Manual Micro Reunion

5/13/2018 Manual Micro Reunion - slidepdf.com

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Manual de Prácticas

Módulo profesional IITécnico en Biotecnología

Realizar el análisis físico-químico y microbiológico enmuestras de alimentos bajo normas de seguridad e

higiene.

Sub módulo II

Realizar el análisis microbiológico en muestras dealimentos

Versión 1.0

1



Enero de 2010Profesores que elaboraron el manual de estudio de la carrera de Técnico en

Biotecnología

Nombre del Maestro Plantel

Aguilar Rocha Ma. Catalina Irapuato IJiménez Magdaleno Luis Antonio Irapuato I

Ricaud Ortiz Sandra Villagrán

Vázquez Martínez Rosalba Villagrán

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1. Preparar material para esterilizar yAplicar métodos de esterilización:

Calor seco.Calor húmedo.Filtración.Radiación UV.

Habilidades y destrezas

para

2. Preparar medios de cultivo:

Medios líquidos.

Medios sólidos.

Medios semisólidos.

3. Realizar técnicas deinoculación:Estría simple.

Estría cruzada.

Punción.

4. Toma de muestras para el posterior análisis microbiológico.

5. Aplicar las técnicas de análisis microbiológicos aefectuar en una muestra de alimentos, bajo la NOM.a) Recuento de mesófilos aerobios totales.b) Recuento de hongos y levaduras.c) Recuento de coliformes totales y fecales.d) Recuento de staphylococcus aureus.

e) Recuento de Salmonella y Shigella

Conocimiento sobre:NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios.Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisismicrobiológico.NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994,Bienes y servicios.Método para la cuenta aerobias en placa.08-25-95 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM -113-SSA1-1994, Bienes yservicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales enplaca.10-19-95 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994, Bienes yservicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número másprobable.09-13-95 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-111-SSA1-1994, Bienes yservicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.09-25-95NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, Bienes yservicios. Método para la determinación de estaphylococcus aureus enalimentos.09-22-95 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, Bienes y

servicios. Método para la determinación de Samonella en alimentos.

ActitudesOrden.

Limpieza

responsabilidad

REALIZAR ANALISIS MICROBIOLOGICOSEN MUESTRAS DE ALIMENTOS BAJONORMAS DE SEGURIDAD E HIGIENE

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Justificación de la Carrera

En los albores del siglo XXI nuestro país esta experimentando grandes retos

científicos, tecnológicos, sociales, y políticos, generando grandes cambios para los

cuales debemos estar preparados.

El proceso de globalización esta colocando a la biotecnología en un primer plano, al

hacer uso de microorganismos, células vegetales, animales, sus partes o fracciones

se pueden generar bienes o servicios con el fin de contribuir a una mejor calidad de

vida participando activamente en el desarrollo sustentable, generando beneficios

ambientales, alimenticios farmacéuticos e industriales.

En los CECYTEs nos preocupamos por formar técnicos en el área de biotecnología

que puedan insertarse en los sitios laborales, donde ofrezcan servicios de análisis

físico – químico, identificación de microorganismos, procesamiento de alimentos de

origen vegetal y animal, elaboración de productos fermentados, áreas donde se

lleven a cabo procesos biotecnológicos, propagación de plantas en agricultura

protegida, así como almacenamiento de granos y semillas.

Con la adquisición de estas capacidades, los alumnos egresados de los colegios

aportarán sus conocimientos, habilidades, destrezas, en el desarrollo sustentable

del país, comprometido con la sociedad y el medio ambiente.

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Estructura de la Carrera de Técnico en Biotecnología

Propósito de la Carrera:

Al término de la carrera el egresado será capaz de realizar análisis físico –químico y microbiológico, procesos fermentativos y aplicar procesosbiotecnológicos en las áreas alimentarías, agropecuarias, ambientales,optimizando los recursos naturales bajo el esquema del desarrollo sustentable.

Perfil Profesional:

Al término de la carrera el egresado será capaz de laborar en áreas alimentarías,agropecuarias y ambientales, donde se utilicen procesos biotecnológicos. Asímismo contará con los principios para auto emplearse mediante el desarrollo deproyectos de tipo empresarial.

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PRESENTACION:

El laboratorio de microbiología tiene como principal objetivo desarrollar

habilidades y destrezas en el estudiante (competencias), las cuales le permitirán en su

momento, desenvolverse en un laboratorio de control de calidad, el presente manual sedivide en dos secciones, la primera da a conocer las técnicas básicas de esterilización

de material, preparación de medios de cultivo y técnicas de inoculación. En la segunda

sección se pretende enseñar las aplicaciones en la realización del análisis

microbiológico basándose en las normas oficiales para la cuantificación de

microorganismos indicadores (cuenta total, coliformes en placa y por la técnica del

NMP, hongos y levaduras, y estafilococos áureos).

METODOLOGÍA:

Las practicas se desarrollaran cada semana (pueden ser hasta 2 sesiones por

practica), para ingresar al laboratorio el alumno deberá revisar anticipadamente la

práctica del día, debiendo realizar un diagrama de flujo, este se revisara al ingresar al

laboratorio. Durante la realización el alumno deberá documentar todas las actividades

realizadas en su manual o cuadernillo de laboratorio (bitácora), para lo anterior el

manual cuanta con dos hojas interpuestas entre cada una de los temas NO SE

ACEPTAN HOJAS SUELTAS.Las practicas requieren en la mayoría de los casos un seguimiento, pues los

microorganismos una vez inoculados sobre los medios y después del periodo de

incubación (24 a 48 hrs.) crecerán y se harán evidentes, es entonces cuando se

describen o contabilizan, por lo que el alumno deberá asistir FUERA DE HORARIO DE

CLASE a revisar el material y hacer las observaciones pertinentes.

OBJETIVO:

El alumno será capaz de realizar análisis microbiológicos en muestras de

alimentos, aplicando Normas Oficiales vigentes y siguiendo las reglas de seguridad e

higiene estipuladas en las mismas.

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REGLAMENTO:

1. Esta estrictamente prohibido comer.

2. Es obligatorio guardar disciplina en el interior del laboratorio.3. Utilizar bata de laboratorio, preferentemente de manga larga y debidamente

abotonada. El alumno ingresara con la bata puesta y saldrá con ella del

laboratorio.

4. Únicamente se permite tener sobre la mesa de trabajo el cuadernillo de notas,

los demás útiles escolares se colocaran en la parte inferior de las mesas, en el

área destinada para este fin.

5. es necesario solicitar el material llenando previamente el vale, este ampara el

material indicado y es responsabilidad de todo el equipo, no únicamente de

quien firma. Se deberá entregar junto con el vale la credencial escolar de quien

firma, la credencial es intransferible y únicamente el titular podrá solicitar el

material.

6. la solicitud y entrega del material se deberá hacer en orden y de forma

progresiva por equipo.

7. Al inicio y al final de la práctica deberá de limpiar el área de trabajo y las tarjas

empleadas.8. el material que adeude el alumno deberá de ser restituido al almacén en un

periodo máximo de una semana.

9. el material es responsabilidad de los alumnos que lo solicitan y deberá de

tratarse con cuidado, en el caso in fortuito de que algún alumno quebrara por

accidente un material de un precio considerable este será pagado por todo el

grupo, solidarizándose sus compañeros. Este punto deberá tratarse en plenaria

de acuerdos y deberá hacerse del conocimiento de todos.

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INDICE.

Mapa curricular 3Justificación de la carrera 4Estructura de la carrera 5

Presentación 6Objetivo general 6Reglamento 7

Práctica 1 Preparación y esterilización de material 10Práctica 2 Preparación de medios de cultivo 16Práctica 3 Técnicas de inoculación 20Práctica 4 Morfología colonial y crecimiento en medio líquido y

sólido.26

Práctica 5 Identificación de bacterias 31

Práctica 6 Manejo y uso de microscopio 36Práctica 7 Aislamiento e identificación de hongos 41Práctica 8 Muestreo 48

Aplicar técnicas de análisis microbiológico a efectuar

en una muestra de alimentos.

• Recuentos de mesófilos aéreos totales.

• Recuento de hongos y levaduras.

• Recuento de estaphylococcus aureus.

• Recuento de Salmonella y Shigella.

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APLICACIONES:

AnexosAnexo 1 NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y

servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentospara su análisis microbiológico.

Anexo 2 NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes yservicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en

8



placa.

Anexo 3 08-25-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-113-SSA1-1994,Bienes y servicios. Método para la cuenta demicroorganismos coliformes totales en placa.

Anexo 4 10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994,Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes.Técnica del número más probable.

Anexo 5 09-13-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994,Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos ylevaduras en alimentos.

Anexo 6 09-25-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994,Bienes y servicios. Método para la determinación deStaphylococcus aureus en alimentos.

Anexo 7 09-22-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994,Bienes y servicios. Método para ladeterminación de salmonella en alimentos.

Anexo 8Lista de cotejo y guía de observación.

PRACTICA 1

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL

I. COMPETENCIA

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Conocer las técnicas de esterilización y la preparación del material previo al proceso,

seleccionara la técnica más adecuada dependiendo de la naturaleza del material a

esterilizar.

II. OBJETIVO

Preparar para esterilizar el material de vidrio más usado en el laboratorio de

Microbiología. Conocer el material y equipo más común para la esterilización y trabajo

en condiciones de esterilidad.

III. INTRODUCCIÓN

La esterilización es un proceso mediante el cual se eliminan por remoción o

muerte todos los microorganismos viables de un objeto, superficie o medio. Un objeto

libre de cualquier forma de vida se dice que esta estéril. El concepto de esterilidad es

absoluto, es decir, no existe un material casi, más o menos, o 99% estéril.

En el trabajo cotidiano de un laboratorio de Microbiología es necesario que todo

el material como pipetas, tubos de ensaye, cajas de Petri de vidrio o de plástico,

medios de cultivo y soluciones estén estériles. Debe prevenirse que el materialesterilizado se conserve estéril. Así, antes de esterilizarse, a los matraces con medio

de cultivo se les pone un tapón de algodón que evitara el acceso de microorganismos

del ambiente al medio de cultivo. También es necesario proteger este tapón con papel

para evitar que se humedezca durante la esterilización con calor húmedo, algunos

laboratorios utilizan tapones de plástico o metálicos con la misma finalidad.

Existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, la selección de uno o

de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar. Por ejemplo, la

esterilización con calos húmedo, generalmente se realiza en un autoclave a 121 0 C

durante 15 minutos, la temperatura se alcanza utilizando vapor de agua a una presión

de 15 lb/pulg2 (2 atm/cm2). Estas condiciones de esterilización con calor húmedo

pueden variar de acuerdo al volumen y tipo de la autoclave que se usa y del material a

10



esterilizar. El material que se esteriliza en la autoclave no debe estar herméticamente

cerrado. La muerte de los organismos contaminantes ocurre principalmente por

desnaturalización de las macromoléculas (proteínas, ARN y ADN) y coagulación de

proteínas.

La esterilización con calor seco se usa principalmente para material de vidrio y

materiales sólidos estables al calor, requiere mayor duración e intensidad porque la

conducción del calor es menos rápida que en un ambiente húmedo. La temperatura

que se utiliza es generalmente entre 160 y 180 0C durante 1.5 horas. Las cajas de Petri

de vidrio y las pipetas se colocan en cilindros de metal con aberturas que permitan el

paso del aire caliente. La inactivación de los contaminantes ocurre por perdida de agua

y oxidación de todos sus componentes esenciales.

La filtración a través de membranas es usada para esterilizar soluciones desustancias termolábiles en donde los microorganismos son retenidos en el filtro, el

filtrado estéril debe recibirse en un recipiente también estéril. Los virus y algunos tipos

de bacterias muy pequeñas como ß - dellovibrio y algunas espiroquetas atraviesan

estos filtros de membrana.

En las campanas de flujo laminar que se usan como áreas estériles en el trabajo

en microbiología, el aire se esteriliza por filtración a través de mallas de fibras de

diversos materiales (filtros absolutos).El gas oxido de etileno y las radiaciones ionizantes son utilizados para esterilizar

material de plástico sensible al calor, porque este gas difunde fácilmente a través de

polietileno, papel y cartón. Estos métodos no son recomendados para esterilizar

soluciones o medios de cultivo.

Para determinar la eficiencia del proceso de esterilización se emplean los

indicadores biológicos de esterilización. Específicamente, cuando se esteriliza con calor

húmedo se utilizan, junto al material que es esteriliza, ampolletas que contienen

esporas viables de Bacillus stearothermophilus que son inactivadas a 1210 C durante

12 min. Después de la esterilización, se incuban las esporas y se analiza si estas

sobrevivieron o no al proceso de esterilización. También existen cintas que con un vire

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de un indicador químico indican si se alcanzaron las condiciones de la esterilización por

calor o con oxido de etileno.

MATERIAL y EQUIPO REACTIVOS y MUESTRASMatraz Erlenmeyer 250 ml Agua destiladaTubos de ensaye de 16 x 150 Organismos indicadores (estreptococo

estearotermophylus)Tubos de ensaye de 13 x 100.Frascos para diluciónPipetas de 1, 5 y 10 ml.Cajas de Petri de vidrio.

Algodón, papel de envoltura, gasa decielo, papel aluminio, cinta testigo ymasking tape

AutoclaveHorno Pasteur Sistema de filtración milliporeCilindros de acero inoxidable para cajaspetri y pipetas.Pinzas de disección, mechero bunsen,tijeras,

Para la parte demostrativa: Equipo Millipore de esterilización por filtración, filtrospequeños para esterilizar soluciones. Tapones de plástico o metal para tubos de

ensaye, pipeteros y recipientes metálicos para cajas de Petri.

V. PROCEDIMIENTO

1. . Preparación de tubos de ensayo y matraces para esterilizar en la autoclave:

a) Colocar con una pipeta de 10 ml de capacidad 9 ml de agua destilada en cada uno

de los tubos de 16 x 150.

b) Tanto a estos tubos con agua como a los de 13 x 100 vacíos y matraces hacerles a

cada uno un tapón de algodón con ayuda de las pinzas como lo indicara el profesor.

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c) Colocar los tubos en una canastilla y protegerlos con papel.

d) Anotar en el material preparado nombre, equipo, sección y grupo.

2. Preparación de pipetas para esterilizar en la autoclave:

a) Colocar en la boca de la pipeta un filtro de algodón con ayuda de un clip desdoblado.

El algodón no debe quedar ni muy apretado ni muy flojo, debe permitir el paso del aire

pero sin moverse.

b) Flamear con el mechero los restos de algodón que salen de la boca de la pipeta.

c) Envolver con papel cada pipeta siguiendo las instrucciones del profesor.

d) Marcar el volumen de cada pipeta en la envoltura.

3. Preparación de cajas de Petri para esterilizar en la autoclave:a) Colocar 10 cajas de Petri de cinco en cinco.

b) Envolverlas con papel siguiendo las instrucciones del profesor.

c) Anotar los datos necesarios para su fácil identificación.

4. Ensamblaje del sistema Millipore de filtración (demostrativo): el profesor enseñara el

equipo Millipore de filtración explicando la forma como funciona. Asimismo se

mostraran algunos filtros pequeños y membranas para la esterilización desoluciones.

5. Otros aditamentos usados para esterilizar material en microbiología (demostrativo):

el profesor enseñara tapones, pipeteros y recipientes metálicos para cajas de Petri

usados en la esterilización por calor seco.

6. Observación de las autoclaves del laboratorio: acudir acompañados del profesor a

conocer las autoclaves usadas para esterilizar material y se explicara su

funcionamiento.

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS.

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VII. CONCLUSIONES.

VIII. CUESTIONARIO.

1.¿Con que finalidad se les pone a las pipetas un filtro de algodón?

2.¿Cuál es el método más apropiado para esterilizar el siguiente material?

-Solución de vitaminas.

-Cajas de Petri de plástico.

-Cajas de Petri de plástico de desecho.

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-Aceite mineral.

-Instrumento de cirugía.

-Cadáveres de animales de experimentación de laboratorio.

-Sangre de desecho.

3.¿Cómo deben obtenerse los líquidos biológicos (por ejemplo sangre) para preparar

un medio de cultivo?

IX. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA.

PRÁCTICA 2

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

I.COMPETENCIA

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El alumno preparara y esterilizara el material y medios de cultivo para el análisis

microbiológico de alimentos, conocerá la técnica de trabajo en condiciones asépticas

para prevenir contaminaciones de microorganismos no deseados.

II. OBJETIVOS:

- Conocer algunos medios de cultivo de empleo común en el Laboratorio de

Microbiología.

- Conocer la composición y principales aplicaciones de los medios de cultivo.

- Adquirir habilidad en la correcta preparación, evaluación y almacenamiento

de los medios de cultivo.

III. INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son esenciales para el trabajo en el Laboratorio de

Microbiología, específicamente en bacteriología cuando se tienen que aislar e

identificar bacterias.

El uso de los medios de cultivo no sólo se reduce al diagnóstico clínico, sino que

incluye también áreas tan importantes como es el control de calidad de alimentos y

medicamentos, entre muchas aplicaciones.Como se sabe, de forma general los medios de cultivo se definen como mezclas

de sustancias que promueven el desarrollo de los microorganismos. Existen diversas

clasificaciones según la composición u objetivo que se persiga, incluso en base a su

consistencia tenemos que se clasifican en: sólidos, semisólidos y líquidos.

La mayor parte de los medios de cultivo comúnmente empleados, se encuentran

disponibles en el comercio bajo la forma de productos deshidratados, los cuales se

reconstituyen con agua destilada y después son esterilizados en la forma convencional;

las instrucciones del fabricante deben seguirse al pie de la letra para obtener resultados

satisfactorios.

MATERIAL y EQUIPO REACTIVOS y MUESTRASTubos De ensayo con tapón de rosca Caldo nutritivo

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Placas de Petri Agar nutritivoBotellas de dilución de leche Agua destilada

Agitador magnético Agar bacteriológicoGradillasProbeta graduada

Pipetas graduadasEspátulaMechero Fisher

Balanza granatariaAutoclaveCampana de flujo laminar

Parrilla eléctricaIncubadora bacteriológicaRefrigerador

V. PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS (AGARES)

1. En una balanza granataría, pesar la cantidad de medio requerida, tomando en

cuenta la relación peso-volumen indicada por el fabricante en la etiqueta.

2. Colocar el polvo dentro de un matraz Erlenmeyer con ayuda de una probeta

graduada adicionar la cantidad correspondiente de agua destilada, agitar

suavemente la mezcla para homogenizarla.

3. Calentar el medio de cultivo ya reconstituido, hasta ebullición cuidando que no se

derrame y con agitación continua.

4. Tapar el matraz sin apretar el tapón e introducirlo en el autoclave, cerrar éste

perfectamente y esterilizar el medio de cultivo a 15 lb de presión por un tiempo de

15 min.

5. Una vez alcanzadas las condiciones de esterilización y transcurrido el tiempo, abrir

el autoclave (previo descenso de la presión) y sacar el matraz con el medio de

cultivo, dejar enfriar hasta una temperatura aproximada de 45 grados centígrados.

6. Dentro de una campana de flujo laminar, empleando cofia y cubre boca, adicionar a

cada una de las placas de Petri (ESTÉRILES) entre 15 y 20 ml. Del medio.

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7. Dejar solidificar, rotular (indicando contenido, fecha de preparación, etc.), invertir las

placas y en esa posición incubarlas por un tiempo de 24 horas a 35ºC.

8. Sacar las placas de la incubadora una vez que ha concluido el tiempo de

incubación; revisar cuidadosamente una por una, desechando aquellas que

presenten algún tipo de desarrollo microbiano (contaminación).

9. Almacenar en el refrigerador (temp. Promedio de 5°C) todas aquellas placas con

medio de cultivo que satisficieron la prueba de esterilidad, hasta su uso y/o

caducidad.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SEMISÓLIDOS Y LÍQUIDOS

(CALDOS)

Se siguen exactamente los mismo pasos, con la diferencia de que en estos casos los

medios son vaciados (con medida) antes de la esterilización.

VI. OBSERVACIÓN Y RESULTADOS

VII. CONCLUSIÓN

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Que función tiene la peptona?

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2. ¿Que es el agar - agar?

3. ¿Cómo define medio selectivo?

IX. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

PRACTICA 3

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN

I. COMPETENCIA

El alumno conocerá y aplicará las técnicas de inoculación del microorganismo

dependiendo de la naturaleza física del medio a inocular, conocerá las técnicas

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cualitativas (estría simple y cruzada) y cuantitativas (siembra en superficie y vertido en

placa) consideradas en las Normas Oficiales Mexicanas.

OBJETIVO

El alumno aprenderá a utilizar las distintas técnicas de inoculación para

bacterias (las técnicas de aislamiento de hongos se manejaran en otra practica).

II. INTRODUCCIÓN.

Se entiende por cultivo un medio en el cual crecen bacterias u otros

microorganismos. Las diferentes especies de hongos y bacterias, cuando crecen en

el mismo medio de cultivo lo hacen en forma completamente distinta; por este

motivo, conviene conocer la apariencia o características de la colonia de cada

especie en particular, para poder reconocer y así aislar los microorganismos de

interés. Por esta razón se han ideado distintos métodos de inoculación; para

bacterias se tienen el de estría cruzada, siembra en picad, siembra en tubo

inclinado, inoculación en caldo, vertido en placa, entre otros. En hongos se tienen el

monocultivo, las diluciones, etc.

MATERIAL y EQUIPO REACTIVOS y MUESTRASMatraz con medio de cultivo licuado yestéril.

Cultivos bacterianos en tubo y en

placa (E.coli, B.subtilis)Cajas de petri con medio estéril. Alcohol

Tubos de ensaye con medio estérilinclinadoTubos de ensaye con medio estéril

vertical.Tubos de ensaye con caldo estéril.Mechero de Bunsen

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Asa bacteriológica con extremo recto ycircular Varilla de vidrio en forma de “L”.Pipetas granuladas de 1ml estériles

Algodón

Incubadora a 37º CAtomizadores

V. METODOLOGÍA.

1. Siembra en estría cruzada.

Con ayuda del asa bacteriológica previamente flameada y fría, tomar una muestra

del material bacteriano y depositarla sobre la superficie del medio sólido, distribuirla

sobre la mitad de la placa en forma de zig zag, procurando no romper el medio,

flamear y enfriar nuevamente el asa, tocar por una sola ocasión la última línea del

rayado anterior y distribuir nuevamente, pero en esta ocasión solamente sobre un

cuarto de la placa, volver a flamear el asa, enfriar, tocar con el asa la última línea

del segundo rayado y distribuir en el último cuarto de la placa. Observa la siguiente

imagen:

21



2. Técnica de siembra en picada.

Esta técnica se realiza en un tubo con medio (no inclinado). Se toma la muestrabacteriana con una asa de punta recta y se introduce dentro del tubo, sin tocar sus

paredes y al llegar a la altura del medio se clava por el centro hasta el fondo de tal

manera que la picadura quede lo más rectamente posible, observa la siguiente

figura.

3. Técnica de inoculación en caldo.

22



El asa que contiene la muestra se introduce en un tubo que contiene un medio

liquido (caldo) y al llegar a este se agita y posteriormente se retira. Posteriormente

se incuba a37o C durante 24 horas, observa la siguiente imagen.

4. Técnica de vertido en placa.

a) Medio liquido.

Con una pipeta estéril se coloca 0.1 ml de la muestra bacteriana sobre la superficie

de una placa estéril, después se agrega el medio de cultivo, el cual debe estar auna temperatura aproximada de 450 C, se tapa, se gira la placa sobre su centro,

ocho veces a la izquierda y ocho veces a la derecha, se cierra e incuba.

b) Medio sólido.

Con una pipeta estéril se coloca 0.1 ml de la muestra bacteriana sobre la superficie

de una placa estéril conteniendo medio de cultivo ya solidificado, se distribuye esta

con la ayuda de una “L” de vidrio flameada y fría. Posteriormente se deja incubar a

37

0

C durante 24 horas, observa la siguiente imagen.

23




VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO.

1.¿Cómo se realiza la técnica de cultivo en tubo inclinado?

2.¿Cuándo se emplea cada una de las técnicas antes descritas?3.¿Qué modificación se realiza al asa bacteriológica par utilizarse en la técnica de

picadura?

24

http://2.bp.blogspot.com/_y6GJ5kWa9AI/SvN0GQoLM4I/AAAAAAAAAH4/ZXAJe4cHt3I/s1600-h/images.jpg




PRACTICA 4

MORFOLOGÍA COLONIAL Y CRECIMIENTO EN MEDIOLÍQUIDO Y SÓLIDO

I. COMPETENCIA

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El alumno aprenderá a describir las UFC en su morfología colonial macroscópica

en medios sólidos y el habito de crecimiento en medios líquidos, conocerá mediante

esto los requerimientos de oxigeno de los microorganismos presentes.

II. OBJETIVO

El alumno aprenderá a describir las características de la morfología colonial de

las bacterias así como su crecimiento en medios líquidos.

III. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos que crecen sobre superficies sólidas, tienden a formar

agrupaciones que se denominan colonias. Las colonias suelen ser de características

constantes para el medio de cultivo usado, la temperatura de incubación, y el

microorganismo del que se trate, por lo que su estudio es de gran utilidad tanto en la

clasificación como en la identificación.

Una colonia microbiana está constituida por individuos de la misma especie

provenientes de una célula o de un grupo de ellas, llamados unidad formadora de

colonias (UFC).

Las características consideradas para la descripción de la morfología colonial de

las bacterias son:1. Tamaño. Se da en milímetros, y puede variar desde colonias extremadamente

pequeñas que miden apenas unos mm de diámetro hasta aquellas que llegan a medir

10 mm o más. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie

del Agar.

2. Color. Pueden ser de muy variados colores.

3. Forma. Puntiforme, circular o irregular.

4. Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lóbulos, filamentos,

proyecciones como dientes de sierra o enrollados.

5. Elevación. Las colonias pueden ser planas, convexas, pulvinadas, umbonadas y

umbilicadas.

6. Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granulada.

7. Aspecto. Húmedo o seco.

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8. Luz reflejada. Brillante o mate.

9. Luz transmitida. Transparente, Translúcida y opaca.

10. Consistencia. Suave (butirosa, mucoide o friable) y dura. Esta característica se

determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto debe ser la última en describirse.

11. Producción de pigmentos. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua,

que puede difundir al medio de cultivo. (Figura 1)

Con experiencia en la observación de cultivos, las características de morfología

colonial vienen a constituir una guía muy útil en el reconocimiento de los principales

grupos de microorganismos, por lo que el estudiante de esta disciplina debe prestar

atención a estas características que son información importante en el estudio de los

cultivos en el laboratorio. En el laboratorio es frecuente el uso de medios de cultivo

líquido y los microorganismos presentan un tipo característico de crecimiento en dichosmedios, propiedad que se utiliza para facilitar su estudio.

Los diferentes tipos de crecimiento en medio líquido se ilustran en el esquema.

MATERIAL y EQUIPO REACTIVOS y MUESTRASPortaobjetos y cubreobjetos Cultivos de la práctica anterior.Asas bacteriológicas Colorantes de Gram.Microscopio óptico Aceite de inmersión

Mecheros bunsen.LupasPuentes de coloración

V.PROCEDIMIENTO

A) Morfología colonial.

Describir tres colonias aisladas ( a partir de muestras de suelo o agua) anotando cada

una de las características de morfología colonial indicadas en la introducción.

B) Crecimiento en medio liquido.

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1. Marcar correctamente un tubo con caldo nutritivo y sembrar con el asa cada una de

las colonias anteriormente descritas.

2. Incubar su material a 37oC durante 24 horas.

3. Identificar el tipo de crecimiento de cada microorganismo con base en el esquema.

Fig. 1 MORFOLOGÍA COLONIAL

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

1. Incluir en el informe una introducción acerca de la morfología colonial y crecimiento

en medio líquido y sólido.

2. Realizar un diagrama de flujo de los métodos utilizados en la práctica.

3. Describir la morfología de las tres colonias seleccionadas en la tabla siguiente:

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Características Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3Tamaño (mm)Color FormaElevación

SuperficieAspectoBordesLuz reflejadaLuz trasmitidaConsistenciaPigmento difusibleMedio de cultivo

4. Describir el tipo de crecimiento que presenta en los tubos con caldo nutritivo

5. Indicar cuántas colonias diferentes se observan aproximadamente por placa. ¿Tieneesto algún significado?

VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO

1.¿Qué es una UFC?

2. ¿Existe alguna relación entre la forma de crecimiento de las bacterias en medio

liquido con la tensión superficial del medio y los requerimientos de oxígeno del

microorganismo?.

3.¿Qué es el fenómeno de “Swarning”?. Diga el nombre de un microorganismo que lo

presente.


29



PRACTICA 5

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE

TINCIÓN DE GRAM

I. COMPETENCIA

El alumno realizará frotis el cual teñirá empleando la tinción de GRAM, con la

finalidad de describir la morfología colonial microscópica, clasificara las bacterias

en dos grandes grupos Gram positivo y Gram negativo (G+ G-) utilizando para ello el

microscopio óptico diferenciando cada una de sus partes.

II. OBJETIVO

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El alumno aplicara la tinción de Gram para la identificación de bacterias

III. INTRODUCCIÓN

Las coloraciones diferenciales se emplean junto con otras técnicas en la

identificación y diferenciación de las bacterias.

Uno de los procedimientos más importantes para identificar las bacterias, es la

tinción de Gram que permite separar a las bacterias en dos grandes grupos, las Gram

Positivas y las Gram Negativas.

En esta técnica se utiliza el cristal violeta como colorante primario, el lugol como

mordente, una mezcla de etanol-acetona o etanol como agente decolorante y safranina

como colorante de contraste.Las bacterias que retienen el cristal violeta después de la decoloración se

observan de color morado y son Gram positivas. Las bacterias Gram Negativas, por el

contrario, pierden el colorante primario por el tratamiento diferencial y toman el

colorante de contraste, se observa de color rojo.

La capa de peptidoglicana de la pared celular bacteriana, juega un papel

fundamental en la coloración. El cristal violeta y el lugol forman una placa en el interior

de las bacterias. Al aplicar el agente decolorante, las bacterias Gram. positivas sufren

una deshidratación y la red de peptidoglicana que es muy abundante, se condensa y

constituye un obstáculo para la salida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias

Gram. Negativas también poseen peptidoglicana pero en menor cantidad por lo que

constituye una barrera laxa, de modo que las bacterias quedan más permeables que

las Gram. Positivas y el complejo cristal violeta-lugol sale con más facilidad dejando así

lugar a las safranina. A la coloración de Gram. están asociadas otras propiedades de

las bacterias como son: su sensibilidad a diferentes antibióticos, a los colorantes del

grupo del trifenil metano, a la lisozima, su capacidad de producir toxinas diferentes

entre si, etc.

MATERIAL y EQUIPO REACTIVOS y MUESTRAS

31



Mechero Solución de Cristal Violeta.Pinzas de disección Solución de lugol.Pizeta Solución de alcohol-acetonaPuente de coloración Solución de safraninaMicroscopio Puentes de Coloración

Portaobjetos y cubreobjetos Cepas que se disponga en el laboratorioAsas bacteriológicas Aceite de inmersión

V.PROCEDIMIENTO

A) Técnica.

1. Hacer un frotis de cada una de las cepas proporcionadas y dejarlos secar al aire .

2. Fijar los frotis al calor.

3. Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante 1 minuto. Escurrir el

colorante y lavar con un chorro suave de agua.

4. Cubrir los frotis con lugol y dejarlos actuar durante 1 minuto, escurrir y lavar con

agua.

5. Decolorar con alcohol-acetona, de 5 a 15 segundos siguiendo las instrucciones

del profesor y lavar con agua.

6. Cubrir los frotis con safranina y dejarla actuar durante 1 minuto.

7. Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire.8. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

B) Influencia del tiempo de decoloración en la técnica de Gram.

1. Hacer dos frotis con una mezcla de las cepas proporcionadas y fijarlas al calor.

2. Teñir los dos frotis con la técnica de Gram, dejando actuar al alcohol-acetona 3

segundos en un frotis y 2 minutos en el otro.

3. Observar ambas preparaciones con el objetivo de inmersión.

32



33



Staphylococcus aureus bacteria G + Neisseria meningitidis bacteria G-


1. Incluir en el informe una introducción de la tinción de Gram.

2. Hacer un diagrama de flujo de los métodos utilizados en la práctica.

3. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el

punto A).

4. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas del punto

B).

5. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas del puntoC).

VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO

a) ¿Cuál es el propósito de teñir a las bacterias?

b) ¿Porqué se utilizan colorantes básicos para teñir a las bacterias?

c) Elabora una tabla en la que señales las diferencias que existen entre las bacterias

Gram positivas y bacterias Gram negativas.

d) ¿Qué importancia tiene la técnica de la coloración de Gram en las identificación de

las bacterias?

e) ¿Cuál es el paso crítico en la tinción de Gram?. Diga ¿por qué?

f) Explique el fundamento de la tinción de Gram relacionándolo con las propiedades de

las células bacterianas.

g) Diga el nombre de tres bacterias (genero y especie) Gram positivas y tres de Gram

negativas.

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h) ¿Porqué. En general, las eubacterias son el único grupo microbiano que responden

a la tinción de Gram?.

i) Escriba el nombre de cuatro microorganismos esporulados y su importancia.

j) ¿Qué es la espora bacteriana y porqué se forma?

IX. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA

Incluir por lo menos tres citas bibliográficas consultadas

PRACTICA 6

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO

I. COMPETENCIA

El alumno aprenderá a diferenciar los sistemas que conforman el microscopio y

manejara el mismo como una herramienta de precisión en la observación de

organismos microscópicos (bacterias y hongos)

II. OBJETIVO

El alumno aprenderá a conocer las partes y funciones de los componentes del

microscopio de luz visible.

III. INTRODUCCIÓN

El microscopio de luz visible es un instrumento que ha sido utilizado por los

estudiantes en cursos previos. Se ha incluido esta práctica para familiarizarlos con sufuncionamiento, manejo y cuidados, así como para desarrollar su habilidad para

trabajar con el objetivo de inmersión cuyo uso es indispensable en la observación de

microorganismos y sus estructuras.

Las partes que lo constituyen están representadas en la figura.

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Este microscopio está formado por tres tipos de lentes: el ocular, los objetivos

"seco débil", "seco fuerte" e "inmersión", y el condensador. Los dos primeros

intervienen en la amplificación de la imagen, mientras que el condensador forma parte

del sistema de iluminación.

Cada objetivo tiene grabada una inscripción.

Para lograr una buena observación es fundamental el sistema de iluminación. Con la

finalidad de enfocar la luz que proviene de la lámpara sobre la muestra se usa un

sistema de lentes llamado condensador, el cual posee un diafragma iris que controla el

diámetro del círculo de luz que sale del condensador para que llene exactamente el

objetivo. Si el diafragma, está demasiado abierto, parte de la luz no llegará al objetivo,

sino alrededor de él , originando brillos. Las muestras varían en su grado de contraste y

la luz deberá ajustarse cuidadosamente con cada preparación que se observa.

Es de importancia recalcar que, de la limpieza y cuidados que se den al

microscopio dependerá el mantener a dicho instrumento en óptimas condiciones de

uso.


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Microscópio Etanol comercialTela suave Aceite de inmersión

Hisopos de algodón FrotisLápices de colores

V. PROCEDIMIENTO

A) Cuidados del microscopio:1.- Transportar el microscopio en forma vertical, tomándolo del brazo con una mano y

de la base o pie con la otra.

2. Colocar cuidadosamente el microscopio en su mesa de trabajo, asegurándose de

que no haya vibraciones en ella.

3. Limpiar el microscopio en el orden que sigue:

a) Sistema mecánico, con un trapo suave que no deje pelusa.

b) Sistema óptico, tanto ocular como objetivos y condensador con un hisopo

humedecido en alcohol.

B) Manejo del microscopio:

1. Iluminación del campo visual.

a) Conectar y prender la lámpara.

b) Acercar el objetivo a la preparación.

c) Subir el condensador hasta el tope.

d) Abrir o cerrar el diafragma hasta tener un campo adecuadamente iluminado.

2. Colocar la preparación en la, platina y sujetarla con las pinzas.

3.- Enfoque de la preparación:

a) Cuando sea necesario colocar el cubreobjetos sobre la preparación.

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b) Enfocar la preparación con el objetivo seco débil (10X) usando el tornillo

macrométrico. A continuación para obtener una imagen clara y nítida, mover

lentamente el tornillo micrométrico.

c) Enfocar con el objetivo seco fuerte (40X).

d) Colocar una gota pequeña de aceite de inmersión sobre la preparación, sin

tocarla con el gotero y enfocar con el objetivo de inmersión.

4.- Examinar las preparaciones proporcionadas.

5.- Desconectar, enrollar el cable y sujetarlo con una liga.

6.- Bajar la platina hasta el tope y colocar el revólver en la posición del objetivo de

menor aumento.

C) Limpieza del microscopio:1. Quitar el aceite del objetivo de inmersión, con un hisopo seco.

2. Limpiar el objetivo con un hisopo humedecido en alcohol.

3. Colocar el microscopio en su lugar y cubrirlo con la funda.


1.- Hacer esquemas de las preparaciones observadas al microscopio guardando lasproporciones entre cada uno de los aumentos.

2. Incluir en el informe una introducción acerca del uso y cuidados del microscopio, así

como un esquema donde indique sus principales partes y describe cada una de ellas.

3. Hacer un diagrama de flujo donde describa las principales pasos de esta práctica.

4 Investigar los principales tipos de microscopios utilizados para fines de investigación.

Preparación 1 Seco débil Seco Fuerte Inmersión

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Preparación 2 Inmersión Preparación 3 Inmersión

Preparación 4 Seco débil Seco Fuerte Inmersión

VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIOa) ¿Qué diferencia hay entre un microscopio biológico y un estereoscópico?

b) ¿Cuáles son las características principales de un microscopio?

c) Defina los siguientes conceptos: Condensador, Ocular, Aberración y Poder de

Resolución.

d) ¿Cuál es la importancia de utilizar aceite de inmersión?

e) Mencione con qué objetivo observamos las preparaciones frescas y con qué las

preparaciones fijas.

IX. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA


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PRACTICA 7

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

I. COMPETENCIA

El alumno aislara y describirá la morfología colonial macroscópica y microscópicade mohos y levaduras, además conocerá sus técnicas de aislamiento y medios decultivo empleados, su hábitat y condiciones de cultivo, comprenderá su importancia enla naturaleza como organismos saprofitos desintegradores de los alimentos.

II. OBJETIVO

El alumno conocerá las técnicas de aislamiento de hongos, los medios de cultivoempleados, su hábitat y condiciones de cultivo.

III. INTRODUCCION

Los hongos se encuentran en una variedad de formas y tamaños. Puedenabarcar desde células individuales hasta multicelulares, son organismos eucariontes(su ADN está contenido en un núcleo). Muchos de ellos pueden semejarse a lasplantas, pero los hongos no fabrican su propio alimento a partir de la energía solar como lo hacen las plantas.

Los hongos comprenden criaturas de una sola célula que existenindividualmente, es el caso de las levaduras, y como agregados multicelulares, losmohos o los champiñones. Las levaduras semejan gotas redondas u ovaladas. Sonmuy pequeñas para poderlas apreciar individualmente, pero las puedes observar cuando están agrupadas como un polvo blanco que cubre las frutas o las hojas de lasplantas.

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Los mohos se describen como filamentos, debido a que forman cadenas largasde células denominadas hifas. Esas hifas le dan al moho su aspecto felpudo. Tambiénforman el cuerpo carnoso de los champiñones, el cual contiene las esporas de algunasespecies. Puede parecer extraño considerar algo tan grande como un champiñón comoun microbio. Pero las células de las hifas que forman el champiñón están conectadas

de una forma más estrecha que las células de otros organismos multicelulares. Lasparedes celulares que separan las células de la hifa tienen usualmente poros quepermiten que el protoplasma, es decir el fluido que llena las células, fluya entre ellas.En esencia, una hifa de un hongo es un tubo que se extiende continuamente.En general, los hongos crecen mejor en medio ambientes ligeramente ácidos (un pH de5,0; un pH de 7,0 es neutral). Pueden crecer en sustancias con baja humedad. Loshongos viven en el suelo, en tu cuerpo, en tu casa, en plantas y en animales, en aguadulce y en agua salada. Una cucharadita de tierra contiene alrededor de 120.000hongos.

Los hongos básicamente son estáticos. Pero se pueden diseminar formando

esporas que viajan en el viento y en la lluvia, o por crecimiento y extensión de sushifas. Recuerda que las hifas son cadenas de células fúngicas que crecen en elextremo, creando cadenas más largas que se ramifican. Es difícil detener sucrecimiento. Las hifas son lo suficientemente fuertes como para abrir huecos a travésde la pared celular de las plantas y el duro exoesqueleto de los insectos.

Los hongos absorben nutrientes de la materia orgánica viva o muerta (plantas,animales) sobre la cual crecen. Simplemente absorben a través de su pared celular nutrientes que se disuelven fácilmente, como son los azúcares, o secretan enzimas querompen los nutrientes más complejos en formas sencillas para poderlas absorber.

MATERIAL y EQUIPO REACTIVOS y MUESTRASMechero Solución de azul de algodón en

lactofenol.Pinzas de disección Solución de glicerol al 10%.*Pizeta Solución de formaldehido al 10%*Puente de coloración Solución de safraninaMicroscopio Puentes de ColoraciónSistema de micro cultivo (caja de petri,

“v” de vidrio, portaobjetos y cubreobjetos)

Solución de azul de metileno al 1%

Asa micológica Agar Dextrosa y papa o Dextrosa

saboraud, medio de Martín o rosa de

bengalaCinta diurex Ácido tartárico al 10% *

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*Nota: Estos reactivos deben estar estériles

V. PROCEDIMIENTO

A) Aislamiento por diluciones.

1. Preparar una serie de diluciones decimales a partir de una muestra de suelo,hasta la dilución 1:100,000 (1 X 10-5).

2. Sembrar las tres últimas diluciones en los medios proporcionados, depositandouna alícuota de 0.1 ml en la superficie.

3. Extender con la varilla de vidrio previamente esterilizada.4. Incubar a 28oC durante 48-72 horas.

B) Descripción de la morfología colonial.

Para describir la morfología colonial de los hongos se utilizan las siguientescaracterísticas:a) Tamaño en cm.b) Aspecto, algodonoso, polvoriento, aterciopelado y granuloso.c) Color del micelio vegetativo.d) Color del micelio aéreo.e) Producción de pigmento difusible.f) Color del reverso de la colonia.

C) Descripción de la morfología microscópica.

Preparaciones en fresco.1. Colocar una gota de azul de algodón lactofenol en el centro de un portaobjetoslimpio.2. Tomar una pequeña porción de la colonia que se desea observar y colocarla en lagota sin extenderla.3. Poner un cubreobjetos y examinar la preparación al microscopio con los objetivosseco débil y seco fuerte.4. Observar las características del micelio vegetativo:

a) Diámetro de las hifas.b) Presencia o ausencia de septos: septado o cenocítico.c) Color de las hifas: hialino o pigmentado.

5. Observar las características del micelio reproductor: tipo de esporas (comparar conlos esquemas).

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D) Microcultivos (ver figura).

1. Utilizando las pinzas estériles, colocar el portaobjetos sobre la varilla de vidrio.2. Con un bisturí cortar cuadritos de 1.5 cm2 de medio de Sabouraud.3. Con ayuda de las pinzas estériles colocar el cuadrito de medio sobre el portaobjetos.

4. Con el asa doblada en ángulo recto inocular el hongo proporcionado en los cuatrocostados del cuadrito de agar.5. Colocar el cubreobjetos estéril sobre el agar.6. Agregar cuidadosamente el glicerol al 10 % en el fondo de la base de la caja dePetri.7. Tapar la caja e incubarla a 28 0C durante 48-72 horas, con la tapa hacia arriba.8. Extraer el glicerol con una pipeta Pasteur y desecharlo en un tubo de ensayedespués de terminado el período e incubación.9. Agregar el formaldehido al 10 % y dejarlo en la caja durante 2 horas.10. Eliminar el formaldehido utilizando una pipeta Pasteur.11. Desprender cuidadosamente el cubreobjetos y colocarlo sobre un portaobjetos que

tenga una gota de azul de algodón lactofenol.12. Sellar la preparación con barniz de uñas transparente, siguiendo las instruccionesdel profesor.13. Desprender el cuadrito de medio de cultivo del portaobjetos y desecharlo en la caja,añadir una gota de azul de algodón lactofenol al portaobjetos y colocarle uncubreobjetos limpio. Sellar la preparación con barniz de uñas.14. Observar las preparaciones a seco débil y fuerte.

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1. Incluir en el informe una introducción del aislamiento y cultivo de hongos.

2. Hacer un diagrama de flujo de los métodos empleados en la práctica.

3.-Hacer una tabla donde se indique el número de colonias de hongos obtenidas en lasplacas de Sabouraud y Rosa de Bengala, indicando el numero de dilución, numero deH/ g de suelo.

4.- Morfología colonial.

Hacer una tabla donde se indique las características morfológicas de tres diferentescolonias de hongos, indicando el tamaño, aspecto, color del micelio si es vegetativo oaéreo, pigmento difusible, color reverso de la colonia y medio de cultivo donde sesembró.

5.- Morfología a microscópica.

Anotar en una tabla las características de la morfología microscópica de las colonias(descritas anteriormente en el punto 2 del informe) anotando el diámetro, presencia de

septos, color de la hifas.

6.- Hacer esquemas a colores de las estructuras observadas en las preparaciones enfresco.

7.- Morfología microscópica a partir del micro cultivo.

Realizar una tabla en donde se indiquen las características de la morfologíamicroscópica sembrados en micro cultivo, indicando el diámetro, presencia de septos,color de hifas, tipo de espora asexual, nombre del hongo.

8.- Haga esquemas a colores de las estructuras observadas en las preparaciones apartir de los micro cultivos.

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TIPOS DE MICELIOS

45



46



VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la composición química de la pared y membrana celular de los hongos?

2. Defina lo siguiente: micelio vegetativo, micelio aéreo, micelio cenocítico, esporasexual y espora asexual.

3. ¿Que es un organismo saprófito?

4. Mencione tres diferencias entre las esporas de hongos y las esporas bacterianas.

5. ¿Qué tipo de condiciones se deben de tener para el crecimiento de hongos?

IX. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA.


PRACTICA 8

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MUESTREO

I. COMPETENCIAEl alumno seleccionara la técnica más adecuada para tomar muestras representativas

considerando las condiciones asépticas necesarias para evitar la contaminación de

organismos no deseados, incluyendo únicamente los presentes en la muestra,

considerara la temperatura óptima de transporte.

II. OBJETIVO

El alumno tomara una muestra representativa de un lote de alimentos previamente

seleccionado.

III. INTRODUCCIÓN

El control de calidad sanitaria de los alimentos encuentra un valioso apoyo en los

análisis microbiológicos. Si bien la inspección a los sitios de fabricación,

almacenamiento, preparación, expendio e incluso a los transportes de alimento son

parte fundamental en sus programas de control, no es posible, en la mayoría de los

casos, tomar una decisión ante un problema específico, sin un reporte de laboratorio. A

través de estos análisis se ponen de manifiesto riesgos, en ocasiones muy serios de

salud, que pueden pasar inadvertidos aún a la más rigurosa inspección.

Los datos proporcionados por los análisis, sin embargo, solo son útiles si se

cumplen 3 condiciones fundamentales.

1. La muestra colectada y utilizada en el análisis es representativa e idónea.

2. La técnica de análisis es ejecutada con estricto apego a la metodología establecida

en cada caso particular.3. Existen normas o estándares de calidad para las pruebas empleadas.

Las técnicas que se describen en este manual han sido utilizadas durante

muchos años en el Laboratorio Nacional de Salubridad. Provienen en la mayoría de los

casos, de las recomendaciones hechas por el Comité Internacional sobre

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Especificaciones Microbiológicas para los Alimentos, conscientes de la importancia de

lograr la máxima uniformidad en la metodología utilizada entre todos los países.

No obstante, teniendo en cuenta el nivel de desarrollo técnico de nuestro país en

esta especialidad, y por razones de carácter económico, se han introducida

modificaciones a fin de hacerlas más accesibles y prácticas. De cualquier modo, se

insiste en la necesidad de seguir cada técnica, precisamente en los términos que en

cada caso señalan.


Papel alumínio y de envoltura Etanol comercialCinta masking tapeMecheroMarcador permanenteFrascos estérilesHisopos

V.PROCEDIMIENTO

I. Muestreo y transporte de la muestra

La técnica de recolección de una muestra para su análisis microbiológicoestablece una serie de precauciones y condiciones que deben ser observadas a fin de

obtener resultados significativos en el trabajo.

Ello implica, en primer lugar, precisar el objetivo del estudio. Puede tratarse de

un alimento sospechoso de haber causado una infección o intoxicación, puede tratarse

de un control de calidad rutinario en una fábrica, puede ser el caso de un alimento con

un grado de frescura incierto, puede ser un problema de investigación sobre la causa

de su descomposición, etc. El tamaño de la muestra (peso o volumen si es solo un

producto aparentemente homogéneo; o el número de unidades si se trata de un lote

está determinado por ese objetivo, y por supuesto, en la práctica, por la cantidad de

alimento posible.

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Para cada alimento o grupo de alimento particular se señala en el manual las

directrices que permiten obtener muestras útiles para el análisis. Pueden hacerse sin

embargo, las siguientes recomendaciones generales:

1. - Utilizar recipientes, bolsas y material, estériles para la recolección. Para

esto hacer uso, según el caso de autoclave a 121º durante 20 minutos, o de horno a

180 ºC durante 30 minutos (o 170 °C durante 1 hora). No basta esterilizar el material;

es necesario cubrirlo con papel de aluminio o papel de estraza resistente, para

protegerlo de contaminación ulterior durante su manejo.

2.- Al colectar la muestra evitar contaminaciones del ambiente tales como

polvo, tierra , saliva, descargas nasofaringeas o de cualquier otra naturaleza. El

recipiente o bolsa se abrirá justamente lo necesario para introducir la muestra, y hecho

esto volverá a cubrirse o cerrarse, tanto con su tapa como con el papel que l a protege.No es requisito el uso de mechero de alcohol durante la maniobra.

3.- Es esencial que el recipiente y los dispositivos empleados para extraer la

muestra no solo se encuentren estériles, sino además limpios, libres de substancias

que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.

4.- Es recomendable identificar claramente mediante rótulo o etiqueta

(indelebles ) el recipiente, antes de colocar la muestra, a fin de evitar confusiones si se

ha de obtener más de una .5.- En el informe o acta anexa se consignará toda la información pertinente que

pudiera afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo

tome en consideración al desarrollar el análisis e interpretar su resultado. Por ejemplo:

la posibilidad de la presencia del algún conservador en el alimento, un olor o color

desiguales, sus condiciones de conservación: temperatura, protección contra

contaminantes, etc.

6.- Si se trata de alimentos envasados colectar las unidades requeridas de

acuerdo al propósito del análisis. Tomarlas al azar si se encuentran por ejemplo en

cajas o situadas en estanterías; si es el caso de un producto de fabricación, obtener

muestras sucesivas distribuidas a lo largo del período en el que se realice la

inspección.

50



7.- Si se trata de alimentos a granel, o de recipientes o piezas grandes de las

que hay que retirar una porción, obtenerla de diferentes localidades. Si se estima de

interés, conviene obtener muestras independientes que pudieran poner de manifiesto

problemas distintos (no mezclar en el mismo recipiente por ejemplo, porciones que

muestren alguna alteración, aún pequeña, con porciones regulares).

8.- Transportar las muestras de alimentos perecederos o semi perecederos al

laboratorio bajo refrigeración (2 a 8 ºC), o en congelación si se trata de alimentos

congelados. Utilizar para el efecto hielo de agua o hielo seco respectivamente.

9.- Evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de

alguna manera contamine los alimentos muestreados. Es recomendable el empleo de

hielo contenido en bolsas de plástico impermeable para evitar estos inconvenientes, lo

que además facilita el acomodamiento de los diferentes envases dentro de la caja detransporte.

10.- Toda medida que se tome para acortar el tiempo comprendido entre la

recolección de las muestras y su entrega al laboratorio, contribuirá notoriamente a

evitar falseamientos en la imagen microbiológica de un alimento al análisis. Los

cambios que pueden sufrir durante su transporte son tanto cualitativos como

cuantitativos: pueden encontrarse cifras mayores a las originalmente presentes como

resultado de la proliferación de un grupo particular de microorganismos o menores sihay un efecto antagónico de otro grupo de gérmenes. Las bacterias patógenas pueden

incluso morir, o llegar a encontrarse en tal desventaja con el resto de la flora, que no

sea posible ponerlas de manifiesto con las técnicas de análisis utilizadas.

Es evidente que cada situación plantea problemas específicos en el muestreo.

Estimamos sin embargo que la consideración de estas recomendaciones y las que se

señalan para cada alimento, permitirán al inspector seguir una metodología adecuada a

los objetivos del muestreo de alimentos para su control sanitario.

II. Recepción de la muestra

Es importante la intervención de un químico en la supervisión del trabajo de recepción

de muestras que se reciban en el laboratorio:

51



1. Para constatar el correcto cumplimiento de las instrucciones que se indican.

2. Para aclarar con los remitentes cualquier duda que se suscitara en relación con la

idoneidad de la muestra y la aplicabilidad de las determinaciones que se soliciten o

procedan.

3. Para la adecuada distribución de la nuestra, si han de intervenir más de un

laboratorio en su estudio.

El procedimiento a seguir es el siguiente:

1. Al recibir la muestra en el laboratorio constatar la clave escrita en el recipiente con el

acta o documento que lo acompañe.

2. Dar el número de control interno con el cual será manejada la muestra dentro del

laboratorio.

3. Tomar nota de las pruebas de laboratorio solicitadas en el Acta de Muestreo o deinspección.

4. Registrar la fecha y hora de recepción de la muestra en el laboratorio.

5. Comprobar que no ha habido derramamiento del contenido del recipiente y que el

envase se mantiene integro, libre de perforaciones, rasgaduras o roturas de cualquier

tipo. En este último caso, la muestra es impropia del estudio.

6. Examinar el contenido del recipiente (envases trasparentes) y consignar cualquier

característica que sugiera algún cambio o alteración del producto: coloraciones, olores,enturbiamiento, formación de película o sedimento, desintegración, etc.

7. Siempre que sea posible obtener la temperatura de la muestra al recibir en el

laboratorio cuando se trate de alimentos que requieran una transportación refrigerada.

8. Distribuir las muestras recibidas con la mayor brevedad posible al laboratorio o

laboratorios que han de intervenir en su análisis.


VII. CONCLUSIONES

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VIII. CUESTIONARIO

1. En base a qué aspectos se escoge la técnica de recolección de muestras.

2. Cuál es la finalidad de manejar condiciones asépticas y el control de la

temperatura, para el muestreo.

3. Porque debe tomarse un tamaño de muestra específico.

4. Con que finalidad se hace la rotulación de las muestras


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Los análisis microbiológicos se harán mediante los siguientes anexos, son

técnicas de rutina que se llevan a cabo de manera obligatoria en todos los

laboratorios de control de calidad en la industria alimentaria.

ANEXOS

APLICACIONES

NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y

dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para

la cuenta de bacterias aerobias en placa.

08-25-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-113-SSA1-1994, Bienes y servicios.

Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.


Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable.


Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.


Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.


Método para la determinación de salmonella en alimentos.

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Documents

Manual Micro Reunion