada por isoenzimas en los mismos genotipos (Singh et al. , 1991 ). Sin embargo, los resultados de diversidad genética obtenidos fueron similares con los AFLP y RFLP. Una de las desventajas para la interpretación de los datos es el tiempo necesario para el análisis cuando se realiza en forma no automatizada (visual). Por otro lado, los loci de AFLP son tan reproducibles como los RFLPs, pues son prácticamente insensibles a las condiciones de la reacción (Tohme et al. , 1996 ), aunque ambas técnicas requieren de una buena calidad de ADN para el proceso de digestión con enzimas de restricción. Comparativamente, estas dos técnicas son de mayor precisión que los RAPDs, susceptibles a una falta de estandarización del proceso de amplificación.

d) Minisatélites y Microsatélites.Las secuencias de ADN de mini (VNTR) y microsatélites (SSR) son dos categorías de secuencias repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se encuentran repetidas en tandem y dispersas a través del genoma representando muchos loci. Cada locus tiene distinto número de repeticiones variable, asociándose de esta manera a alelos específicos de alta variabilidad. A

través del uso de estos marcadores se han obtenido patrones complejos de ADN en animales, plantas, y microorganismos.Dentro de la primera categoría, los minisatélites son usados como sondas de secuencias simples repetidas. Las secuencias repetidas de estos minisatélites son monómeros que generalmente tienen 15-35 pares de bases, y han sido aislados de mamíferos, plantas y del genoma del bacteriófago M13. Una combinación de una enzima de restricción con la sonda de M13 puede generar un alto número de bandas, lo cual produce una gran información, comparada con los RFLPs. Al igual que éstos, la técnica es de alta reproducibilidad, aunque requiere de un proceso de clonación previo de la sonda hipervariable, además de un ADN de alta calidad para el proceso de restricción y transferencia (Southern blot), e hibridación con la sonda, generalmente marcada radioactivamente, y finalmente de la exposición a una película de rayos-X. Actualmente este polimorfismo puede ser detectado mediante PCR, mediante el uso de partidores que reconocen secuencias externas que rodean a las secuencias repetidas (Heat et al. , 1993). Este polimorfismo identifica un locus que resulta ser multialélico debido a un elevado número de unidades repetidas, que corresponden a muchos alelos.Los minisatélites han sido usados para estudiar diversidad genética y realizar la identificación de individuos ("fingerprinting") en diversas especies (Stockton et al. , 1990 ; Ramakrishna et al. , 1995). La segunda categoría de secuencias repetidas son los microsatélites, ellos son secuencias de 1 a 5 nucleótidos repetidas en tandem y existen en forma abundante en plantas (Condit y Hubbell, 1991). Mediante los microsatélites se puede medir la diversidad entre genotipos amplificando mediante PCR la región del ADN genómico que contiene estas secuencias repetidas. El uso de microsatélites ha ido aumentando mediante la producción de bibliotecas de partidores y la secuenciación automática fluorescente que permiten el diseño de los partidores que rodean los microsatélites (Brondani et al., 1998 ). Los fragmentos generados son separados en geles denaturantes de poliacrilamida y visualizados radioactivamente o por tinción con nitrato de plata. Los microsatélites son muy atractivos para los genetistas pues combinan varias ventajas como son su codominancia, multialelismo y su alta heterocigosidad. El alto nivel de polimorfismo que detecta permite una discriminación precisa entre individuos altamente emparentados. Además de ser altamente polimórficos, los microsatélites usan cantidades mínimas de ADN, equivalentes a las que se usan en RAPD. Las condiciones de amplificación y de reacción son especie-específicos y la variación en el largo de los productos amplificados mediante PCR es función del número de unidades repetidas. En general, la amplificación de microsatélites ha demostrado que éstos son más variables que isoenzimas, RFLP, AFLP y RAPD. Por ejemplo, en Cucumis 29 isoenzimas no mostraron polimorfismo entre dos genotipos comerciales (Perl-Treves et al. , 1985 ). Dentro del mismo género RAPD detectó un 38% de polimorfismo, mientras que los microsatélites detectaron un 71%, e incluso detectaron diferencias genéticas entre cultivares altamente emparentados que mediante otras técnicas no habían podido ser distinguidos (Katzir et al. , 1996 ). Es así como se ha comprobado, en diversas especies, la complementariedad de todas las técnicas mencionadas anteriormente en el estudio global de la organización genética del germoplasma.Una de las desventajas de los microsatélites es el tiempo y costo involucrado en el proceso del diseño de cada partidor, sin embargo existe la posibilidad de usar los mismos partidores en más de una especie. Esto es debido, a que existe un grado de conservación de los microsatélites entre genomas de especies tan distantes como son algunos mamíferos, plantas anuales y perennes. Esto no es generalizado en todas las especies, puesto que al comparar entre cereales

de grano pequeño como trigo, cebada y centeno, se ha detectado una limitada conservación de las secuencias microsatelitales. Los microsatélites han sido también utilizados para medir diversidad genética de diversas especies anuales como: soya (Glycine max) (Akkaya et al ., 1992 ), arroz (Oryza sativa) (Wu y Tanskley, 1993), maíz (Zea mays) (Senior y Heum, 1995), cebada (Hordeum vulgare) (Becker y Heun, 1995), trigo (Triticum aestivum) (Röder et al. , 1995 ) y raps (Brassica sp.) (Lagercrantz et al. , 1993 ).Hasta ahora también se han desarrollado microsatélites en especies perennes, aunque el número de ellos ha sido escaso (Brondani et al. , 1998 ). En el caso de Eucaliptus los microsatélites han sido transferidos entre poblaciones y especies del mismo género. En forma adicional, la estimación de heterocigosidad que este marcador pueden entregar presenta una gran ventaja en el mapeo de características cuantitativas (QTLs), comparación de mapas que incluyen QTL y estudios de flujo genético en árboles.Aunque el uso de marcadores bioquímicos y moleculares en estudios de germoplasma y diversidad genética es limitado por el costo de los reactivos, y en algunos casos por el elevado costo de los equipos, los avances técnicos que estas tecnologías han alcanzado en los últimos años, los hacen más accesibles a los genetistas y a los programas de mejoramiento. Ambos tipos de análisis son complementarios en la caracterización morfológica y agronómica del germoplasma y en el entendimiento de la diversidad y estructura genética de las poblaciones, especies y taxas.La elección del marcador a usar dependerá de los objetivos del estudio, del costo y de las características que cada uno de ellos presentan (Cuadro 1).

Cuadro 1. Características generales de los marcadores genéticos.

Característica Proteínas Isoenzima RFLP RAPD VNTR AFLP SSR

Polimorfismo Alto Bajo Bajo-alto

Medio-alto Medio-alto Medio-alto

Alto

Estabilidad ambiental

Alta Moderada Alta Alta Alta Alta Alta

Número de loci Bajo Medio Alto Alto Alto Alto Alto

Reproducibilidad Alta Moderada-alta

Alta Moderada- alta

Alta Alta Alta

Aplicación Rápida-barata

Rápida-barata Lenta- cara

Rápida- cara Intermedia Lenta- cara

Lenta-cara

RFLP : Fragmentos de restricción polimórficosRAPD : Amplificación de ADN al azarVNTR : Número variable de repeticiones en tandemAFLP : Amplificación de fragmentos polimórficosSSR : Secuencias simples repetidas

RESUMENEn las últimas décadas ha habido un notorio aumento en los marcadores genéticos disponibles para estudios de diversidad genética. Algunos de ellos tienen diferentes bases moleculares, pero todos están enfocados a determinar la organización de la estructura genética en las poblaciones naturales y cultivadas. Además, ellos muestran la similitud entre y dentro de las poblaciones evitando el efecto ambiental.Conocer la similitud entre los individuos y las poblaciones es de gran utilidad en los programas de mejoramiento genético, pues permite, además de la organización del material la selección adecuada de los genotipos superiores y la complementación con datos fenotípicos y agronómicos para el desarrollo de una población mejorada. Este artículo revisa algunos antecedentes de estos marcadores basados en su metodología, ventajas y desventajas de su uso.

Palabras claves: biotecnología, diversidad genética, polimorfismo.

LITERATURA CITADAAkkaya, M.S.; Bhagwat, A.A. And Cregan, P.B. 1992. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics 132:1131-1139Arulsekar, S.; Parfitt, D.E. and Mcgranahan, G. 1985. Isozyme gene markers in Junglans species: Inheritance of GPI and AAT in J. regia and J. hindsii. The Journal of Heredity 76:103-106Arulsekar, S. and Parfitt, D.E. 1986. Isozyme analysis procedures for stone fruits, almond, grape, pistachio and fig. HortScience 21 :928-933Becerra, V. and Gepts, P. 1994. RFLP diversity of common bean (Phaseolus vulgaris L.) in its centres of origin. Genome 37: 253-263

Marcadores moleculares: Qué son, cómo se obtienen y para qué valen

M. Gonzalo Claros Díaz Investigador Contratado en el Dpto. de Biología Molecular y Bioquímica (Universidad de Málaga)

Desde la prehistoria, el hombre ha seleccionado y mejorado especies vegetales, animales y microbianas basándose en el fenotipo. Las mejoras genéticas eran posible gracias a la variabilidad genética, a la heredabilidad del carácter que se quería aislar, a la eficacia e intensidad de la selección aplicada, y al tiempo necesario para realizar un ciclo de selección. Sin embargo, quedan muchos aspectos desconocidos, como son el número y efecto de los genes implicados en la expresión de un carácter, la localización de estos genes, y su función fisiológica. Por otra parte, la taxonomía siempre ha estudiado características morfológicas, lo cual requiere observaciones muy exhaustivas de los organismos en diferentes estadios de desarrollo. Los criterios utilizados carecen muy a menudo de definición y objetividad y, en cualquier caso, son marcadores ambiguos debido a las influencias ambientales. Afortunadamente la aparición de los marcadores moleculares está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva. Los

marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser marcadores moleculares son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida). Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequívocamente con un rasgo genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables). Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos los organimos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan hipervariable. Los primeros marcadores desarrollados a finales de los 70 se basaron en la identificación de proteínas e isoenzimas por electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida. Con ellos se abrió el conocimiento de la estructura y heterogeneidad genética entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen geográfico. Pero esta técnica tenía una límitación muy importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo entre variedades o especies próximas debido a que las proteínas son el resultado de la expresión génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente a otro, y de una época del año a otra. Los avances de la tecnología del DNA recombinante han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificación de especies y variedades. El número de técnicas descritas es cada vez más numeroso, por lo que vamos a reunirlas en 3 categorías: RFLP, MAAP y STS. Pero antes conviene saber lo que es una PCR (reacción en cadena de la polimerasa), descrita en 1988. La PCR es una de las técnicas esenciales para la preparación de huellas dactilares, si bien no vale para elaborar marcadores por sí sola. La reacción básica de la PCR comienza con la desnaturalización del DNA molde para separar las cadenas, continúa con el alineamiento de un par de oligonucleótidos con su DNA molde, y termina con la polimerización para sintetizar un nuevo DNA entre los dos oligonucleótidos. De aquí se vuelve a la desnaturalización para comenzar un nuevo ciclo. Hoy en día todo el proceso esta completamente automatizado en un aparato llamado ?termociclador?, y existe una batería de enzimas y condiciones que permiten polimerizar hasta 35 kpb sin errores, aunque las condiciones normales amplifican sin problemas fragmentos de 3 a 6 kpb de longitud. RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción). Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos más fáciles de analizar son los ?pequeños? derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para moléculas de DNA de mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas específicas para visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a genes previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecíficas. Aunque la RFLP evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros mapas genómicos basados en la distribución física de los genes en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se hicieron utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP MAAP (Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación) Término genérico acuñado en 1994 con el que se designan las técnicas que emplean

oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas técnicas caben destacar:

RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar): Es una de las técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990. Se usa una colección de decanucleótidos para amplificar por PCR áreas específicas distribuídas al azar por el genoma. Su pequeñez y la baja temperatura de alineamiento (36°C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de agarosa para obtener perfiles electroforéticos que variarán según el polimorfismo de los distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarán una huella dactilar característica. Es muy cómoda, rápida, requiere poco DNA que además no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rápida y simultáneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algún carácter, sino redundante, y que no da información sobre el número de copias que el DNA genómico contiene de la secuencia amplificada. Esta tecnología ha sido utilizada para la catalogación de frutos, selección de variedades, y diferenciación de líneas clonales. También se está utilizando para el análisis de las variedades de apio, uva, limón y olivo.

AP-PCR (PCR con oligonucleótidos arbitrarios): La idea es similar a la de la RAPD, desarrollándose a la vez que ésta, aunque se cambia el diseño de los oligonucleótidos y el tipo de PCR. Los oligonucleótidos han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja astringencia (poco específicos) que permite la polimerización de una batería de fragmentos característicos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos de alta astringencia para amplificar (visualizar) específicamente las bandas anteriores. Los fragmentos amplificados se pueden migrar en un gel de agarosa para observar las grandes diferencias entre especies, o bien se puede marcar radiactivamente y migrar en gel de poliacrilamida para obtener resultados mucho más finos y precisos. Existe una variación denominada DAF (Huellas dactilares por amplificación de DNA) que utiliza oligonucleótidos de 5 a 15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difíciles de interpretar.

AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): Esta técnica se desarrolló en 1995 y combina el uso de enzimas de restricción y oligonucleótidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores moleculares muy específicos sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. El DNA se corta con dos enzimas de restricción, una de corte muy frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas.y se amplifica por PCR. Jugando con la complementariedad del oligonucleótido con el sitio de restricción se puede disminuir o aumentar el número de bandas amplificadas. Una ventaja especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola reacción. Por eso el resultado debe resolverse en un gel de poliacrilamida de alta resolución, puesto que no se resolverían en agarosa. Esta técnica ya se ha usado con éxito en patatas y cebada.

STS (Sitios etiquetados por la secuencia) o SSLP (Polimorfismo de longitud en las secuencias discretas) Desarrollada a partir de 1989, aprovecha las secuencias conocidas, únicas dentro del genoma, para amplificarlas por PCR. El polimorfismo se suele encontrar fácilmente cuando lo que se amplifican son intrones en lugar de exones.

La ventaja principal es la velocidad con la que se pueden realizar los análisis una vez que las parejas de oligonucleótidos se han establecido claramente. Por tanto se combinan la rapidez de la RAPD con la especificidad de la RFLP. Por la manera en que se determinan los oligonucleótidos y por la forma de analizar los polimorfismos, esta técnica ha derivado en otras que enumeramos a continuación:

SSR (Repetición de secuencias discretas), descrita en 1989. En los genomas existe un DNA ubicuo y abundante denominado "microsatélite" que consiste en mono-, di-, tri- y tetranucleótidos repetidos en tándem. Este DNA, que es muy polimórfico, se ha utilizado como marcador molecular cuando la secuencia del motivo repetido se clona y secuencia para usarla en el análisis de poblaciones. De esta manera se han estudiado con éxito numerosos árboles, aunque en algunos se ha visto que los microsatélites son menos variables de lo que se esperaba. Otras siglas para designar esta técnica son ISSR, IMA, ISA, IRA, y RAMP.

EST (Sitios etiquetados por la expresión), descrita en 1991. Su particularidad proviene del hecho que los oligonucleótidos se han deducido a partir de cDNA parcial o completamente secuenciado. Curiosamente el polimorfismo sólo se observa claramente cuando los fragmentos amplificados se cortan con enzimas de restricción, lo que hace que el método sea realmente costoso en tiempo y dinero.

CAPS (Secuencia polimórfica amplificada y cortada), descrita en 1993. Los fragmentos amplificados se someten a una restricción enzimática y se migra en un gel de agarosa. Las variaciones se detectan por presencia o ausencia de sitios de restricción. Se pueden así localizar cambios finos en una zona específica.

SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas), descrita en 1993. Esta técnica aprovecha que las RAPD proporcionan principalmente fragmentos de DNA altamente repetido. Estos fragmentos de RAPD se clonan y secuencian para elaborar oligonucleótidos específicos. Aunque permite el desarrollo rápido de marcadores moleculares, el grado de polimorfismo obtenido es bastante bajo.

D/TGGE (Geles de electroforesis en gradiente desnaturalizante/térmico), descrita en 1987. Analiza el polimorfismo a través de la estabilidad, a distintas condiciones Desnaturalizantes o Temperaturas, del DNA amplificado. Su principal problema reside en las dificultades técnicas para manetener estables las condiciones experimentales.

SSCP (Polimorfismo de conformaciones monocatenarias), descrita en 1989. Esta técnica se basa en el análisis del polimorfismo a través de las diferencias conformacionales de fragmentos de DNA monocatenario. Las distintas conformaciones son detectables como un cambio de movilidad en geles de poliacrilamida no desnaturalizante. Es especialmente útil cuando las reacciones de PCR producen bandas de DNA de gran tamaño (en general superior a 1?5 kpb) o bien bandas de tamaño muy próximo. Puede llegar a distinguir cambios de pocos nucleótidos en una secuencia de más de 1 kpb. Se está utilizando para caracterizar árboles de interés forestal.

Las aplicaciones de los marcadores moleculares son muy diversas y es de esperar que cada vez se les encuentren nuevos usos. Por ahora se vienen empleando en la diferenciación de individuos, discriminación entre clones, análisis filogenéticos y taxonómicos, mapeo de genomas, cuantificación de variabilidad génica intra e interespecífica, mejoras genéticas, detección de infecciones o propensión a sufrirlas, localización de resistencia a enfermedades, y dispersión de especies.

En internet se puede obtener información adicional en las páginas web: www.ndsu.nodak.edu/insctruct/mcclean/plsc431/markers/ y opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MG01.html.

BOLETÍN DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICASVOLUMEN 41, NO. 2, 2007, PP. 215–226

UNIVERSIDAD DEL ZULIA, MARACAIBO, VENEZUELA215

VALOR POTENCIAL DE MARCADORESMICROSATÉLITE DE TABACO EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE

AGAVE

MARTHA DÁVILA Y MIGUEL A. CASTILLOUnidad de Investigación en Ciencias Biológicas, Departamento de Ciencias Biológicas, Decanato de Agronomía,Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado,Barquisimeto,

Estado Lara, Venezuelamartad@ucla.edu.ve

Resumen.

Las especies del género Agave son principalmente de origen tropical cultivadas por el valor de sus fibras y de las bebidas fermentadas que se obtienen de las plantas. Los estudios moleculares han sido de gran utilidad en el establecimiento de diferencias genéticas en otras especies, especialmente en aquellas donde la base de datos del ADN es conocida. Debido a la inexistencia de información relacionada con algunas especies de Agave y en particular Agave cocui, en este trabajo se realizó un estudio preliminar con el objetivo de evaluar el valor potencial de tres pares de iniciadores para microsatélites obtenidos por consenso de genoma de cloroplasto de tabaco con el fin de determinar su posible utilidad para la realización de estudios genéticos del género. Todos los pares de iniciadores generaron productos mediante la amplificación por PCR, sugiriéndose que es posible utilizar loci SSR derivados de secuencias de consenso de tabaco en estudios poblacionales de especies de Agave hasta que se cuente con una base de datos propia de las especies de interés. Recibido: 20 noviembre 2006, aceptado: 19 marzo 2007.

Palabras clave: Agave, marcadores microsatelite, Agave cocui, tabaco, taxonomía, base de datos del ADN.

*Nota: Los artículos sobre religión expuestos aquí no son en su totalidad de

fuentes adventistas.

¿Qué sucedió el 22 de Octubre de 1844?

febrero 25th, 2011 viogrecea

Un día como hoy 22 de Octubre, pero de 1844, sucedió lo que se conoce como “El Gran Chasco”. Muchos cristianos de esa época, que incluía a bautistas, presbiterianos, metodistas, lute-ranos, anglicanos, episcopales, congregacionalistas y discípulos de Cristoi, creían en el segundo advenimiento, y pensaron que ese día Jesús regresaría a la tierra para buscar a sus hijos. Pero Jesús no llegó. Con el aliento casi suspendido, los adventistas (creyentes en el segundo adveni-miento de Jesús) de diferentes denominaciones (Vale la pena aclarar que no nos referimos aquí a los Adventistas como Iglesia, pues todavía no existía como organización, ésta sucedió hasta 1863), “…no menos de 50,000 y probablemente cerca de los 100,000 esparcidos a lo largo de la sección noreste de Norteamérica, se levantaron para saludar aquel día memorable, el martes 22 de Octubre de 1844. Las horas de la mañana pasaron lentamente. Llegó el medio día y luego la tarde. Finalmente las tinieblas descendieron sobre la tierra y cayó la noche. Jesús no había veni-do. Pero todavía tenían esperanza, porque 22 de Octubre lo seguiría siendo hasta la medianoche. Finalmente llegó esa hora, y Jesús no vino”ii Hiram Edson, uno de los que esperaba que Jesús regresara en esa ocasión, describió su experiencia en estas palabras:“Hasta que el reloj tocó las doce campanadas a medianoche. Entonces nuestro chasco se convirtió en una certeza…Nuestras más caras esperanzas y expectativas quedaron destrozadas, y se apoderó de nosotros un ansia de llorar como yo nunca había experimentado antes. Parecía que la pérdida de todos los amigos terrenales no podía compararse (a ese dolor). Lloramos y lloramos, hasta que amaneció.”iii¡Qué dramática experiencia! ¿No? ¿Se imaginan cómo se habrán sentido? ¿Cómo enfrentar la

vida? ¿Cómo enfrentar a sus vecinos, amigos, familiares y críticos? Ellos, que tanto estuvieron exhortando a los demás a creer y tomar una decisión por Cristo; ahora se encuentran con las ma-nos vacías y “Sin Cristo” (aparentemente).¿Cómo llegaron a la conclusión, los creyentes en el segundo advenimiento de aquel tiempo, que Jesús regresaría a la tierra el 22 de Octubre de 1844?La profecía que parecía revelar con mayor claridad el tiempo del segundo advenimiento, era la de Daniel 8:14:”Hasta dos mil y trescientas tardes y mañanas; entonces el Santuario será purifica-do” (NRV-2000). Siguiendo el principio de que la Biblia fuera su propio intérprete, Miller, el pregonero del advenimiento, llegó a saber que un día en la profecía simbólica representa un año (Núm. 14:34; Ez. 4:6); vio que el período de los 2,300 días proféticos representaban años literales, y que se extendía mucho más allá de la era judaica y por lo tanto no podía referirse al Santuario de aquel entorno y época. Miller aceptaba la creencia general de que durante la era cristiana la tierra era el santuario y dedujo por consiguiente que la expresión: “el Santuario será purificado” de Daniel 8:14, representaba la purificación de la tierra. ¿Cómo se purifican las cosas incluyendo nuestro planeta? por el fuego, y ¿Cuándo sucederá eso? Pues en ocasión de la segunda venida de Cristo (Parafraseado).ivMiller llegó a la conclusión de que si podía encontrar el punto de partida de los 2,300 días o años, sería fácil fijar el tiempo del segundo advenimiento de Cristo a la tierra.Siguió escudriñando las Escrituras con mayor empeño que nunca pero no encontró en Daniel 8 la respuesta a su interrogante. Sin embargo descubrió que en la revelación del ángel a Daniel del capítulo 8 había algo que había quedado inconcluso y que Daniel mismo no había podido comprender de la visión por lo que había quedado “sin fuerzas” y “enfermo algunos días” (Dan. 8: 26,27). Entonces fue al capítulo 9 de Daniel y encontró que el ángel Gabriel vuelve a Daniel para darle la explicación de la visión de los 2,300 días o años del capítulo anterior (es decir, del

cap. que no había comprendido. El ángel le dice a Daniel: “Daniel, ahora he salido para darte sabiduría y entendimiento. Al principio de tus ruegos fue dada la orden, y yo he venido para en-señártela, porque tú eres muy amado. Entiende, pues, la orden, y entiende la visión (se refiere a la visión del capítulo 8 de los 2,300 días)” (esto lo encontramos en Dan. 9:22-23).El ángel le dice a Daniel: “Setenta semanas están determinadas sobre tu pueblo y sobre tu santa ciudad…sabe pues y entiende que desde la salida de la orden para restaurar y edificar Jeru-salén hasta el Mesías príncipe, habrá siete semanas y sesenta y dos semanas; tornaráse a edificar la plaza y el muro en tiempos angustiosos. Y después de las sesenta y dos semanas se quitará la vida al Mesías, y no por sí…Y en otra semana confirmará el pacto a muchos, y a la mitad de la semana hará cesar el sacrificio y la ofrenda” (Dan. 9: 24-27).La palabra traducida aquí por “determinadas”, significa literalmente “Descontadas” o “cor-tadas”. El ángel declara que las 70 semanas o 490 años, debían ser descontadas por pertenecer especialmente a los judíos. Pero, ¿descontadas de qué o de dónde? Miller comprendió que el único punto de referencia eran los 2,300 días o años de Daniel 8:14; por lo tanto las 70 semanas deben ser descontadas de los 2,300 días o años y que ambos períodos deben comenzar juntos. El ángel le había declarado a Daniel que las 70 semanas debían comenzar a contarse desde el mo-mento en que se diera el edicto para reedificar a Jerusalén; por lo tanto concluyó que si se podía fechar el inicio de ese edicto, sería fácil llegar al fin de las 70 semanas y por consiguiente de los 2,300 días o años. Al hacerlo, se podría saber la fecha de la purificación del santuario (tierra) o segunda venida de Cristo.vBasado en Esdras 6: 14; 7: 12 – 26, encontró que de los tres intentos de decretos para la res-

tauración de Jerusalén (Ciro, Darío y Artajerjes), el de Artajerjes fue cuando finalmente fue com-pletado. Éste, sucedió en el otoño del 457 a.C. Por lo tanto, tomando esa fecha de partida, las 70 semanas o 490 años llevan al otoño del año 34 d.C.Veamos las cuentas:2, 300 días = realmente son = 2 300 años.Las 70 semanas en realidad son = 490 años. (1 semana tiene 7 días y si lo multiplicamos por las 70 semanas: 7 X 70 = 490)Estos 490 años estaban cortados o descontados de la profecía mayor, es decir los 2, 300 años, por lo tanto lo que Miller hizo fue: Partiendo del año 457 a.C. sumó 490 años (de las 70 semanas) le llevaron al año 33 d.C.457 a. C. 2 300 años año 33 d.C.+ 490 años – 490 años + 1810 años= 33 d. C. año 1,810 año 1843 d.C.Al descontar los 490 años (de las 70 semanas) de la profecía mayor, (la de los 2,300 días o años) quedaban 1,810 años. Al seguir contando, partiendo del año 33, los 1,810 años le llevaron a 1843. Por lo tanto Miller concluyó que Jesús purificaría la tierra en otoño de 1843. Cuando lafecha pasó, Miller expresó su decepción de que Cristo no había venido, pero instó a los creyentes a seguir aguardando la pronta venida del Señor. En Febrero de 1844 un grupo de predicadores adventistas, que no incluía a Miller, concluyó que la profecía no terminaría sino hasta el otoño de 1844. Llegaron a esa conclusión porque notaron que Miller había contado el año cero; es decir, en la era antes de Cristo, los años se contaban de manera decreciente: 5, 4, 3, 2, 1 a.C. al pasar a la era cristiana Miller contó un año cero y luego continuó 1, 2, 3, 4, 5 d.C. por eso le llevó al año 1843. Pero el grupo de adventistas pasaron del año 1 a.C. al año 1 d.C. y los llevó al año 1844.457 a. C. 2 300 año 34 d.C.+ 490 – 490 +1810 años= 34 d. C. 1,810 año 1844 d.C.El 22 de Octubre se calculó sobre la base de la fecha para el día de expiación judío, en el séptimo mes del calendario judío Karaíta. La fecha del 22 de Octubre se aceptó lentamente; Mi-ller mismo decidió que el 22 de Octubre de 1844 era la fecha correcta apenas dos semanas antes del día decisivo.viHacia una comprensión más completa del Ministerio de CristoEl cálculo había sido correcto, la profecía era clara y el cómputo exacto; ¿Cuál pues había sido el error? el problema fue en la interpretación de qué significaba el santuario y qué aconte-cimiento sucedería al fin de ese período profético, es decir, qué significaba la expresión: “el san-tuario será purificado”.Como resultado de la decepción pasada, muchos abandonaron el estudio de la Biblia y su fe, pero otros decidieron en oración, seguir estudiando el significado de esta profecía y el ministerio de Cristo a favor de la humanidad. Los esfuerzos fueron recompensados con una mejor com-prensión del ministerio de Cristo en el santuario celestial y su decepción fue transformada en esperanza y gozo.viiEl 23 de Octubre de 1844, Hiram Edson y un amigo millerita decidieron animar a quienes, como ellos, se habían chasqueado. Mientras cruzaban el maizal de Edson después de orar juntos, Edson tuvo una iluminación en forma repentina. “Le pareció que una mano le tocaba el hom-bro. Alzó los ojos y vio, como en una visión, los cielos abiertos y a Cristo en el santuario entran-do en el lugar santísimo para comenzar su ministerio de intercesión a favor de su pueblo, en vez de salir del santuario para purificar el mundo por fuego.”viii Los milleristas habían

pensado que el Santuario que debía ser purificado (Dan. 8:14) era la iglesia en la tierra, la que sería purificada del pecado en la segunda venida de Cristo. Ahora Edson comprendió que el Santuario que debía ser purificado no estaba en la tierra sino en el cielo; el 22 de Octubre marcaba el comienzo, no el fin, del día antitípico de expiación. Jesús había entrado en el lugar santísimo del Santuario celestial para realizar una obra especial antes de venir a esta tierra.ix El Santuario era el cielo no la tierra.Edson y sus amigos milleritas reexaminaron las Escrituras guiados por esta convicción. En 1845 Owen R.L. Crosier elaboró el punto de vista de Edson, articulando más tarde la posición adoptada por los Adventistas del Séptimo Día. El 22 de octubre marcó el comienzo de la purifi-cación del Santuario celestial y la iniciación del juicio investigador previo al advenimiento; la se-gunda venida de Cristo a la tierra estaba en el futuro. Encontraron además que no se debía fijar ninguna fecha específica para ello.x¿Por qué debe realizarse un juicio investigador anterior al advenimiento?Este juicio no es para beneficio de la Dios. Es primariamente para beneficio del universo, puesto que refuta las acusaciones de Satanás y provee para la creación no caída la seguridad de que Dios permitirá entrar en su reino únicamente a los que estén verdaderamente convertidos. De modo que abre los libros de registro para una inspección imparcial (Dan. 7, 9,10)Los seres humanos pertenecen a una de estas tres clases: (1) los malvados, que rechazan la au-toridad de Dios, (2) los creyentes genuinos, que confiando en los méritos de Cristo por la fe vi-ven en obediencia a la ley de Dios, y (3) los que parecen creyentes genuinos pero no los son.Los seres no caídos pueden distinguir fácilmente quienes pertenecen a la primera clase. Pero, ¿quién es un verdadero creyente y quién no lo es? Ambos grupos están escritos en el libro de la vida, que contiene los nombres de todos los que alguna vez han pasado a estar al servicio de Dios (Luc. 10: 20; Fil. 4: 3; Dan. 12: 1; Apoc. 21: 27). La misma iglesia contiene el trigo y la cizaña (Mat. 13: 28-30).Los seres no caídos de la creación no son omniscientes; no pueden leer el corazón. Por eso se necesita un juicio – antes de la segunda venida de Cristo – para separar lo verdadero de lo falso y demostrar al universo interesado, la justicia de Dios que salva al creyente sincero. Requiere que se abran los libros de registro y que se revele la verdadera naturaleza de los que han profesado fe y cuyos nombres han sido entrados en el libro de la vida.xiEl día 22 de Octubre que se conoce como “El Gran Chasco”, aunque fue una experiencia difícil para los pioneros adventistas, en realidad fue el inicio de la comprensión de una gran noti-cia y esperanza: El inicio del Juicio investigador. El juicio de un Dios justo y bueno a favor de todos aquellos que han aceptado a Jesús como su Salvador. El llamado es: “Temed a Dios y dad-le gloria, porque la hora de su juicio ha llegado; y adorad a aquel que hizo el cielo y la tierra, el mar y las fuentes de las aguas” (Ap. 14: 7). El mensaje que como iglesia predicamos, tiene como centro el mensaje de los tres ángeles. Una predicación que proclama un mensaje de esperanza y amor. Mensaje que es un llamado a adorar a Dios y vivir de tal manera que podamos dar gloria a Dios con nuestro estilo de vida siempre. Mensaje que exalta una entrega diaria al Dios Triuno, creador del cielo, la tierra y todo cuanto existe.Los adventistas aprendieron la amarga pero correcta posición no establecer fechas para la ve-nida de Cristo, sino estar preparados siempre para su retorno. Entendieron también, que la pro-fecía tenía que ver con el cielo y no con la tierra. Comprendieron el valor del estudio profundo y sincero de las Escrituras y la sensibilidad a escuchar y obedecer las indicaciones de Dios. ¡Que podamos nosotros también aprender lo mismo!

CENTRO WHITE – MONTEMORELOS________________________________________i Asociación Ministerial de la Asociación General de la Iglesia Adventista del Séptimo Día, Creencias de los Adventis-tas del Séptimo Día. Publicaciones Interamericanas: Nampa, Idaho, 2006. Pág. 361.ii Arthur L. White, Elena de White Mujer de Visión. Casa Publicadora Sudamericana, Buenos Aires, Argentina, 2003. Pág. 23iii DF 588, Manuscrito de Hiram Edson. Review And Herald, 23 de Junio de 1921.iv Elena de White, Primeros Escritos. Publicaciones Interamericanas: Mountain View, California, 1979. Pág. X.v Ibid. XI, XII.vi Asociación Publicadora Interamericana y GEMA Editores, Teología, Fundamentos Bíblicos de Nuestra Fe. Tomo 1, Serie: Fundamentos de la Iglesia. Asociación Publicadora Interamericana: Colombia, 2005. Pág. 46.vii Creencias de los Adventistas del Séptimo Día, 362.viii Primeros Escritos, XVIII

¿El fin del mundo en 2012?febrero 25th, 2011 viogrecea

Prioridades

Una profecía maya de hace más de doce siglos augura un inminente colapso de la humanidad en 2012. Algunos dicen que tiene base científica….La película “2012”, dirigida por Roland Emmerich, y basada en una profecía maya que vaticina un cambio para la Tierra y el colapso de la actual humanidad para el 21 de diciembre de 2012, ha producido un importante interés del público sobre el tema. Esto se evidencia en la explosión de nuevos libros, artículos y videos. Se han publicado libros como El misterio de 2012, de José Argüelles; El regreso maya 2012, de Luciano Colman; 2012, de Brian D´Amato; La serpiente de luz: después de 2012, de Drunvalo Melchizedek; y El proyecto Gaia 2012, de Yong Jang Hwee Yong. Quizás el más importante sea el libro de Brian D´Amato, que salió con bombos y platillos en los Estados Unidos, convirtiéndose en uno de los libros más vendidos, según The New York Times.Los artículos centrales del número de enero de 2010 de la revista Muy interesante, se titula: “Profecías del fin del mundo. Según los mayas, la Biblia y Nostradamus”. En YouTube puede verse una enorme cantidad de videos sobre el fin del mundo en relación al 2012. Pero seguramente lo que más ha impactado son las escenas imponentes de la película “2012”, que ha alcanzando a millones de personas por su accesibilidad en Internet. Yo bajé la película a mi computadora. Es impresionante contemplar cómo se hunde la ciudad de Los Ángeles en una gigantesca grieta abierta en la falla de San Andrés, y Washington DC, con su Casa Blanca, sucumbir bajo un terremoto y un gigantesco tsunami, igual que el resto de los continentes.

David Shiga, periodista del New Scientist, ha declarado: “Ver ‘2012’ te hace desear el fin del mundo solo para que la película termine”.Un informe realizado para la NASA y la ESA por un grupo de científicos de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos corrobora las apocalípticas predicciones para 2012. El informe dice que para esa fecha se espera una tormenta solar que acabará con todos los sistemas vivos en la Tierra. La predicción la dio el equipo Mausumi Dikpati del Centro Nacional de Investigación Atmosférica (NCAR) de los Estados Unidos. “El siguiente ciclo de manchas solares será entre un 30 y 50 por ciento mayor que los anteriores” (http://science.nasa.gov/headlines/y2006/10mar_stormwarning.htm).El interés por el año 2012 es mundial. En México, Random House publicó El testamento maya; y fue un éxito editorial. En Bélgica, Patrick Geryl ha escrito libros convertidos en best sellers, como El cataclismo mundial en 2012 y Cómo sobrevivir al 2012, de la Editorial Kier. Geryl asegura que: “La NASA dice que una gran tormenta solar puede destruir la gran matriz mundial cerca del 2012”. Y agrega: “En los Estados Unidos está creciendo una corriente científica a partir de un informe del National Research Council, fundado por la NASA y reconocido por la National Academy of Sciences, que advierte sobre una potencial devastación en 2012, que afectará la matriz global del planeta”. Por las dudas, Geryl ya armó un grupo de supervivencia que esperará el fin del mundo en Sierra Nevada, Granada (diario La Nación, de Buenos Aires, Argentina, del 2 de enero de 2010).¿Qué dice la Biblia?Los cristianos nos guiamos por la Palabra de Dios, no por las ficciones cinematográficas ni por predicciones humanas ni por los informes científicos que también son falibles. La única fuente veraz y autorizada es la que emana de las Sagradas Escrituras. En los registros sagrados se habla del fin del mundo, pero no como lo imagina Emmerich en la película “2012”, con terremotos y volcanes que explotan por todos lados, produciendo un nuevo diluvio universal, del cual muy pocos logran salvarse en gigantescas y modernas arcas, pagando boletos de mil millones de euros. Después del diluvio ocurrido en la época de Noé, Dios prometió: “No exterminaré ya más toda carne con aguas de diluvio, ni habrá más diluvio para destruir la tierra” (Génesis 9:11). Según el apóstol Pedro, el fin del mundo que se avecina será por fuego, no por agua. Previamente habrán múltiples catástrofes, como guerras (S. Mateo 24:6, 7), terremotos (S. Mateo 24:7), epidemias (S. Lucas 21:11), aumento de la delincuencia (S. Mateo 24:12), destrucción del medio ambiente (Apocalipsis 11:18), caos en la naturaleza (S. Mateo 24:29), entre otros eventos trascendentes (ver S. Lucas 21 y Apocalipsis 16).Tampoco el fin ocurrirá el 21 o el 31 de diciembre del 2012, ya que el “día y la hora nadie sabe, ni aún los ángeles de los cielos” (S. Mateo 24:36), según advirtió nuestro Señor Jesucristo. Por otra parte, el fin del orden actual acontecerá en forma imprevista, por eso el consejo bíblico es “velad, pues, porque no sabéis el día ni la hora en que el Hijo del Hombre ha de venir” (S. Mateo 25:13). La descripción que realiza las Sagradas Escrituras acerca del fin es muy diferente de lo que muestran la película “2012”, los videos, las siete profecías mayas y las especulaciones de los científicos. Será por la llegada personal y directa de Dios a la tierra en la persona de Jesucristo, que regresará por segunda vez. Las profecías bíblicas anuncian que vendrá el Señor con toda su gloria para juzgar a las naciones (ver S. Mateo 25:31-46). Entonces se producirán eventos portentosos, que la más fecunda imaginación de los productores de Hollywood nunca imaginó, como es la resurrección de los justos de toda la historia (ver S. Mateo 22:31, 32; 1 Corintios 15:35-54).Pero la diferencia más importante de lo que dice la Biblia con las profecías cinematográficas, mayas, de Nostradamus y las predicciones científicas es que anuncia un fin con esperanza para

todos. La voluminosa producción de vaticinios que pululan por todas partes augura una gigantesca destrucción y la exterminación de la humanidad, o en el mejor de los casos la salvación de unos pocos para mantener la especie.La enseñanza bíblica por el contrario abre gloriosos espacios de esperanza, que nos alcanzan a todos. En la película “2012”, se muestra un multimillonario que pagó tres mil millones de euros para obtener tres lugares, para él y sus dos hijos, que incluso no le sirvió ya que lo dejaron afuera. Dios no actúa así. Ofrece la salvación a todos los que quieran aceptarla y crean de corazón. “Venid a mi todos”, dice el Señor (S. Mateo 11:28). Ya que “ninguna condenación hay para los que están en Cristo Jesús” (Romanos 8:1). Somos salvos por la fe (Efesios 2:8), no solo para librarnos de la destrucción futura sino para vivir eternamente. “Yo les doy vida eterna, y no perecerán jamás” (S. Juan 10:28), garantiza Cristo. Es la misericordia de Dios lo que nos salva (ver Tito 3:5), no nuestro dinero o cualquier esfuerzo que hagamos. Este hecho tan increíble y glorioso tampoco aparece en las profecías humanas. Por lo tanto, el arca de la salvación está dispuesta a nuestro alcance. ¿La aprovecharemos o la despreciaremos? La decisión es suya.“El día del Señor vendrá como ladrón en la noche; en el cual los cielos pasarán con grande estruendo, y los elementos ardiendo serán desechos, y la tierra y las obras que en ella hay serán quemadas” (2 Pedro 3:10).por Mario Pereyra

El autor es doctor en Psicología y director de la Escuela de Psicología de la Universidad de Montemorelos, México.

Necesitamos Solo un Buen Hombre

febrero 25th, 2011

Siempre tuve cierta admiración secreta por quienes saben ganarse la vida con la habilidad de sus manos. Mi madre solía decirles a sus amigas que mi hermano era más inteligente que yo porque “concretaba con sus manos las órdenes de su mente”.  Claro que no es alentador escuchar por boca de la propia progenitora que un hermano es superior. Pero como siempre fui de la idea de que lo peor es padre de lo mejor, me empeñé en ser perseverante y trabajador para suplir mis propias deficiencias. No digo que logro compensarlas fácilmente; la verdad es que no sé clavar un clavo. Literalmente. Aunque me convencí que tengo otros talentos, no dejo de admirar a quienes saben defenderse con sus manos. Me parecen hombres más completos.En estos días conocí a un joven hispano que sí sabe clavar clavos. Sabe hacer mucho con sus manos. Lo estuve ayudando (en realidad mirando más que ayudando) en algunas tareas de construcción que estamos haciendo en la sala de mi casa. Juan Cabrera es un muchacho que no llega a las tres décadas de vida pero ya muestra en sus manos y en su rostro las huellas de una vida muy dura. Llegó de México hace doce años. Era casi un niño. Solo. Y solo vivió hasta que conoció a María, su amada esposa. Su infancia huérfana de afecto le pasó factura, y cuando quiso ser padre de sus hijos no pudo. Lo mató la responsabilidad. Lo hirió casi de muerte su impotencia de no poder ser lo que quería ser. Y así, sintiendo la deuda de la vida sobre sus hombros se dio a la droga. Fue deportado tres veces. La última vez que compareció ante un

tribunal, el juez lo miró a los ojos y le dijo: “No quiero verte más aquí. Hoy voy a limpiar tu registro, de lo contrario jamás dejarás de entrar y salir de la cárcel; pero te portarás bien”. Se lo repitió ocho veces (Juan las contó): “Te portarás bien”.Desde ese momento Juan hizo el esfuerzo de portarse bien, de no drogarse más. Pero no pudo. Y en medio de su impotencia, exclamó interiormente, sin saberlo, lo mismo que Pablo le había dicho al Señor dos mil años antes: “Porque no hago el bien que quiero, sino el mal que no quiero, eso hago… ¡Miserable de mí! ¿Quién me librará de este cuerpo de muerte?” (Romanos 7:19, 24).Gracias a Dios, Juan se encontró con dos hombres buenos en la vida. El juez que le limpió su historial y el pastor Pedro Rascón, que lo condujo a Cristo. Ahora sí, sabiendo de qué se trataba, Juan pudo exclamar con Pablo: “Gracias doy a Dios, por Jesucristo Señor nuestro” (Romanos 7: 25). Jesucristo lo libró de la ley de la muerte, de la droga, y le dio una vida nueva.Hoy Juan es un excelente constructor que despierta en mí una gran admiración por la forma en que resuelve los problemas que le plantea la construcción. Es talentoso y creativo, hábil y trabajador. Jamás pierde la paciencia ante las dificultades de su trabajo (muy complicado por cierto), porque resolvió problemas más graves. Hace todo con esperanza.“Toda esa energía que tu alma no podía contener y que la entregabas a la droga, hoy la vuelcas en creación y libertad. Antes, la droga transformaba tu energía en amargura y esclavitud. Hoy Jesucristo transforma tu energía en una flor y un plato de comida para tu esposa y tus hijos. ¡Qué cambio maravilloso!”, le dije a Juan luego de escuchar su testimonio.“Así es”, me respondió. Y tras un silencio profundo, sus ojos se llenaron de lágrimas.“Encontrar un hombre bueno en el camino de la vida ayuda a enderezar nuestros pasos”, me dijo mi esposa después de escuchar a Juan. Hacía referencia al juez y al pastor que habían ayudado a Juan.Querido lector, ¿seremos nosotros hoy esa persona buena en la vida de nuestro prójimo?

Equilibrio en el hogarabril 3rd, 2011 viogrecea

Vamos a referirnos a usted, señor o señora super trabajadores. A ustedes que disfrutan de buena salud y que deseosos de mantener un status social acorde con su entorno pasan buena parte de su tiempo trabajando para tener una buena casa, un buen carro, los mejores muebles, vajillas, ropas de marca, televisores, computadoras,  etc. Desde luego que estarán orgullosos de todo lo que han logrado. Pero ¿a qué precio han conseguido todo eso?? Veámoslo con total franqueza.        Mantener un ritmo de vida con todo lo anteriormente mencionado absorbe largas horas de cada día. Tanto que a veces no les quedan ganas ni tiempo para hacer otras cosas. Sus hijos, les piden hacer alguna actividad juntos y responden que están cansados. Los domingos la familia quiere salir de paseo, pero ustedes prefieren quedarse en  casa, porque tienen tanto por hacer. Sus hijos se acercan a ustedes para pedirles algo o simplemente conversar, pero ustedes alegan que no tienen tiempo. Y así poco a poco, ustedes que tanto hacen a favor de su hogar, sin advertirlo, están minando la unidad de su querida familia. Con frecuencia ustedes están nerviosos y descontentos, porque tanto se esfuerzan en trabajar para que no valoren sus esfuerzos.        ¿Saben amigos?, no todo en la vida consiste en trabajar o tener; haciendo esto perdemos lo más importante que es tener una buena relación con el cónyuge y los hijos, cultivar el amor, la

amistad, la confianza y valores tiene más méritos que los logros materiales que al final del camino no queda nada porque todas las cosas se acaban y pasará, pero el amor jamás dejará de ser y existir.        Sí, amigos trabajen pero con equilibrio, contribuyan a la felicidad de la familia. Tomen tiempo para gozar de la compañía mutua y de los hijos. Tienen derecho a disfrutar de tranquilidad en su hogar y tener descanso, su felicidad es más importante que el trabajo.        Recuerde que su casa no es un lugar de exposición donde la gente puede ver todo lo que han logrado, sino el nido donde se mueven seres humanos necesitados de afectos y comprensión. Ustedes no son siervos o esclavos, son hijos de Dios y en la medida que ustedes reconozcan a Dios como parte de sus vidas es una bendición en su hogar y estarán logrando ser una familia feliz.

Porque Esdras había preparado su corazón para estudiar la ley de Jehová y cumplirla, y para enseñar en Israel sus estatutos y decretos

Cuando era pequeña mi mamá me contaba una anécdota sobre Elena G. White. Un día mientras Elena enseñaba a tejer a unas de sus nietas, esta no teniendo deseos de aprender, replico: “Abuela, tejer es para las ancianas como tú. Elena respondió: ¿y cuándo crees que las ancianas como yo aprendimos a tejer? Pues cuando éramos niñas como tú”.

Ese consejo fue seguido por mi madre al pie de la letra. Ella se esmeró en que yo aprendiera muchas cosas durante mis primeros años de vida.

Ahora le doy gracias por haberme hecho tan enorme favor.

El versículo de hoy nos presenta una escalera cuyos peldaños conducen a una vocación privilegiada: la enseñanza. Subamos uno a uno los peldaños que subió Esdras:

1. Concentró su mente en lo que Dios quería enseñarle. Se dedicó a inquirir la palabra de Dios, indagó, escudriñó y escuchó. Todos estos verbos indican una actitud esforzada y alejada de la pasividad. El corazón de Esdras estaba abierto a la búsqueda de la verdad y al estudio profundo de la ley de Dios.

2. Cumplió lo que Dios le había enseñado. El conocimiento de este profeta no se quedó en la comprensión teológica de la verdad, sino que pasó a la práctica: la obediencia.

3. Compartió lo que había aprendido. Como resultado de los conocimientos adquiridos y respaldado por una vida consecuente con esos principios, se involucró en la misión sagrada de enseñar.

El pueblo de Israel se benefició porque Esdras subió los peldaños de la verdadera enseñanza. Como dijo el famoso filósofo y pedagogo cubano José de la Luz y Caballero Instruir puede cualquiera. Educar, solo quien sea un evangelio vivo. Este hombre que modernizó la enseñanza en Hispanoamérica, señaló la importancia de los valores religiosos.

Debemos enseñar a los que nos rodean. Enseñar es alimentar el alma hambrienta.

Ruth Herrera

Cómo enfrentar los conflictosJansen E Trotman

LA BIBLIA nos amonesta a que vivamos en paz con todos los seres humanos Rom.

12:18. Sin embargo, pocos mortales han sido capaces de lograr esta hazaña. Sin embargo, el funcionamiento eficaz de los hogares, la iglesia o el lugar de trabajo depende de la capacidad de que las personas se lleven bien unas con otras. Por lo tanto, es necesario que aprendamos todo lo posible sobre el manejo de conflictos.

"Un conflicto es una situación en la cual dos o más seres humanos desean objetivos que ellos perciben como alcanzables por parte de uno u otro, pero no por parte de ambos". Los conflictos pueden variar de intensidad, desde los más moderados hasta los terriblemente violentos. Cuando un marido quiere utilizar un dinero para comprar un nuevo aparato de televisión, pero su esposa quiere utilizarlo para adquirir una nueva lavadora, el matrimonio tiene un conflicto. Cuando la mitad de los miembros de la iglesia quieren alfombrar el piso del templo y la otra mitad prefiere el piso de losas, estamos ante la presencia de un conflicto.

¿Cómo manejar el conflicto? La forma de manejar el conflicto va a afectar de manera significativa el resultado que obtengamos. El objetivo es lograr la armonía y la paz, no la victoria personal. En la solución de conflictos, Dios debería ser glorificado. He aquí unos principios importantes que pueden ayudar:

Haga uso de los recursos espirituales Reformule el problema Comprométase a ser un pacificador

El conflicto es inevitable. Puede usarlo como una ayuda para el crecimiento o ser derrotado por él, lo que podría atrofiar su progreso espiritual. La decisión es suya, aunque no tenemos por qué buscar conflictos, podemos considerarlos como una oportunidad de crecimiento.

"Vestíos, pues, como escogidos de Dios, santos y amados, de entrañable misericordia, de bondad, de humildad, de mansedumbre, de paciencia. Soportaos unos a otros y perdonaos unos a otros, si alguno tiene queja contra otro. De la manera que Cristo os perdonó, así también hacedlo vosotros. Sobre todo, vestíos de amor, que es el vínculo perfecto

Artículos para leer y discutir

TODAS LAS RELIGIONES TIENEN RASGOS FUNDAMENTALISTAS

Todas las religiones, en mayor o menor medida, pueden comportar rasgos fundamentalistas. En Occidente, por ejemplo, el cristianismo ha conocido momentos de fanatismo e intolerancia increíbles; la Santa Inquisición abrasó en la hoguera a quinientas mil personas en nombre de la lucha contra el demonio, y si bien eso no sucede en la actualidad, la ortodoxia llevada a extremos delirantes persiste. Sólo para muestra: durante la guerra en Bosnia el Papa mandó una carta abierta a las mujeres que habían quedado embarazadas después de ser violadas, en la que les pedía que no se practicaran un aborto y que cambiaran la violación en un acto de amor haciendo a ese niño carne de su carne. Una primera hipótesis que esto nos plantea es que el "salvajismo" fundamentalista, en todo caso, no es patrimonio islamista como la verdad mediática nos lo presenta cotidianamente.

POR UNA SOCIEDAD LAICA, LA RELIGION FUERA DE LA ESCUELA

En septiembre ya tendremos asignatura de religión, con nota, dentro del sistema educativo obligatorio y con todos los parabienes del Estado, pero sin control alguno de los contenidos, que dependerán directamente de la Iglesia católica. Una vergüenza, por supuesto. La Confederación Española de Padres y Madres de Alumnos (CEAPA) está promoviendo una recogida de firmas en contra de esta decisión ya avalada por el Parlamento dentro de la Ley Orgánica de Calidad de la Educación. En la declaración "Por una sociedad laica, la religión fuera de la escuela" se dice: "Las entidades que firmamos esta declaración creemos que la nueva Ley Orgánica de Calidad de la Educación (LOCE) supone un retroceso para nuestro Sistema Educativo. El incremento de los conciertos con la enseñanza privada y una mayor segregación escolar profundizarán la desigualdad social y el deterioro de la escuela pública. La LOCE atenta, entre otros, contra principios tales como la igualdad de oportunidades, la participación y el control social de la educación. Actúa en contra del libre pensamiento y de la libertad de conciencia. Además de que pone en grave peligro los avances hacia la coeducación." Se exige la derogación de los Acuerdos con el Vaticano y que la religión salga fuera del currículo escolar, ya que las creencias religiosas y no religiosas forman parte del ámbito de lo privado. También se pide que con dinero público no se pague el adoctrinamiento religioso. Asimismo se aboga por una enseñanza científica y humanística, que propicie una educación para la interculturalidad, que defienda la libertad de

pensamiento y de conciencia y que eduque en valores democráticos y en la tolerancia.

LOS INTEGRISTAS ISLAMICOS PROHIBEN GRAN HERMANO

Nuevo caso de censura en televisión. Las presiones de grupos radicales islamistas han conseguido que se dejara de emitir la versión árabe de "Big Brother" (Gran Hermano) al cabo de una semana de su estreno. El gobierno de Bahrein ha obligado a la cadena MBC a suspender las emisiones del popular reality show porque "no respetaba los usos y costumbres culturales y religiosos" de Oriente Medio. Esperemos que esta censura televisiva, propia de dictaduras trasnochadas, no se produzca nunca en países democráticos y los tele espectadores puedan seguir gozando de la libertad de elegir el programa de televisión que más les plazca, sin controles políticos y religiosos. En el caso del Big Brother árabe, los fundamentalistas islámicos han protagonizado múltiples protestas y manifestaciones contra la emisión de Gran Hermano porque "no querían que la televisión emitiera este tipo de programas donde viven hombres y mujeres juntos antes del matrimonio y esto no es aceptable para el Islam". Finalmente ha llegado la prohibición, los concursantes han regresado a sus casas y los espectadores se han visto privados de su libertad. La auténtica realidad és que a los reaccionarios no les gusta la tele realidad, porque no es manipulable. Por cierto, los periodistas e intelectuales occidentales ¿denunciarán como es debido este nuevo atentado

a la libertad de expresión?, ¿mirarán hacia otro lado?, ¿dirán que es un ejemplo a seguir, quedando así en evidencia?

LA APOSTASIA, UNA ALTERNATIVA A LA SECTA CATOLICA

Que la Iglesia Católica (mentiras, poder y dinero) se ha codeado con el poder, es algo que ya nadie puede poner en duda, y que ahora lo añora es cosa que se deduce a raíz de las histéricas campañas que desde esta institución se vienen realizando cuando se toca alguno de sus principios fundamentales. La falta de respeto, el desprestigiar y satanizar al adversario, son reacciones corrientes entre los militantes del clero, defensores de una moral en la que ven la espina en el ojo ajeno pero no la viga en el propio. Sino, ¿cómo es posible que se intenten justificar las campañas de la que hablábamos (eutanasia, aborto, anticoncepción...) como un gravísimo atentado contra la vida, cuando es de todos es sabido que el clero ha colaborado con regímenes políticos que

han utilizado el genocidio como moneda de cambio habitual, sin que todavía se dignen a admitir y arrepentirse de tales atrocidades? (Modelo de instancia para apostatar)

¿POR QUE LOS ATEOS SON ATEOS Y NO CREEN EN DIOS?

En todos los tiempos han existido personas que dudaban de la existencia de dioses o de un "orden sobrenatural". La posición dominante de las posiciones religiosas han evitado que el ateísmo pueda avanzar. Durante los últimos siglos, la cantidad de información científica ha hecho del ateísmo una alternativa fuerte a todos los modelos de explicación religiosos. Por lo que las posiciones ateas se han convertido en más usuales. El ateísmo niega la existencia de dioses y otros entes sobrenaturales y la influencia de éstos en el orden universal. Algunas religiones que niegan la existencia de dioses como el budismo y el jaonismo no son ateas ya que contienen una gran cantidad de elementos sobrenaturales como ser la creencia en la reencarnación.

DIOS Y LA TELEBASURA (LA TEORIA DE JUAN CARLOS ORTEGA)

Juan Carlos Ortega, colaborador de Javier Sardá en "Crónicas Marcianas" (Telecinco)

y de Gemma Nierga en "La Ventana" (Cadena SER) acaba de publicar un libro tan

genial como el contenido de sus secciones en los programas mencionados. Se trata

de "Buenos días, Sócrates" (Reflexiones de un filósofo sin estudios). Con grandes

dosis de inteligencia y de ironía, Juan Carlos Ortega trata de 30 temas, del que aquí

reproducimos uno que se titula, nada más ni nada menos, "Dios y la telebasura". En

él, Ortega desmonta el tópico anti telebasura ("La gente ve telebasura no porque le

guste, sino porque se la ponen. Si pusieran otra cosa mejor, les gustaría más."),

comparándolo con el mundo creado por Dios ("A los poetas no les gusta la naturaleza.

Se fijan en ella y la describen siempre porque es lo que hay. Si Dios pusiera otra cosa

mejor; les gustaría más."). Su conclusión es radical: "Si hubiera muchos universos

compitiendo entre sí, cada uno ofreciéndonos espectáculos y leyes naturales

diferentes, es bastante probable que el Cosmos en el que estamos tuviera un bajísimo

índice de audiencia. Nos gusta la naturaleza porque no podemos hacer zapping. Si

hubiera varios Universos, Dios duraría tres días como programador."

Los obispos no quieren enterarse

La intromisión inaceptable de la Iglesia católica en los asuntos del Estado empieza a ser escandalosa. Alguien tendría que decirle a los obispos que se han producido dos grandes cambios: la Constitución de 1978 proclama que España es un pais aconfesional, rompiendo la tradición franquista que tanto añoran; y, por otro lado, tenemos un nuevo gobierno democrático fruto de las elecciones del 14-M. No

sería lógico que José Luís Rodríguez Zapatero quisiera nombrar obispos ni cambiar las normas religiosas. Pero tampoco es lógico que estos señores vestidos de señora, riñan al Presidente del Gobierno por legalizar las bodas entre homosexuales. A Dios lo que es de Dios y al Cesar lo que es del Cesar.

Fermín Bocos ha escrito un excelente artículo sobre este tema, en el que dice: No es nuevo que un obispo aproveche el púlpito para hacer política. En realidad, la Iglesia católica no ha hecho otra cosa desde los tiempos del Edicto de Milán. Lo que sí puede sonar a nuevo -por extemporáneo- es la oportunidad del arzobispo de Santiago de Compostela para trufar su prédica al apóstol con una crítica directa a la disposición del Gobierno para regular el matrimonio entre parejas del mismo sexo. Nadie discute el derecho de la Iglesia a pronunciarse acerca de lo divino y lo humano puesto que los creyentes aceptan de buen grado su magisterio, pero la Conferencia Episcopal no puede extender esa tutela a los ciudadanos que no son católicos. El Reino de España es un Estado laico y el laicismo es el punto de encuentro que garantiza y permite el encuentro y la convivencia entre los creyentes y los no creyentes.

La jerarquía católica que tanto se acomodó en el pasado a ordenamientos políticos refractarios a las libertades públicas, no debería olvidar que en los sistemas democráticos es al Parlamento a quien corresponde dictar las leyes. Cualquier ensayo para establecer una estructura de pensamiento ajena a la expresión libre y democrática de las ideas está fuera de lugar. La Iglesia tiene derecho a decir lo que estime oportuno, pero a creyentes y no creyentes les puede llamar la atención que los mismos prelados que no encontraron ocasión para recordarle al anterior presidente, Aznar, que el Papa había dicho que participar en la guerra de Irak era un acto inmoral e ilegal, hayan aprovechado la presencia del Rey para leerle la cartilla a Rodríguez Zapatero.28 julio 2004, Política | PSOE - Zapatero | Religión | Opiniones (338) | Inicio

La Operación Triunfo de los árabes

Operación Triunfo ha revolucionado el mundo árabe al ser víctima de fuertes críticas y protestas de los fundamentalistas islámicos, pero conseguir un seguimiento masivo. La

versión árabe de OT ha tenido 350 millones de espectadores (93% de share), a pesar de las protestas y consignas de boicot de los fundamentalistas. Operación Triunfo se convierte así en el programa más visto en la historia de la televisión árabe. Los telediarios de los países de la zona y la CNN destacaronla noticia del récord histórico de audiencia del programa. OT ha provocado la ira de varios jeques, que incluso publicaron decretos que prohibían ver el programa por ser "una invitación al pecado y una fuente de desgracias para el Islam". Un editorial de "L'Orient-Le Jour", en cambio, estimó que prohibir a los musulmanes que vieran Operación Triunfo era "como querer privar a los árabes de un preciado oxígeno: la diversión". Otro artículo destacaba que el

programa ha demostrado que "existen otros valores que no se han enseñado ni en las casas, ni en las escuelas, ni en las mezquitas e iglesias... 16 jóvenes árabes dieron una magistral lección de solidaridad e inteligencia al conjunto de sus dirigentes".

Esta noticia nos hace recordar que los fundamentalistas no sólo se encuentran entre los islamistas, hay fundamentalistas en todas las religiones, todos los países y todas las ideologías políticas. Lo que tienen en común es su voluntad de prohibir o censurar todo aquello que no coincida con sus creencias, gustos y tradiciones. De forma manifiesta o veladamente, a todos los "fundamentalistas", de oriente o de occidente, del mundo islámico o del mundo cristiano, les place limitar la libertad de expresión, sobretodo en el caso de la televisión. Cuando leemos sus argumentos contra los programas de tele realidad, hay una total coincidencia entre lo que piensan los imanes más radicales del Islam o los obispos católicos españoles. Los políticos conservadores, tanto árabes como europeos, dicen lo mismo sobre este tema. Y los periodistas fundamentalistas islámicos coinciden hasta en los signos de puntuación con lo que han escrito algunos periodistas europeos supuestamente demócratas. Ante esa disyuntiva, la redacción de Info-TK lo tiene claro: SI a la libertad en todos los medios, NO al fundamentalismo de todos los signos.

LA OPERACION TRIUNFO ARABE, RECORD DE ESPECTADORES Y DE POLEMICAS

Casi 350 millones de espectadores (93% de share) siguieron la final de la versión árabe de Operación Triunfo, emitida simultáneamente en Argelia, Egipto, Jordania, Kuwait, Libia, Marruecos, Arabia Saudita, Sudán, Siria, Túnez, Turquía, Iran, Irak y Palestina, entre otros países. Operación Triunfo se convierte así en el programa más visto en la historia de la televisión árabe. Los telediarios de los países de la zona y la CNN han destacado la

noticia de este récord histórico de audiencia que ha conseguido el programa. Operación Triunfo ha sido víctima de fuertes críticas y protestas de los fundamentalistas islámicos, pero a pesar de ello, su seguimiento ha sido masivo. La emisión de este OT árabe ha provocado la ira de varios jeques, que incluso publicaron decretos que prohibían ver el programa por ser "una invitación al pecado y una fuente de desgracias para el Islam". Un editorial de "L'Orient-Le Jour" estimó que prohibir a los musulmanes que vieran Operación Triunfo era "como querer privar a los árabes de un preciado oxígeno: la diversión".

Durante los cuatro meses que ha durado el programa han existido muchas polémicas, sobretodo cuando los fundamentalistas constataban el éxito que estaba obteniendo en gente de todos los países, todas las edades y todas las religiones. El Operación Triunfo árabe ha servido para mostrar otra cara de la juventud de Oriente Medio y para comprobar que la inmensa mayoría de la población árabe no ha seguido las propuestas de boicot planteadas por los líderes y medios más conservadores. 350 millones de espectadores y un share del 93% han sido la contundente respuesta que los ciudadanos han dado a quienes pretendían prohibir el programa. En un editorial de un periódico libanés se decía: "Este programa da miedo porque muestra una virtud, el mestizaje con todo lo que comporta como solidaridad, respeto, aceptación del otro, igualdad, sobre todo entre los sexos; gérmenes indiscutible de la democracia". Según este diario, "los espectadores árabes (un 80% de 15 a 25 años) aprendieron que 16 personas procedentes de horizontes radicalmente opuestos, con solo una cosa en común, el idioma árabe, pueden construir una forma de armonía e unidad". También que "existen otros valores que no se les han enseñado ni en las casas, ni en las escuelas, ni en las mezquitas e iglesias... y que pueden cohabitar chicos y chicas, en tierra árabe, sin que hayan abusos o acoso de ninguna clase". "Dieciséis jóvenes de ocho países diferentes dieron una magistral lección de solidaridad e inteligencia al conjunto de sus dirigentes", concluyó el diario.

Las calles estaban desérticas en la noche de la final. Todos los países árabes estaban pendientes de quién se hacía con el triunfo. El egipcio Mohamad Attie, de 21 años, fue el vencedor de la versión árabe de OT, obteniendo el 55% de los votos, frente a su rival y amigo, el kuwaití Bechar el Chatti, en una final con un suspense enorme, en el que participaron además los ocho finalistas árabes de este concurso, basado en Operación Triunfo, el formato español más vendido en el mundo. El programa creado por Gestmusic Endemol se emite en 20 países y pronto se estrenará en Sudáfrica y Australia. El programa se había convertido en el principal tema de conversación en todos los países árabes en los que se emitía el programa, a través de la cadena LBC y del canal temático que ofrecía las 24 horas en directo desde la Academia, también con una audiencia millonaria.

Según la prensa de Oriente Medio, el recibimiento que han tenido los concursantes de "Star Academy" (título de la versión árabe de "Operacion Triunfo", puede compararse con el que tiene el Papa en sus viajes. En Libano, las Fuerzas de Seguridad desplegaron más de 50 soldados, ambulancias y vehículos de bomberos en los alrededores del plató. Cuando los alumnos de la Academia salieron, fueron aclamados por multitudes, en un ambiente propio de los tiempos de la "beatlemanía". Pero en realidad era la "triunfomanía", que se ha estrenado en los países árabes con gran fuerza y masiva participación. Las llamadas y mensajes de móvil para votar a los favoritas se contaban por millones cada semana. El álbum de la versión árabe de Operación Triunfo, consiguió ser Disco de Oro el primer día de ponerse a la venta, según Pascalle Gaillot, directivo de EMI en Líbano. "Es la primera vez en historia libanesa, y en la historia de Oriente Medio, que un CD es Disco de Oro en su primer día", dijo. Hay que tener en cuenta que el porcentaje de piratería deesta zona es del 70%. Y dentro de

unos días se inicia una gira en directo con los alumnos de la Academia que recorrerá 25 países del área.

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La religión fuera de la escuelaEn septiembre ya tendremos asignatura de religión, con nota, dentro del sistema educativo obligatorio y con todos los parabienes del Estado, pero sin control alguno de los contenidos, que dependerán directamente de la Iglesia católica. La Confederación Española de Padres y Madres de Alumnos (CEAPA) está promoviendo una recogida de firmas en contra de esta decisión. En la declaración "Por una sociedad laica, la religión fuera de la escuela" se dice que la nueva Ley Orgánica de Calidad de la Educación (LOCE) supone un retroceso para nuestro sistema educativo.

Se exige la derogación de los Acuerdos con el Vaticano y que la religión salga fuera del currículo escolar, ya que las creencias religiosas y no religiosas forman parte del ámbito de lo privado. También se pide que con dinero público no se pague el adoctrinamiento religioso. Asimismo se aboga por una enseñanza científica y humanística, que propicie una educación para la interculturalidad, que defienda la libertad de pensamiento y de conciencia y que eduque en valores democráticos y en la tolerancia. Sigue leyendo si quieres ver el manifiesto completo o adherirte a él.

POR UNA SOCIEDAD LAICA, LA RELIGION FUERA DE LA ESCUELA (CEAPA)

Las entidades que firmamos esta declaración creemos que la nueva Ley Orgánica de Calidad de la Educación (LOCE) supone un retroceso para nuestro Sistema Educativo. El incremento de los conciertos con la enseñanza privada y una mayor segregación escolar profundizarán la desigualdad social y el deterioro de la escuela pública. La LOCE atenta, entre otros, contra principios tales como la igualdad de oportunidades, la participación y el control social de la educación. Actúa en contra del libre pensamiento y de la libertad de conciencia. Además de que pone en grave peligro los avances hacia la coeducación. En efecto, una de las medidas que contempla la LOCE, plegándose a los ansiados anhelos de la Conferencia Episcopal, es extender la doctrina y enseñanzas religiosas a todo el alumnado a través de las dos opciones (tanto la confesional, como la no confesional).

Queremos que la religión salga de la escuela pública: Las creencias religiosas forman parte del ámbito de lo privado y, por lo tanto, la enseñanza de las religiones deben de quedar al margen de la enseñanza obligatoria y fuera del currículo escolar. La escuela, hoy más que nunca, debe ser un espacio público, donde el adoctrinamiento religioso o ideológico quede fuera de sus puertas. Por ello, abogamos por un modelo de Escuela Laica, que eduque sin dogmas, en valores humanistas y universales, en la pluralidad y en el respeto a los derechos humanos, en la asunción de la diferencia y de la diversidad y en los valores éticos, no sexistas y democráticos. Queremos una escuela en donde se sientan cómodos, tanto no creyentes, como creyentes de las diversas religiones o creencias.

Diversas organizaciones hemos interpuesto recursos ante los tribunales, con el fin último de conseguir la declaración de inconstitucionalidad y la suspensión de la obligación de estudiar y evaluar la religión. Asimismo,

hemos iniciado una campaña a favor de una escuela laica. La sociedad demanda una secularización más intensa de la vida pública y no regresar al Estado confesional católico, ni propiciar la aparición de otros fundamentalismos religiosos. Los poderes públicos no pueden seguir parapetándose en unos Acuerdos pactados con el Vaticano, antes de aprobarse la Constitución, con la intención de anular la libertad de conciencia de ciudadanos y ciudadanas.

Exigimos la derogación de los Acuerdos con el Vaticano. Exigimos que la religión salga fuera del currículo escolar, ya que las creencias religiosas y no religiosas forman parte del ámbito de lo privado. Exigimos que con dinero público no se pague el adoctrinamiento religioso. Sí a una enseñanza científica y humanística, que propicie una educación para la interculturalidad, que defienda la libertad de pensamiento y de conciencia y que eduque en valores democráticos y en la tolerancia.

Ateísmo: por qué los ateos son ateos?

En todos los tiempos han existido personas que dudaban de la existencia de dioses o de un "orden sobrenatural". La posición dominante de las posiciones religiosas han evitado que el ateísmo pueda avanzar. Durante los últimos siglos, la cantidad de información científica ha hecho del ateísmo una alternativa fuerte a todos los modelos de explicación religiosos. Por lo que las posiciones ateas se han convertido en mas usuales.

El ateísmo niega la existencia de dioses y otros entes sobrenaturales y la influencia de éstos en el orden universal. Algunas religiones que niegan la existencia de dioses como el budismo y el jaonismo no son ateas ya que contienen una gran cantidad de elementos sobrenaturales como ser la creencia en la reencarnación.

BASES DEL PENSAMIENTO ATEO, HISTORIA DEL ATEISMO

El ateísmo es apoyado tanto por hechos comprobados científicamente como por las incongruencias de la fe religiosa. En su crítica a las creencias, los ateos por ejemplo señalan la antropomorfía de los dioses, es decir a sus características humanas, como ser la capacidad de pensar y comunicarse. También el hecho de que el hombre es el punto central de la creación divina, demuestra ser un signo del egoísmo humano.

Un ateo no cree en fenómenos sobrenaturales y tampoco en ninguna fuerza

inexplicable que gobierne el mundo. El mundo se puede explicar con ayuda de la investigación científica y el razonamiento lógico. La escasez en la capacidad de observación y de la inteligencia colocan límites al entendimiento de la realidad, pero eso no es ninguna prueba de que lo sobrenatural exista.

No ha existido ningún periodo cultural donde todas las personas compartían su creencia en dioses o fuerzas sobrenaturales (su modelo del mundo). Las opiniones religiosas han tenido generalmente una posición fuerte en sus sociedades y sus oponentes no han tenido siempre la oportunidad de expresar sus puntos de vista en público. Por ello es raro encontrar puntos de vista ateos en la historia oficial. En la antigua Grecia vivieron muchos filósofos ateos que no aprobaban la religión que dominaba su propia sociedad. La mayoría tenía un modelo materialista según el cual todo en su origen es material. Incluso los "fenómenos espirituales" tienen base material, por lo que no es necesario ningún dios. Conocidos materialistas fueron Epicuro y Demócrito que pensaban que la realidad estaba compuesta por átomos y vacío.

La edad media fue bastante negativa a las opiniones ateas, y la crítica a la religión dominante se castigaba duramente. La situación empezó a liberalizarse recién el siglo XVIII. El materialismo y la resistencia a la iglesia fue la marca del renacimiento. Entre otros Denis Diderot observó que el mundo se podía explicar sin ninguna hipótesis divina. El alemán Karl Marx que vivió el siglo XIX fundó su opinión materialista en los filósofos de la antiguedad Demócrito y Epicuro. Después las opiniones ateas han tenido el apoyo en filósofos y científicos. Famosos ateos del siglo XX Alberto Camus, Jean-Paul Sarte y Bernard Russel.

También dentro del ateísmo hay diferencias de opinión. Entre los principales sectores tenemos al ateísmo-científico y al ateísmo-filosófico. El

primero se basa en el método científico. Muchos de los representantes del ateísmo-filosófico pueden llamarse agnósticos, ya que dicen que las personas no tienen ningún motivo para creer en dios, ya que no existe información válida que apoye ese pensamiento. La naturaleza socio-política del ateísmo, se refleja en la ideología marxista. Según esta, la religión es dañina, porque mantiene una imagen del mundo equivocada, y las estructuras sociales están construidas en esa imagen equivocada. Ateos que no pertenecen a ninguna de esas ideas representan el ateísmo-personal (ateísmo-psíquico) y se declaran neutrales a la creencia de dios, dicen que no es una necesidad para el desarrollo psíquico de las personas. Este ateísmo práctico es el que empieza a ser el más común en la cultura occidental.

ATEISMO.WS

Las mentiras de todas las religiones

El cristianismo ha sido la religión dominante en Occidente y ha tenido fuerte influencia en el Oriente. Es a partir de la conversión del Emperador Constantino que se erige en un poder tanto ideológico, para no decir espiritual, sino económico. El clero cristiano, proveniente de las comunidades perseguidas bajo el

imperio romano clásico y abanderado de las reivindicaciones de los pobres, devino en un poder económico compartido con los emperadores romanos y luego con las monarquías feudales imperantes en Europa a partir de la decadencia romana.

La legitimación del poder monárquico estuvo en las manos del pontífice máximo de la Iglesia católica. Las monarquías feudales fueron teocracias sustentadas en el poder ideológico del papado sobre las amplias masas humanas de creyentes.Sobre ese poder económico e ideológico de la Iglesia, el clero impidió todo pensamiento que no fuese el impuesto por él. Se erigió en "vigilante" del dogma y en amo y señor de todo ser humano que habitase en sus dominios.

Entonces, cuando por el desarrollo del conocimiento, basado en la práctica del trabajo y la investigación, se llega a cuestionar las supuestas verdades en boga y sostenidas por la clerecía cristiana, se persigue inplacablemente a quien lo haga. El clero, por encontrarse en posiciones privilegiadas de poder, era el que podía dedicarse a auscultar los fenómenos de la naturaleza, el universo y el humano. Pero los clérigos que se dedicaban a la investigación lo hacían sobre los textos de las leyendas judías compendiadas en la "Biblia". Esos textos no son más que leyendas basadas en el nivel de desarrollo económico y cultural del pueblo israelí y por ello no tienen valor alguno en el aspecto científico. Todo el texto bíblico referente a cuestiones fenomenológicas de la naturaleza y el cosmos son anticientíficas y absurdas desde el punto de vista del sentido común, como lo han reconocido muchos de los clérigos mismos.

Cuando se enfrentan esas leyendas, como tales, surge la represión y aparece lo que

conocemos como la Inquisición, fenómeno ideológico-político que llevó a la hoguera y a los lugares de torturas a cientos y miles de hombres y mujeres acusados de "herejía". Giordano Bruno, importante pensador, Miguel Servet profundo investigador del cuerpo humano, fueron llevados a la hoguera por cuestionar los dogmas católicos o los absurdos de la biblia cristiana, Galileo Galilei fue obligado a "abjurar" de algunos descubrimientos. Kepler fue perseguido por sus descubrimientos astronómicos y sus tesis contrarias al dogma cristiano.

Lo anterior viene a cuento porque últimamente el Vaticano ha pretendido engañar a las gentes con el cuento de arrepentirse y perdir perdón a la humanidad por las persecuciones inquisitoriales del pasado. El Vaticano intenta ocultar el hecho cierto de estar actuando en similar forma a como lo hacía en épocas pasadas.

Lo real es que la Iglesia católica sigue ejerciendo la represión al pensamiento y a las conductas humanas que no se someten a sus dogmas y criterios. En efecto, se sigue estigmatizando el sexo no "bendecido" por los clérigos, se discrimina y reprime a los heteroxesuales; últimamente el Vaticano se ha pronunciado contra la clonación humana y muchos gobiernos la han erigido en delito bajo pretextos moralistas de origen religioso.

El Vaticano y las Iglesias de todas las religiones siguen reprimiendo el pensamiento libre, se erigen en supuestos depositarios de la verdad y todo aquel que no se les somete es anatematizado como en los tiempos de la Inquisición medieval.

La causa de esta conducta de las Iglesias se encuentra en que la ciencia va descubriendo, cada día más, la verdadera esencia de los fenómenos del Universo, la Naturaleza y el ser humano como especie y como individuo. La ciencia va develando la mentira de las religiones y ello significa el desmoronamiento de las estructuras eclesiales y el fin de la prédica mentirosa de las religiones.

El supuesto arrepentimiento vaticano por los crímenes del pasado no es más que un velo para cubrir los que hoy comete contra los derechos humanos en lo que se refiere a la libre expresión y determinación del individuo. Millones de personas gimen bajo el peso de supuestas culpas y pecados que los clérigos les hacen creer que han competido. Se aprovecha el bajo nivel cultural de las gentes para medrar sobre su ignorancia y su miseria.

Quienes sentimos la verdadera realidad del ser humano debemos denunciar en forma

franca y valerosa, en todos los tiempos y lugares del planeta, las mentiras de todas las religiones y la doble moral de sus respectivos jerarcas y funcionarios de todos los niveles.

ULISES CASAS

¿Por qué no existe Dios?

Científicamente: por qué no existe Dios? Jamás se ha demostrado, ni se ha observado, ni se ha contrastado, ni se ha reducido a las matemáticas la existencia de Dios. El método científico, el más válido para nuestro conocimiento, se basa en el razonamiento para sacar hipótesis, y en la observación y la medición para comprobarlas. Un experimento científico debe poderse repetir en cualquier lugar y con cualquier persona.

En primer lugar, jamás se ha observado a Dios. No se puede hacer ciencia de algo que jamás se ha observado, es totalmente absurdo. Como el primer paso del método científico es la observación, y éste falla, no podemos seguir ni con mediciones ( es absurdo intentar medir a Dios si ni siquiera le hemos observado ni sabemos qué es realmente), ni con hipótesis, ni con comprobaciones o reducción a leyes matemáticas.

Algo que no se ha observado jamás, por principio no existe. Si, pongamos un ejemplo, estoy solo en una habitación vacía y me dicen que hay otra persona junto a mí, por principio esa persona no existe hasta que no demuestre lo contrario. Es igual que en un estado Democrático: alguien es inocente hasta que no se demuestre lo contrario. Es más, ni siquiera la Ciencia nos aporta una mínima pista que nos permita sospechar que Dios sí existe. ¿De qué está hecho Dios? ¿Dónde se encuentra? Las respuestas religiosas comunes a estas preguntas son totalmente absurdas desde un punto de vista puramente científico. ¿Qué es eso de "espíritu"? El Universo sólo está hecho de materia y energía. Si Dios no es materia ni energía, ¿qué coño es? "Dios se encuentra en todas partes" científicamente es absurdo, ya que sabemos que la materia es espacio casi totalmente vacío.

Varios han sido los intentos de encontrar científicamente a Dios o a algo relacionado con él, y todos han fracasado. Una vez se pesó un cuerpo recién muerto, y otro vivo, para determinar la masa del espíritu o alma. Las diferencias no fueron apreciables. Las preguntas que antes se contestaban religiosamente (quién ha creado el Mundo, por qué vivimos, qué son los astros, etc.) ahora tienen respuesta puramente científica que por supuesto ha anulado a la mística (o supersticiosa, o religiosa... como la queramos llamar). Sabemos incluso el origen del Universo y su fin (la teoría del Big-Bang, demostrada ya recientemente). Las únicas gran incógnitas en las cuales la religión aún se refugia son: Qué había antes del Big-Bang y qué lo provocó. Qué hay fuera de nuestro universo. En ambos casos, la respuesta religiosa es, obviamente, Dios.

Pero nos damos cuenta, únicamente con conocer un poco de Física, que ambas preguntas (y por lo tanto sus respuestas) no son válidas ni caben hacérselas bajo ningún concepto. La primera implica un concepto temporal (qué había antes del origen), y la segunda uno espacial (qué hay fuera del Universo). Nuestro universo tiene tres dimensiones espaciales y al menos una temporal, por ello los conceptos relacionados con el espacio y con el tiempo sólo tienen cabida en nuestro propio Universo. Si existen otros, sus dimensiones son totalmente inimaginables. Así pues, el tiempo y el espacio nacieron junto con el Universo, por eso no cabe preguntarse que había antes del origen (porque el tiempo no existía) o qué hay fuera del Universo (porque el espacio sólo existe aquí dentro). Así pues, vemos que efectivamente la Ciencia por fin, después de tantos milenios de existencia humana, ha anulado completamente a la Religión. Las personas que creen aún en Dios son aquellas que necesitan la seguridad moral que un ser superior proporciona, o aquellas que no poseen los suficientes conocimientos científicos (que no por ello dejan de ser básicos y al alcance de todos).

Además, la ciencia no nos deja ni siquiera un ápice de incertidumbre en el que refugiarnos. Todo se puede reducir a leyes matemáticas, todo se puede controlar. No hay nada extraño. Incluso detrás de fenómenos aparentemente caóticos se esconde siempre el orden. Sabemos que el Universo es finito en espacio y en tiempo. Conocemos todos los misterios de la vida, y no encontramos nada "raro" en nuestro interior... todo es química: el amor, los sentimientos, la razón, el movimiento, los pensamientos... todo se puede reducir a combinaciones y reacciones entre átomos. ¿Dónde está lo extraño? Sabemos de dónde venimos, y a dónde vamos. Conocemos la historia natural de nuestro planeta, y de sus especies (incluida la nuestra). Cada vez nos adentramos más en la física de lo muy pequeño (física cuántica) y seguimos sin encontrar nada que la ciencia no pueda analizar. ¿Dónde se encuentra, pues, nuestro Dios? Ha muerto bajo el puñal de la Ciencia.

CARLOS GRIMA

Ciencia y religión: ocupar iglesias

Un grupo de profesores con gran sensatez, mucha inteligencia y buena dosis de ironía han escrito un manifiesto con una

imaginativa solución para que aumente el nivel cultural del país: ocupar las iglesias y exigir el 10% del tiempo de las misas para que profesores de diversas disciplinas puedan hacer sus intervenciones de tipo didáctico.

En su manifiesto detallan el objetivo, los métodos y todos los pormenores de esta genial iniciativa. Están dispuestos incluso a negociar con el Vaticano. Pero, ¿aceptarán las autoridades eclesiásticas este revolucionario sistema? Lee este artículo y saca tus propias conclusiones...

NEGOCIAR EL 10 % DEL TIEMPO DE LAS MISAS PARA DIVULGAR LA CULTURA

"Somos un grupo de docentes de todos los niveles educativos que estamos muy preocupados por el bajo nivel cultural en nuestra sociedad, los altos índices de fracaso escolar y la proliferación de telebasura. Para salir de esta situación queremos traspasar los muros de las escuelas, los institutos y las universidades, llevando la cultura y la educación a ámbitos en los que hasta la fecha hemos estado ausentes, en los que nuestra dejadez ha privado a muchos ciudadanos del derecho a la cultura.

Como primer paso, queremos llegar a un acuerdo con las autoridades eclesiásticas para que nos cedan un diez por ciento del tiempo de las misas con el fin de que profesores especialistas en las distintas disciplinas puedan llegar más fácilmente a los creyentes mediante breves intervenciones didácticas. Estamos estudiando cuál sería el momento idóneo para insertar en las misas contenidos científicos y culturales, tal vez inmediatamente después de la consagración o justo antes del padre nuestro.

Está claro que algunos feligreses podrían, con razón, objetar que ellos no tienen por qué aumentar sus conocimientos ni su cultura, ya que acuden a misa con el sólo fin de orar y escuchar la palabra de Dios. Para solucionar este problema, y aunque pudiera parecer inconstitucional, a la entrada a la Iglesia les haríamos rellenar un formulario para que manifestaran su preferencia por la religión o la cultura.

Una vez identificadas estas personas, podrían abandonar en el momento adecuado la nave principal de la Iglesia y reunirse en las capillas laterales, la cripta o el salón parroquial. Con el fin de evitar agravios, estas personas podrían recibir durante ese rato charlas de carácter no cultural ni educativo pero muy relacionadas con los contenidos que se estén impartiendo en ese momento al resto de los fieles desde el altar. Por ejemplo, los feligreses que

no quieran repasar la tabla periódica, estudiarán los efectos perniciosos de los colorantes alimentarios, los que no quieran hacer ejercicios de educación física podrán ver un documental sobre la obesidad, y los que no quieran repasar los verbos irregulares ingleses podrían estudiar estadísticas sobre la importancia de hablar idiomas en el mundo moderno.

Los obispos nos han adelantado que no habría problema en computar el tiempo de cualquiera de estas actividades como tiempo equiparable al dedicado a escuchar la palabra de Dios, a la oración, a la contemplación, la penitencia o a la caridad y en ningún caso podrá discriminarse el acceso a la salvación eterna a los fieles en razón a sus preferencias religiosas o educativas. Tampoco han puesto la más mínima objeción a la aparente contradicción derivada de que el contenido de las misas esté basado en la fe y las creencias, en contraste con la naturaleza científica y académica de los contenidos que habitualmente impartimos en las aulas.

En un primer momento, las clases se impartirían sólo durante las misas obligatorias de los domingos y fiestas de guardar, para más adelante extenderse a otros actos religiosos de asistencia no obligatoria como bautizos, bodas, comuniones, funerales, ejercicios espirituales, ordenaciones sacerdotales e incluso ceremonias de canonización o beatificación. Pero, ¿de dónde saldría el dinero para pagar al profesorado que trabaje los domingos? Sin duda alguna de los donativos que los fieles depositan en los cepillos, del porcentaje de impuestos destinados al sostenimiento de la Iglesia Católica o, en general, de los presupuestos de la Iglesia. Para garantizar la calidad de las enseñanzas impartidas, nuestra asociación gestionaría directamente el dinero aportado por la Iglesia y con él contrataría a profesores de sólida formación pedagógica y científica que se encargarían de impartir las clases durante las misas.

Naturalmente, dado el carácter eminentemente laico de las clases, no dudaríamos en despedir fulminantemente a aquellos profesores que no mantuvieran una coherencia laica entre su vida profesional y personal haciendo cosas como casarse por la iglesia, acudir a misa semanalmente o participar en cualquier tipo de acto religioso. Finalmente, llevaremos nuestras negociaciones hasta el mismo Vaticano, con cuyas autoridades firmaríamos un Concordato que garantizara la continuidad de nuestra noble tarea docente en las iglesias durante los años venideros."

ASOCIACION POR EL PROGRESO DE LA CIENCIA EN MEDIOS HOSTILESREGRESAR A LA PORTADA DE INFO-TK, TU OTRA FUENTE DE INFORMACION15 octubre 2003, Ciencia | Religión | Opiniones (22) | Inicio

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