Manejo Ecologico de Suelos-5

8/14/2019 Manejo Ecologico de Suelos-5

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ManejoEcdgicodeSudos /

Estudio de la asociacin simbitica Rhizobium -leguminosa - hongo micorrtico para la produccin de

inoculante doble de uso agrcola en ArequipaGuillermo Zvietcovich M.; Gloria Nieves C.

Alcides Claveri Q.; Luis Miguel C.

IntroduccinEl actual sistema de agricultura basado en el uso intensivo d e agroqum icos,en vez d e solucionar los problem as del ham bre y la pobreza, viene produ-ciendo deseq uilibrio econm ico en los medianos y pequeos agricultores,sum ndos e a esto la carencia de capitales, desembocando en la dism inu-cin d e los ingresos de los peque os p roductores, jornaleros y comunida-des campesinas que trabajan en la agricultura de subsistencia.Con el propsito de promover el desarrollo de la agricultura sostenibleadoptando alternativas tecnolgicas que estn al alcance de todos los agri-cultores, que mantengan y10 recuperen la capacidad productiva de la tie-rra, es conveniente utilizar al m xim o los mecanism os de la fertilizacinbiolgica promovida por la doble asociacin simbitica Rhizobium - egu-min osa -h on go micorrtico, a travs de la cual es posible obtener un buensuministro de nitrgeno, notable absorcin del fsforo en suelos pobresutilizados para cultivos de legu m inos as y para m ejorar el uso del suelo.


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U na im portante cualidad de las legum inosas es su capacidad para fijar ni-trg eno a tn ~o sf ric o l asociarse con bacterias del gnero Rhizohiurn, ra-zn por la cu al se las incluye en rotacin con cultivos de cereales y otrasno leguminosas como recuperadoras de fertilidad. Adems de esta cuali-da d, las legumino sas tambin se asocian en forma simbitica con lasm icorrizas; so n asociacione s simbiticas entre hongos Zygomycetes y ra-ce s de las legum inosas. Permiten a stas una mayor absorcin de fsforo,agu a y otros nutrientes, adem s el hongo libera hormonas d e crecim iento,colabora en la formacin de agregados del suelo, etc.

En el presente trabajo se realiza una recopilacin de los resultados inhe-rentes a este tema. Los mism os com prenden la observacin cualitativa ycuantitativa de micorrizas nativas en distintas zonas de nuestro pas quepresenten deficiencias de fsforo y la experimentacin en condicionescontroladas y d e campo sobre el comp ortamiento de los hongos m icorrticosfren te a su co-sim bionte, el Rhizobium en leguminosas.

Mater ia le s y mtodosS e realizaron ensayos en laboratorio, invernadero y campo de agricultoresdurante la cam paa 1993/94.Para la preparacin del inoculante doble (Rhizobium-hongo micorrtico)s e utilizaron tres componentes: turba, la bacteria de la leguminosa y elhon go micorrtico vesculo-arbuscular (HMAV). Estos compo nentes fue-ron m anejados primero separadam ente, para luego combinarlos.La turba procedi de las alturas del distrito de Chivay, con las siguientescaractersticas: materia orgnica 30%, la capacidad de absorcin de aguaes cerca del 100% y el pH es de 5,8. Para utilizarla fue secada al aire yneutralizada hasta un pH de 6,3 con carbonato de calcio al 3%. La turbaneutralizada es molida, cernida y fraccionada en cantidades de 200 g depo lvo seco por bolsa de polietileno; fue esterilizada en un au toclave a 121Cdurante d os horas.


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La seleccin de cepas de Rhizobium es llevada a cab o en tres fase s. En laprimera se estudi la infectividad de las cepas en plantas crecidas en siste -m as estriles en jarras Leon ard en solario . En la segunda, la nod ulaci n yfijacin de nitrgeno fue determinad a en el invernadero mediante el conte-nido de nitrgeno en la parte area de las plantas crecidas en m acetas dePV C con suelo (Silvester-Bradley, 1 987). Con los resultados d e la fase 1 yla fase 2, se realiz una pre-seleccin de cepas para finalme nte valida rlasen e nsayos de cam po en Arequipa, C usco y Puno ; con alfalfa, frijol y habadura nte varias cam paas. En base a estos resultados, fueron sele ccion ado slas mejores cepas SEM IA 135 (Brasil) para alfalfa, CIAL 65 2 (Colom bia)para frijol y USDA 2488 (U SA ) para haba, tomando en cuenta su eficie n-cia, virulen cia y efectividad.Para determ inar la presencia del hongo micorrtico s e aislaron las esporaspresentes en el suelo adyacente a las plantas de alfalfa, frijol y haba. Po rla tcnica de sep aracin y flotacin s e clasific y enumer por sus c arac-tersticas morfolgicas y pigmentarias, siguiendo la clave de Mosse yBow en (1 968 ). Para cuantificar la colonizacin m icorrtica, las races delas plantas (tres por cabecera de parcela) de 1 - 1,5 g de peso fresco, secortaron en trozo s de 1 cm de longitud. S e le realiz una decoloracin decontenidos celulares vegetales y coloracin diferencial de las estructu rasdel hongo hospedado. Luego se calcul el porcentaje de raz colonizadamed iante la tcnica de interseccin de lnea. M ediante ensayos en inver-nadero y cam po se determin que las esporas vacuolada amarilla y casta-a rojiza laminada micorrizaban naturalmente y aparecieron con m s fre-cuencia.La multiplicacin de las cepas de Rhizobium seleccionadas se efectu en unmedio conteniendo glicerol como fuente de azcar en un fermentador adaptadopara 25 litros de volumen y conteniendo biol (bioabono lquido) que estimula eldesarrollo y crecimiento de las plantas. Para inocular la cepa madre se leprecultiv durante 5 das, en un Erlenmeyer con medio Balatti modificado, a 150rotaciones por minuto. Con 150 m1 de esta suspensin madre se inocula elfermentador y se deja de 15 a 20 das.


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La mu ltiplicac in de los hongos micorrticos s e hizo en un medio nu tritivoen Agar C zapek m odificado, en placas Petri, incubadas a una temperaturade 20 a 25C por un perodo de ocho a quince das. Al cabo de este tiemp ose observ el crecimiento d e colonias claras blanco amarillentas y castaorojizas. De las placas anteriores, con la escuadra de Kolle se extrajeron colo-nias de hongos y s e transfirieron a matraces Erlenmeyer de medio litro, quecontenan 300 m1 de medio de cultivo lquido de Watson; en este medio secolocaron granos de trigo esterilizados y cocinados para que los hongos infes-ten en un perodo de doce das a una temperatura de 25C y agitndolosdiariamen te a fin de asegurar su fraccionamiento y aireado ade cuado. Enestas condiciones los Erlenmeyer fueron guardados a temperatura amb ien-te, asegurndose un inculo con hongos especficos de comprobada efi-ciencia y com pletamen te puros q ue servirn para realizar los estudios deinteraccin con las cepas de Rhizobium sp .La preparacin del inoculante doble se inici cu ando las cepas de Rhizobiumalcanzaron la fase estacionaria de su crecimiento (15 dias de fermentacin,con una concentracin de 1O' clulas por m1 de ca ldo), la turba prev iamenteesterilizada y preparada fue colocada en bolsas de polietileno de 0,002 mmde porosidad por 200 gramos e inmediatamente inyectada con 20 m1 decaldo fermentado con rizobias especficas y mezclado con el medio lquidode W atson que contiene las colonias de los hongos micorrticos vesculo-arbusculares, im pregnacin suficiente por cada bolsa de inoculante slido.En estas condiciones el inoculante fue dejado madurar a temperatura am-biental d e 7 a 10 das. El producto final fue almacenad o en una cm ara fraa 10C para te ner una mayor sobrevivencia del Rhizobium como de loshongos micorrticos (Royughley, 1967).Para obtener resultados ms precisos, se evalu el inculo doble en inver-nad ero con los suelos del campo de agricultores, sin poblacin natural deRhizobium y cuyas caractersticas se observan en el Cuadro 1.Esta tierra fue mezclada con arena de ro lavada y previamente esterilizada enautoclave, en una relacin volum trica de 5:2. Con este substrato se llenaron


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macetas en las cuales se sembraron separadam ente semillas de alfalfa, fijo1 yhaba; desinfectadas previamente con bicloruro d e m ercurio al 0, l %. En elmomento de la siembra se distribuy el inculo fungo-rizobial, 20gp or maceta,suspendido en biol. Se evaluaron 5 tratamientos: 1- testigo sin inocular; 2-3-4-5y 6 con semilla inoculada con hongo micorrtico vesculo-arbuscular y rizobiaespecfica para cada legum inosa. El riego se realiz diariamente y sem anal-mente con 10 m1 de biol al mismo pH del suelo por maceta. A los 60 das sehicieron observaciones de nodulacin. Las plntulas se llevaron a 105C hastapeso constante para obtener datos de peso seco. Al mismo tiempo se deter-min el nmero y t ipo de esporas como el porcentaje de colonizacinmicorrtica.

Cuadro 1.- Caractersticas de los suelos empleados en los diferentes ensa-yos.

Node Lqpr Tdma fl MO. N. total P.disponible(Olsen)rtnEstm e4 (O? ) @ P ~ I

Finalmente, se llevaron a cabo ensayos de campo en las tres zonas de dondeprovenan las bacterias y los hongos m icorrticos seleccionados. Se emple undiseo de b loques al azar distribuido en parcelas de 100 metros cuadrados, concinco lneas de 6 metros de largo distanciadas 0 ,70 m en caso de frijol y haba;para alfalfa se sembr en pozas. El cultivar y los tratamientos fueron iguales alos sea lados en el ensayo en invernadero.


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:es de establecer el cultivo y despus de la cosecha se obtuvieron muestras,~ ie lo ara determinar la presencia de los Rhizobium especficos, el num eroipo de esporas presentes. S e tomaron tres sistemas radicales completos de

d a parcela para determ inar el porcentaje de colonizacin.

Resultados y discusinEn el cuadro 2 se puede observar que existe un paralelismo entre el ciclo devida del hospedante y del endofito, de manera tal que las sucesivas estructu-ras fngicas observadas: micelios enrollados, arbsculos y vesculas, apare-cen como una respuesta a los estmulos recibidos de la planta hospedante ydel medio.

Cuadro 2.- Colonizacin micorrtica de los cultivares de leguminosas.

Cultivar Lugar Estado Estructuras Colonizacinreproductivo observadas %l * 2* 3*Aresuipa:AlfalfaFrijolHahaCusco:AlfaltaFrijolHabaPuno:AlfalfaFnjd

-- Haba

MajesLaBoyaSanCamilo

HumcondoCalcaH m

IchuAsUuniw1* Micelios enrollados2 * Arl>sculos3 * Vesculas


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Si observamos los estados reproductivos menos avanzados (R2 y R3) existemayor porcentaje de vesculas que son rganos de almacenam iento fngico,en tanto que en estados reproductivos ms avanzados (R5 y R6) los arbsculosestn en su mximo desarrollo, proporcionando al vegetal una mayor superfi-cie de intercambio.Com o resultados de la interaccin Rhizobium-leguminosa-hongo micorrtico,bajo c iertas condiciones, es posible aum entar el nmero d e esporas medianteuna seleccin y manejo de cultivares y cepas de rizobios. Esto es til debido aque los HMAV reproducidos "in vitro" son relativamente costosos, pero tam -bin muy efectivos.Se ha comprobado que existe una estimulacin por parte d e los rizobios espe-cficos sobre los HMAV debido a la liberacin de sustancias ex tra celulares(Gaillard, 1984). Esta caracterstica puede emplearse para seleccionar espe-cies de HMAV mediante la aplicacin de inoculantes rizobiales especficos.

Cuadro 3.- Resultados del ensayo en invernadero.

Tratamiento Peso seco Colonizacin Nmero de Nodulacin(g) (%) esporas en

100 m1 de sueloSin inocular 2,31 a 25 a 42 a Nulainoculado con SEMIA 135 4,30 b 46 b 102 a Excelenteinoculado con CIAT 652 3,34 ab 35 a 76 a Excelenteinocuiado con USDA2488 3,25 ab 38 b 43 a MuyBuena

En el cuadro 3 se observa los diferentes parmetros evaluados para determi-nar diferencias entre las cepas de rizobios usados en la inoculacin. Los trata-mien tos con igual letra no presentan diferencia significativa entre s (P


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Mari*EcvI@iw de Suelos/

cen a la colonizacin y reproduccin micorrtica. La nodulacin y el peso secototal tam bin se vieron favorecidos.Respecto al tipo de esporas predominantes, fueron nuevamente castaa rojizalaminada y vacuolada amarilla, observndose adems otro tipo, ssil y m ucila-ginoso, qu e no fue hallado antes de la seleccin del HMAV.

Cuadro 4.- Porcentaje de esporas obtenidas en el ensayo en invernaderobajo condiciones controladas.

Tipo de espora Sin inocular Inoculado con las cepasSemia 135 CiAT 652 USDA 2488

Vacuolas amarillasVacuolas bulbosasReticuladas blancasReticuladas bulbosasCastaarojiza lamuiadaPedicelo bulbosoCrenadaEmbudifonneSsil mucilaginosoNo clasificada

Los resultados en el campo, mostrados en el cuadro 5 , fueron s imilares. Nueva-mente las cepas de Rhizobiun? aparecen como estimulantes de la colonizacinradicular y la m ultiplicacin del HMAV en conjunto con las races, mientras laplanta adquiere un aumento en la tasa de asimilacin de fsforo, nitrgeno yotros nutrientes inorgnicos.


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Cuadro 5.- Resultados del ensayo en cam po.

Tratamiento Nmero de esporas despus de la Colonizacincosecha radical (%)

Sin inocularSEMIA 135CIAT 652USDA 2488

Conclusiones

Los cultivos de alfalfa, fiijol y haba son susceptibles de ser miconizados encondiciones naturales en los suelos deficientes en fsforo disponible, siendoel rango de colonizacin entre 55 y 77 %.Se comprob una estimu lacin de la colonizacin y multiplicacinmicorrtica po r cep as d e Rhizobium como las estudiad as en estetrabajo de investigacin (R. m eliloti, R. phaseoli y R. leguminosarum).Con el inoculante doble Rhizobium - hongo micorrtico vesculo-arbuscular es posible m ejorar la disponibilidad de nitrgeno, fsforo,potasio, azufre, zinc y otras sales inorgnicas. Adems, los miceliosde los hongos protegen a la raz contra las infecciones provocadaspor una g ran variedad de ag entes patgenos originados en el suelo.Por su bajo costo y por ser un producto garantizado, es una buena altema-tiva para los pequeos y medianos agricultores que pueden utilizarlo paracultivar leguminosas en terrenos pobres en nitrgeno y fsforo.


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Bibliografa

Gaillard, J. 1984. IFS Work, Mycorrhiza and Forestation. International Foundation forScience - IES Sibyllegatan.47, S- 11442. Stockholm. Sweden.Gonzles, S.; Pacheco B.,J.C.; Piantanida N. 1983. Actas VI1 Reunin Tcnica Nacio-nal de Soja. E29-E35, 1983. INTA-Castelar.

Mosse y Bowen. 1968. Tcnica de separacin y flotacin de esporas en hongosmicomticos para reconocimiento taxonmico.Roughley, R.J.; Vincent, J.M. 1967 . Grow th and surv ival of Thizobium spp in peatculture. J. Appl. Bact. 30,362-376.Sylvester-Bradley, R.; Kipe-Nolt, J. 1987 . Simbiosis Leguminosa Rhizobio; Manualde M todos de Evaluacin, Seleccin y Manejo. CIAT. Cali, Colombia.Watdyanatha, U.,P. 1987 . Effect of endomycorrhiza on growth and nutrient uptake inrubber and leguminous ground covers. Rubber Research Institute. Dartonfield,Agalawatta. Sri Lanka.

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