-
UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL FRANCISCO DE MIRANDA
REA CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MEDICINA
U.C. MICROBIOLOGA I
MANUAL DE TRABAJOS PRCTICOS DE MICOLOGA
MDICA REALIZADO POR: Profa. LEYLA HUMBRA DE HEYLIGER
SANTA ANA DE CORO, 2011
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
1
NORMAS DE BIOSEGURIDAD E INDICACIONES A SEGUIR PARA EL
TRABAJO
PRCTICO EN EL LABORATORIO DE MICOLOGA
Las tcnicas de laboratorio realizadas para la identificacin de
los hongos, deben
llevarse a cabo cumpliendo con todas las normas de bioseguridad
establecidas, para
evitar la contaminacin tanto del ambiente como del personal
encargado del
procesamiento. Es por ello que se deben cumplir las siguientes
normas:
1. El uso de la bata es de carcter obligatorio.
2. Lavar las manos con agua y jabn antes y despus de cada
actividad prctica.
3. No se debe ingerir alimentos ni bebidas en el
laboratorio.
4. Mantener apagado el mechero cuando no est en uso, a fin de
evitar
quemaduras o calor excesivo.
5. Los productos inflamables (alcohol, ter, etc.) deben
mantenerse alejados de la
llama del mechero.
6. NUNCA se debe oler el cultivo de un hongo. Los hongos
difieren de las bacterias
en que muchos de ellos producen gran nmero de esporas, que
pueden
diseminarse en el aire y ser inhaladas. Los cultivos de hongos
filamentosos
(sobre todo los agentes causales de micosis sistmicas cuya va de
transmisin
es la inhalatoria) han de ser manipulados en el interior de una
cabina de
seguridad biolgica clase II, sin excepciones.
7. Es permisible el manejo de los cultivos de levaduras en la
mesa del laboratorio
pero deben ser tratados como material infeccioso.
8. Los cultivos de hongos deben ser sellados con cinta adhesiva
para evitar la
contaminacin del laboratorio y deben ser esterilizados en
autoclave o bien
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
2
eliminarlos en los recipientes adecuados para residuos
sanitarios grupo III o de
riesgo.
9. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del
laboratorio.
10. Cualquier accidente como derrame de reactivos, cortes y
quemaduras, deben
comunicarse inmediatamente al Profesor.
11. El orden y la limpieza son esenciales en todas las
experiencias de laboratorio.
En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a
limpiar
cuidadosamente el rea de trabajo y descartar el material
utilizado envases
dispuestos para tal fin. Todo material contaminado con material
biolgico
(lminas portaobjetos, puntas desechables) debe ser descartado en
envases
adecuados que contengan hipoclorito de sodio al 0,5% u otro
desinfectante
antes de ser lavado o eliminado.
Indicaciones:
1. Antes de cada prctica el profesor dar una breve introduccin y
una
demostracin del trabajo a realizar.
2. Antes de realizar una actividad prctica, el alumno debe haber
ledo con
anterioridad el material correspondiente a la misma. No comience
a trabajar
hasta que no haya entendido con claridad las instrucciones. Ante
cualquier duda
consulte al profesor.
3. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como
lupas y
microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o
el forzar sus
mecanismos.
4. Los alumnos debern asistir a la actividad prctica equipados
con: la gua
prctica, fsforos, tirro y lpices de colores.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
3
5. Los alumnos no podrn cambiarse de turno o grupo despus de
estructurada la
nmina de estudiantes para cada laboratorio e iniciado los
trabajos prcticos.
6. Los alumnos deben asistir a la prctica en el horario que les
corresponde
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
4
El microscopio es un instrumento muy necesario para el
microbilogo, ya que
permite la observacin de organismos que no pueden ser apreciados
en detalle a
simple vista, es decir, los microorganismos. Existe una gran
variedad de microscopios
que, segn la fuente de iluminacin utilizada, se agrupan en:
MICROSCOPIOS PTICOS: La fuente de iluminacin es la luz. Pueden
ser:
- De campo claro: Permiten la observacin de preparaciones en su
color natural
contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo ms
brillante.
- De campo oscuro: Permiten la observacin de formas celulares
que se
destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se
consigue utilizando
diafragmas especiales.
- De contraste de fases: Gracias a la utilizacin de diafragmas y
objetivos
especiales, que consiguen aumentarlas diferencias en el ndice de
refraccin de las
clulas y el medio que las rodea, permiten la observacin de
clulas vivas, ya que no
es necesario realizar ninguna tincin de las mismas.
- De interferencia: Permiten observar clulas vivas sin teir,
obtenindose una
imagen en relieve de las mismas.
- De fluorescencia: La fuente de iluminacin proporciona luz
ultravioleta que
excita ciertas molculas presentes en las clulas (bien de forma
natural o aadidas a la
preparacin) que emiten fluorescencia en el espectro visible.
MICROSCOPIOS ELECTRNICOS: La fuente de iluminacin es un chorro
de
electrones y las lentes son electroimanes. Pueden ser:
- De transmisin: Permiten la observacin de muestras teidas con
sustancias
que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar
a lminas finas,
denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles
directamente por lo que stos
se envan a una pantalla que emite fluorescencia ms o menos
intensa segn el
nmero de electrones que inciden en ella. Las estructuras
celulares que se tian ms
intensamente impedirn el paso de electrones y por lo tanto no
permitirn la emisin de
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
5
fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecern oscuras en
un fondo ms
brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos.
- De barrido: Permiten la observacin de clulas enteras, sin
necesidad de cortes
finos, de modo que aparecen los relieves originales y las
superficies externas. Alcanzan
entre 1.000 y 10.000 aumentos.
Durante las prcticas de micologa y parasitologa se emplear el
microscopio
ptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecnicos,
de iluminacin
y pticos) se muestran en la figura 1.
Parte Mecnica: Constituida por:
a. Tubo: Soporta la parte ptica, tiene una longitud variable,
segn el fabricante, en
su parte superior se encuentra el ocular y en la inferior el
revlver con la serie de
objetivos.
Figura 1: Partes de un microscopio ptico.
http://cienciasept.blogspot.com/2008/09/caza-de-tesoros-1.html
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
6
b. Columna o Brazo: Une el tubo con el pie, sta es la parte por
la que se debe
tomar el microscopio para transportarlo.
c. Revlver: Es el extremo inferior del tubo donde estn colocados
los objetivos
tienen movimientos de rotacin alrededor de su eje.
d. Platina: Sobre ella son colocadas las preparaciones. Es plana
y presenta un
orificio central que permite el paso de los rayos luminosos,
posee pinzas que aseguran
la inmovilidad de las preparaciones y un carro provisto de dos
tornillos para
desplazarlas en direccin lateral y antero-posterior, con lo cual
se logra visualizar toda
la preparacin.
e. Tornillo Macromtrico: Mueve la platina hacia arriba y hacia
abajo.
f. Tornillo Micromtrico: Permite enfocar con precisin.
g. Pie: Sirve de base al microscopio y tiene el peso suficiente
para dar estabilidad
al aparato.
Parte ptica: Constituida por:
a. Fuente de luz: Puede ser un espejo mvil con dos caras: una
plana que se
utiliza para la iluminacin con luz solar y otra convexa para luz
artificial. Su funcin es
dirigir los rayos luminosos hacia el eje ptico.
b. Condensador: Se encuentra colocado exactamente en el eje
ptico del
microscopio, su finalidad es condensar la luz en un punto sobre
la platina, donde va a
ser colocado la preparacin. Est constituido por un
diafragma-iris para controlar la
cantidad y el ngulo de los rayos luminosos y por un sistema de
lentes. Posee un
aparato enfocador, que consiste en un pin y una cremallera, que
permiten bajar y
subir el condensador.
c. Objetivos: Son tubos que contienen en su interior un sistema
de lentes de
diferentes aumentos, adems genera una imagen real e invertida
del objeto. Los
microscopios suelen tener 3 o 4 objetivos colocados en la parte
inferior del tubo. Los
objetivos pueden ser:
- Secos: Son los que no necesitan interponer ninguna sustancia
entre el
objetivo y la preparacin. La preparacin y la lente estn
separadas por aire
(lupa, 10x-40x).
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
7
- Inmersin: En ellos se interpone un lquido entre la preparacin
y la lente
(aceite de inmersin, 100x).
d. Ocular: Es una lente situada cerca del ojo del observador.
Ampla la imagen del
objetivo. Su misin es captar y ampliar la imagen proporcionada
por los objetivos. Un
microscopio puede tener uno o varios oculares: monocular,
binocular o trilocular.
Actualmente se utilizan los binoculares porque son ms cmodos y
tienen mejor
calidad de imagen.
Manejo del Microscopio ptico
1. Ajustar la iluminacin del campo de tal forma que ste quede
bien iluminado,
para lo cual se coloca el objetivo de menor aumento, se abre
todo el diafragma-iris y se
sube totalmente el condensador.
2. Montar la preparacin sobre la platina, fijarla de tal modo
que el centro de la
preparacin coincida con el orificio central de la platina por
donde pasarn los rayos
luminosos.
3. Observar lateralmente y con el tornillo macromtrico, bajar el
tubo hasta que el
objetivo de menor aumento quede muy cerca de la preparacin.
4. Observar por el ocular, subir lentamente el tubo con el
tornillo macromtrico
hasta que aparezca la preparacin y aclarar la imagen con el
tornillo micromtrico. Si
una vez obtenida la imagen, la iluminacin es muy intensa, sta
puede disminuirse
cerrando el diafragma-iris del condensador hasta que su margen
sea igual al tamao
del lente posterior del objetivo. Con los objetivos secos, el
condensador debe estar
abajo y el diafragma no muy abierto.
5. Al encontrar una parte del campo que merezca mayor anlisis de
detalles, se
cambiar para un aumento mayor de la siguiente manera:
a. Centrar en el campo la parte que desea estudiar, ya que al
cambiar el
objetivo, el campo se reduce y se corre el riesgo de que el
objeto quede fuera
del mismo.
b. Girar el revlver hasta que el objetivo de mayor aumento
seleccionado quede
en la posicin indicada.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
8
c. Enfocar la preparacin con el micromtrico si no se ha movido
el tubo y con
el macromtrico si este se movi, procediendo de la misma forma
que para el
enfoque con menor aumento.
d. En la medida que se incrementan los aumentos, la cantidad de
luz requerida
va siendo mayor por lo que debe corregirse el diafragma-iris y
el
condensador.
Cuando se desea utilizar el objetivo de inmersin (100x), se
procede de la
siguiente manera:
a. Abrir el diafragma-iris y subir al mximo el condensador.
b. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la
preparacin.
c. Colocar el objetivo de inmersin en su posicin efectiva,
siguiendo el eje
ptico.
d. Bajar cuidadosamente el tubo por medio del tornilllo
macromtrico, bajo
control visual lateral externo, hasta que el objetivo entre en
contacto con el
aceite de inmersin, sin tocar la lmina.
e. Observar a travs del ocular y enfocar con mucho cuidado con
el tornillo
micromtrico hasta que sea posible ver bien la preparacin.
Despus de utilizar el microscopio ptico se deber proceder de la
siguiente
manera:
1. Apagar la lmpara
2. Quitar la lmina.
3. Bajar la platina.
4. Colocar el objetivo de menor aumento.
5. Mover el carro para que quede en la posicin correcta.
6. Desconectar el cable que alimenta de corriente a la
lmpara.
7. Limpiar los oculares y los objetivos.
8. Colocar el forro.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
9
PRACTICA NMERO 1: CULTIVOS FNGICOS
OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad
de:
Diferenciar los diferentes tipos de medios de cultivo.
Diferenciar el crecimiento de levaduras y mohos en medios de
cultivo en
placa y en tubo.
Sealar los pasos para realizar un microcultivo.
Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio
ambiente: aire
agua y tierra.
MEDIO DE CULTIVO
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de
microorganismos
es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el
laboratorio. Al conjunto de estas soluciones lquidas o slidas
que contienen los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos
se les conoce como
medio de cultivo.
El medio de cultivo es aquella solucin que cuenta con los
nutrientes necesarios
para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los
microorganismos (bajo condiciones
favorables de temperatura y pH, exento de todo microorganismo
contaminante), as
como efectuar pruebas de susceptibilidad.
Los medios de cultivo pueden clasificarse:
Segn su consistencia:
a. Lquidos
b. Slidos
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
10
Los medios lquidos son infusiones preparadas bien sea colocando
carne picada
en agua o disolviendo en esta un extracto de carne
comercializado, no llevan ninguna
solucin solidificante. Contienen protenas, factores esenciales
de crecimiento y
oligoelementos. A estos medios se les pueden aadir otros
nutrientes como peptonas y
glucosa as como cloruro de sodio y un tampn de pH.
Los medios slidos estn constituidos por un medio lquido ms una
solucin
gelificante, como el agar en polvo que se disuelve por
ebullicin, que los solidifica.
Pueden ser trasvasados en tubos o placas de Petri. Estas ltimas
son recipientes de
vidrio o plstico transparente con una tapa y ofrecen una gran
superficie para la
siembra.
Segn su aporte nutritivo:
a. Bsicos
b. Complejos
Los medios bsicos contienen las sustancias mnimas para el
crecimiento de
hongos metablicamente no exigente. Pueden contener agar o no
dependiendo si se
quieren slidos o lquidos, respectivamente; peptonas, glucosa.
Deben poseer un pH y
una osmolaridad adecuada para la multiplicacin de los hongos.
Estos medios tambin
pueden ser utilizados como base en la preparacin de otros medios
como los
enriquecidos, selectivos, entre otros.
Los medios enriquecidos pueden contener suero, sangre o factores
esenciales
especficos como vitaminas o cofactores para el crecimiento de
hongos exigentes en
requerimientos nutritivos y que no crecen bien en los medios
bsicos.
Segn su finalidad:
a. Medios de aislamiento: Utilizados para el aislamiento de
levaduras por la
tcnica de agotamiento, han de ser slidos. Ejemplo: Agar
Sabouraud, Agar
Lactrimel
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
11
b. Medios selectivos: Son aquellos que permiten la recuperacin
de un
hongo en especfico e inhiben el crecimiento de otro. Ejemplo,
Sabouraud con
clicoheximida (inhibe hongos contaminantes como Aspergillus,
etc).
c. Medios selectivos diferenciales: son aquellos medios
utilizados para
recuperar o aislar un hongo en especfico, por ello, para
diferenciar las distintas
colonias, se les aade sustancias que confieren un color
diferente a las colonias
segn la distinta actividad metablica. Para este propsito se
utilizan azcares
como el manitol, la lactosa, sorbitol y otros, junto a un
indicador de pH como rojo
neutro, azul de bromotimol, etc. Ejemplo. CHROMagar Candida
utilizado en la
identificacin de Candida albicans, Candida krusei y Candida
tropicalis.
Los medios de cultivo utilizados en micologa contienen
nutrientes suficientes
para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrgeno,
vitaminas,
oligoelementos, etc). El pH ligeramente cido tiende a facilitar
el crecimiento de los
hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros
microorganismos.
A los medios de cultivo se les puede aadir antibiticos
antibacterianos para
inhibir el crecimiento de las bacterias saprfitas que suelen
contaminar las muestras.
Los ms usados son el Cloranfenicol y la Gentamicina. Se aade
tambin actidiona
(Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos saprfitos
ambientales. Los medios
cuya composicin contengan actidione no debe ser utilizados para
el aislamiento de
Cryptococcus neoformans, ya que inhiben su crecimiento.
Entre los medios ms empleados en la Micologa se encuentran:
Medio Sabouraud Dextrosa (SAB):
Contiene un 2% de glucosa y es ligeramente cido (pH=6.9), se
considera el
medio estndar para recuperar y mantener una amplia variedad de
hongos que pueden
aislarse en el laboratorio de micologa clnica. Es el medio
estndar para observar la
morfologa tpica de los hongos, pero no es el medio ideal de
crecimiento o para
estudiar la esporulacin. Permite el crecimiento de actinomicetos
aerobios. Se utiliza
indistintamente en tubo o en placa.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
12
Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina:
Es el medio Sabouraud clsico con la incorporacin de los
antibiticos
Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi
todos los hongos
filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran
mayora de bacterias.
Se utiliza en tubo o en placa.
Agar Lactrimel de Borelli:
Se emplea para favorecer la produccin de pigmentos y la
esporulacin de la
mayora de dermatofitos. Contiene harina de trigo, leche
descremada en polvo, agar,
miel y antibitico.
Los medios de cultivo pueden ser preparados en placa o en tubo.
Los medios en
placa tienen la ventaja de ofrecer mayor superficie para el
aislamiento pero, para
soportar la deshidratacin durante el largo perodo de incubacin a
que van a ser
sometidos (un mes o ms), has de contener una gruesa capa de
medio (25 a 40 ml).
Son ms peligrosos a la hora de su manipulacin y fciles de
contaminar. Mientras que
los medios en tubo tienen una superficie de trabajo mucho ms
pequea, pero ofrecen
mxima seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la
deshidratacin y a la
contaminacin. (Figura 2 y 3)
A la hora de elegir un medio de cultivo adecuado se debe tener
en cuenta el tipo
de muestra y los microorganismos fngicos que requieren ser
aislados. Si la muestra
Figura 2: Medio de cultivo en
placa de Petri.
Figura 3: Medio de cultivo en tubo
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
13
procede de zonas presuntamente contaminadas, es fundamental
incluir, junto a los
medios normales, medios que contengan sustancias inhibitorias de
bacterias y hongos
saprofitos (cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida).
Tanto la muestra como las placas y tubos que se van a sembrar
deben
manipularse por medidas de seguridad y para evitar
contaminaciones ambientales, los
cultivos con crecimiento micelial (temperatura ambiente) de
Histoplasma capsulatum,
Paraccoccidioides brasiliensis y Coccidioides posadasii o C.
immitis deben ser
manipulados en campana de flujo laminar. Han de rotularse
adecuadamente, con el
nmero de la muestra y la fecha en que se realiza la siembra. Las
placas se precintan
con cinta de parafilm, en la que se realizan un par de
aberturas, y los tubos se dejan
con el tapn de rosca a medio cerrar (para mantener la
aerobiosis).
Para realizar un cultivo fngico, generalmente los especmenes se
colocan sobre
la superficie del medio de cultivo y se conservan a temperatura
ambiente (26 a 27 C);
en caso de micosis sistmicas, es mejor a 30-37 C. Las levaduras
se siembran con
tcnica de agotamiento en placa. Los pelos y escamas se disponen
en fragmentos en
diferentes puntos de la superficie del medio. En lquidos, heces
y pus se deben
sembrar aproximadamente 0,5 a 1,0 ml por tubo. Las levaduras se
desarrollan en 24 a
48 horas, los contaminantes en dos a cuatro das y la mayora de
los hongos
patgenos requiere una a dos semanas o hasta un mes para su
crecimiento.
La identificacin de los hongos se basa en el examen macroscpico
de la
colonia y en sus caractersticas microscpicas. Semejanzas
macroscpicas como la
forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la
produccin de pigmentos
son muy tiles para la identificacin (cuadro 1). En los medios de
cultivo las levaduras
forman colonias hmedas, cremosas, opacas o pastosas, y los
hongos filamentosos
producen colonias algodonosas, lanosas o pulverulentas.
En general, la morfologa microscpica de los hongos es estable y
presenta
pocas variaciones. La identificacin definitiva se basa en la
forma caracterstica,
mtodo de produccin y ordenamiento de las esporas, siendo tambin
importante
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
14
conocer el tamao y la disposicin de las hifas en el caso de los
hongos filamentosos,
en los levaduriformes se observa la presencia de blastoconidias,
seudohifas,
clamidosporas. (Cuadro 2)
CARACTERSTICAS
MACROSCPICAS
HONGO FILAMENTOSO
HONGO LEVADURIFORME
COLOR
Colonia
Reverso
Pigmento del medio
TAMAO DE LA COLONIA
Dimetro
ASPECTO
Aterciopelada,
algodonosa,
pulverulenta
Cremosa
Cuadro 1. Descripcin macroscpica de los hongos
CARACTERSTICAS MICROSCPICAS
HONGO FILAMENTOSO
HONGO LEVADURIFORME
MICELIO
HIALINO
SEPTADO
OBSERVACIN DE BLASTOCONIDIAS,
SEUDOHIFAS Y CLAMIDOSPORAS
ASEPTADO
DEMATIACEO
SEPTADO
ASEPTADO
GRUESO
DELGADO
PRODUCCIN, TAMAOY DISPOSICIN DE LAS
CONIDIAS
DEPENDIENDO DE LA ESPECIE
Cuadro 2. Descripcin microscpica de los hongos
La preparacin del material para la observacin microscpica puede
realizarse
en fresco, con cinta de celofn adhesiva o mediante cultivo en
lmina o microcultivo.
PREPARACIN EN FRESCO
Este procedimiento es el que se utiliza en la mayora de los
laboratorios, ya que
las muestras se preparan con facilidad y rapidez y adems permite
identificar muchas
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
15
de las especies de hongos ms frecuentes. El mayor inconveniente
de la observacin
en fresco es que se puede alterar el ordenamiento caracterstico
de las esporas al
presionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no
es vlido en los casos
en que es necesario conocer la disposicin de las esporas.
Se realiza empleando el procedimiento descrito a
continuacin:
1. Seleccionar una colonia aislada.
2. Calentar el asa en aguja (al rojo vivo) para esterilizar,
dejar enfriar.
3. Extraer un fragmento de la colonia que contenga adems un poco
de agar en
la parte inferior.
4. Depositar el fragmento extrado sobre un portaobjetos en el
cual, previamente,
se ha depositado una gota de azul de lactofenol.
5. Cubrir con un portaobjeto y presionar suavemente para
dispersar la colonia y
el agar; de esta forma, la muestra est disponible para su
observacin al
microscopio.
PREPARACIN CON CINTA DE CELOFN ADHESIVA
Es un mtodo rpido para observar microscpicamente los mohos sin
alterar el
arreglo de sus conidias.
Una de las desventajas es que si la cinta transparente no se
presiona con
suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra
no es adecuada, ya que
al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no
se pueden identificar.
En los casos en que mediante este mtodo no se observen esporas
deber
realizarse la preparacin en fresco.
El procedimiento se lleva a cabo como sigue:
1. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lmina
portaobjeto.
2. Cortar un pedazo de cinta adhesiva transparente (2 a 3 cm) y
fijarlo a un asa
en aguja.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
16
3. Colocar la cinta sobre la superficie de la colonia de moho,
haciendo presin.
4. Colocar la cinta sobre la lmina, cubrir con una
laminilla.
5. Observar al microscopio.
MTODO DE MICROCULTIVO (Mtodo de Riddel):
Tambin llamado cultivo en lmina. Este cultivo se realiza una vez
recuperado el
hongo del espcimen clnico. Es til para la identificacin de
especies de hongos
filamentosos (exclusivamente).
La tcnica de microcultivo se realiza de la siguiente manera:
1. Introducir en una placa de Petri un papel absorbente, una
varilla de vidrio en
forma de U y una lmina portaobjeto. Esterilizar con calor
seco.
2. Tomar una placa de Petri con agar Sabouraud o Lactrimel y
bajo condiciones
de esterilidad cortar con un bistur cuadros de 1 cm. de lado y
colocar uno de
ellos sobre la lmina portaobjeto previamente esterilizada en el
paso 1.
3. Inocular en el centro de los cuatro lados del agar con el
hongo en estudio y
colocar encima una laminilla o lmina cubreobjeto (Figura 4).
4. Humedecer el papel absorbente con aproximadamente 5 ml de
agua destilada
estril, para evitar desecacin.
5. Incubar a temperatura ambiente. La colonia crecer por debajo
de la
superficie del cubreobjeto. Se examina el montaje peridicamente
a simple
vista para determinar si la colonia ha crecido o se haya
contaminado, se deja
por un lapso mnimo de 15 das.
6. Cuando es evidente el crecimiento, se retira cuidadosamente
el cubreobjeto
con pinzas estriles y se coloca en un portaobjeto que contiene
una gota de
azul de lactofenol. Si se desea un montaje permanente, se limpia
la superficie
del portaobjeto e inmediatamente adyacente al borde del
cubreobjeto se
aplica esmalte para uas color claro.
7. Observar las dos lminas preparadas al microscopio ptico.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
17
HONGOS CONTAMINANTES
Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayora saprfitos,
hallndose
libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgnica en
descomposicin. Las
condiciones necesarias para que un hongo crezca en una
superficie son: existencia de
esporas, base nutriente, humedad y temperatura entre 4 y 38
oC.
El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado y
edificios puede
producir en sus habitantes determinadas patologas entre las que
cabe destacar asma
y alveolitis alrgicas. La contaminacin ambiental por hongos en
el medio ambiente y
en interior de edificios, es debida bsicamente a hongos
filamentosos y levaduras.
Procedimiento para el aislamiento de hongos contaminantes
Aire:
Materiales: Placa de Petri con medio de cultivo Sabouraud o
Lactrimel.
Las placas sern expuestas en diferentes ambientes (cerrados y
externos),
mediante 2 procedimientos:
Inculo del hongo a los
cuatro lados del cubo de
agar
Cubo de agar
Lmina
cubreobjeto
Varilla de vidrio en
forma de U
Lmina Portaobjeto
Placa de Petri
Figura 4: Placa de microcultivo. Tomado de
Arenas. Micologa Mdica Ilustrada.
McGrawHill. Mxico. 2003
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
18
a. Captura por sedimentacin:
1. Rotular una placa de Petri con el nmero del equipo de
trabajo, profesor,
turno, fecha y lugar.
2. Destapar la placa y dejarla abierta por 10 minutos.
3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la
prxima
actividad prctica.
b. Captura por choque sobre la superficie de agar:
1. Rotular una placa de Petri con el nmero del equipo de
trabajo, profesor,
turno, fecha y lugar.
2. Destapar la placa y agitarla 10 veces.
3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la
prxima
actividad prctica.
Agua:
Materiales: Un tubo con tapa de baquelita, estril; 1 placa de
Petri con Agar
Sabouraud o Lactrimel, pipeta Pasteur, hisopo estril o asa de
siembra.
1. Recolectar aproximadamente 10 ml de agua (poceta, filtros,
entre otros.
Segn le indique el profesor), con la ayuda de la pipeta Pasteur
y
colocarlos dentro del tubo con tapa de baquelita estril.
2. Rotular el tubo con el nmero del equipo de trabajo, profesor,
turno, fecha y
lugar.
3. Sembrar la muestra en una placa de Petri con medio Sabouraud
o
Lactrimel segn le indique el profesor.
4. Rotular la placa con el nmero del equipo de trabajo,
profesor, turno, fecha
y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de
la misma.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la prxima
actividad
prctica.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
19
Tierra:
Materiales: 1 placa de Petri vaca y estril, 1 placa de Petri con
medio de cultivo
Sabouraud o Lactrimel, 1 baja lengua estril, 1 tubo con tapa de
baquelita que
contenga 1 ml de solucin salina fisiolgica (estril).
1. Recolectar la tierra con baja lengua estril y colocarla en la
placa de Petri
estril, vaca.
2. Llevar al laboratorio. Agregar una porcin de tierra con la
ayuda de un baja
lengua estril dentro del tubo que contiene 1 ml de solucin
salina
fisiolgica (SSF), mezclar para homogeneizar.
3. Agregar esta mezcla (Tierra+SSF) en la superficie de la placa
de Petri con
agar Sabouraud o Lactrimel.
4. Rotular la placa con el nmero del equipo de trabajo,
profesor, turno, fecha
y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de
la misma.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la prxima
actividad
prctica.
Luego de la incubacin por una semana a temperatura ambiente,
realizar el
estudio macroscpico de las colonias aisladas (a simple vista),
anotando: color,
presencia de pigmento, textura, bordes de la colonia. Realizar
tambin el estudio
microscpico a travs del reconocimiento de las especies por medio
de la
morfologa de las esporas.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
20
ACTIVIDAD PRCTICA:
1. Describa las caractersticas macroscpicas de un hongo
filamentoso y de un
hongo levaduriforme en medio de cultivo preparado en tubo y en
placa de Petri,
siguiendo el siguiente esquema:
CARACTERSTICAS
MACROSCPICAS
HONGO FILAMENTOSO
HONGO LEVADURIFORME
COLOR
TAMAO DE LA COLONIA
ASPECTO
2. Describa las caractersticas microscpicas de un crecimiento
micelial y uno
levaduriforme en lminas proporcionadas por el profesor,
siguiendo esquema.
Dibuje las estructuras observadas.
CARACTERSTICAS MICROSCPICAS
HONGO FILAMENTOSO
HONGO
LEVADURIFORME
MICELIO
PRODUCCIN, TAMAOY DISPOSICIN DE LAS
CONIDIAS
3. Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio
ambiente: aire, agua y
tierra.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
21
PRCTICA NRO 2: INMUNODIAGNSTICO DE LAS MICOSIS.
OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad
de:
Sealar la importancia de las pruebas inmunolgicas en el
diagnstico de
las micosis que afectan al hombre en nuestro medio.
Interpretar las pruebas de intradermorreaccin (IDR) en el
diagnstico de las
micosis.
Describir e interpretar la tcnica de Inmunodifusin Doble (IDD)
en el
diagnstico de las micosis.
Correlacionar los resultados obtenidos de la impresin clnica, el
diagnstico
epidemiolgico, las pruebas intradrmicas y la serologa para
realizar un
diagnstico adecuado de las micosis sistmicas.
INMUNODIAGNSTICO DE LAS MICOSIS
El diagnstico de las micosis se realiza mediante el estudio
micolgico, el cual
consiste en la realizacin del examen directo de muestras clnicas
y el aislamiento e
identificacin de los agentes etiolgicos en los medios de
cultivos. Sin embargo, en
ausencia de una muestra clnica representativa, como es el caso
de algunos pacientes
con micosis sistmicas, es de gran ayuda los datos epidemiolgicos
y la aplicacin de
otras tcnicas diagnsticas, tales como estudios inmunolgicos, los
mismos evalan
tanto la respuesta celular y humoral del paciente.
INMUNIDAD CELULAR
Se estudia mediante la reaccin de la hipersensibilidad retarda
de tipo IV; estas
son reacciones inflamatorias las cuales se caracterizan por una
infiltracin
principalmente con fagocitos. Estas reacciones se estudian
haciendo uso de las
pruebas intradrmicas (IDR) utilizando antgenos obtenidos a
partir de diferentes
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
22
formas (micelial o levaduriforme) de los hongos causantes de las
micosis. El antgeno
se inyecta en volumen de 0,1 c.c., por va intradrmica, en la
cara anterior del
antebrazo (Figura 5) y la reaccin se observa a las 48 horas. Se
considera positiva si
se obtiene una induracin igual mayor de 5 mm. de dimetro.
(Figura 6)
Figura 5: Colocacin intradrmica de antgenos
fngicos.
Figura 6: Lectura de prueba intradrmica.
Tcnica de Sokal
La IDR se utiliza bsicamente en estudios epidemiolgicos, para
investigar la
existencia de infeccin subclnica en una poblacin y rara vez como
orientacin
diagnstica, ya que una reaccin positiva de 5 mm. de dimetro o
ms, significa que la
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
23
respuesta inmunitaria del paciente est intacta y slo seala
exposicin al agente. Por
el contrario, una reaccin negativa no necesariamente excluye
infeccin y se puede
observar en pacientes con casos de micosis diseminadas, lo que
indica un estado de
anergia de la respuesta inmunitaria celular. La IDR se considera
una prueba auxiliar en
el diagnstico, pronstico y valoracin del estado inmunitario de
los pacientes con
micosis sistmicas.
Las pruebas intradrmicas ms utilizadas en nuestro medio son las
siguientes:
Candidina:
Antgeno obtenido a partir de la levadura Candida albicans.
Resulta positiva en
quienes han tenido contacto previo con el hongo; no indica
enfermedad; en adultos la
positividad es de 60%. En casos diseminados puede ser
negativa.
Esporotriquina:
Antgeno obtenido a partir de la forma levaduriforme de
Sporothrix schenckii. En
presencia de lesiones clnicas la esporotriquina es diagnstica en
un alto porcentaje de
los casos. Las pruebas positivas perduran por aos en sujetos que
viven en zonas
endmicas; un resultado positivo en personas sin antecedentes de
enfermedad sugiere
contacto previo con el hongo, probablemente por va pulmonar, por
lo que es til en
estudios epidemiolgicos. Resulta negativa en ausencia de
infeccin o en pacientes
anrgicos.
Histoplasmina:
Glicoprotena que se prepara a partir de la forma micelial de
Histoplasma
capsulatum. Una respuesta positiva indica infeccin presente o
pasada. Es positiva en
50 a 80% en personas que habitan reas endmicas. Una respuesta
negativa a la
histoplasmina puede traducir una ausencia de infeccin o un
estado anrgico del
paciente, ya sea por una histoplasmosis diseminada o por la
presencia de alguna
enfermedad intercurrente.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
24
Paracoccidioidina:
Se prepara a partir de la forma micelial y levaduriforme de
Paracoccidioides
brasiliensis. Se utiliza en estudios epidemiolgicos y para
evaluar la respuesta del
organismo al tratamiento sobre todo en aquellos casos en los
cuales la respuesta a la
paracoccidioidina antes del tratamiento fue negativa.
Coccidioidina:
Existen dos tipos de antgenos fabricados a partir de
Coccidioides posadasii o C.
immitis utilizados en el estudio de hipersensibilidad retardada.
La esferulina, fabricada a
partir de las esfrulas y la coccidioidina a partir de la forma
filamentosa o micelial del
hongo. Es positiva 2 a 3 semanas despus del inicio de los
sntomas y puede persistir
durante aos. En pacientes sintomticos la positividad a la IDR se
considera de buen
pronostico; mientras que su negatividad se traduce en una
inadecuada respuesta
celular, anergia y por lo tanto, mal pronstico.
INMUNIDAD HUMORAL
La inmunidad humoral en las micosis se estudia mediante tcnicas
ideadas con
el fin de revelar in vitro las interacciones especficas que
tienen lugar cuando se
mezclan antgenos y anticuerpos homlogos en proporciones
adecuadas.
Las tcnicas de laboratorio usadas en la seccin de micologa para
el estudio de
la inmunidad humoral del paciente son: pruebas de
inmunoprecipitacin tales como
inmunodifusin doble (IDD), inmunoelectroforesis y
contrainmunoelectroforesis;
pruebas de aglutinacin de partculas de ltex, fijacin de
complemento (FC) e
inmunoanlisis enzimtico (IAE).
La tcnica IDD se fundamenta en los principios de doble difusin
descritos por
Oudin y Ouchterlony. Consiste en la determinacin de anticuerpos
especficos contra
extractos antignicos de los hongos causantes de micosis, los
cuales migran hasta un
punto, en el que interaccionan originando bandas de
precipitacin, que son
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
25
evidenciadas mediante tincin de protenas. La especificidad de
esta banda se
corrobora comparando la banda producida por el suero del
paciente con la originada
por el suero de referencia; si ambas se fusionan formando un
arco continuo, se
produce la llamada lnea de identidad, que se traduce en un
resultado positivo,
poniendo en evidencia que el paciente posee anticuerpos
especficos contra el
antgeno en estudio. Si la banda del suero del paciente se
contina con la del suero
control pero sin fusionarse por completo, se denomina banda de
identidad parcial,
originada porque los anticuerpos del suero de paciente
reaccionan en una forma
incompleta con los antgenos fngicos y puede deberse a reacciones
cruzadas con
fracciones antignicas comunes a varios hongos. La banda de
identidad parcial no se
interpreta como positiva, pero debe considerarse realizar otras
pruebas
complementarias como la fijacin de complemento o inmunoanlisis
enzimtico para
evaluar la especificidad de los anticuerpos. Por otra parte, si
no se produce banda de
precipitacin en el suero del paciente o si esta se entrecruza
con la del suero de
referencia (banda de no identidad), constituye un resultado
negativo (Figura 7).
Procedimiento de la IDD:
1.- Enumerar lminas portaobjetos limpias y secas (25x75mm) con
lpiz de
diamante.
Lneas de identidad Lneas de no
identidad
Lneas de identidad
parcial
Figura 7. Reacciones de Identidad, identidad parcial y no
identidad
usando suero control. Tomado de:
http://www.monografias.com/trabajos911/interaccion-antigeno-
anticuerpo/interaccion-antigeno-anticuerpo.shtml.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
26
2.-Adicionar a cada lmina 3 ml de agarosa fundida al 1%
(preparada con agua
destilada) y dejar solidificar a temperatura ambiente.
3.- Labrar en el gel el diagrama para IDD (Figura 8), orificio
central de un (1) mm
de dimetro para el antgeno y seis orificios perifricos de cuatro
(4) mm de
dimetro para los sueros a ensayar.
4.-.Agregar 40 l de los sueros controles y sueros de los
pacientes a evaluar,
seguidamente agregar 10 l de antgeno, en los pozos
correspondientes.
5.- Colocar las lminas en cmara hmeda (placa de Petri con papel
de filtro
humedecido con agua destilada), por 24 horas a temperatura
ambiente y luego
por 24 horas a 4 C. Luego de transcurrido este tiempo realizar
la lectura
preliminar.
6.- Sumergir las lminas en solucin de Citrato Trisdico al 5% por
90 minutos.
7.- Lavar las lminas con agua de chorro y sumergirlas en placas
de Petri
conteniendo Solucin Salina Fisiolgica 0,85% (volumen suficiente
que cubra
por completo la lmina) durante 48 horas (cambiando la solucin
tres veces al
da).
1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
1
Figura 8. Diagrama para Inmunodifusin Doble con sueros de
referencia en el estudio de micosis subcutneas y sistmicas.
1,4:
Suero control positivo para el antgeno a evaluar. 2,3,5 y 6:
Suero de
paciente. O antgeno a evaluar.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
27
8.- Lavar las lminas con agua destilada y cubrirlas con papel de
filtro
humedecido con agua destilada. Colocarlas en estufa a 50-60 C
hasta obtener
una deshidratacin total.
9.- Colorear las lminas con solucin colorante de protenas
(Amidoschwarz)
durante 5 a 10 minutos y decolorarlas con Acido Actico Glacial
al 4% hasta
obtener visualizacin de las bandas.
Lectura e interpretacin de resultados:
Un resultado es considerado positivo al observar bandas de
identidad. Las
muestras que resulten con bandas de identidad parcial deben ser
verificadas mediante
otras pruebas complementarias como Inmunoanlisis enzimtico o la
tcnica de fijacin
de complemento. Si no se produce banda de precipitacin en el
suero del paciente o si
esta se entrecruza con la del suero de referencia (banda de no
identidad), se interpreta
como negativo.
Al ser positivo el resultado es importante que el suero del
paciente sea sometido
a la prueba semicuantitativa de la IDD para determinar el ttulo
de anticuerpos
presentes en ese suero.
En la IDD semicuantitativa se emplean los mismos antgenos que
para la IDD y
la tcnica es similar variando en lo siguiente: Se coloca en el
pozo N 1 el suero control
o de referencia, en el N 2 el suero del paciente sin diluir y en
los N 3, 4, 5 y 6 el suero
diluido con solucin salina a 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16, etc. En el
hoyo central se coloca el
antgeno especfico de la micosis a evaluar. El resto del
procedimiento se contina
igual al de la IDD (Figura 9). El ttulo del suero del paciente
va a ser la ltima dilucin
donde se observe la lnea de identidad.
Figura 9: Diagrama para IDD semicuantitativa. Evaluacin de
ttulos de anticuerpos. C: Suero control. S: Suero problema sin
diluir. 1/21/16 diluciones del suero. O: Antgeno
1/2 1/4
1/8
1/16
S
1/2 1/4
1/8
1/16
S
1/2 1/4
1/8
1/16
S C C C
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
28
CORRELACIN E INTERPRETACIN DE LA IDR E IDD EN EL
INMUNODIAGNSTICO MICOLGICO.
ESTUDIO
MICOLGICO
IDR IDD RESULTADO
Directo y
cultivo:
POSITIVO
Positivo:
Estuvo en contacto con el
hongo
Positivo:
Presenta anticuerpos
precipitantes frente a
los antgenos fngicos
Presenta la enfermedad
Directo y
cultivo:
Positivo
Negativo:
No estuvo en contacto con
el hongo o se encuentra
en estado anrgico
(inmunosuprimido).
Positivo:
Presenta anticuerpos
frente a los antgenos
fngicos
Presenta la enfermedad
Directo y
cultivo:
Positivo
Positivo:
Estuvo en contacto con el
hogo
Negativo:
No presenta
anticuerpos frente a los
antgenos fngicos
Estuvo expuesto al
hongo. Presenta la
micosis puesto que se
hizo la observacin
microscpica del hongo
y aislamiento del mismo
en el medio de cultivo
Directo y
cultivo:
Negativo
Positivo:
Estuvo en contacto con el
hogo
Negativo:
No presenta
anticuerpos frente a los
antgenos fngicos
Estuvo expuesto al
hongo ms no presenta
la enfermedad.
Directo y
cultivo:
Negativo
Negativo:
No estuvo en contacto con
el hongo o se encuentra
en estado anrgico
(inmunosuprimido).
Negativo:
No presenta
anticuerpos frente a los
antgenos fngicos
El paciente puede:
1. No presentar
enfermedad mictica.
2. Estar
inmunosuprimido y
presentar enfermedad
por otro agente.
ACTIVIDAD PRCTICA:
1. Realizacin de la tcnica de Inmunodifusin doble.
(Demostrativa)
2. Discusin e interpretacin de las pruebas inmunolgicas.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
29
PRCTICA NMERO 3: DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES
OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad
de:
Establecer la importancia mdica del diagnstico micolgico de las
micosis
superficiales.
Realizar el diagnstico micolgico de las micosis
superficiales
Describir las caractersticas macro y microscpicas de las
especies de
dermatofitos.
Describir las caractersticas macro y microscpicas de colonias de
Candida
spp.
Ante la sospecha clnica de una micosis superficial, el clnico
tiene que confirmar
la infeccin recurriendo a una serie de procedimientos de
laboratorio que incluyen la
deteccin del agente causal en el tejido, por examen directo, y
el aislamiento del
patgeno en el cultivo. Al conocer el agente etiolgico se
confirma la sospecha clnica
de la micosis, permitiendo as la eleccin del tratamiento
especfico y la valoracin del
mismo.
DIAGNSTICO MICOLGICO DE LAS TIAS:
RECOMENDACIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA:
La muestra debe ser tomada antes de instituido el tratamiento o
cuando ste
se ha suspendido previamente (1-2 semanas, para piel o pelo;
varios meses,
para las uas).
Explicarle al paciente que no se coloque el da de la toma de
muestra cremas
ni talco porque pueden producir artefactos que obstaculicen la
visualizacin
del hongo y dar resultados falsos negativos o positivos.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
30
Antes de realizar la toma de muestras de una micosis superficial
es
aconsejable examinar las lesiones de la piel y cuero cabelludo,
en una
habitacin completamente oscura bajo la luz de Wood (luz
ultravioleta de 365
nm. de longitud de onda, que pasa a travs de un filtro de
cristal que contiene
xido de nquel). La piel normal muestra un color azul. Los pelos
afectados
con tinea capitis de tipo ectothrix por Microsporum canis o M.
gypseum
emiten fluorescencia de color verde brillante. Las infecciones
bacterianas
como el eritrasma, emite fluorescencia rojo y las escamas
parasitadas por
Malassezia sp fluorescentes de color amarillo oro.
Antes de realizar la recoleccin de la muestra, la piel, pelos o
uas afectados
deben limpiarse con una gasa humedecida en alcohol o en agua
destilada
estril, con el fin de eliminar el polvo y los contaminantes
ambientales
depositados en la piel. No se recomienda las torundas de algodn,
ya que
sus fibras pueden interferir con el examen directo.
En caso de toma de muestra en las uas, se debe remover con
anterioridad
el esmalte de uas, si estn pintadas y no deben ser cortadas.
La obtencin de la muestra, as como su transporte y procesamiento
debern
realizarse con estricta tcnica estril.
Una vez cumplidas estas indicaciones se procede a tomar la
muestra.
TOMA DE MUESTRA PARA EL DIAGNSTICO DE LA DERMATOFITOSIS:
Tinea capitis y barbae (tia del cuero cabelludo o de la
barba):
Realizar asepsia con alcohol. La muestra debe incluir tanto
cabellos alterados
como escamas del cuero cabelludo o de piel (Figura 10). Para la
obtencin de los
cabellos (cuero cabelludo) y vellos (de la barba), deben
preferirse aquellos que estn
opacos, quebradizos y fracturados dando aspecto de puntos
negros; igualmente
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
31
aquellos que se extraigan fcilmente con una pinza de depilacin.
Las escamas se
obtienen por raspado con bistur estril.
Las lesiones pueden ser examinadas con lmpara de Wood (luz
ultravioleta, 365
nm), en busca de zonas fluorescentes que indicarn la presencia
de cabellos y pelos
infectados por dermatofitos, lo cual permite recolectar muestras
apropiadas con mayor
seguridad.
Remisin: Los cabellos o vellos pueden ser enviados al
laboratorio en sobres,
tubos o cajas de Petri plsticas estriles, identificndolas
adecuadamente con el
nombre y edad del paciente, as como del sitio donde fue
tomada.
Tinea facie, corporis, cruris, pedis y manuum (tia del cuerpo,
crural,
del pie y de la mano):
MUESTRA: Escamas.
Las escamas son recolectadas con bistur romo, raspando los
bordes de la
lesin, donde est el crecimiento activo del hongo (Figura 11 y
12). Se recogen
Figura 10. Lesiones de Tinea capitis. Foto cortesa Profa. Leyla
Humbra
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
32
directamente sobre la lmina portaobjeto. En caso de lesiones
eritematosas, hmedas
o con exudados, la muestra debe tomarse tambin con bistur y, si
hay vesculas, stas
pueden romperse y el material recolectado se transfiere a una
lmina portaobjeto.
Remisin: Si el examen directo y cultivo no va a ser realizado
por la persona
que toma la muestra o que la misma no vaya a ser procesada de
inmediato en el
laboratorio, las escamas pueden ser remitidas en un sobre nuevo,
entre dos lminas
portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri
plstica estril,
acompaada de la identificacin del paciente y de las descripcin
de la lesin y del
rea donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para
ser directo y cultivo.
Tinea ungium (tia de la ua):
MUESTRA: Depender del tipo de lesin (figura 13):
Lecho ungueal (Onicomicosis subungueal distal o proximal):
Previa limpieza con alcohol, la muestra debe ser tomada con
bistur
haciendo raspado profundo del lecho ungueal o de la lmina
afectada partiendo del
Figura 12: Borde (flecha) lesin de Tinea
corporis. Foto cortesa Profa. Leyla Humbra.
Figura 11: Borde (flecha) lesin de Tinea facie.
Foto cortesa Profa. Leyla Humbra.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
33
extremo distal al proximal y recolectando el detritus el detrito
subungueal de la parte
incolora, pigmentada, distrfica y ms dbil de la ua; si las uas
son distrficas
pueden cortarse con tijera o cortauas estriles.
En la ua misma (onicomicosis superficial blanca, endonixis):
Se raspan las reas alteradas o se cortan pequeos fragmentos de
las uas
afectadas.
Reborde ungueal (onicomicosis proximal subungueal o
paroniquia):
La muestra debe tomarse por presin sobre el reborde ungueal, o
por debajo de
este, tratando de recuperar el material caseoso.
Remisin: El exudado proveniente del reborde ungueal debe ser
tomado y
procesado de inmediato en el laboratorio. El detrito, los
raspados ungueales y los
fragmentos de la uas pueden enviarse en sobres o cas de Petri
plsticas estriles,
acompaados de los datos del paciente.
Existe una tcnica complementaria para la recoleccin de las
escamas en las
tias o dermatofitosis. El mtodo del cuadrado de moqueta de
Mariat y Adan-Campos.
El cual consiste en frotar 5 veces con un cuadrado de alfombra
de lana estril la
totalidad de la superficie a examinar (piel glabra o cuero
cabelludo); posteriormente, la
A) Onicomicosis distal y lateral subungueal
B) Onicomicosis blanca superficial
C) Onicomicosis blanca proximal subungueal
D) Onicomicosis distrfica total
Figura 13: Formas clnicas de onicomicosis.
www.uv.es/derma/CLindex/CLdermatofit/onicomic.jpe
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
34
moqueta se guarda en un sobre de papel o en una caja de Petri y
se enva al
laboratorio de Micologa para su procesamiento.
Este procedimiento posee varias ventajas:
1. No es cruento para el paciente.
2. Es til para realizar tomas de tinea capitis con fluorescencia
negativa.
3. Permite estudiar a portadores asintomticos de dermatofitos o
pacientes ya
tratados, cuando la lesin clnica ha desaparecido.
4. Facilita los estudios epidemiolgicos de las tineas o tia.
5. Permite estudiar animales (gatos, perros, etc.) que pueden
ser reservorio de
dermatofitos. Sin embargo, tiene el inconveniente de que no se
puede realizar la
observacin directa, solamente el cultivo.
EXAMEN DIRECTO
Una vez recolectadas las muestras de piel, pelos o uas se
procede a realizar el
examen directo. Este se realiza colocando la muestra entre lmina
y laminilla con una o
dos gotas de KOH, solucin aclarante de la queratina (10-40%
dependiendo de la
muestra), se flamea para acelerar el aclaramiento (sin dejar
hervir) y se observa al
microscopio con objetivos de 10x y 40x. Si el material es muy
denso, se puede
disgregar presionando la laminilla con el borrador de un lpiz o
con el dedo. Este
procedimiento tambin ayuda a separar las clulas y evitar
artefactos como el mosaico
del hongo. Para favorecer la visualizacin, se puede agregar unas
gotas de azul de
lactofenol o tinta Parker.
Tinea capitis (tia de la cabeza):
Pueden presentar cinco tipos de parasitacin, dos endothrix y
tres ectoendothrix
(figura 14).
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
35
Del tipo endothrix se distinguen:
1. Parasitacin tricoftica (Trichophyton tonsurans), con una
gran
cantidad de esporas agrupadas densamente en el interior del
pelo.
2. Parasitacin fvica (T. schoenleinii, poco frecuente en nuestro
medio),
con escasa esporas y filamentos, as como con vesculas de aire en
el interior
del pelo.
Del tipo ectoendothrix se distinguen:
1. Parasitacin microsprica (Microsporum canis), con esporas
pequeas que forman un manguito alrededor del pelo.
2. Parasitacin microide (Trichophyton mentagrophytes), con
esporas
con disposicin laxa alrededor del pelo.
3. Parasitacin megasporada (T. verrucosum, poco frecuente en
Venezuela): con grandes esporas alrededor del pelo.
Figura 14: Tipos de parasitacin del pelo. (Modificado de
Segratain G.
Mariat F, Drouhet E. Diag Lab Muc Md 1979).
Tinea corporis, cruris, peds, manuum, barbae y ungium: Se
observan hifas
hialinas (Figura 15), de 3 a 15 um de dimetro, septadas y
ramificadas, con o sin
artroconidias.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
36
CULTIVO
Para la identificacin definitiva del agente causal es
fundamental realizar cultivo
en tubos de ensayo o placa y, cultivo en lmina. El cultivo de la
muestra se realiza
sobre agar Lactrimel, Sabouraud o DTM (medio para probar
dermatofitos), el cual es un
medio con antibacteriano y rojo fenol como indicador; de esta
manera se inhiben
bacterias y si crece un dermatofito hay viraje de color amarillo
a rojo. Se incuban a
temperatura ambiente durante 7 a 15 das, despus de lo cual
crecen colonias
caractersticas para cada gnero y especie (cuadro 3, 4 y 5).
Figura 15: Hifa hialina (Hh) con septos (S), sin
artroconidias, obtenida del estudio directo de una Tinea
pedis, (KOH 10%), 1000 x. Tomado de Atlas de
Micologa. Auristela Snchez de Mirt.
Dibujo
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
37
Actividad: Dibuje el crecimiento filamentoso de las principales
especies de
dermatofitos (Anverso y reverso de la colonia).
Microsporum
canis
Microsporum
gypseum
Trichophyton
mentagrophytes Trichophyton
rubrum
Epidermophyton
floccosum
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
38
Gnero: Microsporum Tcnica: Microcultivo
Especie M. canis M. gypseum
Caractersticas macroscpicas
Anverso de la colonia: Color blanco amarillento, de aspecto
lanoso o algodonoso. Reverso: Pigmento amarillo anaranjado
caracterstico.
Anverso de la colonia: Color canela, con superficie
pulverulenta, granulosa plana. Reverso: Pigmento de color caf.
Caractersticas microscpicas
Se observa un micelio septado, con macro y microconidias. Las
macroconidias son en forma de huso, con extremos afilados, pared
gruesa, con abundantes tabiques (6 o ms). Permiten la identificacin
de especie. Las microconidias son alargadas en forma de maza,
ssiles, en nmero variable, sin valor diagnstico.
Se observa un micelio septado, con macro y microconidias. Las
macroconidias son fusiformes con puntas romas, paredes gruesas y
con menos de 6 tabiques. Permiten la identificacin de especie.
Cuadro 3: Cuadro comparativo Gnero Microsporum
Dibujo
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
39
Gnero: Trichophyton Tcnica: Microcultivo
Especie T.rubrum T. mentagrophytes
T. interdigitale T. tonsurans
Caractersticas macroscpicas
Anverso de la colonia: Color blanco, de aspecto algodonoso,
pulverulento, con formacin de pliegues en su centro, algunas
colonias se observan agrietadas, mientras que algunas cepas son
menos vellosas. Reverso: Pigmento rojo vino caracterstico.
Anverso de la
colonia:
Color blanco
crema, de aspecto
granular,
pulverulenta con
los mrgenes
radiados.
Reverso:
Pigmento color rojo (no siempre) o caf.
Anverso de la colonia: Color blanco
crema, de
aspecto velloso
o algodonoso.
Anverso de la colonia: Puede presentar 4 variedades morfolgicas:
crateriforme, cerebriforme, sulfrea y acuminada, de aspecto
algodonoso o pulverulento. Reverso: Pigmento amarillo azufre,
pardo-rojizo o negruzco que puede ser difusible.
Caractersticas microscpicas
Presenta un micelio muy fino, septado; las microconidias son
piriformes en forma de lgrima, ssiles o pedunculadas y adoptan una
disposicin irregular en ambos lados del filamento. Las
macroconidias son muy escasas o ausentes, digitiformes, en forma de
salchicha, de pared celular delgada y lisa.
Presenta abundantes microconidios esfricos y nacen en acmulos,
as como a lo largo de las hifas; las macroconidias son cilndricas y
de paredes delgadas y frecuentemente se ven hifas en espiral.
Presenta
abundantes
microconidios
subesfricos o
piriformes. Las
macroconidias
son
multiseptadas y
ocasionalmente
presentes. Se
observan
escasas hifas
en espiral.
Clamidosporas
presentes en
cultivos viejos
Se observa un micelio ramificado en ngulo recto, septado, y
microconidias grandes (2-5 x 3-7 um), piriformes o en forma de
maza, ssiles o penducludas. Las macroconidias son escasas o estn
ausentes.
Cuadro 4: Cuadro comparativo especies del gnero Trichophyton
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
40
Dibujo
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
41
Gnero: Epidermophyton
Especie: E. floccosum
Caractersticas
macroscpicas
Anverso de la colonia:
Colonias blancas, pulverulentas o algodonosas, formando
al principio una colonia plana que con el tiempo suele
presentar pliegues en su parte central.
Reverso:
Pigmento de color amarillo-verdoso, en ocasiones un
poco amarillo-parduzco.
Caractersticas
microscpicas
Posee numerosas macroconidias, de paredes lisas,
gruesas, con el extremo distal redondeado, fusiformes o
en forma de maza de 7-9 x 20-35 m, generalmente con
2-5 tabiques. Ausencia de microconidias.
Cuadro 5: Cuadro descriptivo Epidermophyton floccosum
Dibujo
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
42
DIAGNSTICO DE PITIRIASIS VERSICOLOR
CARACTERISTICAS DE LAS LESIONES:
Presencia de maculas hipo o hiperpigmentadas y rara vez
ligeramente
eritematosas; solitarias o confluentes, puntiformes, redondeadas
a mapiformes y de
bordes bien definidos. Suelen estar acompaadas de descamacin
fina y el paciente
puede relatar prurito, especialmente cuando hay sudoracin. Los
lugares ms
comnmente afectados son: el trax, los hombros y el cuello.
MUESTRA
Escamas obtenidas por raspado con bistur o la tcnica de la cinta
adhesiva.
Tcnica de la cinta adhesiva: Se corta un pedazo de cinta
adhesiva, un poco
ms largo que una lmina portaobjeto, se delimita la lesin con un
bolgrafo y se
dispone a frotar, con la ua, la lesin con la cinta adhesiva
(tratando que las escamas
Figura 16. Lesiones en cara (flechas) de Pitiriasis Versicolor.
Foto tomada de: atlasdemicologia.blogspot.com/2008/11/3-pitiriasis
versicolor.html
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
43
se adhieran a la pega de la misma), una vez recolectada la
muestra se coloca sobre
una lmina portaobjeto con una o dos gotas de azul de metileno al
0,05%.
ESTUDIO MICOLGICO
EXAMEN DIRECTO: Azul de metileno a 0,05%
Al microscopio se observan blastoconidias de Malassezia sp, de
3-8 m de
dimetro, de paredes gruesas y refringentes, aisladas o
dispuestas en acmulos y
asociadas con hifas cortas y gruesas, poco ramificadas de 2,5 a
4 m de dimetro. Con
estos hallazgos se establece el diagnstico de pitiriasis
versicolor.
CULTIVO
Generalmente no requiere cultivo, a menos que los resultados
sean atpicos o
que se desee determinar la especie implicada.
Figura 17: Examen directo de Pitiriasis
versicolor. Se observan blastoconidias (B) de
Malassezia sp. en acmulos e hifas (H)
cortas y gruesas. Tcnica de cinta adhesiva.
Coloreada con Azul de metileno 0,05%. Foto
tomada por Profa. Leyla Humbra
B
B
H
H
DIBUJO
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
44
DIAGNSTICO MICOLGICO DE LA CANDIDOSIS MUCOCUTNEA
MUESTRA
Escamas, detrito subungueal, fragmentos de uas, exudado de
mucosas,
secreciones, flujo vaginal. Las cuales pueden ser tomadas por
raspado de bistur o
haciendo uso de un hisopo estril en el caso de exudados,
secreciones o flujo vaginal.
Remisin:
Las escamas pueden ser remitidas en un sobre nuevo, entre dos
lminas
portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri
plstica estril,
acompaada de la identificacin del paciente y de las descripcin
de la lesin y del
rea donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para
ser directo y cultivo.
El exudado proveniente del reborde ungueal debe ser tomado y
procesado
de inmediato en el laboratorio. El detrito, los raspados
ungueales y los fragmentos de la
uas pueden enviarse en sobres o cajas de Petri plsticas
estriles, acompaados de
los datos del paciente.
En el caso de la toma de muestra en mucosas, las mismas deben
enviarse
en tubo con tapa de rosca que contenga 1 ml de solucin salina o
agua destilada
estril. La muestra debe ser procesada en la hora siguiente a su
recoleccin; por ello
debe anotarse en la orden de remisin la hora de toma de muestra.
Si no es posible la
remisin inmediata al laboratorio de muestras de mucosa vaginal,
genital masculina o
perianal, se recomienda realizar un extendido para su posterior
coloracin con Gram,
con el fin de controlar la cantidad de blastoconidias y
seudohifas al momento de tomar
las muestras.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
45
ESTUDIO MICOLGICO
EXAMEN DIRECTO
Se realiza con la observacin al microscpico del material
colocado entre una
lmina portaobjeto y una laminilla con KOH al 10-20%. Se observan
blastoconidias
ovaladas o redondeadas de diferentes tamaos dependiendo de la
especie. Aunque la
presencia de seudohifas asociadas con blastoconidias,
caracterizan el gnero Candida,
al examen directo no siempre se observan ambos elementos.
En candidosis cutnea la presencia de seudohifas e hifas es
diagnstico, debido
a que el hongo no es flora normal de la piel, con la excepcin de
la piel de las reas
periorificiarias donde ocurre contaminacin por proximidad con
las mucosas. En la
candidiasis de membranas mucosas, es indispensable observar las
blastoconidias y/o
seudohifas para establecer el diagnstico (Figura 18).
Figura 18: Blastoconidia, seudohifa y clamidosporas de
Candida albicans.
CULTIVO
Es importante resaltar que el solo aislamiento en cultivo no es
significativo
debido a que las levaduras constituyen parte de la flora normal
de las mucosas. Una
vez aislada la levadura en el medio de cultivo (Sabouraud,
Mycosel, Lactrimel), se
Seudohifa
Clamidospora
Blastoconidia
DIBUJO
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
46
procede a la diferenciacin de especies a travs de la realizacin
de diferentes pruebas
bioqumicas: como lo son la formacin de tubo germinal,
filamentacin, produccin de
clamidosporas, hidrlisis de la urea y asimiliacin de azcares o
Auxonograma).
(Esquema 1)
En el informe de resultados se debe informar la cantidad de
elementos micticos
observados, de acuerdo a los siguientes datos:
Cantidad Uas (cm x 40) Flujo (cm x 40)
Escasa 1-5 1-10
Moderada 6-10 10-20
Abundante >10 >20
Actividad: Describir las caractersticas macro y microscpicas del
cultivo de
Candida albicans.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
47
MUESTRA CLNICA
LEVADURA AISLADA (SABOURAUD O LACTRIMEL)
BILIS AGAR (Clamidosporas)
Candida albicans, Candida dubliniensis
FILAMENTACIN (Corn Meal Tween 80)
+
Trichosporum Candida spp Cryptococcus Rodotorula
(Anaranjada)
UREASA
-
UREASA
+ - - +
Auxonograma, crecimiento: 37 C y 42 C
Para identificacin de especies de Candida no albicans
Esquema 1: Identificacin de levaduras
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
48
PRCTICA NMERO 4: DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS
OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad
de:
Reconocer la importancia mdica del diagnstico micolgico de las
micosis
subcutneas.
Realizar el diagnstico micolgico de las micosis subcutneas.
Describir las caractersticas macro y microscpicas de los agentes
causales
de las micosis subcutneas.
DIAGNSTICO DE LA CROMOBLASTOMICOSIS
La cromoblastomicosis (CBM) es una enfermedad crnica,
granulomatosa, que
afecta predominantemente a hombres, trabajadores del campo, en
edades
comprendidas entre los 20 y 70 aos, aunque tambin se han
reportado casos en nios
y adolescentes. Es causada por varios hongos filamentosos con
melanina, clasificados
en la familia Demateacea y denominados cromomicetos por Borelli
Se adquiere por
inoculacin accidental del hongo saprofito en la piel a travs de
traumatismos
ocasionados con espinas de plantas o restos vegetales que
contienen el agente.
Para establecer el diagnstico de la cromoblastomicosis se hace
necesario
conocer la epidemiologa, impresin clnica y recuperar el agente
causal de las
muestras clnicas.
Estudio epidemiolgico
La cromoblastomicosis se presenta especialmente en hombres
adultos,
agricultores entre la tercera y cuarta dcada de la vida, quienes
han estado
repetidamente expuestos a pequeos traumas. Los nios y
adolescentes tambin
pueden ser afectados principalmente por Cladophialophora
carrionii. La distribucin
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
49
geogrfica es mundial, pero el mayor nmero de casos se han
informado en las
regiones tropicales y subtropicales de Amrica y frica.
En Venezuela las reas endmicas ms importantes se localizan en la
regin
noroccidental, en los estados Lara, Zulia y Falcn. Esta rea
endmica incluye dos
reservareas segn el agente causal implicado.
Fonsecae pedrosoii se encuentra en regiones de clima clido y
hmedo
descritas como "Bosque deciduo montano".
Cladophialophora carrionii es el agente causal ms frecuentemente
asilado y es
considerado el responsable de la endemia de CBM en la zona
semirida del estado
Falcn. C. carrionii se encuentra en zonas ridas descritas como
"bosque xerfilo de
espinar"
Impresin Clnica
La cromoblastomicosis se caracteriza clnicamente por la
presencia de lesiones
ppulo postulosas o ndulo abcesado que evolucionan lenta y
progresivamente a placa
verrugosa de superficie irregular con diminutas hemorragias,
visibles como puntos
negros, escamo-costrosas, de bordes activos y zonas con
tendencias a la cicatrizacin,
dejando reas atrficas, acrmicas o hipocrmicas. Al cabo de varios
aos de
evolucin, estas lesiones pueden llevar a deformaciones
irreversibles e invalidez parcial
del miembro afectado. Las lesiones son generalmente nicas, se
encuentran
principalmente en extremidades aunque tambin pueden ser
observadas en manos,
espalda, tronco, regin gltea y cara. (Figura 19).
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
50
Figura 19: Diferentes lesiones clnicas de cromoblastomicosis.
Fotos cortesa
Profa. Leyla Humbra.
Estudio Micolgico
Muestra:
Previa asepsia con alcohol, las escamocostras son recolectadas
con bistur
romo, raspando la lesin, con preferencia donde se encuentran los
puntos negros
drmicos, los cuales contienen las estructuras del hongo. Se
recogen directamente
sobre la lmina portaobjeto.
En algunos casos es necesario recurrir a la biopsia debido a la
hiperqueratosis
que impide penetrar al lugar donde se encuentra el hongo.
Remisin: Las escamocostras pueden ser remitidas en un sobre
nuevo, entre
dos lminas portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja
de Petri plstica
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
51
estril, acompaada de la identificacin del paciente y de la
descripcin de la lesin y
del rea donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente
para ser directo y cultivo.
Examen Directo:
Se realiza entre lmina y laminilla con KOH al 10-20%, slo o
adicionado con
tinta, Negro de clorazol E y haciendo uso de coloraciones
histolgicas como
Hematoxilina-Eosina (HE) o cido Perydico de Schiff (PAS).
En un paciente con cromoblastomicosis se observan las clulas
esclerticas,
clulas fumagoides o esclerotes de Medlar, las cuales son clulas
redondeadas, de
color caf o amarillo ocre, de 4 a 12 m de dimetro, de pared
gruesa, con inclusiones
citoplasmticas y con particiones (Figura 20). Estas clulas
pueden dividirse en varios
planos, con septos en diferente orientacin. No son
blastoconidias ni tienen
reproduccin por gemacin. En casos muy crnicos, se pueden
observar tambin la
presencia de hifas cortas, septadas, de pared gruesa y
dematiaceas.
En la biopsias teidas con HE los cuerpos esclerticos conservan
su color
caracterstico. La respuesta tisular es mixta con una respuesta
supurativa y predominio
de granulomas, con acmulos de neutrfilos en el centro. Las
clulas esclerticas se
localizan en los microabscesos drmicos, mientras que las hifas
pueden verse en la
epidermis.
Figura 20: Cuerpos esclerticos. (S) Septos. Escamocostras. KOH,
40x. Foto cortesa Profa. Leyla Humbra
S S
DIBUJO
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
52
El examen directo es muy importante ya que la observacin de las
clulas
esclerticas establece el diagnstico de enfermedad, pero el
cultivo es indispensable
para determinar el gnero y la especie del agente etiolgico y
ulterior aplicacin de
tratamiento.
Reporte: al examen directo se observan clulas esclerticas
compatibles con
agentes de cromoblastomicosis.
Cultivo y microcultivo:
La siembra se realiza sobre agar Sabouraud o Lactrimel, en placa
o tubo, se
incuba a temperatura ambiente por 8 15 das.
Caractersticas macroscpicas: Todas las especies causantes de
cromoblastomicosis producen colonias de crecimiento lento,
micelio areo corto, de
color variable entre pardo oscuro, verde oliva o negro; con
aspecto aterciopelado,
superficie plana o ligeramente elevada y plegada; al reverso la
colonia es de color
negro.
Caractersticas microscpicas: El estudio de los microcultivos
facilita la
observacin de la conidiognesis, permitiendo la identificacin por
especie del agente
causal.
Cladophialophora carrionii:
Presenta fructificacin tipo Cladophialophora con conidiforos
simples, erectos,
de longitud variable, que dan origen en su extremo distal a
cadenas de conidias
brotantes, de color pardo, unicelulares o bicelulares, ovoides,
elpticos o cilndricos de 2
a 4 m, que se disponen en cortas cadenas acrpetas y ramificadas.
En los puntos de
unin de las conidias, se observan zonas engrosadas de la pared
celular que actan
como disyuntores, favoreciendo su desprendimiento. (Figura
21)
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
53
Figura 21. Cladophialophora carrionii. Azul de lactofenol. 40x.
Foto cortesa Profa. Leyla Humbra
Phialophora verrucosa:
Presenta fructificacin Phialophora, la cual se caracteriza por
la produccin de
conidiforos terminales o dispuestos a los lados de las hifas
vegetativas, en forma de
florero (filides), con una zona estrecha o cuello y una porcin
distal ms ancha. Las
conidias son ovales, lisas, ligeramente pigmentadas y de 2 a 3 m
de dimetro; se
forman en el interior de la filide, salen del exterior
acumulndose en pequeos
conglomerados en forma de cabezuela. (Figura 22).
Figura 22: Phialophora verrucosa.
http://overcomingcandida.com/mycology/phialophora.jpg
Fialide
Conidias
Hifa septada
Cadena de
conidias
Conidiforo
simple
Hifa septada
DIBUJO
DIBUJO
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
54
Rhinocladiella aquaspersa:
Presenta la fructificacin de tipo Rhinocladiella, exhibe un
conidiforo poco
diferenciado, erecto, cilndrico, ligeramente dilatado en su
extremo distal, en forma de
clava o maza; en esta porcin se ven cortas prolongaciones del
conidiforo en forma
de dientes, donde se implantan las conidias con disposicin
acropleurogena. Las
conidias son ovales, unicelulares, de 2 a 5 m de dimetro y
forman brotes que dan
origen a cortas cadenas de 2 a 3 elementos. (Figura 23)
Figura 23: Rhinocladiella aquaspersa.
www2.ac-lyon.fr/.../rhinocladiellaaquaspersa.gif
Fonsecaea pedrosoi:
Presenta los tres tipos de formacin de conidias que exhiben los
agentes
causales de esta enfermedad: Cladosporium, phialophora y
Rhinocladiella,
generalmente predominan las dos primeras. (Figura 24)
Conidias
Conidiforo
Hifa septada
Hifa septada
Conidioforo
Conidias
DIBUJO
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
55
Figura 24. Fonsecaea pedrosoi.
www.doctorfungus.org/thefungi/img/fon1_l.jpg
DIAGNSTICO DE LA ESPOROTRICOSIS
La Esporotricosis es una micosis endmica, producida por la
penetracin del hongo
dimrfico Sporotrhrix schenckii. Ocasionando lesiones cutneas y
extracutneas.
Para establecer el diagnostico de la esporotricosis se hace
necesario conocer la
epidemiologa, impresin clnica y recuperar el agente causal de
las muestras clnicas.
Estudio epidemiolgico
S. schenckii es de distribucin mundial, aunque es ms frecuente
en areas
tropicales, tiene su hbitat ms comn en la tierra y en los
vegetales.
La enfermedad se presenta en todas las edades y en ambos sexos,
con mayor
incidencia en el sexo masculino, que por su ocupacin estn
expuestos a cualquier tipo
de trauma.
Entre los factores de riesgos conocidos para las formas cutneas
se han descrito el
contacto traumtico con material vegetal (plantas espinosas,
helechos, paja, musgo).
En las formas sistmicas, el alcoholismo y la inmunosupresin han
sido sealados
como factores de riesgos importantes.
Se recomienda realizar diagnstico diferencial con leishmaniasis
mucocutnea,
sfilis, tuberculosis, epitelioma, cromomicosis, acn,
piodermitis, criptococosis cutnea,
sarcoidosis, lepra tuberculoide, lesiones queloideanas,
dermatofitosis y enfermedades
malignas.
Impresin Clnica
Esporotricosis cutnea primaria: se describen dos formas.
DIBUJO
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
56
Cutnea primaria fija: se caracteriza por la presencia de una
lesin ulcerada,
verrucosa o vegetante, solitaria o con lesiones satlites
perifricas, contiguas, rojizas o
violceas, que crecen por contigidad.
Cutnea primaria linfangtica: Se caracteriza por la presencia de
un chancro
de inoculacin, la cual es una lesin nodular, verrucosa o
ulcerada, seguida de
mltiples lesiones nodulares a lo largo de los canales linfticos
adyacentes. En los
adultos se localiza principalmente en las extremidades
superiores e inferiores, mientras
que en los nios predomina en la cara.
Esporotricosis pulmonar primaria o extracutnea: esta forma se
adquiere por
inhalacin del hongo. En los individuos normales es asintomtica y
puede estimular
inmunidad especfica, pero en el hospedero inmunocomprometido,
suele ocurrir
diseminacin hematgena.
Figura 25: Lesin de Esporotricosis linfangtica.
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/medicina/2010828/l
ecciones/cap6/cap6-3.htm
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
57
Estudio Micolgico
Muestra:
Se solicitan usualmente:
Exudados
Material purulento
Biopsias
En las formas diseminadas se solicita:
Esputo
Liquido sinovial
Liquido cefalorraqudeo
Examen Directo:
Se realiza haciendo uso de la coloracin de Giemsa o histolgicas
(HE, PAS,
plata-metenamina), inmunofluorescencia directa y tcnicas de
inmunoperoxidasa.
Usualmente no se observan estructuras micticas y ocasionalmente
se observa
el cuerpo asteroide. Las blastoconidias son adems, difciles de
diferenciar de otros
hongos, como Histoplasma capsulatum, especialmente en fresco o
con la coloracin de
plata metenamina.
En biopsias teidas con HE o PAS, se observan blastoconidias
rodeadas de
espculas eosinfilas en forma de estrella (reaccin de
Splendore-Hoeppli), conocida
con el nombre de cuerpo asteroide. Estas estructuras rara vez se
observan al examen
en fresco.
Por inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa se observan
blastoconidias de S.
schenckii.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
58
Figura 26: Cuerpo asteroide.
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/medicina/2010828/lecciones/cap6/cap6-3.htm
Cultivo:
Caractersticas macroscpicas: A temperatura ambiente los cultivos
son de
crecimiento rpido (4 a 5 das), de aspecto micelial, de color
gris claro que con el
tiempo se tornan ms oscuros, de superficie vellosa, muy plegada
y de consistencia
membranosa. A 37 C se observan colonias blancas, cremosas, de
aspecto
levaduriforme.
Caractersticas microscpicas: el micelio est constituido por
finos filamentos
hialinos, ramificados y septados. Las conidias tienen forma
elptica, de pared lisa y
delgada, se originan en forma simpodial, en el extremo distal de
conidiforos simples,
erectos y finos, presentando en su conjunto el aspecto del tallo
y ptalos de una flor de
margarita. El estado levaduriforme est constituido por
blastoconidias esfricas, ovales
o en forma de cigarro, mono o multigemante de 1 a 3 m por 3 a 10
m. en algunos
casos se hace necesario demostrar el carcter dimrfico del hongo
inoculando
animales de experimentacin como ratas o cobayos.
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
59
Inmunodiagnstico:
Inmunidad celular: Se estudia mediante la aplicacin intradrmica
de 0,1 c.c. de
esporotriquina, la cual es un antgeno que se prepara bien sea de
la fase micelial o
levaduriforme del hongo, se realiza la lectura a las 48 horas.
Una lectura mayor o igual
de 5 mm indica que la persona ha estado expuesta al hongo. A
pesar de que la
intradermorreaccin carece de valor diagnstico, una prueba
positiva ante un cuadro
clnico sugestivo de esporotricosis orienta hacia el diagnstico
de la enfermedad, el
cual debe ser confirmado con el aislamiento e identificacin del
agente causal.
Inmunidad humoral: La prueba de eleccin para el estudio de los
casos de
esporotricosis cutnea linftica y la extracutnea es la ID. En los
casos de
esporotricosis cutnea fija las pruebas de eleccin, usando un
antgeno levaduriforme,
son la aglutinacin, el ltex y la electrosinresis.
Figura 27: Cultivo en lmina de Sporotrhrix schenckii. Hifa
septada (H), Conidiforo simple (C) y conidias (c)
dispuestas en flor de margarita.
www.facmed.unam.mx/.../pages/sschenckii2_jpg.htm
C
H
H
S
c
DIBUJO
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
60
DIAGNSTICO DE MICETOMA
El Micetoma es una infeccin crnica, supurativa de los tejidos
cutneo,
subcutneo y seo. Se caracteriza por la presencia de edema,
fstulas y granos que
drenan a travs de las fstulas, esta triada es usada en un
sentido estricto para definir
el trmino Micetoma. Puede estar causado por bacterias
(actinomicetos) u hongos
(eumicetos).
Estudio epidemiolgico:
El Micetoma se produce por la implantacin traumtica o heridas en
el tejido
subcutneo, de ciertos hongos o bacterias, presentes en espinas o
astillas de madera,
entre otros. Es frecuente en regiones tropicales y
subtropicales, presentndose
espordicamente en regiones templadas. La enfermedad es endmica
en la India y en
algunos pases del frica y de Latinoamrica. En Venezuela, la
enfermedad predomina
en la regin Centrooccidental del pas, en los estados Lara y
Falcn. As mismo, se
han reportado casos en las regiones: Central, Zuliana y de
Guayana.
La enfermedad se ha observado en nios de 3 aos de edad y en
individuos de
80 aos, pero predomina entre la 2a dcada de la vida. Es ms comn
en hombres que
en mujeres, en una relacin 2:1, y predomina en campesinos, por
lo que esta entidad
es considerada una enfermedad ocupacional. Afecta principalmente
los miembros
inferiores, pero tambin puede producirse en manos, rodillas,
regin gltea, brazos,
cabeza, cuello y tronco.
Agentes etiolgicos:
El Micetoma puede ser ocasionado por bacterias aerbicas
(Micetoma
actinomictico) los cuales producen granos claros a excepcin de
Actinomadura
pelletieri que es rojo, y por hongos verdaderos (Micetoma
eumictico), los cuales
producen granos de color negro, excepto Cephalosporium. (Tabla
1).
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
61
En Venezuela, los principales agentes de Micetoma son:
Actinomicetoma:
A. madurae
N. brasiliensis
Eumicetoma:
Pyrenochaeta mackinonnii
P. romeroi
Madurella grisea
Tabla 1. Agentes etiolgicos del Micetoma
-
Mic
rosc
op
io
pti
co
62
Impresin clnica:
La lesin inicial se localiza en el tejido celular subcutneo. Se
caracteriza por
ser una masa firme, indolora y no adherida a los planos
superficiales. Luego se
extiende hasta el tejido subcutneo donde forma reas de
tumefaccin con produccin
de abscesos que alcanzan la piel y drenan a travs de mltiples
fstulas. En el lquido
seropurulento que de all drena, se encuentran los granos
caractersticos de la
enfermedad. El progreso de la lesin lleva a compromiso seo, el
cual ocasiona
deformacin marcada del miembro comprometido.
Diagnostico micolgico:
Muestra:
Granos
Material purulento
Liquido serohemtico
biopsias
Examen directo:
Se realiza con la observacin directa de los granos entre lamina
y laminilla con
KOH al 10%, tambin
