Manual enzimología actualizado

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO

INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ÁREA ACADÉMICA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

LICENCIATURA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS

MANUAL DE PRÁCTICAS

ENZIMOLOGÍA

ELABORÓ:

M. en C. Rodolfo Gómez Ramírez

SEMESTRE: 5°AGOSTO DE 2011

LICENCIATURA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOSMANUAL DE PRÁCTICAS

ENZIMOLOGÍA Semestre: 5°

FECHA ELABORACIÓN:

Agosto de 2011

ELABORARON:

NOMBRE FIRMA

Rodolfo Gómez Ramírez

VO. BO. ACADEMIA DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA:

NOMBRE FIRMA

Ing. Javier José Álvarez Gayosso

Dra. Martha Gayosso Canales

M. en C. Rodolfo Gómez Ramírez

Lic. Dalia Erika Islas Pérez

Dr. Guillermo Arlando López Huape

M.T.I Marco Antonio Ortiz Ruíz

Dra. Adriana Inés Rodríguez Hernández

Dra. Gabriela Sánchez Olguín

VO. BO. COORDINACIÓN DE LA LICENCIATURA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS:

DR. NORBERTO CHAVARRÍA HERNÁNDEZ

FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN:

Julio de 2012





ÍNDICE

Pág.

Introducción. 1

Medidas de seguridad en el Laboratorio, Taller y/o Clínicas 2

Lineamientos de uso de Laboratorios, Talleres y/o clínicas 4

Práctica No. 1: Factores que determinan la velocidad de las reacciones

enzimáticas 11

Práctica No. 2: Inhibición de la actividad enzimática21

Práctica No. 3: Inactivación térmica de la peroxidasa26



INTRODUCCIÓN

En este manual se aborda el estudio in vitro de la actividad enzimática, incluyendo el

efecto de las condiciones del medio de reacción tales como el pH y la temperatura, así

como las concentraciones del sustrato y de la enzima. Se aborda también el estudio de

los inhibidores enzimáticos y un ejemplo de enzimas de importancia en el

procesamiento de los alimentos. De esta manera se prepara al estudiante para un

posterior estudio de la tecnología enzimática aplicada en el procesamiento de

alimentos.

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MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO, TALLER Y/O CLÍNICAS DE LA

UAEH

Normas generales para el trabajo seguro en el laboratorio

Debe familiarizarse con la ubicación y uso de los elementos de seguridad con que cuenta

el laboratorio (duchas, lava ojos, matafuegos, etc.).

Utilice siempre los elementos de protección personal (guardapolvo, guantes, pinzas, etc.).

Como norma higiénica básica, el personal deberá lavarse las manos al entrar y salir del

laboratorio y siempre que haya habido contacto con algún producto químico.

Portar, en todo momento las batas y ropa de trabajo abrochadas y los cabellos recogidos,

evitando colgantes o mangas anchas que pudieran engancharse en los montajes y

material del laboratorio.

Usar bata de manga larga con todos los botones abrochados, ya que esto ofrece

protección frente a salpicaduras o derrames de sustancias químicas.

No llevar pantalón corto, falda, sandalias, zapatos abiertos, es decir zonas descubiertas

de piel que queden expuestas a posibles salpicaduras.

No se debe trabajar separado de la mesa o de la repisa.

No se debe realizar trabajo en solitario en el laboratorio, especialmente fuera de horas

habituales, por la noche, o si se trata de operaciones con riesgo.

Debe estar prohibido fumar e ingerir alimentos (incluyendo gomas de mascar) o bebidas

en el laboratorio, ya que pueden contaminarse con las sustancias químicas.

Las personas que usan lentes de contacto deberán sustituirlas por gafas de seguridad

graduadas o que permitan llevar las gafas graduadas debajo de ellas, ya que el efecto de

los productos químicos es mucho mayor si se introducen entre el lente y la cornea.

Mantener las mesas de trabajo limpias y sin productos, libros, cajas o accesorios

innecesarios para el trabajo que se está realizando, ya que pueden entorpecer las

prácticas y así provocar un accidente.

Circular con precaución por el laboratorio, sin interrumpir a los que están trabajando.

Para trabajar dentro del laboratorio deben llevar gafas de seguridad normalizadas ya que

protegen a los ojos de alguna salpicadura con productos químicos.

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Evitar las visitas porque distraen.

Conocer donde están las salidas de emergencia.

Conocer dónde está el equipo de seguridad como extintores, botiquín, etc.

Registrar todos los sucesos del experimento, aún los accidentes que hayan ocurrido.

No guardar lápices afilados, objetos cortantes o punzantes en las bolsas de la bata.

No calentar sistemas cerrados.

Está prohibido: Tener o consumir bebidas alcohólicas en el laboratorio; fumar; correr

dentro del laboratorio, salvo en casos de extrema urgencia; Provocar alborotos y bromas.

Nunca utilice materiales, equipos y/o reactivos de los cuales desconoce su peligrosidad.

Utilice la campana de seguridad para toda actividad que involucre el uso de sustancias

inflamables y/o de elevada toxicidad.

Nunca trabaje en una zona con ventilación deficiente.

Participe en todos los entrenamientos de seguridad

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LINEAMIENTOS DE USO DE LABORATORIOS, TALLERES Y/O CLÍNICAS DE LA UAEH

DE LOS USUARIOS (ALUMNO):

I. Respetar la Normatividad Universitaria vigente.

II. Los alumnos sólo podrán trabajar y permanecer en el laboratorio bajo la supervisión directa

del profesor, de acuerdo al Artículo 20 del Reglamento de Laboratorios. En ningún caso el

auxiliar o responsable de laboratorio, podrá suplir al maestro en su función.

III. Para asistir a sesiones de laboratorio, es requisito indispensable presentarse con bata

reglamentaria (blanca y de manga larga), Taller bata de color y de manga larga portada

adecuadamente, manual de prácticas correspondiente y con los materiales que no son

específicos de los laboratorios

IV. La entrada al laboratorio será a la hora exacta de acuerdo a lo Programado.

V. El laboratorio no proporcionará manuales de prácticas a los usuarios, ya éstos serán

suministrados por el catedrático de la materia correspondiente.

VI. Todo usuario trabajará con el equipo de seguridad que se requiera, (bata blanca, filipina,

careta, mascarilla, cubre boca, cubre pelo, guantes de hule látex, zapato de piso, guantes

quirúrgicos, guantes industriales y/o de asbesto.

VII. El usuario tendrá cuidado de no contaminar los reactivos o tomar alguno directamente con

la mano. Existen muchos reactivos de los cuales se preparan soluciones diluidas, que son

altamente corrosivos. En este sentido, el contacto con ellos deber ser reducido al mínimo con las

manos, la nariz o la boca. Usar en todos los casos una perilla o propipeta para auxiliarte al tomar

la cantidad deseada de reactivo. Manual de Ecología, Seguridad e Higiene.

VIII. Por ningún motivo pipeteará las soluciones con la boca, no debes “PIPETEAR”

directamente del frasco que contiene al reactivo. Con esto, se evitará que los reactivos se

contaminen y que los resultados de tu práctica (y la de los demás) se vean afectados. Para ello,

toma sólo la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y NO DEVUELVAS EL RESTANTE

al frasco de origen. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología.

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Si necesitas preparar una solución de un reactivo que desprende gases (como los ácidos o el

amoniaco) HAZLO EN LA CAMPANA y no en las mesas de laboratorio. Activa los extractores.

Manual de Higiene, Seguridad y Ecología.

IX. En caso de que alguna sustancia corrosiva te caiga en la piel o en los ojos, LAVA

INMEDIATAMENTE la parte afectada al chorro del agua durante al menos 5 minutos y AVISA A

TU PROFESOR. Si el derrame fue en una gran área de la piel y

X. de la ropa, usa las regaderas que están ubicadas en el laboratorio. Manual de

Procedimientos Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6

XI. Cuando peses en la balanza cualquier producto químico hazlo en un pesafiltro o en un

recipiente adecuado, NUNCA en un trozo de papel. Además, procura no tirar el producto

alrededor de la balanza ya que puedes dañarla. Si esto sucede límpialo inmediatamente con una

brocha y/o con un trozo de tela limpio. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología.

XII. Las sustancias que se manejan comúnmente en el laboratorio son altamente

contaminantes. Como UNIVERSITARIOS tenemos gran compromiso con el cuidado del medio

ambiente y en consecuencia debemos desecharlas de manera adecuada conforme a las

indicaciones que te indique tu catedrático. NO DESECHES TUS SOLUCIONES, RESIDUOS O

PRODUCTOS DIRECTAMENTE EN LA TARJA, utiliza los contenedores correspondientes al tipo

de sustancia en particular. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología.

XIII. Todo frasco, bolsa, caja o contenedor, deberán ser etiquetados. Por lo tanto cualquier

sustancia con recipiente no etiquetado será desechada. Manual de Procedimientos

Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6

XV. Todo usuario de laboratorio o taller, debe conocer la ubicación de los extintores, las puertas

de emergencia, y la circulación del lugar en caso de emergencia.

XVI. El usuario solicitará el equipo, herramienta, material y reactivos de acuerdo a las

especificaciones del manual de prácticas, mediante el vale de laboratorio, Formato DLA-009, y

su identificación oficial de la U.A.E.H.

XVII. Que el usuario que reciba el material sea el mismo que solicite durante el desarrollo y el

que haga entrega al final de la práctica.

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XVIII. Los usuarios deberán revisar el equipo y material que se les proporcione, verificando que

esté limpio, ordenado, completo y funcionando, el cual deberá ser devuelto en las mismas

condiciones.

XIX. Al devolver el equipo y material, el usuario deberá solicitar el vale de laboratorio Formato

DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H.

XX. Cuando el material quede bajo la responsabilidad del usuario, el vale de laboratorio Formato

DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H., será retenido por el auxiliar hasta la devolución

del material.

XXI. En caso de pérdida, ruptura o desperfecto del equipo o material de laboratorio, el usuario

solicitará al auxiliar el vale de adeudo Formato DLA-010 el cual debe anotar el nombre y núm. de

cuenta de todos los integrantes del equipo y ser respaldado con su identificación oficial de la

U.A.E.H., se deberá reponer en un plazo no mayor a 15 días hábiles., para lo cual se retendrá el

vale de adeudo y su identificación oficial de la U.A.E.H.

XXII. Si el material adeudado no es repuesto en el plazo fijado, el o los usuarios responsables,

no podrán continuar con la realización de las prácticas correspondientes. Control de adeudo

Formato DLA-011.

XXIII. En caso de no cumplir con la reposición del material en el plazo establecido, el integrante

del equipo o grupo, según sea el caso, serán dados de alta, en la aplicación del sistema de

control de adeudos en laboratorios implementado en la U.A.E.H.

XXIV. La acreditación de cada una de las prácticas que se realicen, estará sujeta a la evaluación

que aplique el catedrático.

XXV. El usuario que realice práctica de recuperación deberá cumplir con lo estipulado en el

punto III.

XXVI. Los alumnos que por indisciplina o negligencia pongan en peligro su integridad, la de sus

compañeros, la del material o la de las instalaciones, serán sujetos a la sanción correspondiente

prevista en el Reglamento de Laboratorios Artículo 36 y 38. Por la naturaleza de las cosas que

existen en el laboratorio debes mantenerte alerta y sin distracciones (no corras, no se permiten

equipos de sonido personales). TAMPOCO SE ACEPTAN VISITAS a las horas de laboratorio.

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XXVII. El usuario que incurra en alguna falta académica será sancionado de acuerdo a la

Normatividad Universitaria vigente.

XXVIII. Queda estrictamente prohibido realizar cualquier tipo de actividad ajena al desarrollo de

las tareas propias del laboratorio.

XXIX. Todo usuario deberá entrar y salir por los accesos autorizados, en orden y cuidando su

integridad y la de sus compañeros. (Manual de Higiene, Seguridad y Ecología, Capitulo 1).

XXX. Los usuarios deben reportar cualquier anomalía o maltrato por parte del catedrático y del

personal de laboratorio, al jefe de los mismos o en su caso a la Dirección de la escuela.

XXXI. Al concluir la práctica, deben dejar limpia el área de trabajo, así como el material y

equipos utilizados. NO TIRES PAPELES Y/O BASURA A LAS TARJAS.

XXXII. Al concluir la licenciatura, maestría o doctorado y realicen su trámite de titulación al

solicitar su constancia de no adeudo de material, herramienta y/o equipo de laboratorios,

clínicas y talleres, se realizara una donación en especie a las, clínicas, laboratorios y talleres

correspondientes de acuerdo al Formato DLA-043, la cantidad de la donación será entre tres y

cuatro salarios mínimos vigente en el estado de Hidalgo para ello es necesario entregar la nota y

escribir en el formato el material donado, posteriormente el documento que se extienda se

entregará a la Dirección de Laboratorios y Talleres donde se elabora y entrega la constancia de

no adeudo.

DEL USUARIO (CATEDRÁTICO/INVESTIGADOR):

I. El catedrático/investigador es Responsable del desarrollo y del cumplimiento de los objetivos

establecidos en su manual de prácticas o guías o proyecto de investigación (tesis).

II. El catedrático/investigador que incurra en alguna falta académica será reportado a la Dirección

de la Escuela, así mismo se elaborará el Reporte de Acción (oportunidad de mejora, acción

preventiva o acción correctiva).

III. El catedrático llenará y entregará las Programaciones correspondientes según aplique:

Prácticas Formato DLA-001, lo entregara al personal de laboratorio y/o taller los primeros días

del inicio del semestre, con tres copias. Proyecto de investigación Formato DLA-003, lo entregara

al personal de laboratorio una hora antes de hacer uso del laboratorio y/o taller.

IV. Para asistir a sesiones de laboratorio, es requisito indispensable presentarse con bata

reglamentaria (blanca y de manga larga) y equipo de seguridad.7



V. La entrada al laboratorio será a la hora exacta de acuerdo a lo Programado, el catedrático que

no inicie la práctica durante los primeros 10 minutos ésta será suspendida y tendrá que ser

reprogramada.

VI. Antes de realizar cualquier sesión práctica o experimento, el catedrático deberá informar a los

alumnos las características del material y equipo a emplear, así como las propiedades físicas,

químicas y toxicas de las sustancias empleadas.

VII. El catedrático deberá exigir el uso de bata reglamentaria (blanca y de manga larga)

personalizada y portada adecuadamente, manual de prácticas correspondiente y con los

materiales que no son específicos de los laboratorios.

VIII. El catedrático deberá anotar los datos indicados en el libro de registro de prácticas (bitácora)

de acuerdo a lo estipulado. Formato DLA-013

IX. El catedrático programará en coordinación con el Responsable de laboratorios la

recuperación de prácticas. Formato DLA-035.1

X. El catedrático es corresponsable de la reposición del material de adeudo de los alumnos de su

grupo.

XI. El catedrático tiene la responsabilidad de que los desechos químico-biológicos sean

depositados en los contenedores correspondientes. Manual de Procedimientos Departamento

Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6

XII. El catedrático es responsable de supervisar a los alumnos desde el inicio, durante y al

finalizar la práctica. Al inicio de esta verificar que realice la práctica programada, solicite lo

necesario y cumpla con las medidas de seguridad, durante que hagan buen uso de los

materiales, equipos y que no haya desperdicio de reactivos y al finalizar que dejen limpia el

área de trabajo, bancos en el lugar y QUE NO DEJEN PAPELES Y/O BASURA EN LAS

TARJAS.

XIII. El catedrático deberá ser el primero y último en salir de los laboratorios, (NO ABANDONAR

EL LABORATORIO HASTA QUE HAYA CONCLUIDO SU SESIÓN, NO DEBE DE CALIFICAR

EXAMENES, NO REVISAR TAREAS, NO REVISAR TRABAJOS, NO REALIZAR

ACTIVIDADES EN LAPTOPS, ETC. Recuerda que en la enseñanza experimental es necesario

valorar las actitudes y la motivación en el trabajo grupal, ya que es en el laboratorio donde el

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alumno forma su actitud hacia el trabajo en equipo, lo cual se verá reflejado en su ejercicio

profesional (Valdez, 2001).

DEL AUXILIAR DE LABORATORIOS:

I. El auxiliar de laboratorio está obligado a proporcionar el equipo, material y reactivos a los

alumnos. Formato DLA-001 y Formato DLA-003

II. Auxiliar a los alumnos durante el desarrollo de la práctica, así como vigilar el buen uso de los

materiales y equipo.

III. Vigilar el cumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso de Laboratorios, así como el

Manual de Higiene Seguridad y Ecología.

IV. En ausencia del Responsable del Laboratorios, puede suspender la práctica en caso de

incumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso del Laboratorio.

V. El auxiliar debe permanecer en su área de trabajo y realizar las actividades inherentes a su

área.

VI. Apoyará en las actividades académicas que encomiende la Dirección y el Responsable de

laboratorios de la escuela, siempre y cuando no tenga prácticas asignadas.

VII. Registrará en los formatos de limpieza DLA-025, DLA-026, DLA-027, DLA-028, DLA-029,

DLA-030 al DLA-031, las actividades realizadas por el personal de intendencia.

VIII. En caso de pérdida, ruptura desperfecto o extravió de algún material, equipo e

infraestructura, notificará de manera inmediata al Responsable del laboratorios. Formato DLA-

017

IX. Es responsable de la custodia del material, equipo, sustancias e instalaciones, por lo que en

caso de pérdida o desperfecto de algún bien se tendrá que deslindar responsabilidades de

acuerdo con la Normatividad Universitaria.

X. Preparará previamente el material, equipo y reactivos necesarios para elaborar las prácticas

que ya están programadas correspondientes a los planes y programas de estudio vigentes.

Formato DLA-041

XI. Será responsable de mantener el material y equipo en óptimas condiciones, así como el

cubículo de laboratorio. Mantener vigente el inventario de equipo, material y reactivos.

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XII. Será responsable de reportar desperfectos o fallas en los equipos de laboratorio y solicitar el

mantenimiento y/o acción necesaria para su funcionamiento al responsable de laboratorios.

XIII. Elaborará y entregará el reporte mensual de actividades de su laboratorio al responsable de

laboratorios.

XIV Será responsable de verificar que el usuario registre en el vale de laboratorio y adeudo los

datos correctos de acuerdo a la identificación oficial de la UAEH.

XIV. Vigilará que el catedrático se registre debidamente en la bitácora de uso al concluir su

práctica.

DEL RESPONSABLE DE LABORATORIOS:

I. Es el responsable del buen funcionamiento, mantenimiento y participar con la Dirección en

las propuestas para actualización y desarrollo de los laboratorios.

II. Supervisará permanentemente los laboratorios, asesorará a catedráticos, alumnos y personal

de los mismos con la finalidad de lograr las metas planteadas.

III. Recepcionará las programaciones Formato DLA-01, DLA-03, Servicio a Tesistas, alumnos y

Profesores. Elaborará la calendarización, horario y control de prácticas Formato DLA-005 o DLA-

006

IV. Vigilar el cumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso de Laboratorios así como el

Manual de Higiene Seguridad y Ecología.

V. Tiene la autoridad de suspender la práctica en caso de demora por parte del catedrático y/o

alumnos o bien, incumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso del Laboratorio.

VI. Elaborará y entregará a la Dirección el reporte mensual Formato DLA-016practicas, Formato

DLA-016inv.

VII. Elaborará y entregará relación de alumnos que tienen adeudos a la instancia

correspondiente. Reposición de adeudos Formato DLA-018

VIII. Ingresará en la Captura en la “Aplicación Sistema de Control de Adeudos en

Laboratorios”, a los alumnos que no realizaron la reposición de material en el tiempo

establecido. Formato DLA-018

IX. Apoyará en las actividades académicas que encomiende la Dirección de la escuela.

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X. Elabora requerimiento semestral de material, equipo, reactivos y agua destilada necesarios

para las prácticas correspondientes a los planes y programas de estudio vigentes, a la instancia

correspondiente. Formato DLA-042.

Nota: Los lineamientos de Uso de Laboratorios, Clínicas y/o Talleres de Institutos, Escuelas Superiores y Bachilleratos derivan del “Reglamento de Laboratorios, Manual de Seguridad, Higiene y Ecología y Documentos Institucionales.

I.-

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:Factores que determinan la velocidad de las

reacciones enzimáticas

No. DE PRÁCTICA: 1 No. DE SESIONES: 4

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO: 5

INTRODUCCIÓN:

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATOEl enfoque central para estudiar el mecanismo de una reacción catalizada por una enzima consiste en medir la velocidad de la reacción y la forma en que se modifica como respuesta a cambios en los parámetros experimentales (Nelson y Cox, 2001).Uno de los factores claves que afecta a la velocidad de una reacción catalizada por una enzima catalizada in vitro es la concentración del sustrato presente [S] (Nelson y Cox, 2001).El complejo enzima – sustrato constituye la clave para entender el comportamiento cinético: la enzima se combina en primer lugar de forma reversible con su sustrato formando un complejo enzima – sustrato en una paso reversible relativamente rápido (Whitaker, 1994).

E + S ES (1)

El complejo enzima sustrato se descompone seguidamente de un segundo paso más lento produciendo el producto de la reacción (P) y a la enzima libre.

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ES E + P (2)

En este modelo la segunda reacción es más lenta y limitada, por lo tanto la velocidad global de la reacción catalizada por la enzima es proporcional a la concentración de la especie que reacciona. Es decir, si aumentamos la concentración de sustrato (S1 < S2 < S3 < S4) la cantidad de producto (P) formado en función del tiempo aumenta progresivamente a medida que se eleva la concentración de sustrato, durante los primeros instantes la velocidad de la reacción permanece constante y aumenta conforme a medida que se eleva la concentración de sustrato, esto significa que, la velocidad inicial de una reacción enzimática es proporcional a la concentración del sustrato. Pero a partir de un determinado momento, ya no aumenta la cantidad de producto formado, en este punto se dice que la reacción ha alcanzado el equilibrio. Ya que la velocidad de la reacción es mayor cuanto más elevada es la concentración de sustrato. El equilibrio se alcanza antes con concentraciones de sustrato altas que con concentraciones bajas.

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMASi se añaden cantidades crecientes de enzima a una reacción en la que se han establecido la condiciones óptimas de pH y temperatura y en la que hay cantidades suficientes de sustrato, se observara que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima, estableciéndose una relación lineal entre ambos parámetros. Cuando se inicia la reacción no existen moléculas de producto que puedan reaccionar en forma inversa para formar sustrato, en este momento, la reacción transcurre a una velocidad inicial, que es directamente proporcional a la concentración de la enzima. Si se representara la aparición del producto en función del tiempo, a distintas concentraciones de enzima (figura).

Las velocidades iniciales estarían dadas por las pendientes de la zona recta de cada línea, observándose, que la velocidad aumenta progresivamente a medida que se incrementa la concentración de la enzima. En todos los casos llega un momento en que se alcanza el equilibrio, es decir, deja de aumentar la concentración de producto formado, este equilibrio se alcanza antes cuanto mayor sea la cantidad de enzima.

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EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD ENZIMÁTICACambios en el pH del medio producen cambios en la velocidad de la reacción (Figura 1) esto es debido a que el pH tiene influencia en la situación iónica de la enzima y del sustrato. En la Figura 1 se aprecia un pH optimo, en este punto, existe una máxima eficacia en la interacción entre las moléculas de la enzima y el sustrato.

La línea acampanada de la Figura 1, se debe a que a valores muy bajos o muy altos de pH, la enzima se desnaturaliza y además a que un cambio de pH, afecta la carga de molécula de la enzima, el sustrato o ambas, modificando el proceso de catálisis, la eficacia de la unión del sustrato a la enzima o ambos procesos. En consecuencia, un cambio de pH hace que aumente o disminuya la eficiencia catalítica de la enzima y por lo tanto la velocidad de la reacción.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LAS REACCIONES ENZIMÁTICASLos cambios en la temperatura afectan las reacciones enzimáticas de diversa maneras. Estas incluyen el efecto en la estabilidad de la enzima, cambios en la solubilidad de gases, el pH del amortiguador, la afinidad de la enzima por activadores e inhibidores, la afinidad enzima – sustrato, velocidad de conversión del sustrato a producto y el agrado de asociación de los multipolipeptidos de la enzima.Dentro de un determinado margen, la velocidad de las reacciones enzimáticas aumenta al elevarse la temperatura. Se denomina coeficiente de temperatura (Q10) al incremento producido en dicha velocidad al aumentar la temperatura 10 °C, y se expresa como la relación de las velocidades a cada una de las temperaturas.

Q10 = Velocidad de la reacción a T2/Velocidad de la reacción a T1

El incremento de la velocidad de la reacción en respuesta a la temperatura llega a un límite por encima del cual se produce un rápido descenso (Figura 1).

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La temperatura a la que se alcanza el valor máximo de velocidad de reacción se denomina temperatura óptima, y suele corresponder a un valor similar o superior al del interior de la célula donde se encuentra la enzima.

OBJETIVO GENERAL:

Evaluar los factores que determinan la velocidad de las reacciones enzimáticas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Evaluar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática.

Evaluar el efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática.

Evaluar el efecto del pH sobre la velocidad de la reacción enzimática.

Evaluar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción enzimática.

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA:

EXTRACCIÓN DE LA ENZIMA:Se homogenizan 0.6 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) insoluble con 5 g de tejido fresco y 30 ml de amortiguador de fosfatos 50 mM a pH 7 (previamente enfriado). El homogenizado se filtra a través de 2 capas de manta de cielo. El filtrado se centrifuga a una velocidad de 13,500 rpm durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se considera como el extracto crudo de la enzima.

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO:

14



En siete tubos de ensayo de 13 x 100 mm se coloca la enzima, el sustrato y el buffer de pH 7.0 como se indica en la siguiente tabla:

Bco. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6Buffer pH 7.0 2700 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μlExtracto enzimático 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μlCatecol 10 mM 50 μlCatecol 20 mM 50 μlCatecol 30 mM 50 μlCatecol 40 mM 50 μlCatecol 50 mM 50 μlCatecol 60 mM 50 μl

La adición del sustrato se realiza justo antes de iniciar la lectura al espectrofotómetro. La lectura se realiza a 420 nm durante 3 minutos, registrando las lecturas de absorbancia inicial y final, utilizando el blanco para calibrar el espectrofotómetro.Las muestras se procesan una enseguida de la otra, teniendo cuidado de no adicionar el sustrato sino justo antes de iniciar la lectura espectrofotométrica.

La actividad se reporta como el cambio de absorbancia por g de tejido y por minuto.

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA:En siete tubos de ensayo de 13 x 100 mm se coloca la enzima, el sustrato y el buffer de pH 7.0 como se indica en la siguiente tabla:

Bco. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6Buffer pH 7.0 2950 μl 2900 μl 2850 μl 2750 μl 2650 μl 2450 μl 2150 μlExtracto enzimático 50 μl 50 μl 100 μl 200 μl 300 μl 500 μl 800 μlCatecol 60 mM 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl



EFECTO DEL pH:En diez tubos de ensayo de 13 x 100 mm se coloca la enzima, el sustrato y el buffer como se indica en la siguiente tabla:

Bco. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9

Agua destilada 2700 μlExtracto enzimático

300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl

Buffer de pH 4.0 2650 μlBuffer de pH 4.5 2650 μl

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Buffer de pH 5.0 2650 μlBuffer de pH 5.5 2650 μlBuffer de pH 6.0 2650 μlBuffer de pH 6.5 2650 μlBuffer de pH 7.0 2650 μlBuffer de pH 7.5 2650 μlBuffer de pH 8.0 2650 μlCatecol 60 mM 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl



EFECTO DE LA TEMPERATURA

El ensayo de actividad se realizará con 2.65 ml amortiguador de fosfatos 0.2 M (pH 7). Se mantienen tanto el buffer como el extracto a las temperaturas de: 15, 20, 25 30, 35, 40, 45 y 50 °C al menos por 10 minutos, se agregan 50 µl de catecol (60 mM) como sustrato y 300 µl del extracto de laenzima. Se lee el cambio de absorbancia, durante 1 minuto, a una longitud de onda de 420 nm.La actividad se reportará como el cambio de absorbancia por g de tejido y por minuto.

Bco. Tubo 115°C

Tubo 220°C

Tubo 325°C

Tubo 430°C

Tubo 535°C

Tubo 640°C

Tubo 745°C

Tubo 850°C

Extracto enzimático 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μlBuffer de pH 7.0 2700 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μlCatecol 60 mM 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl

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MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:Sesión 1:

MATERIAL/UTENSILIOSCANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

7 Tubos de ensayo 13mm x 100mm2 Tubos de centrífuga

Hermle refrigeradaDe fondo redondo, con tapón de rosca,

de 50 ml.1 Probeta Graduada, de 50 ml.1 Mortero con pistilo Capacidad de 100 ml1 Embudo Chico, de cristal o de

plástico, de cuello corto

2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml1 Matraz aforado Capacidad de 25 ml1 Matraz aforado Capacidad de 50 ml1 Matraz aforado Capacidad de 100 ml7 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml1 Micropipeta Capacidad de 50 μl1 Micropipeta Capacidad de 100 μl1 Micropipeta Capacidad de 1000 μl1 Gradilla Para tubos de 13 x

100mm2 Trozos manta de cielo 25 x 25 cm aprox.1 Piceta Capacidad de 100 ml5 Celdas para

espectrofotómetroDe plástico o de vidrio, de 3 ml

REACTIVOS/INSUMOS

17



CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.1 Papa Fresca, sin daño

aparente.0.6 g Polivinilpolipirrolidona Insoluble30 ml Buffer de fosfatos 50 mM, pH 7.0

100 ml Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7.025 ml Catecol 0.1 mM25 ml Catecol 1.0 mM25 ml Catecol 2.0 mM25 ml Catecol 4.0 mM25 ml Catecol 6.0 mM25 ml Catecol 8.0 mM25 ml Catecol 10.0 mM25 ml Buffer de calibración pH 4.025 ml Buffer de calibración pH 7.0

EQUIPOCANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

1 pH metro1 Espectrofotómetro1 Centrífuga refrigerada1 Balanza analítica Sensibilidad de

0.0001 gSesión 2:






2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml1 Matraz aforado Capacidad de 25 ml1 Matraz aforado Capacidad de 50 ml1 Matraz aforado Capacidad de 100 ml8 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml1 Micropipeta Capacidad de 50 μl1 Micropipeta Capacidad de 100 μl1 Micropipeta Capacidad de 1000 μl1 Gradilla Para tubos de 13 x

100mm2 Trozos manta de cielo 25 x 25 cm aprox.

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1 Piceta Capacidad de 100 ml5 Celdas para


REACTIVOS/INSUMOSCANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

1 Papa Fresca, sin daño aparente.

0.6 g Polivinilpolipirrolidona Insoluble30 ml Buffer de fosfatos 50 mM, pH 7.0

100 ml Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7.010 ml Catecol 60 mM25 ml Buffer de calibración pH 4.025 ml Buffer de calibración pH 7.0



0.0001 g

Sesión 3:MATERIAL/UTENSILIOS

CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.10 Tubos de ensayo 13mm x 100mm2 Tubos de centrífuga




2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml1 Matraz aforado Capacidad de 25 ml1 Matraz aforado Capacidad de 50 ml1 Matraz aforado Capacidad de 100 ml

10 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml1 Micropipeta Capacidad de 50 μl1 Micropipeta Capacidad de 100 μl1 Micropipeta Capacidad de 1000 μl1 Gradilla Para tubos de 13 x

100mm2 Trozos manta de cielo 25 x 25 cm aprox.

19



1 Piceta Capacidad de 100 ml5 Celdas para





100 ml Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7.025 ml Catecol 60 mM25 ml Buffer 100 mM, pH 4.025 ml Buffer 100 mM, pH 4.525 ml Buffer 100 mM, pH 5.025 ml Buffer 100 mM, pH 5.525 ml Buffer 100 mM, pH 6.025 ml Buffer 100 mM, pH 6.525 ml Buffer 100 mM, pH 7.025 ml Buffer 100 mM, pH 7.525 ml Buffer 100 mM, pH 8.025 ml Buffer de calibración pH 4.025 ml Buffer de calibración pH 7.0



0.0001 g

Sesión 4:MATERIAL/UTENSILIOS

CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.9 Tubos de ensayo 13mm x 100mm2 Tubos de centrífuga




2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml1 Matraz aforado Capacidad de 25 ml1 Matraz aforado Capacidad de 50 ml

20



1 Matraz aforado Capacidad de 100 ml8 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml1 Micropipeta Capacidad de 50 μl1 Micropipeta Capacidad de 100 μl1 Micropipeta Capacidad de 1000 μl1 Gradilla Para tubos de 13 x






100 ml Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7.010 ml Catecol 60 mM25 ml Buffer de calibración pH 4.025 ml Buffer de calibración pH 7.0


1 pH metro1 Espectrofotómetro Con control de

temperatura1 Centrífuga refrigerada1 Balanza analítica Sensibilidad de

0.0001 g

CUESTIONARIO: 1. Investigar el significado de Km y Vmáx.

2. Investigar el efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas.

3. Investigar el efecto del pH sobre la estabilidad de las enzimas.

4. Investigar qué es la desnaturalización de una enzima.

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: Graficar el inverso de la velocidad contra el inverso de la concentración del sustrato y calcular los valores de Km y Vmáx.

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Graficar la velocidad de la reacción enzimática contra la concentración de enzima.Graficar la velocidad de la reacción enzimática contra el pH y determinar el pH óptimo de la reacción.Graficar la velocidad de la reacción enzimática contra la temperatura y determinar la temperatura óptima.Calcular el valor de Q10 con los datos obtenidos en la práctica.

III.- BIBLIOGRAFÍAFox, P. F. 1991. Food Enzymology vol. 1. Ed. Elsevier Applied Sciencie. New York. USA.Whitaker, J. R. 1994. Principles of Enzymology for the Food Sciencie. Ed. Marcel Dekker. New York. Second Edition.Whitaker, J. R., Voragen, A. G. and Wong, W. S. 2003. Handbook of Food Enzymology. Marcel Dekker. New Cork.

I.-

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:Inhibición de la actividad enzimática



INTRODUCCIONA los compuestos que reducen la velocidad de una reacción catalizada por la actividad enzimática, se le da el nombre de inhibidores enzimáticos, son de suma importancia practica en toxicología, farmacología y en la ciencia de los alimentos, Los inhibidores son de gran valor en la elucidación de los mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas, en la determinación de los gropos que están presentes en el sitio activo de la enzima y en la determinación de la secuencia de las rutas metabólicas. Los inhibidores también son usados en el control de plagas.Los inhibidores se pueden dividir en dos tipos, inhibidores reversibles e irreversibles, esta división se basa en consideraciones cinéticas.En la Inhibición irreversible, el inhibidor queda unido a la enzima de forma covalente o no covalente, es tan fuerte esta unión que su disociación es muy lenta.

E + I EI

La inhibición reversible, se caracteriza por la rápida disociación del complejo enzima – inhibidor (EI).

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La inhibición reversible puede dividirse en tres distintos Inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos e inhibidores acompetitivos.

OBJETIVO GENERAL:

Evaluar el efecto de los inhibidores sobre las reacciones enzimáticas.


Evaluar el efecto inhibidor del ácido ascórbico sobre la enzima polifenol oxidasa.

Evaluar el efecto de la concentración de ácido ascórbico sobre los parámetros cinéticos (Km y Vmáx.) de la polifenol oxidasa.

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA:EXTRACCIÓN DE LA ENZIMA:Se homogenizan 0.6 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) insoluble con 5 g de tejido fresco y 30 ml de amortiguador de fosfatos 50 mM a pH 7 (previamente enfriado). El homogenizado se filtra a través de 2 capas de manta de cielo. El filtrado se centrifuga a una velocidad de 13,500 rpm durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se considera como el extracto crudo de la enzima.

EFECTO DEL INHIBIDOREn ocho tubos de ensayo de 13 x 100 mm se coloca la enzima, el inhibidor (Ácido ascórbico) el sustrato y el buffer de pH 4.5 como se indica en las siguientes tablas:

Conc. del inhibidor: 0Bco. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

Ácido ascórbico 0 0 0 0 0 0 0 0Extracto enzimático 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μlBuffer pH 4.5 2700 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μlCatecol 0.1 mM 50 μlCatecol 1.0 mM 50 μlCatecol 2.0 mM 50 μlCatecol 4.0 mM 50 μlCatecol 6.0 mM 50 μlCatecol 8.0 mM 50 μlCatecol 10.0 mM 50 μl

Conc. del inhibidor: 0.01%Bco. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

Ácido ascórbico 0.01%

50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl

Extracto enzimático 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μlBuffer pH 4.5 2650 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μlCatecol 0.1 mM 50 μlCatecol 1.0 mM 50 μlCatecol 2.0 mM 50 μlCatecol 4.0 mM 50 μlCatecol 6.0 mM 50 μlCatecol 8.0 mM 50 μl

23



Catecol 10.0 mM 50 μl


Ácido ascórbico 0.1% 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μlExtracto enzimático 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μlBuffer pH 4.5 2650 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μlCatecol 0.1 mM 50 μlCatecol 1.0 mM 50 μlCatecol 2.0 mM 50 μlCatecol 4.0 mM 50 μlCatecol 6.0 mM 50 μlCatecol 8.0 mM 50 μlCatecol 10.0 mM 50 μl


Ácido ascórbico 1.0% 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μlExtracto enzimático 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μl 300 μlBuffer pH 4.5 2650 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μl 2600 μlCatecol 0.1 mM 50 μlCatecol 1.0 mM 50 μlCatecol 2.0 mM 50 μlCatecol 4.0 mM 50 μlCatecol 6.0 mM 50 μlCatecol 8.0 mM 50 μlCatecol 10.0 mM 50 μl

La mezcla del inhibidor (Ácido ascórbico) con el extracto se realiza 1 minuto antes de adicionar al amortiguador y sustrato. La lectura se realiza a 420 nm durante 3 minutos, registrando las lecturas de absorbancia inicial y final, utilizando el blanco para calibrar el espectrofotómetro.Las muestras se procesan una enseguida de la otra, teniendo cuidado de no adicionar el sustrato sino justo antes de iniciar la lectura espectrofotométrica.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:






2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml1 Matraz aforado Capacidad de 25 ml

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1 Matraz aforado Capacidad de 50 ml1 Matraz aforado Capacidad de 100 ml7 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml1 Micropipeta Capacidad de 50 μl1 Micropipeta Capacidad de 100 μl1 Micropipeta Capacidad de 1000 μl1 Gradilla Para tubos de 13 x




1 Brócoli Fresco, sin daño aparente.


100 ml Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7.025 ml Catecol 0.1 mM25 ml Catecol 1.0 mM25 ml Catecol 2.0 mM25 ml Catecol 4.0 mM25 ml Catecol 6.0 mM25 ml Catecol 8.0 mM25 ml Catecol 10.0 mM25 ml Ácido ascórbico 0.01%25 ml Ácido ascórbico 0.1%25 ml Ácido ascórbico 1.0%25 ml Buffer de calibración pH 4.025 ml Buffer de calibración pH 7.0



0.0001 g

CUESTIONARIO: 1. Investigar los distintos tipos de inhibición enzimática.

2. Investigar cómo se modifican los parámetros cinéticos con la presencia de los distintos tipos de inhibidores en las reacciones enzimáticas.

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II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: Graficar el inverso de la velocidad contra el inverso de la concentración del sustrato y calcular los valores de Km y Vmáx. en presencia y en ausencia del inhibidor.Con los datos obtenidos, establecer qué tipo de inhibición se presenta en esta reacción.


26



I.-

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:Inactivación térmica de la peroxidasa



INTRODUCCIONLas frutas y verduras frescas contienen muchas enzimas activas que provocan el deterioro de la calidad y el valor nutricional posterior a la cosecha. Este deterioro se produce incluso cuando los productos se congelan. Por lo general las frutas y verduras se escaldan antes de congelarlas o enlatarlas para inactivar estas enzimas.La estabilidad térmica de las enzimas varían considerablemente, como se muestra en la figura. Por lo tanto, las condiciones del blanqueado necesitan enfocarse a las enzimas más resistentes al calor. La peroxidasa es una de las enzimas más estables al calor, por lo que, resulta un buen indicador de qué tan adecuado es el escaldo, ya que los tratamientos térmicos suficientes para inactivar a la peroxidasa también inactivan a la mayoría de las otras enzimas.Las peroxidasas son oxidorreductasas, es decir, son miembros del grupo de enzimas que catalizan reacciones de oxidación – reducción. Como su nombre lo indica, uno de los sustratos de la peroxidasa es un peróxido:

ROOH + AH2 H2O + ROH + A

En la reacción el AH2, un donador de hidrógeno, se oxida por acción de un peróxido, ROOH. Muchos peróxidos tienen baja especificidad, es decir, catalizan la oxidación de muchos donadores de hidrógeno distintos. Algunos sustratos comunes son los compuestos fenólicos y otros compuestos aromáticos. Además, o un hidroperóxido de lípidos o el peróxido de hidrógeno funciona como el agente oxidantes.

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El peróxido de hidrógeno oxida al guayacol (ο-metoxifenol) para formar productos de estructura desconocida que son de color café rojizo. La peroxidasa cataliza la reacción proporcionan un ensayo conveniente y cualitativo para determinar si el escaldado es adecuado. Los sustratos peróxido de hidrógeno y guayacol se ponen en contacto con hortalizas y frutas y se incuban durante un breve periodo de tiempo, si aparece un color café rojizo, significa que la peroxidasa presente esta activa, lo que indica que el escaldado fue inadecuado.

OBJETIVO GENERAL:

Evaluar la inactivación térmica de las enzimas.


Evaluar el efecto del escaldado sobre la inactivación de la enzima peroxidasa.

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA:INACTIVACIÓN TÉRMICA DE LA ENZIMASe corta en pequeños trozos el brócoli, cada trozo con un peso aproximado de 5 g. y se calientan agua a ebullición durante 0, 1, 2, 5 y 10 minutos, posteriormente los trozos de brócoli se enfrían en agua con hielo.

EXTRACCIÓN DE LA ENZIMA:Se homogenizan 0.6 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) insoluble con 5 g de tejido y 30 ml de amortiguador de fosfatos 50 mM a pH 7 (previamente enfriado). El homogenizado se filtra a través de 2 capas de manta de cielo. El filtrado se centrifuga a una velocidad de 13,500 rpm durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se considera como el extracto crudo de la enzima.

ENSAYO DE ACTIVIDADEl ensayo de actividad se realiza con 2.65 ml de buffer de fosfatos 0.2 M (pH 4.5), 100 μl de guayacol (al 1% en etanol) y 100 μl de peróxido de hidrógeno (0.5 %), como sustratos y se inicia la reacción agregando 150 μl del extracto de la enzima. Se lee el cambio de absorbancia, durante 3 minutos, a una longitud de onda de 420 nm, en un espectrofotómetro. La actividad se reporta como el cambio de absorbancia por g de tejido y por minuto.

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Bco. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9 Tubo 10

Buffer pH 4.5 2800 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μl 2650 μlGuayacol (1% en etanol)

100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl

Peróxido de hidrógeno al 0.5%

100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl

Extracto enzimático

t0

150 μl 150 μl


t1

150 μl 150 μl


t2

150 μl 150 μl


t5

150 μl 150 μl


t10

150 μl 150 μl

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:






5 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml1 Matraz aforado Capacidad de 25 ml1 Matraz aforado Capacidad de 50 ml1 Matraz aforado Capacidad de 100 ml7 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml1 Micropipeta Capacidad de 50 μl1 Micropipeta Capacidad de 100 μl

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1 Micropipeta Capacidad de 1000 μl1 Gradilla Para tubos de 13 x




1 Brócoli Fresco, sin daño aparente.

3.0 g Polivinilpolipirrolidona Insoluble30 ml Buffer de fosfatos 50 mM, pH 7.050 ml Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 4.510 ml Guayacol Al 1% en etanol25 ml Peróxido de

hidrógenoAl 0.5%

25 ml Buffer de calibración pH 4.025 ml Buffer de calibración pH 7.0



0.0001 g

CUESTIONARIO: 1. Investigar las implicaciones de la actividad de la peroxidasa en los vegetales.

II.- REPORTE DE LA PRÁCTICA: Graficar la actividad enzimática contra el tiempo de tratamiento térmico.

Calcular el porcentaje de inhibición con respecto a la muestra sin tratamiento térmico.


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