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Los contaminantes emergentes en los sistemas
de saneamiento y sus efectos ambientales
Damià Barceló, M. José Lopez de Alda, Mira Petrovic, Silvia Lacorte, Benjamí Piña, M.D. Hernando Department de Quimica Ambiental, IIQAB-CSIC, Barcelona
Antoni Ginebreda Agencia Catalana de l’Agua
Resumen
� Contaminantes emergentes � Clases y compuestos � Disruptores endocrinos (EDCs)
�Integración de análisis químicos y biológicos (RYA) � Ensayo con cepas de levaduras recombinantes � Inducción de la síntesis de vitelogenina en peces
Análisis
�
� Integración del análisis químico de EDCs y de la actividad estrogénica medida por RYA en la cuenca del Llobregat
� Integración del análisis químico de EDCs y de la inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas en los ríos Cardener and Anoia
Aplicación del método
� Conclusiones
Nuevos y más sensibles métodos de análisis químicos y biológicos
Nuevos Contaminantes Orgánicos (Emergentes)
Def.: contaminantes previamente desconocidos o no reconocidos como tales cuya presencia en el medio ambiente no es necesariamente nueva pero si la
preocupación por las posibles consecuencias de la misma
Línea prioritaria de investigación (OMS, EPA, UE)
Poco o no investigados Escasez/ausencia de datos ambientales
Falta de métodos analíticos
...........No regulados...........
Elevada producción y consumo fi continua introducción en el medio ambiente: no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos.
Contaminantes orgánicos emergentes
� Retardantes de llama (difenil éteres polibromados) � Detergentes de tipo alquilfenol etoxilado y derivados
2455/2001/ECParafinas cloradas � Ftalatos
� Compuestos organoestánnicos Subproductos de desinfección del agua potable
� Productos de transformación de pesticidas
Ya legislados Datos nuevos
Metil tert-butil éter y otros aditivos de la gasolina Surfactantes perfluorados (PFOA, PFOS)
� Fármacos Productos para el cuidado y la higiene personal Toxinas de algas
� Bisfenol A
No legislados Datos insuficientes
. . . . � Disruptores endocrinos
*Susan D. Richardson (2004) Anal. Chem. 76, 3337-3364.
:
Compuestos disruptores endocrinos (EDCs)
� Los EDCs son compuestos sintéticos o productos naturales que interfieren en el sistema endocrino (hormonal)
� El Sistema Endocrino produce hormonas que guían el desarrollo, crecimiento, reproducción, y comportamiento de humanos y animales
Mucha documentación de efectos Efectos sospechosos en humanos en organismos del medio natural:
• Malformaciones en recién nacidos • Disminución de la fertilidad y el • Problemas en los testículos
crecimiento • Esperma anormal y pobre • Alteraciones sexuales • Funcionamiento tiroideo anormal • Problemas en las cáscaras de los • Posible cáncer de testículos
huevos • Cáncer de próstata • Funcionamiento tiroideo anormal • Otros efectos
)
Surfactantes de tipo alquilfenol etoxilados
O OH
R n
n=1-20
OH
R
O OH
R
n
n=1-2
n OCH2COOHO
R
Análisis:Análisis: GC-MS-MS (deriv.), LC-MS-MS
Alquilfenol etoxilados (APEOs)
APEOs de cadena corta
Alquilfenoles (APs)
Alquilfenoxi carboxilados
(APECs)
Petrovic M y col. (2003) Environ. Sci. Technol. 37, 4442-4448
- Detergentes en formulaciones industriales (textil, curtidos, papeleras - Coadyuvantes de pesticidas - Ingredientes de pinturas - Agentes humectantes
Productos de degradaciónProductos de degradación aeróbica y anaeróbicaaeróbica y anaeróbica
Niveles enNiveles en - aguas: ng-mg-mg/L - sedimentos: mg/Kg - lodos: mg/Kg - biota: ug/Kg
EfectosEfectos estrogénicosestrogénicos: 1-20 mg/L (NP and NP1EO)
Directiva 2455/2001Directiva 2455/2001 Nonilfenoles; 4-p-Nonifenol Octilfenoles, p-t-Octilfenol
Fármacos en el medio ambiente acuático
Analgésicos/antiinflamatorios: paracetamol, ác. acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenac
Antibióticos: - Macrólidos: claritromicina, dehydroeritromicina, roxitromicina, lincomicina
- Sulfamidas: sulfametoxazol, sulfadimetoxina, sulfametacina, sulfatiazol
- Fluoroquinolonas: ciprofloxacina, norfloxacina, enrofloxacina
- Tetraciclinas: clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina
... cloranfenicol, tilosin, trimetoprim Antiepilépticos: carbamazepina, primidona
b-Bloqueantes: metoprolol, propanolol, bisoprolol, betaxolol, nadolol, sotalol
Reguladores de lípidos: ácido clofíbrico, bezafibrato, gemfibrozil, ác. fenofíbrico
Medios de contraste en rayos-X: diatrizoato, iohexol, iopamidol, iopromide, iomeprol
Citostáticos (quimioterapia): ifosfamida, ciclofosfamida
Anticonceptivos orales: etinilestradiol, mestranol Esteroides: coprostanol, estradiol, progesterona, testosterona. Broncodilatadores, tranquilizantes, antihistamínicos, barbitúricos, antidiabéticos...
NIVELES: ng-mg/L; mg-g/Kg Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17.
Fármacos más problemáticos/ menos estudiados1
Antibióticos2: � Resistencia bacteriana - 2/3 en medicina humana: posición 3. - 1/3 en medicina veterinaria: 70%
Citostáticos: � Prop. Carcinogénicas Poca eliminación en STP �niveles, destino, y riesgos
Anticonceptivos orales: � Efectos estrogénicos a ~ 1ng/L �Medio marino, sedimentos y fangos
Medios de contraste en rayos-X: � Persistencia Poca eliminación en STP Aguas subterráneas �Metabolitos
.
U.S. EPA Contaminants Canditate List (CCL)3
Diclofenac (antirreumático) Carbamazepine (antiepiléptico) Análisis: Chloramphenicol (antibiótico) LC-UV-FL
LC-MS fi LC-MS-MS 1Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17. 2 Thiele-Bruhn S (2003) J. Plant Nutr. Soil Sci. 166, 145-167. GC-MS fi GC-MS-MS 3 http://www.epa.gov/OGWDW/ccl/cclfs.html
- -
Environmental samples
Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)
HPLC fractionation
Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)
SPE -C18 (aqueous samples)PLE (solid samples)
Environmental samples
Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)
Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)
SPE -C18 (aqueous samples)PLE (solid samples)
Procedimiento integrado de análisis químicos y ensayos biológicos
Muestras ambientales Extracción de componentes activos
SPE-C18 (muestras acuosas) PLE (muestras sólidas)
Extractos Medida de la estrogenicidad (vitelogenina)
Ensayo levaduras recombinantes (RYA)
Cor
rela
ción
y c
uant
ifica
ción
de
fact
ores
caus
ativ
os
Análisis de compuestos diana
por LC-MS
Actividad positiva
Fraccionamiento HPLC
Medida de la estrogenicidad (vitelogenina) Ensayo levaduras recombinantes (RYA)
Fracciones activas
Identificación de comp. desconocidos por LC MS MS
Chemical analysis
Muestras agua
Filtración Off-line On-line (steroids)
SPE (ASPEC) LiChrolut RP-18
SPE (PROSPEKT) PLRP-s
N2 evaporación
LC-MS/(MS)
Muestras sólidas (sedimentos/lodos)
LyophilizationLiofilización
Ultrasonic extraction
Rotary evaporation
Extracción con fluídos presurizados
Rotavapor
Purificación (clean-up)
SPE Sep-Pak C18 Plus (esteroides) LiChrolut RP18 (alquilfenoles)
N2N2 evaporación
LC DAD MSLC-MS/(MS)
Análisis químico – compuestos diana
1. etoxilado (OPEO) y sus productos de degradación nonilfenol (NP), octilfenol (OP), y derivados carboxilados (NPEC y OPEC), respectivamente.
2. Bisfenol A (BPA)
3. Ftalatos (DMP- dimetil ftalato; DEP – dietil ftalato, DBP - dibutil ftalato, BBP - butil bencil ftalato, DEHP-di(2-etil-hexil) ftalato)
4. Hormonas sexuales esteroidales naturales y compuestos sintéticos relacionados (E1-Estrona; E2- b-estradiol , E3-Estriol, EE- etinil estradiol, DES-Dietilestilbestrol, PRO-Progesterona, NOR-Noretindrona, LEV-levonorgestrel)
5. Benzotiazoles (HOBT. 2-hidroxibenzotiazol)
Detergentes no iónicos, nonilfenol etoxilado (NPEO), y octilfenol
Ensayo con cepas de levaduras recombinantes (Recombinant Yeast Assay, RYA)
� Basado en una cepa de levadura que expresa el receptor humano de estrógenos (hER) y un gen de ensayo (ßgalactosidasa) cuya expresión depende de la activación del receptor del hER.
� La actividad b-galactosidasa se mide fácilmente con substratos cromogénicos o fluorogénicos y depende de la presencia de ligandos del hER, por lo que puede ser tomada como indicadora de actividad estrogénica.
� Todo el ensayo puede ser llevado a cabo en placas de ensayo de 96 pocillos
Concentration efectiva media (EC50) y factor de estrogenicidad relativa obtenida para diferentes compuestos por RYA
Vitelogenina en plasma: Western blot
Cyprinus carpio
Extracción de sangre: 2 ml jeringa heparinizada + Aprotinina
Obtención plasma: Centrifugaciónn 1,000 g x5’
SDS-PAGE análisis: PAb anti-conejo (Biosense, Norway)
APLICACIONES
Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con cepas de levaduras recombinates para la determinación de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat Análisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat
Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos fluviales).
Area de estudio: Cataluña
Mapa con los puntos de muestreo en la cuenca del Llobregat.
Números 1 al 10 indican los puntos de muestreo de aguas. Letras A a la D corresponden a la localización de las EDAR.
Zonas en gris indican la localización de las poblaciones próximas a las EDAR: A-Manresa; B-Terrassa , C-Igualada; D-Martorell.
-
Puntos Río OP NP BPA NPEO1 NPEO2 DEP DEHP DBP Aguas superficiales
1 Llobregat < 0.09 0.22 0.09 < 0.22 < 0.06 1.45 < 0.20 0.6 2 Llobregat < 0.09 < 0.15 0.09 < 0.22 0.61 1.5 < 0.20 0.34 3 Cardener < 0.09 0.39 < 0.09 3.22 2.53 6.85 < 0.20 0.3 4 Llobregat < 0.09 0.26 < 0.09 1.19 1.2 0.54 < 0.20 0.47
5a Llobregat 0.09 0.5 0.27 < 0.22 0.39 1.26 0.82 1 5b Llobregat < 0.09 0.45 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.05 3.09 1.3
6 Anoia < 0.09 1.23 < 0.09 < 0.22 < 0.06 0.85 0.65 < 0.19 7 Anoia < 0.09 0.53 0.12 < 0.22 1.27 0.58 0.45 < 0.19 8 Llobregat 0.26 2.57 0.11 3.54 1.17 0.46 0.31 < 0.19 9 Rª de Rubí 21.9 37.3 0.85 6.87 3.17 0.4 0.77 < 0.19
10 Llobregat 2.57 13.9 2.97 < 0.22 < 0.06 0.22 < 0.20 < 0.19
Aguas resid. EDAR EDAR A Inf Manresa 0.17 17.1 0.94 19.3 5.56 1.62 3.17 0.07 EDAR A Efl Manresa < 0.09 2.99 0.34 9.53 8.97 0.93 1.34 < 0.19 EDAR B Inf Terrasa 0.08 29.8 < 0.09 < 0.22 < 0.06 12.97 0.26 0.83 EDAR B Efl Terrasa < 0.09 0.8 < 0.09 10.6 9.69 10.21 0.23 < 0.19 EDAR C Inf Igualada 0.24 44.8 6.98 2.37 5.61 3.19 0.82 8.86 EDAR C Efl Igualada < 0.09 1.24 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.25 1.12 < 0.19 EDAR D Inf Martorell 0.18 11.9 < 0.09 3.8 0.82 1.06 1.9 0.35 EDAR D Efl Martorell 0.09 0.89 < 0.09 < 0.22 3.87 0.56 0.33 < 0.19
LOD (mg L-1) 0.09 0.15 0.09 0.22 0.06 0.2 0.2 0.19
Concentraciones en mg/L de diferentes EDCs analizados por LC MS
Cálculo de equivalentes de estradiol a partir de los resultados RYA.
Los círculos negros, los blancos, y los triángulos representan los valores relativos de ß-galactosidasa, obtenidos a diferentes factores de dilución, en el agua residual de entrada de la EDAR de Manresa, en el agua de salida, y en un punto de muestreo próximo a ésta (el 3), respectivamente.
Las funciones sigmoidales se calcularon mediante métodos de regresión no-lineal. Las líneas gruesas continua y discontinua corresponden a las aguas de entrada y de salida de la EDAR de Manresa, y la línea fina discontinua a la muestra de agua en el punto 3.
Valores totales de estrogenicidad en equivalentes de estradiol para muestras de aguas residuales (izquierda) y de aguas de río (derecha).
Correlación entre los valores totales de estrogenicidad (en eq. E2) obtenidos por RYA (eje X) y los estimados a
partir de la composición química de las muestras (eje Y).
APLICACIONES
Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con cepas de levaduras recombinates para la determinación de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat Análisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat
Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos fluviales).
AreaArea de estudio:de estudio: CataluñaCataluña
DetecciónDetección dede fármacosfármacos
ACIDO CLOFIBRICOACIDO CLOFIBRICO
ACIDO ACETILSALICILICOACIDO ACETILSALICILICO
DICLOFENACDICLOFENAC
EDAR ABRERAEDAR ABRERAEDAR ABRERA LlobregatLlobregat riverriver
CardonaCardona 150150150 ngngng/L/L/LRIO ANOIARIO ANOIA CardenerCardener riverriver 100100100 150150 505050ngng/L/L100100 000
5050
00 ManresaManresa
NN
MediterraneanMediterranean SeaSea
AnoiaAnoia riverriver
(2)(2) LlobregatLlobregat riverriver EDAR RUBIEDAR RUBIEDAR RUBIIgualadaIgualada 111202020000 ngngng/L/L/L
100100100 (4)(4)
505050AbreraAbrera (1)(1) 000MartorellMartorell
RIO LLOBREGATRIO LLOBREGAT
Sant Joan DespíSant Joan Despí 150150150BarcelonaBarcelona ngngng/L/L/L(3)(3) 100100100 505050 000
00 25 km25 km
Area de estudio: Cataluña
Concentraciones en ng/L de fármacos
� Octubre 2003 Fármacos
Muestras Diclofenac Ac. clofíbrico
Ac. acetilsalic ílico
Distribució zona Ter - - -MPATSA - 24.5 -EDAR Abrera - 40 31.5 Anoia final - - -Llobregat abans Anoia - 35 -Llobregat després Anoia - 14 -Edar Rubí 1200 107 50 Aigua tractada ETAP Abrera - - -Llobregat captació ETAP SJD - - -Aigua tractada ETAP SJD - - -
Area de estudio: Cataluña
Concentraciones en ng/L de fármacos
� Abril 2004
Muestras
ETAP Cardedeu aigua tractada
MPATSA, 28-04-04, 10:00
EDAR de Abrera, 28-04-04, 10:30
Llobregat abans Anoia, 28-04-04, 11:00 Anoia final, 28-04-04, 11:30
EDAR Martorell, 28-04-04, 12:00
ETAP Abrera (aigua tractada), 28-04-04, 12:40 Llobregat després Anoia, 28-04-04, 14:30 Abocament ETAP (SJD), 28-04-04, 15:15
Captació ETAP SJD, 28-04-04, 17:00
Aigua tractada ETAP SJD
Ibuprofen
--
134.30
27.42
127.20
53.70
-
30.50
-
17.46
-
Diclofenac
---
240.68
11.8
31
134
-
14.40
-
-
-
Ácido clofíbrico
----
-
--
-
-
-
-
-
Atenolol
-----
---
-
-
-
-
MAPTSA
3
Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA
MUESTRAS pH ACIDO
0
5
10
AIGUA TR
ACTADA ET
AP ABRER
A 3
EDAR SO
RTIDA ABRER
A 3
DISTRIBUC. Z
ONA 3
LLOBREG
AT ABANS A
NOIA 3
ANOIA FI
NAL 3
EDAR RUBI 2
AIGUA TRACTA
DA ETAP S
JA 3
LLOBREG
AT DES
PRES
2 BLANC
BLANC OH-
BLANC H+
UN
IDA
DE
S 1:30
1:90
1:270
1:500
Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de las muestras extra ídas a pH ácido.
Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA
CONTROL POSITIVO
0
500
1000
1500
0 0 0 0
GENIST
EINA 228
ENTE
ROLACTO
NA
UN
IDA
DE
S
1:30
1:90
1:270
1:500
Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de control positivo (Genisteína 1.9 mM) y negativos (0). Véase la diferencia de escala con respecto a la anterior figura.
APLICACIONES
Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con cepas de levaduras recombinates para la determinación de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat
Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos fluviales).
Mar Mediterráneo
Río Anoia
Río Cardener
Río Llobregat
A1
A2 A3
C1 C2
C3
Barcelona
EDAR1 EDAR2
EDAR3
EDAR4
0 30 60 km
�N
C1-C3
Spain
A1-A3,
Area de estudio: Cataluña
Agua Sedimento
Pez (Cyprinus carpio) sangre, hígado, bilis, tejido
(130 machos adultos, 116 hembras de carpas)
SEDIMENT
Variación temporal de las concentraciones de compuestos nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Anoia
50
40 AGUA
30 mg/L
20 NPEO10 NP1EC0 NP
0
200
I III V VII
50 mg/kg 5040400
30 40600 AGUA20 30 800 mg/L10 20
0 10 I III V VII 0
Río Anoia
Río Llobregat
A1 A2 A3 Barcelona
EDAR1 EDAR2
EDAR3
SEDIMENTo mg/L AGUA
I III V VII0 0
200 mg/kg 200
400 mg/kg 400
600 SEDIMENTO 600 SEDIMENTO 800 800
Variación temporal de las concentraciones de compuestos nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Cardener
10
8
6m g/L 4
2
0 I
0
100 mg/kg
200
300
400
400
NPEO NP1EC NP
Río Cardener
Río Llobregat
C1
C2 C3
Barcelona
STP
m
SEDIMENTO
0
100
200
300
g/kg
0 2 4 6 8
10
I III V VII
mg/L
AGUA
0 2 4 6 8
10
I III V
mg/L
AGUA
0
100
200
300
400
mg/kg
SEDIMENTO
AGUA
III V VII
SEDIMENTO
VII
Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y sedimentos del río Anoia
0
5
10
15
20
25
A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3
ng/L
E3 E2 EE E1 DES NOR LEV PRO
Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 2000 0
1
2
3
4
ng/g
E3 E2 EE E1 DES NOR LEV PRO22.8
Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y sedimentos del río Cardener
0
5
10
15
20
25
30
C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3
ng/L
E3 E2 EE E1 DES NOR LEV PRO
71.1
0 1 2 3 4 5 6 7 8
ng/g
E3 E2 EE E1 DES NOR LEV PRO11.8
Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 2000
Niveles de vitelogenina, en mg/mL de plasma, en carpas macho (Cyprinus carpio) del río Anoia
ControlAnoia A1 A2(7:3)
(4)
(6) (4)
(9) (6) (3)
(6)
x100
* * *
(10:4)
(4) (5)
(6)
0
40
80
120
VTG
( g/
ml p
lasm
a) A3
Enero Marzo Mayo Julio
Correlación entre la concentración de VTG en plasma y la concentración de NP en agua de río
16
14
12
10
mg NP/L 8
6
4
2
0 0 20 40 60 80
mg VTG/mL plasma
R = 0.82
Anoia
(4)
(7:3)
(6)(4)
(9) (6) (3)
(6)
x100
* **
(10:4)
(4) (5)
(6)
0
40
80
120V
TG (
g/m
l pla
sma)
January March May July
A1A2A3
Control
Cromatograma obtenido en el análisis off-line de etinil estradiol por LC-NI-ESI-MS-MS (295>145) en un sedimento tomado en una
zona en donde se observó una alta incidencia de peces intersex y de niveles de vitelogenina.
21 22 23 24 25 26
6500
7000
7500
8000
8500
9000
9500 Etinil estradiol
Tiempo (min)
Abu
ndan
cia 22.8 ng/g sedimento A2
MRM
VTG-Anoia
(4)
(7:3)
(6) (4)
(9) (6) (3)
(6)
x100
* * *
(10:4)
(4) (5)
(6)
0
40
80
120V
TG (
mg/m
l pla
sma)
Enero Marzo Mayo Julio
A1 A2 A3
Control
Conclusiones/propuestas para la mejora de la calidad del agua en Cataluña
- Mejor depuración de las aguas residuales urbanas - Incremento significativo del tratamiento terciario en la depuración de
aguas residuales urbanas - Reutilización creciente de aguas depuradas - Tratamiento separado, y diferenciado desde el origen, de las aguas
de procedencia industrial - Máxima reutilización del agua industrial mediante circuitos cerrados y
autodepurados - Implementar la calidad integral de las aguas promoviendo programas
de vigilancia ambiental para los contaminantes emergentes de forma que se garantice la conservación del medio acuático natural, la gestión integral de los recursos hídricos, la eficacia en el uso del agua y la reutilización de la misma.