manejo de ratones de laboratorio

8/18/2019 manejo de ratones de laboratorio

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USO Y MANIPULACIÓN DE Mus musculus TIPOBalb/c EN EL LABORATORIO: OBTENCIÓN DE

MACRÓFAGOS Y ESPLENOCITOS.

Llamuca, M., Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Departamento deCiencias de la Vida. Carrera de n!enier"a en #iotecnolo!"a. nmunolo!"a.

San!ol$u" – Ecuador. Marzo %&, '%().

RESUMEN

La e*perimentaci+n con animales de laoratorio, principalmente con ratones,-a sido undamental para los avances en el campo de la iomedicina / lanmunolo!"a. El presente ensa/o tiene como o0etivo principal conocer lat1cnica correcta de manipulaci+n del rat+n 2Mus musculus) tipo #al3c en ellaoratorio, / !racias a esto lo!rar la otenci+n, oservaci+n / cuanti4caci+nde macr+a!os / esplenocitos. En el presente ensa/o se -an desarrolladot1cnicas de manipulaci+n, v"as de administraci+n / necropsia en ratones delaoratorio mac-os de seis semanas de vida, cu/o peso tuvo una variaci+ndesde la primera semana -asta la se!unda con una reducci+n del (),'56.Posteriormente se otuvo macr+a!os del l"$uido peritoneal con medio 7PM(&8% / condiciones de incuaci+n de 9:;C / al )6 de C


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otained in t-e mouse A ).) = (% > &, mouse # '.') = (% > & in t-e mouse Cand (.) = (% > & cells 3 mL. Suse$uentl/ splenoc/tes o t-e spleen Basotained and t-e oservation Bas made in inverted microscope and cameracell count @euaer. Countin! splenoc/tes resulted avera!ed .:) = (% > ) cells3 mL.

e! "#r$s: mmunization, splenoc/tes, macrop-a!es.


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INTRODUCCIÓN.

La e*perimentaci+n con modelosanimales inici+ antes de los aHos(&%% / se utiliz+ para estudios de

anatom"a, 4siolo!"a e -istolo!"a.Actualmente, la investi!aci+n conanimales si!ue siendo de !ranimportancia en diversas ?reas deestudio, comoI investi!aci+n enc?ncer / enermedadesinecciosas, sanidad -umana /animal, desarrollo de procesosiotecnol+!icos, investi!aci+n!en+mica, neurociencias,

armac1utica / ensa/osinmunol+!icos 2JranadosKHi!a,'%(%. A pesar de la di4cultad $uerepresenta e*trapolar losresultados otenidos a -umanos,la e*perimentaci+n con animalesrepresenta varias venta0as, comoI?cil manipulaci+n, altaecundidad, a0o costo /reproduciilidad 2Sal!uero et al.,

'%%:.Mus musculus como modeloe*perimental La especie m?sutilizada en la investi!aci+ncient"4ca es el rat+n 2Musmusculus. Posee un pe$ueHotamaHo, peso adulto de ')K9% !. Elolato es mu/ desarrollado / tieneun sentido mu/ a!udo de laaudici+n / el tacto. Las unciones

de la cola son termorre!ulaci+n /e$uilirio. Son animales de -?itosnocturnos La determinaci+n delse*o se realiza oservando ladistancia anoK!enital, $ue en losmac-os suele serapro*imadamente el dole $ue enlas -emras 2Santos, s.f ..

El rat+n se su0eta con 4rmeza por

la ase de la cola / se coloca unasuper4cie ru!osa donde pueda

a!arrarse. Se pinza la piel delcuello con el pul!ar / el "ndice dela otra mano. A continuaci+n selevanta al animal / se atrapa lacola entre el dedo anular /

meHi$ue. El rat+n se dee su0etar4rmemente, con la 4nalidad de$ue no muerda al investi!ador2Hi!a et al., '%%(N Oedric-,'%%8.

Las v"as m?s comunes para laadministraci+n de sustancias sonIsucut?nea, intravenosa eintraperitonial. La v"a de

administraci+n peritoneal se aplicaen el cuadrante inerior derec-o oiz$uierdo del adomen. La 0erin!ase introduce con el isel -aciaarria, paralelamente a la columnaverteral, para evitar penetraci+nen las v"sceras, con (% respectoal adomen. Se recomiendaintroducir un volumen de -asta 9ml 2Oedric-, '%%8.

Se!n Hi!a et al. 2'%%( laeutanasia es el acto de sacri4caranimales mediante m1todos $ueinduzcan una inconsciencia r?pida/ muerte con m"nimo dolor /estr1s. Un m1todo de eutanasia esla dislocaci+n cervical, la cualproduce inconsciencia inmediata /muerte. En ratones se sitanpul!ar e "ndice a cada lado del

cuello 0unto a la ase del cr?neo o,de modo alternativo, se presionauna varilla 0unto a la ase delcr?neo, paralelamente con la otramano, se tira r?pidamente de laase de la cola, produciendo laseparaci+n de las v1rterascervicales / el cr?neo 2#anister et al., s.f .

Se!n StraussKA/ali et al. 2'%%:citado por Larocca 2'%(%, los


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macr+a!os son c1lulas delsistema inmune $ue poseencapacidad a!oc"tica / microicidaNpor lo tanto, desempeHan un rolimportante en la inmunidad antiK

inecciosa. Se derivan de losmonocitos de la san!re, despu1sde su mi!raci+n a trav1s deltorrente circulatorio. Son c1lulasespecializadas $ue se encuentranen la ma/or"a de te0idoscon0untivos / en +r!anos, comoI-"!ado 2c1lulas de QupRer,sistema nervioso central 2c1lulasmicro!liales / pulmones

2macr+a!os alveolares. Adem?sde in!erir microios, losmacr+a!os in!ieren c1lulasmuertas del an4tri+n, secretancitocinas, actan como c1lulaspresentadoras de ant"!enos 2CPA/ promueven la an!io!enia /4rosis 2Aas, Lic-tman Pillai,'%('.

Los Esplenocitos se!n Jarc"a2(558 los esplenocitos son c1lulasdel sistema inmune $ue seencuentran principalmente en elseno del azo. Se encar!an dereconocer / a!ocitar c1lulassan!u"neas enve0ecidas omalormadas / microor!anismos.

La c?mara de @euauer se empleapara el conteo de c1lulas en un

medio l"$uido. Est? adaptada almicroscopio de campo claro o decontraste de ases. Est? ormadapor un portao0etos de cristal encu/o tercio central se encuentrantres plataormas de las cuales lacentral, $ue est? situada %,( mmpor dea0o de las laterales,presenta una cuadr"culasudividida en 5 cuadrados de ( *

( mm cada uno 2( mm' . Paraacilitar el conteo celular, cada

cuadrado se divide nuevamente en(&. En la c?mara de @euauerme0orada el cuadrado central sedivide en ') cuadrados terciarios2Fuentes, CastiHeiras Tueralt+,

(55N 7amos Mart"nez, '%%.

El o0etivo del presente traa0o esaprender t1cnicas demanipulaci+n, v"as deadministraci+n de sustancias /necropsia en ratones delaoratorio, para posteriormenteotener macr+a!os alveolares, dela m1dula +sea, del l"$uido

peritoneal / esplenocitos del azo/ realizar el conteo celular enc?maras de @euaer.

MATERIALES Y M%TODOS.

M#$el# a&'(al

Se emple+ ratones de laoratoriomac-os de apro*imadamente seissemanas de vida, cu/o pesopromedio inicial ue de ().& !.Durante el per"odo dee*perimentaci+n los animales semantuvieron a0o condicionescontroladas de alimentaci+n, cu/adieta estuvo asada enzana-orias, !elatina sin saor /a!ua.

Ma&')*lac'+&

Para la manipulaci+n de losratones se emple+ la t1cnica derestricci+n a mano descrita enHi!a et al., '%%( / Oedric-,'%%8. En la 4!ura ( se oserva elm1todo de su0eci+n de los ratonesutilizado en los ensa/os.

Se su0et+ el rat+n por la ase de

su cola / se coloc+ en una re0illadonde pueda sostenerse. Se


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a!arr+ un plie!ue de piel en laparte posterior del cuello 2cerca delas ore0as. Se 40+ la piel Go0a a lolar!o de la espalda / la cola delrat+n. Se coloc+ al rat+n con el

lado ventral -acia arria / seatrap+ la cola entre el dedo anular/ meHi$ue.

F',*ra -. Manipulaci+n adecuada delrat+n. 2Llamuca, '%().

C#&r#l $e )es#

Se pes+ cada rat+n dos veces por

semana por un periodo de dossemanas. En la si!uiente 4!ura sepuede oservar el procedimientoempleado para determinar el pesode los ratones

I&(*&'ac'+&.

Mediante la v"a de administraci+nintraperitoneal se in/ect+apro*imadamente %,' ml de una

soluci+n tamp+n denominada P#S2P-osp-ate #uRered Saline.Posteriormente, se administr+ %,'ml de tio!licolato Guido deconcentraci+n 9% m! LK( mediantev"a intraperitoneal, con la 4nalidadde estimular los macr+a!os delrat+n. En la 4!ura ' se oserva laadministraci+n de tio!licolato.

F',*ra 0. nmunizaci+nintraperitoneal del rat+n contio!licolato. 2Llamuca, '%().

Necr#)s'a.

Se sacri4c+ ' ratones al azardespu1s de ) d"as de lainmunizaci+n con tio!licolato paraproceder a la e*tracci+n demacr+a!os / los otros 9 ratonesse los sacri4co a los d"asdespu1s de la inmunizaci+n.

Se realiz+ la eutanasia del rat+n

por dislocaci+n cervical. Se tomaal rat+n de la cola / se lo -aceestirar en una re0illa / con elman!o de istur" de orma verticalse -ace presi+n en un solomovimiento 0usto dea0o de lanuca para dislocar las v1rterascervicales. Una vez realizado elprocedimiento se compruea elreGe0o del o0o para con4rmar su

muerte.Posteriormente se realiz+ unadisecci+n del rat+n, con la4nalidad de oservar losprincipales +r!anos internos. See*tra0o el intestino, el azo, lospulmones / el coraz+n realizandocortes en las ases de los +r!anos.Para arir el cr?neo se realiz+ uncorte a nivel del -ueso occipital,

posteriormente se cort+ el nervioocular / se e*tra0o el cerero. Se

CA


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midi+ las dimensiones de los+r!anos.

F',*ra 1. Disecci+n anat+mica del Aadomen, # t+ra* / C cr?neo delrat+n. 2Llamuca, '%().

Obe&c'+& ! #bservac'+& $e(acr+2a,#s'&er)er'#&eal(e&e.

Se realiz+ un lavado peritoneal de' ratones al azar, $ue consisti+ enin/ectar. Se coloc+ el rat+n soreuna super4cie / se llen+ la cavidadperitoneal con (% ml de medio

7PM 2contiene LK!lutamina, uRerOEPES ')mM / icaronato desodio r"o. Se realiz+ cortes en elpela0e para e*poner el ?reaadominal / se recuper+ el l"$uidoin/ectado con la misma 0erin!uilla,a continuaci+n se verti+ en unaca0a Petri / se adicion+ medio7PM resco. Se lleva a incuaci+ncon )6 de C


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otener ra!mentos pe$ueHos. Acontinuaci+n se 4ltr+ el medio conuna !asa en tuos Falcon. Se llev+los tuos a centriu!aci+n a ('%%rpm por minutos a una

temperatura amiente. Deido a$ue e*iste contaminaci+n por!l+ulos ro0os se aHadi+ el uRerlisis / se realiz+ aspiracionessucesivas por minuto, lue!o secentriu!+ nuevamente por (%minutos. A continuaci+n, seelimin+ el sorenadante / el pelletue resuspendido en )ml de medio7PM. Se tom+ (% Wl del medio / se

dilu/+ en 5% Wl de azul rip?n. Pararealizar el conteo se emple+ unac?mara de @euauer. Se coloc+ (%Wl de esta diluci+n en el ori4cio dela c?mara, para distin!uir lasc1lulas vivas de las muertas. Secoloc+ la c?mara de @euauer enel microscopio +ptico a 8% / seprocedi+ a realizar el conteo deesplenocitos. En la si!uiente 4!ura

se ilustra las re!iones de lac?mara.

F',*ra 6. C?mara de @euauer2Llamuca, '%().

El conteo de c1lulas puederealizarse en los cuadrados (,' +9. En cada caso se aplicar? una+rmula para la determinaci+n dela concentraci+n celular. Se calcul+la concentraci+n de c1lulasmediante la si!uiente +rmulaI

C .C =Total decélulas contadas

¿decuadrados

DondeI

C.C.X concentraci+n celular, F.D.Xactor de diluci+n, Vo Xvolumen4nal.

Se coloc+ una concentraci+ncelular de )*(%& esplenocitos enuna al"cuota de '%% uL en cincopocillos de una P5& /posteriormente se llev+ almicroscopio invertido para la

oservaci+n de esplenocitos.

RESULTADOS

Pes#s $e l#s ra#&es

Los pesos de los ratones setomaron a los d"as %, ), : / ('. Enla si!uiente tala se oserva elpeso promedio de los ratonesdurante las dos semanas dee*perimentaci+n.

Pes# $e ra#&es vs. T'e()#

N#.ra+

&

T'e()#e& $7as

Pes# ra+&8,9

$'s('&*c'+

&A % ()

) (9,' (',%%

# % (8,&

) (),): (9,

(' (',: (9,%(

C % (9,5

) (8,9

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(' (',) (%,%:

D % (:

) (8,8 (),'5

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) (&,): (),9


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(' (9,5 '&,%&

T#al

Pr#(e$'#'&'c'al:(),&

(),'5

Tabla-. Cuadro de los dierentespesos de los ratones dentro de las dossemanas del e*perimento.

En el !r?4co ( se muestra el pesopromedio de los ratones durante elper"odo de e*perimentaci+n. Seoserva el mismo patr+n decrecimiento $ue en el an?lisis delpeso individual.

Gr; ) (%%

6 9 &%

? 9 &%-0 % %

Tabla 0. Sorevivencia de los ratonesdurante las dos semanas del ensa/o.

% ) (% ()

((

S*)erv've&c'a

T'e()# 8$7as9

N@(er# $e ra#&es

Gr;


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DISCUSIÓN

Se!n Sori!uer L+pez 2(5&citado por Medarde 2'%(9 elcomportamiento social de losratones var"a notalementedependiendo de la disponiilidadde recursos alimenticios. Cuandola disponiilidad de alimento esaundante, los ratones tienden aormar !randes !rupos donde elcomportamiento a!resivo no esrecuente. Adem?s, e*istendierencias de comportamientoentre mac-os / -emras, siendolos mac-os m?s territoriales /a!resivos.

En el presente ensa/o todos losratones ueron sacri4cados pordislocaci+n cervicalN por lo tanto,no se oserv+ muertesocasionadas por comportamientoviolento, a pesar de $ue todos los

ratones eran mac-os.Proalemente, no presentaronconductas violentas deido a $uela disponiilidad de alimento /espacio ue adecuada para cadauna de las especies. El pesoapro*imado de un rat+n de &semanas de vida es de ()K(!2Pierce, '%%5. El peso promedioinicial de los ratones ue de ().&!

2ala (, lo cual est? dentro delintervalo estalecido por lailio!ra"a. Sin emar!o, si seanaliza el peso inicial de cadarat+n -asta la ltima semana dele*perimento, se puede determinarclaramente $ue el peso promediode los ratones presenta unavariaci+n, con una reducci+n del(),'56. Se!n 7oitt 2'%%, el

tio!licolato es un est"mulo noinmunol+!ico $ue induce la

activaci+n de los macr+a!os / larespuesta inmune en el rat+n. Porlo tanto, la disminuci+n de pesooservada est? asociada con elestr1s ocasionado en los ratones

deido a la inoculaci+n detio!licolato. Adem?s, Yonas 2(5:&citado por Fuentes 2s.. de4ne $ueotros actores comoI edad, se*o,constituci+n !en1tica, nutrici+n,e*posici+n al amiente / mane0osanitario, producen camios en elestado 4siol+!ico de los ratones delaoratorio, $ue conducen a unincremento o p1rdida de peso.

Se oserv+ $ue los +r!anosinternos de los ratones estaan enuenas condiciones a e*cepci+ndel intestino, /a $ue se oserv+$ue los ratones restantes al d"a ('presentaron inGamaci+n delintestino del!ado a nivel del Zleon,adem?s las -eces ueron de coloranaran0ado. Se!n Velasco,

2'%(', la inGamaci+n causada enel intestino del!ado, impide laasorci+n de componentesimportantes de los alimentos,raz+n por la cual se produ0o laperdida e*cesiva de peso. El daHoa la mucosa del intestino provienede una reacci+n a la in!esti+n de!luten, $ue se encuentra en eltri!o, la ceada, el centeno, /posilemente la avena, / enalimentos elaorados con estosin!redientes. Esto adem?socasiona la alta de asorci+n denutrientes deido a un daHo en lasvellosidades intestinales. Por lotanto, los animales resultandesnutridos sin importar cu?ntoalimento consuma. Este trastornoes m?s comn en los or!anismosde raza lanca.


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Se determin+ las dimensiones delazo, intestino, coraz+n, pulmones/ cerero, /a $ue se!n Hi!a etal. 2'%%( son los +r!anos dema/or inter1s en las

investi!aciones iom1dicas. Lasmedidas de los +r!anos ueronseme0antes entre los dos ratonesanalizadosN al i!ual $ue lasmedidas del cerero. 2ala 9.

Se!n Mart"nez 2'%% e*istenmuestras de esplenocitos totalesaislados mediante la mismat1cnica de esta pr?ctica, $ue dan

como resultado ')*(%&

esplenocitos3mL. Sin emar!o enlos resultados otenidos seoserv+ una concentraci+npromedio de ,:)=(%>)2C1lulas3mL esplenocitos viales.Proalemente una de las causas$ue inGuenci+ en estos resultadoes $ue no se emple+ condicionestotalmente est1riles durante el

procedimiento 2Porras et al.,'%%9. Adem?s deido a la alta depr?ctica de los estudiantes, eltiempo de preparaci+n de lac?mara de @euauer con lasuspensi+n celular, para llevarla almicroscopio +ptico ue mu/ lar!o,pudiendo ocurrir lisis celular.

CONCLUSIONES

El rat+n 2Mus musculus es elmodelo animal m?s empleado enla investi!aci+n iom1dica. Laaplicaci+n correcta de t1cnicas demanipulaci+n, v"as deadministraci+n / necropsia,ase!ura en !ran parte la 4ailidadde los procedimientos /resultados.

Los ratones se encontraan enuen estado al empezar ele*perimento, pues su pesopromedio ue de ().&!, el cualest? dentro del ran!o aceptale

se!n ilio!ra"a.

Los ratones se mantuvieron a0ocondiciones controladas / nopresentaron comportamientosa!resivos, por lo $ue no seoserv+ otras causas de muerte, aparte de la dislocaci+n cervical.Este patr+n se oserva en el!r?4co ', pues la sorevivencia se

mantiene constante -asta los d"asdonde se sacri4caron los ratones.El comportamiento no a!resivo delos ratones se e*plica en !ranparte a $ue no ten"an $uecompetir entre ellos por conse!uiralimento, pues diariamente se lessuministr+ la cantidad adecuada.

Los animales restantespresentaron presentaron

inGamaci+n del intestino del!ado anivel del Zleon al 4nal dele*perimento, producto de lainadecuada alimentaci+n.

Los macr+a!os son c1lulas $ue sead-ieren a la super4cie donde secultivan. Se pudo oservarmacr+a!os en el microscopioinvertido, con un conteo celular

otenido en el rat+n A de),)=(%>&, en el rat+n # de',')=(%>& / en el rat+n C de(,)=(%>& c1lulas3mL.

Al realizar el conteo deesplenocitos en la c?mara de@euauer, se oserv+ un promediode c1lulas viales de ,:)=(%>)c1lulas3mL. Los resultados noesperados se atriu/en a alta dee*periencia en los estudiantes / a


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$ue no se realiz+ el procedimientoa0o condiciones est1riles.

RECOMENDACIONES

Los ratones de e*perimentaci+ndeen mantenerse en un ioterioa0o condiciones est1riles /controladas.

El investi!ador dee tomar lasmedidas de iose!uridadpertinentes al manipular ratones,como el uso de !uantes / mandil.

Las t1cnicas de manipulaci+ndeen ser empleadas conprecisi+n para evitar mordeduras ocomportamientos violentos delrat+n.

El trato -acia los animales delaoratorio dee ser respetuosoaplicando los principios de#io1tica, por e0emploI la t1cnica dedislocaci+n cervical dee serr?pida para provocar una muertecon el m"nimo surimiento a laespecie.

Los procedimientos detallados enel presente ensa/o deen serrealizados en una c?mara de Gu0olaminar, con la 4nalidad de tenerun medio as1ptico / de $ue no-a/a intererencias $ue podr"an

aectar los resultados. As" tami1n,para prote!er la salud delinvesti!ador.

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