Upload
asher
View
72
Download
7
Embed Size (px)
DESCRIPTION
L’Spliceosoma Introducció. 1. INTRODUCCIÓ GENERAL A L’SPLICING 2. APROXIMACIÓ ESTRUCTURAL A LES SUBUNITATS DE L’SPLICEOSOMA 3. APROXIMACIÓ A 3 DOMINIS ALTAMENT REPETITS: RS RRM Polar Zippers 4. BIBLIOGRAFIA. L’Spliceosoma. Expressió proteïnes. L’Spliceosoma Introducció mecanística. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
L’SpliceosomaIntroducció
L’Spliceosoma
1. INTRODUCCIÓ GENERAL A L’SPLICING
2. APROXIMACIÓ ESTRUCTURAL A LES SUBUNITATS DE L’SPLICEOSOMA
3. APROXIMACIÓ A 3 DOMINIS ALTAMENT REPETITS:
RSRRM
Polar Zippers
4. BIBLIOGRAFIA
Expressió proteïnes...
L’SpliceosomaIntroducció mecanística
L’SpliceosomaIntroducció mecanística
L’SpliceosomaIntroducció mecanística
L’SpliceosomaIntroducció mecanística
L’SpliceosomaIntroducció mecanística
ATPATP
Molts passosMultitud de proteïnes i RNAs
ATP DEPENENT!
Aproximació estructural al Spliceosoma
• Estructures extremadament grans
• Nombroses proteïnes
• Molt dinàmic
U1
• Funció: Reconeix lloc 5’ i recluta altres unitats.
• Imatge de criomicroscopia electrònica de 10Å
• Proteïna de 240 KDa
U1 components
• snRNA de 165nt amb lloc Sm (AAUUUGUGG)
• Unitat Sm (heteroheptàmer)
• Proteïna U1A
• Proteïna C
• Proteïna 70K
U1A
Loop II de la snRNA U1
snRNP U1A1. 31 Kda
2. Ressolució de 10 Å3. Domini RRM (prot-RNA)
Al SCOP
Cl α+β
Fold Ferrodoxin-like (α+β sandwitch with antiparalel β sheet = (β-α-β)*2
Sfam RNA binding domain
Fam Canonical RBD
Anell Sm• Repetit en diverses U (U1 U2 U4/6)• Només es disposava d’estructures de Rx per a
quatre de les 7 subunitats i de una reconstrucció a partir de criomicrografia electrònica.
70-80Å
Anell Sm (II)Construcció de les subunitats que falten mitjançant MODELLER i partint de les subunitats que sí que teníem (es a dir D1 D2 D3 i B).
SCOOP
•Cl = all β
• Fold = Sm-like fold (core: barrel open n*=4 s= 8 meander)
•Sfam = Sm-like RNP
B
D2D3
D1 E
F
G
Anell Sm Muntatge
Homoheptàmer format per Sm-like protein(de cierta archea, de cuyo nombre no quiero acordarme)
Monòmer
+ D1, D2, B...
Xam!!!
Alignment score Sc = 6.361942
Alignment length Lp = 107
RMS deviation after fitting on 35 atoms = 1.083019
Secondary structures are from DSSP
Anell Sm Muntatge
+SUPERPOSE.pl
(Xam!)
Anell Sm Muntatge
70-80Å
Visió conjunta de U1
Sm
U1 smRNA
U1A
70 Kda + C
U2 Components
• Auxiliar factors = U2AF65 i U2AF35
• U2 SF3B
• P14 – interacció branch site
• SF3b 145, 49, 120, ...... Doblegen exó
• SF1 interacció amb el branch site
• U2 SF3A composat per:
• U2B’’- U2A’ prot complex
• Core Sm
• snRNA U2
U2AF = Auxiliar factors
Només una part te estructura per crsistalografia de Rx (2.2 Å)
• U2B’’
•U2A’
Tenen com a funció reconeixer el lloc 3’ i recluten la resta de U2
Interacciones entre ells per dominis RRM (prot-prot)
U2 SF3BReconstrucció a partir de criomicrografia electrònica de 10Å
•P14 (reconeix branch site)
•Dominis RRM (intereacció altres prot i amb RNA). Localitzat en les protuberancies del complex
• Altres
U2 SF3A
U2B’’- U2A’ prot complex (2’4 Å) Core Sm
snRNA U2
Visió conjunta de U2
U 4/6
Consta de
•Anell Sm
•U4
•U6 (act.catalítica)
•Auxiliar factors ???
U4/6 Criomicrografia electronica 100 Å
U5
U5 C complex (30 Å)
Conclusió
La aproximació estructural al spliceosoma en conjunt és encara impossible.– Falten dades (400 prot – 10 pdb’s)
– Complexitat elevada
– Dinàmica
– Gran tamany
– A més al sistema se li han d’afegir les helicases ...
Vam concluir que el més raonable és estudiar el spliceosoma per dominis.
MOTIUS COMUNS A MOLTES DE LESPROTEÏNES QUE FORMEN PART DE
L’SPLICEOSOME
DOMINIS KH
El mòdul KH ( K homology) és un motiu ubicu d’unió a RNA .
Està conservat en organismes molt divergents filogenèticament com àrquees, bactèries i eucariotes
Aparició ancestral del domini KH en l’escala evolutiva
DOMINIS KH
CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
PDB: 1DT4
DOMINIS DINS LA FAMILIA KH
Protein Domains:
1) Neuro-oncological ventral antigen 1, nova-1, KH3
2) Neuro-oncological ventral antigen 2, nova-2, KH3
3) Vigilin, KH6
4) Fragile X protein, KH1
5) HnRNP K, KH3
6) RNA splicing factor 1
7) Far upstream binding element, FBP, KH3 and KH4 domains
Dona nom als dominis “KH”
Domini d’Interès en el context del treball
DOMINIS KH
CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
DEFINICIÓ de DOMINI KH (I)
~ 70 residus d’extensió
Els dominis sovint troben disposats en tàndem (= RRM) Javi.
“Maxi KH-Domain”: major grandària ( ~ 100 residus). No repeticions en tàndem.
Presents en proteïnes STAR : Signal Transduction Activation RNA (Dominis WW i SH3)
El Factor de Splicing 1 (SF1) es una proteïna STAR que conté un domini maxi-KH
DOMINIS KH
CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
DEFINICIÓ DOMINI KH (II)
MOTIU ESTRUCTURAL COMÚ: beta-alpha(2)-beta(2)-alpha; 2 layers: alpha/beta - Fulla beta (3 cadenes antiparal·leles)
- 3 hèlix alfa.
- Loop entre α1- α2: GXXG (VIGXXGXXI)
RECONEIXEMENT DE RNA:
- Simultani o únic. Motiu: N-Beta-Alfa-Alfa-Beta (la resta estabilitza el domini)
- Ampli Rang per al reconeixement de RNA (Inespecífic?) discussió
- Reconeixement de 7 a 75 nucleòtids.
DOMINIS KH
CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
INTERACCIÓ KH-RNA.
Resolució: 2.60 Angstroms
PDB: 1DT4
DOMINIS KH
CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
INTERACCIÓ KH-RNA (II)
Resolució: 2.60 Angstroms
PDB: 1DT4
Estructura de domini KH ++ RNA hairpin (20 nucleòtids)
DOMINIS KH
CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
INTERACCIÓ KH-RNA.
Resolució: 2.60 Angstroms
PDB: 1DT4
Domini KH: butxaca hidrofòbica
DOMINIS KH
CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
FACTOR DE SPLICING 1 (SF1)
- Proteïna STAR que S’unex al BPS (Branching point site) de 7 nucleòtids
- A més del domini KH...Domini zinc knuckle: unió inespecífica a RNA
-Participa en l’ensamblatge del complex de compromís (Comitment Complex) juntament amb U2AF
- El domini N-ter de SF1 interacciona mab el 3er domini RRM del U2AF65: interacció cooperativa important. La unió de SF1 a BPS i la unió de U2AF65 a PPT són interdependents (Javi)
- Model actual : en l’ensamblatge del Spliceosoma, unió primerenca de SF1, que serà desplaçat per un sistema ATP depenent no identificat encara
DOMINIS KH
CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
MODEL ACTUAL DE RECONEIXEMENT DEL
BPS. DISCUSSIÓ.
DOMINIS KH
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
Zn-Knuckle
“Nudets de Zenc”: motiu d’unió a nucleòtids format pel consens:
CX2CX4HX4C
· Present en:
- proteïnes gag (nucleocàspida) Empaquetament del genoma víric
- proteïnes eucariotes binding RNA o ssDNA
DOMINIS KH
RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS.
Zn-Knuckle
PDB: 1A6BResolució: “not applicable”
Zn 2+
Domini KH del SF1; Interacció amb RNA
PDB 1K1G: RESOLUTION. NOT APPLICABLE.
Domini KH del SF1; Interacció amb RNA
Domini KH del SF1; Interacció amb RNA
Teoria del “meta splicing”
· El Facor d’splicing SF1 presenta diverses variants d’splicing
· Algunes variants presenten regions C-ter riques en Prolina
Interacció amb dominis SH3 i WW
· yFBP11: proteïna amb domini WW. Relacionada amb U1snRNP, que al seu temps interaccionarà amb ySF1.
Especulació: Autorregulació del reconeixement del lloc d’splicing via senyalització mediada per les pròpies variants d’splicing del SF1
DOMINIS KH: “EL FET DIFERENCIAL”
KH domains: Proteïnes extranyes
- Presenten alta similaritat de seqüència el les regions del motiu d’unió a RNA.
- Diferent topologia.
Exemple únic de proteïnes amb seqüencies similars i plegaments considerablement diferents
hnRNP (eucariota) S3 (procariota)
Psi-blast hnRNP.
Sequences producing significant alignments: (bits) Value
pdb|1KHM|1KHM-A hnrnp kfragment: c-terminal kh domain, residues ... 116 9e-28pdb|1EC6|1EC6-B RNA-binding protein nova-2fragment: kh3;(astrocy... 95 3e-21pdb|1EC6|1EC6-A RNA-binding protein nova-2fragment: kh3;(astrocy... 95 4e-21pdb|1DT4|1DT4-A neuro-oncological ventral antigen 1fragment: thi... 89 3e-19pdb|1VIG|1VIG vigilinfragment: kh6, residues 432 to 501; 37 0.001pdb|1VIH|1VIH vigilinfragment: kh6, residues 432 to 501; 37 0.001pdb|1K1G|1K1G-A sf1-bo isoformfragment: residues 133-260, kh-qua... 26 3.1pdb|1ALB|1ALB Adipocyte lipid-binding protein 25 3.6pdb|1LIC|1LIC Adipocyte lipid-binding protein complexed with hex... 25 3.6pdb|2ANS|2ANS-A adipocyte lipid-binding protein(albp, ap2, a-fabp) 25 3.6pdb|1A18|1A18 adipocyte lipid binding protein(albp-phen) 25 3.8pdb|1A2D|1A2D-A adipocyte lipid binding protein(albp-px) 25 3.8pdb|2EFG|2EFG-A elongation factor g(ef-g)elongation factor g dom... 24 8.5pdb|1EFG|1EFG-A Elongation factor g complexed with guanosine 5'-... 24 8.6pdb|1ELO|1ELO elongation factor g(translocase) 24 8.9pdb|1FNM|1FNM-A elongation factor g(ef-g)Mutant 24 9.2pdb|1FJF|1FJF-C 16s ribosomal RNAfragment of messenger RNA30s ri... 24 9.2pdb|1FJG|1FJG-C 16s ribosomal RNAfragment of messenger RNA30s ri... 24 9.2pdb|1GIX|1GIX-F 30s 16s ribosomal RNAtrna(phe)trna(phe)a- and p-... 24 9.2pdb|1JQM|1JQM-B 50s ribosomal protein l11elongation factor g(ef-... 24 9.6
Score = 24.0 bits (52), Expect = 9.2Identities = 8/17 (47%), Positives = 13/17 (76%)
Proteïna s3
Topologia KH eucariota vs el procariota
• Motiu local implicat en la unió a nucleòtids: conservat. βααβ
• Plegament global: diferent. Diferents extensions en N-ter i C-ter per estabilitzar el domini.
CLASSIFICACIÓ DELS DOMINIS KH Classe: (11 Categories)
Alpha and beta proteins (a+b)
Mainly antiparallel beta sheets (segregated alpha and beta regions)
Fold: (~230 categories)
Eukaryotic type KH-domain (KH-domain type I) beta-alpha(2)-beta(2)-alpha; 2 layers: alpha/beta
Superfamily: (1 categoria)
Eukaryotic type KH-domain (KH-domain type I)
Prokaryotic and eukaryotic domains share a KH-motif but have different topologies
Family: (1 categoria)
Eukaryotic type KH-domain (KH-domain type I)]
an RNA-binding domain
RRM(RNA recognition Motif)
RNA
U2B’’
U2A’
Complex U2B’’-U2A’ unit a RNA
RRM
PDB: 1A9N. 2,4Å
RNP(Ribonucleoprotein motif)
RNP-CS RBD(RNP consensus-sequence-type
RNA-binding domain)
RRM
•80 Aa aprox.
• Unió RNA (i altres!)
• Nº còpies variable
• ESTRUCTURA:
• -
-----
PDB: 1A9N. 2,4Å
RRM
•Proteïnes:
• hnRNPs
• traslation factors
• snRNPs
• Altres proteïnes:
• Tranport RNA
• Processament RNA
• Poly(A)-binding proteins
•...
(1)RNP2
RNP1(octamer)
(hexàmer)
(3)
PDB: 1A9N. 2,4Å
Hèlix A
Hèlix B
Hebra 2
Hebra 4
+ de 150!!!
Factors d’elongació, putative RNA-binding protein SYM-2, nuclear protein, NP220 [Mus musculus], ...
Interacció RRM-RNA
PDB: 1A9N. 2,4Å
U2B’’
U2A’RNA
Complex U2B’’-U2A’ unit a un fragment de snRNA de U2
PDB: 1URN. 1,9Å
U1A
( U2 snRNA
Hairpin IV)
( U1 snRNA Hairpin II)
Reconeixement RNA-
específic!!!
Complex U1A unit a un fragment de snRNA de U1
Com?
SimilaritatU1A vs. U2B’’
Alineació amb STAMP
Alineació amb CLUSTALW
25 canvis
73% igualtat
RNP2 RNP1
U2B’’
U1A
A
B
1 2
3
4 5
Motiu sensible a proteases
Motiu sensible a proteases
RMSD: 0,499312
SimilaritatU1A vs. U2B’’
Alineació amb STAMP
Alineació amb CLUSTALW
RMSD: 0,499312
SimilaritatU1A vs. U2B’’
Alineació amb STAMP
Alineació amb CLUSTALW
Interacció amb el donor Lloc d’unió per proteïnes Sm
Interacció amb el punt de ramificació
Lloc d’unió per a proteïnes Sm
U1 snRNAHairpin II
U2 snRNAHairpin IV
C5
G16
U5 U17
G12
C12
PDB: 1URN. 1,9Å
PDB: 19AN. 2,4Å
InteraccionssnRNA U1 – U1A
RESIDUS BÀSICS
RESIDUS AROMÀTICS
RESIDUS NEGATIUS
Phe56
Tyr13
PDB: 19AN. 2,4Å
RNP2 RNP1
PDB: 1URN. 1,9Å
Leu17
Glu19
44-49
PDB: 19AN. 2,4Å
InteraccionsRNA-proteïna
Asp92Phe56
Tyr13
C10
A11
G12
PDB: 1URN. 1,9Å
U1A-RNA
PDB: 19AN. 2,4Å U2B-RNA
InteraccionsRNA-proteïna
Asp92Phe56
Tyr13
C10
A11
C12
PDB: 1URN. 1,9Å
U1A-RNA
U2B-RNA
PDB: 19AN. 2,4Å
G12
Tyr13C10
Asp92
U2B-RNA
Phe56
Tyr13
C10
A11G12
Asp92
Lys50
U1A-RNA
C12
Asp92 A11
Phe56Tyr13
C10
3,6Å3,3Å
3,56Å
3,52Å
3,34Å
2,76Å
2,6Å
InteraccionsRNA-proteïna
U2B-RNA
PDB: 19AN. 2,4ÅU1A-RNA PDB: 1URN. 1,9Å
InteraccionsRNA-proteïna
A14C15
C16
Ponts H entre C15-C16 i U13
Leu46
Thr48
A14
C15C16U2B-RNAPDB: 19AN. 2,4Å
U13
U13
3,68Å
3,66Å
3,66Å
Tancament del loop
U2B-RNA
PDB: 19AN. 2,4Å
U17
U5
A6C’-C’ (U.U)= 8,8Å
U1A-RNA
PDB: 1URN. 1,9Å
A6
C5
G16
C’-C’ (C.G)= 10.5Å
3,20Å
Tancament del loop
U2B-RNA
PDB: 19AN. 2,4Å
Lys20U17 i U5G4
Tancament del loop
U1A-RNAPDB: 1URN. 1,9Å
Lys20
U1A-RNA
PDB: 1URN. 1,9Å
G16
C5
Arg52Lys20
A6
3,44Å2,97Å
2,69Å
U2B-RNA
PDB: 19AN. 2,4Å
Arg52
U5
U17
C15
C16
Lys20
2,56Å
2,76Å
3,44Å2,97Å
2,69Å
Arg52
C4
C5
A6
U7
G17
G16
U1A-RNA
Tancament del loop
Lys22Lys151
Interracions
RNA-U2A’
U2A: Motius LRR
XLXLXLXXN
Interaccions
Heterodímer
U2A-U2B’’
U2AF
U2AF35
U2AF65
•Funció: Reconèixer 3’ splice site i reclutar el U2snRNP al “branch point”.•Heterodímer.
RRM utilitzat per reconeixement e interacció proteïna-proteïna!
RRMs que reconeixen el tracte de polipirimidines
Segment SR
Regió SR
RRM utilitzat per reconeixement e interacció proteïna-proteïna!
U2AF•Competència amb altres proteïnes que uneixen tractes de polypirimidines
•Pex Sex-lethal, o pyrimidine tract binding protein
MECANISME DE REGULACIÓ NEGATIVA DE LA SELECCIÓ DEL
3’ splice site
• S’uneix a U2 snRNp-associated proteins ÚNICAMENT amb la presència de U1 snRNP al lloc d’splicing 5’.
• Facilita la unió de SF1/BBP a la seqüència adjacent al branch point.
• Interacció amb altres factors d’splicing addicionals que posseeixen dominis rics amb Ser i Arg (SR proteins)
• Un cop el complex U2 snRNP s’ha unit a l’spliceosoma, U2AF es dissocia del pre-mRNA.
U2AFDimerització
Estructura:
U2AF35 (42-146)
U2AF65 (85-112)
2,2Å
U2AF35
Trp92 (U2AF65)
Trp134 (U2AF35)
Hèlix A
Hèlix B
Hebra 4
InteraccióU2AF35-U2AF65
Hèlix A – Hèlix B: 102º vs 82-92º canòniques
Stacking interactions
Ponts d’hidrògen
Ponts salins
•Conservació absoluta d’aquests triptòfans.
•Essencial per la viabilitat.
InteraccióRRM3 U2AF65-SF1
Hèlix C
SF1Interaccions hèlix C – fulla
Interaccions RRM3 – SF1
Domini SR (Serine/Arginine rich)
• Rics en tàndems de Arg i Ser (SR)
• Família de proteines SR:
• Dominis RRM (un o dos) C-term
• Domini SR N-term
Interaccions Proteina-RNAU2AF-65
• Reclutament de U2 al branch-site
• Domini RS media el contacte amb branch-site
• Importància Arg (+) per afavorir l’aproximament de les dues cadenes
Interaccions Proteina-ProteinaU2AF-35 - U1snRNP 70 k
• No s’ha demostrat que sigui suficient per a la interacció.
• Fosforilació:- Augmenta la interacció.
- Anula intertacció amb RNA
“POLAR ZIPPER”
Cadenes antiparal·leles
Cremalleres fetes de repeticions regulars de carregues complementàries+ - + - + -
Hèlix
Splicing
Associat a cromatina
Transcripció
Kinases i fosfatases
EstructuraCicle Cel·lular
Traducció
BIBLIOGRAFIAA subset of human 35S U5 proteins, including Prp19, function prior to catalytic step 1 of splicing Makarova OV, Makarov EM, Urlaub H, Will CL, Gentzel M, Wilm M, Luhrmann R. Department of Cellular Biochemistry, Max
Planck Institute for Biophysical Chemistry, Gottingen, Germany. EMBO J. 2004 Jun 3 Epub 2004 Jun 03.Three-dimensional structure of a pre-catalytic human spliceosomal complex B.
Boehringer D, Makarov EM, Sander B, Makarova OV, Kastner B, Luhrmann R, Stark H. Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Department of Cellular Biochemistry, Am Fassberg 11, 37077 Goettingen, Germany.Nat Struct Mol Biol. 2004 May;11(5):463-8. Epub 2004 Apr 18.
Molecular architecture of the multiprotein splicing factor SF3b.Golas MM, Sander B, Will CL, Luhrmann R, Stark H. Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Am Fassberg 11, 37077 Gottingen, Germany
U1A RNA-binding domain at 1.8 A resolution.Rupert PB, Xiao H, Ferre-D'Amare AR.
Arrangement of RNA and proteins in the spliceosomal U1 small nuclear ribonucleoprotein particle
HOLGER STARK, PRAKASH DUBE, REINHARD LÜHRMANN & BERTHOLD KASTNERNature 409, 539 - 542 (25 January 2001); doi:10.1038/35054102
Crystal Structures of Two Sm Protein Complexes and Their Implications for the Assembly of the Spliceosomal snRNPsChristian Kambach 1, Stefan Walke 1, Robert Young 1§ , Johanna M. Avis 1 , Eric de la Fortelle 1, Veronica A. Raker 2, Reinhard Lührmann 2, Jade Li 1, and Kiyoshi Nagai 1‡
Estudi coimputacional de l’espicificació del llocs d’splicingTesi doctoral Moises Burset Alabarda
Electron Microscopy of U4/U6 snRNP Reveals a Y-shaped U4and U6 RNA Containing Domain Protruding from the U4 Core RNPBerthold Kastner, Montserrat Bach, and Reinhard LfihrmannInstitut for Molekularbiologie und Tumorforschung, Emil-Mannkopff-StraBe 2, D-3550 Marburg, FRGon 2004 www.jcb. from
BIBLIOGRAFIAThree-dimensional structure of C complex spliceosomes by electron microscopy.Jurica MS, Sousa D, Moore MJ, Grigorieff N.
Birney E, Kumar S, Krainer AR. Analysis of the RNA-recognition motif and RS and RGG domains: conservation in metazoan pre-mRNA splicing factors. Nucleic Acids Res. 1993 Dec 25;21(25):5803-16.
Ding J, Hayashi MK, Zhang Y, Manche L, Krainer AR, Xu RM. Crystal structure of the two-RRM domain of hnRNP A1 (UP1) complexed with
single-stranded telomeric DNA. Genes Dev. 1999 May 1;13(9):1102-15. Vitali J, Ding J, Jiang J, Zhang Y, Krainer AR, Xu RM. Correlated alternative side chain conformations in the RNA-recognition motif of
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1. Nucleic Acids Res. 2002 Apr 1;30(7):1531-8. Price SR, Evans PR, Nagai K. Crystal structure of the spliceosomal U2B"-U2A' protein complex bound to a fragment of U2 small nuclear RNA. :
Nature. 1998 Aug 13;394(6694):645-50. Oubridge C, Ito N, Evans PR, Teo CH, Nagai K. Crystal structure at 1.92 A resolution of the RNA-binding domain of the U1A spliceosomal protein
complexed with an RNA hairpin. Nature. 1994 Dec 1;372(6505):432-8. Kielkopf CL, Rodionova NA, Green MR, Burley SK. A novel peptide recognition mode revealed by the X-ray structure of a core U2AF35/U2AF65
heterodimer. Cell. 2001 Sep 7;106(5):595-605. Selenko P, Gregorovic G, Sprangers R, Stier G, Rhani Z, Kramer A, Sattler M. Structural basis for the molecular recognition between human
splicing factors U2AF65 and SF1/mBBP. Mol Cell. 2003 Apr;11(4):965-76.
PEM1. Quina de les següents afirmacions sobre l’spliceosoma és o són incorrectes? a) L’splicing en eucariotes és un procés ATP-depenent.b) L’splicing, gràcies a l’spliceosoma, ocorre en un sol pas.c) El tipus de reacció que es produeix a l’splicing són transesterificacions.d) Existeixen unes seqüències consens força ben conservades que delimiten els inicis i finals dels introns.e) Totes les anteriors són correctes.
2. Assenyala la resposta INCORRECTA. a) L’splicing està intimament lligat a la transcripció b) Existeixen certs mRNAs que autocatalitzen el seu splicing c) L’splicing és un procés que ocorre de manera aïllada de la resta de la cèl·lula. d) La complexitat de l’spliceosoma permet introduir punts de control a diferents nivells i augmentar així la seva precisió e) Totes són incorrectes
3. Sobre les proteïnes que intervenen en l’spliceosoma: a) Intervenen nombroses proteïnes (depenent de la font, entre 400 i 700)b) Formen una estructura dinàmica.c) Les dues anteriors.d) Estàn formades per complexes formats amb proteïnes i snRNAs.e) Totes les anteriors.
4. Sobre les diferents subunitats que formen part de l’spliceosoma: a) Les diferents subunitats (U1, U2, U4/6, U5) estan formades únicament per proteïnes.b) L’estructura denominada Sm es troba en moltes de les subunitats.c) Sm és un heptàmer que forma una estructura en forma d’anell.d) B i c són correctes.A i c són correctes
5. Respecte als dominis SR a) Són rics en arginines alternades amb serines b) Es creu que interaccionen entre ells seguint el model teòric de “polar zipper” c) Les dues anteriors són certes d) Interacionen amb seqüències específiques de RNA e) Totes les anteriors són certes
6) Els dominis KH (K homology): a) Presenten diferent topologia en eucariotes i en procariotes.b) Són un exemple curiós de com seqüències similars poden donar lloc a plegaments diferents.c) Tenen un loop de seqüència molt conservada i que és necessari per a la interacció amb RNA.d) El Factor d’splicing 1 (SF1) presenta un domini KH.e) Totes les anteriors són correctes. 7) Pel que fa a l’especificitat del reconeixement de RNA per part dels dominis KH: a) Tots els dominis KH interaccionen amb el RNA de la mateixa manerab) L’especificitat en el reconeixement d’un RNA concret sorgeix de la interacció amb varis complexes
ribonucleoproteïcs.c) Els dominis KH reconeixen una seqüència específica de deoxinucleòtids.d) A i b són correctes.e) Cap de les anteriors és correcta.
8) En relació al grau de coneixement de l’estructura de l’spliceosoma: a) Actualment es coneix a la perfecció tota l’estructura de l’spliceosoma amb totes les seves interaccions.b) Degut a la seva grandària, complexitat i nombre de subunitats, es fa molt difícil estudiar l’spliceosoma pel
que falten moltes coses per conèixer.c) Cada subunitat de l’spliceosoma té motius de plegament diferent, de tal forma que no es troba cap motiu
de plegament repetit.d) La grandària de l’spliceosoma facilita el seu estudi ja que és més fàcil dilucidar l’estructura de complexes
grans, més fàcils de purificar, que dels petits.e) No es té cap estructura per criomicroelectrografia electrònica de cap subunitat.
9) En relació als motius RRM (RNA Recognition Motif): a) És un motiu de plegament amb estructurca alfa/beta que només es troba en proteïnes de l’spliceosoma.b) És un motiu de plegament amb estructurca alfa/beta que es troba en moltes proteïnes que interaccionen amb RNA, com proteïnes de l’spliceosoma, de traducció, de transcripció...c) Els motius RRM no es fan servir per interaccions proteïna-proteïna, només per RNA-proteïna.d) Les proteïnes només poden tenir un motiu de plegament RRM ja que més d’un desestabilitzaria l’estructura global de la proteïna.e) Cap de les anteriors és correcte. 10) En referència al motiu estructural RRM (RNA Recognition Motif): a) Forma una estructura molt ben conservada formada per una fulla beta i dos hèlix alfa, on la fulla beta es situa en un costat i les hèlix a l’altre.b) Entre d’altres interaccions, són molt importants les interaccions anomenades d’stacking, en que intervenen residus aromàtics de la fulla beta del motiu amb bases del ARN.c) De la part conservada dels motius RRM, els més importants són dues hebres beta denominades RNP1 i RNP2.d) L’unió proteïna RRM – RNA és altament específica.e) Totes les anteriors són correctes.