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Los microorganismos como todo sistema biológico tiene un ciclo de vida limitado por lo que cuando las condiciones ambientales se muestran adversas mueren o en algunos casos generan estructuras de resistencia para pasar a un estado latente (ej. esporas). Cuando no es posible mantener los cultivos microbianos en las condiciones optimas para su crecimiento es momento de considerar las técnicas para la preservación de estos. La conservación de cepas se divide comunmente en 3 tipos, a corto plazo, cuando el periodo a preservar es de dias o semanas, a mediano plazo, de semanas a meses, y , a largo plazo, de meses y años.

Dentro del material común para manipular a los microorganismos se encuentran las agujas y asas inoculadoras que son usadas para transferir microorganismos asépticamente de un medio de cultivo a otro. Ambos (agujas y asas) pueden consistir de un mango, tallo y ensamble, los cuales sostienen un alambre que puede ser de níquel-cromo o platino. Si el alambre esta derecho (o recto) es una aguja inoculante; y si esta en forma de doblada es un asa inoculante. Antes de cualquier uso el extremo del alambre debe esterilizado pasando lentamente a través de la punta de la flama de un mechero Bunsen. Se esteriliza correctamente el alambre cuando este cambia a color rojo por efecto del calor. Después de cada uso de la aguja o asa inoculante debe ser completamente esterilizado en la flama, los microorganismos son transferidos desde un medio de cultivo a otro por sub-cultivo, usando procedimientos específicos y técnicas asépticas.

Después de que ha habido crecimiento del microorganismo que se desea preservar en agar en tubo inclinado, la superficie interna del tubo es cubierta asépticamente con el aceite estéril. La superficie del aceite mineral puede ser de 0.5 a 1.0 cm. de espesor sobre el agar. El tubo cubierto de aceite puede ser almacenado a temperatura ambiente. Varios géneros puede ser almacenados por de esta manera (por ejemplo: Bacillus, Proteus, Pseudomonas, y Streptococcus) aunque hay otros que no (por ejemplo: Azotobacter y Leuconostoc).

Introducción

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Práctica 5Preservación de Cepas y Métodos de Cultivos.

Que el alumno se familiarice con las técnicas de transferencia de cultivos, el instrumental microbiológico y las formas comunes de preservación de cepas.

Objetivo

En otros casos hay géneros que no necesitan aceite mineral para lograr periodos largos de mantenimiento. Como E. coli y otros miembros de la familia de Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa pueden ser satisfactoriamente almacenados por años a tempera-tura ambiente. Aunque el mejor de los modos para preservar muchos cultivos puros de microorganismos por periodos largos es por “liofilización” (secado en frió). Este método elimina la necesidad de transferir periódicamente y reduce la posibilidad de que ocurran mutaciones en los cultivos puros. En la liofilización, las bacterias son suspendidas en una solución estéril de algún medio protector como: leche, suero, o lactosa al 3%. Pequeñas cantidades de la suspensión espesa son transferidas a viales y rápidamente enfriadas en una mezcla de hielo-seco/ alcohol. La suspensión enfriada es secada al vació mientras aun se enfría en el vial sellado. Este sello diseca (o deshidrata) al cultivo y a menudo puede ser almacenado por años.

A. Usando un plumón o (marcador de cera), marque los tubos o placas que van a ser inoculados con fecha, nombre del alumno y el nombre del microorganismo.

B. Mezcle suavemente el tubo del cultivo primario para suspender homogéneamente en todo el tubo a las bacterias. El tubo puede estar tapado para usar el vortex y suspender a los microorganismos.

C. Colocar el tubo de cultivo puro (tubo con cultivo stock) y el tubo a donde va a ser inoculado (tubo con medio nuevo) en la palma de la mano y afianzar con el dedo pulgar. Los tubos son separados en forma de “V” en la mano; esto puede ser sostenido en un ángulo que al abrirlos no estén en posición vertical y expuestos directamente a corrientes contaminantes de aire del laboratorio.

D. Usando la otra mano pase por la flama del mechero la punta del asa inoculadora hasta que el asa cambie a color rojo.

E. Usando la misma mano que está sosteniendo el asa remueva las tapas de los tubos, sosteniéndolas entre sus dedos y suavemente flamee la boca (o cuello) de los tubos. Nunca caliente los tubos hasta que sea doloroso sostenerlos.

F. Enfrié el asa en el agar del tubo que va a ser inoculado y sáquela. Con el asa estéril transfiera una gota del tubo con el cultivo puro al interior del tubo nuevo. En este punto uno puede transferir la muestra de cultivo puro a un portaobjetos (6a), a la superficie de agar de un tubo inclinado (6b) o una caja petri (6c).

G. Flamee nuevamente la boca de los tubos.H. Tape los tubos I. Flamee otra vez la punta del asa inoculante. y a menudo puede ser almacenado por años.

Método

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Práctica 5Preservación de Cepasy Métodos de Cultivos

Práctica 5Preservación de Cepasy Métodos de Cultivos

Materiales y Equipos

1. Técnica aséptica para siembra

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Asa inoculadoraAguja inoculadora Mechero BunsenCultivos de 24 horas de caldo nutritivo y tubo inclinado con agar nutritivo de E. Coli. Tubos inclinados con agar Nutritivo Tubos hondo con agar Nutritivo Marcador o crayón de cera Incubadora

Figura 2.- Técnica aséptica para resiembra de bacterias.

2. Usando la técnica aseptica realice:

3. Reporte

Cuestionario

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A. Con el asa, transfiera a E. coli del cultivo en caldo Nutritivo a un tubo inclinado con agar Nutritivo y un tubo con caldo

Nutritivo.

B. Con la aguja inoculadora transfiera E. coli a un tubo hondo con agar Nutritivo. Esto se hace sumergiendo la aguja con

el inoculo dentro del tubo sin tocar las paredes de este. Penetrando el medio a 2/3 partes del fondo y la aguja es retirada

del tubo (figura 3 a, b y c).

C. Usando el asa hacer una transferencia de tubo a tubo inclinado. Esto se hace rayando suavemente la superficie del

tubo inclinado en forma de serpiente parecido a una S (figura 3d).

D. Colocar los tubos en una gradilla e incubarlos a 35 °C por 24 a 48 horas. Después de este tiempo examinar todos

los tubos para ver la presencia de crecimiento bacteriano. El crecimiento es indicado por la turbidez en el cultivo del

caldo; en el cultivo de tubo inclinado por la apariencia de un color de naranja a rojo; y solo se aprecia una línea de

inoculación en el tubo hondo.

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Figura 3.- Técnica de transferencia

Agar hondo de NutritivoTubo inclinado con agar NutritivoCaldo de Nutritivo

CrecimientoTipo de cultivo Contaminación

1. ¿Cuál es el propósito del flameo en la técnica aséptica?

2. ¿Cuál es el propósito del subcultivo?

3. En el subcultivo ¿Cuándo se usa el asa inoculadora?

4. ¿Cómo es posible la contaminación de un subcultivo?

Referencias

1.Harley, J., Prescott, L. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw−Hill . 5th Edition. EUA.

2.Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª edición. Prentice Hall. USA.

3.Prescott, H. K. Microbiología. 4ª. Edición. McGraw Hill.

Schiegel, G. Microbiología General. Editorial Omega. España.

Práctica 5Preservación de Cepasy Métodos de Cultivos

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