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agron. 18 (2): 7 - 16, 2010ISSN 0568-3076
MÁS ALLÁ DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN: CUANTIFICACIÓNDE
VARIACIONES MORFOLÓGICAS POR ANÁLISIS DE
IMÁGENES EN PRUEBAS DE ANTIBIOSIS*
Juliana Soler Arango** , Laura María Muñoz*** y
Juan Carlos Pérez****
** Joven Investigador de COLCIENCIAS, estudiante de
Maestría en Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad
Nacional de Colombia, Sede Medellín.
[email protected].*** Ingeniera Biológica, Facultad
de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín.
[email protected].
**** Profesor Asociado, Coordinador Laboratorio de Microbiología
de Suelos, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia,
Sede Medellín. [email protected].
Recibido: 15 de junio; aprobado: 30 de junio de 2010.
RESUMEN
El antagonismo entre microorganismos mediado porantibiosis, es
un fenómeno ampliamente registrado en laliteratura cientíca. En los
organismos sensibles sus efectosgeneralmente se estudian a nivel
celular, y resultan en laformación de halos de inhibición de
crecimiento, pero, rara vez, se estudian cambios generales en
las colonias. Esteestudio utilizó análisis de imágenes para
detectar variacionesmorfológicas en las colonias de la bacteria
Bacillus mycoides ,enfrentadas a otros aislamientos
productores de antibiosis.Los resultados indicaron diferencias
significativas enpatrones de crecimiento de colonias de B.
mycoides ,
cuando se enfrentó a diferentes aislamientos
bacterianosproductores de antibiosis. Esos cambios no siemprefueron
paralelos a los observados en las áreas de la zonade inhibición.
Estos resultados sugieren que la medicióntradicional de halos de
inhibición pueden subestimar lasdiferencias entre aislamientos
bacterianos para generarantibiosis. Así, como los mecanismos de
respuesta enlos microorganismos antagonizados. Igualmente,
elanálisis de imágenes ofrece una herramienta sensible paraestudiar
la naturaleza de relaciones antagónicas entremicroorganismos y,
como apoyo a programas de búsquedade microorganismos cultivables
ecientes.
Palabras clave: antagonismo, control
biológico,densidad, dimensión fractal, patrón de crecimiento.
ABSTRACT
BEYOND THE INHIBITION ZONE:MORPHOLOGICAL VARIATIONS
QUANTIFICATION FOR IMAGE ANALYSESIN ANTIBIOSES TESTS
The antagonism between microorganisms mediated
byantibioses is a widely reported phenomenon in scienticliterature.
In sensitive organisms, its effects are generallystudied at a
cellular level and result in the formation ofgrowth inhibition
zones. However, the general changes
in the colonies are rarely studied. This study used
imageanalyses to detect morphological variations in theBacillus
mycoides , bacteria colonies facing other isolationsproducing
antibioses. The results indicated signicantdifferences in growth
patterns of B. mycoides , confronted
with other bacterial isolates producing antibioses.
Thesechanges not always were parallel to those observed in
theinhibition zone. These results suggest that the
traditionalmeasurement of inhibition zones might overlook
thedifferences between bacterial isolates to generate antibiosesas
well as the response of mechanisms in antagonized
microorganisms. Similarly, image analysis offers a sensitive
tool for the study of the nature of antagonic relationsbetween
microorganisms and serves as a support forprograms searching
efcient cultivable microorganisms.
Key words: antagonism, biological control,
density,fractal dimensions, growth patterns.
*Está investigación se benefció con la participación de
Elizabeth Meneses, Marcela Ramírez y Verónica Yépez, quienes
prestaron ayuda durante
el desarrollo de esta investigación y la corrección de este
manuscrito.
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INTRODUCCIÓN
La competencia entre microorganismos del
suelo, mediada por antibiosis es un fenómenobien establecido. La
presencia de antibiosis entre
microorganismos tradicionalmente se evalúa en
pruebas in vitro, que han sido clave para el desarrollo
de bioproductos que controlan patógenos de plantas
y animales (Cook & Baker, 1983). Un criterio común
para la selección de microorganismos cultivables
productores de antibióticos se basa en la detección
de zonas de inhibición de crecimiento de otros
microorganismos, pero se presta menos atención
a las variaciones morfológicas de las colonias de
los microorganismos sensibles en la prueba. Esteaspecto es
importante, debido a que, las variaciones
morfológicas de las colonias en varios tipos de
bacterias representan las estrategias de respuesta
global frente a la presencia de antibiosis (Ben-Jacob
& Cohen, 2000).
El suelo alberga múltiples especies de bacterias
y hongos productores de antibióticos (Dennis &
Webster 1971; Gottlieb 1976; Be’er et al ., 1990;
Haas & Keel 2003; McSpadden, 2004; Tsviya et al .,
2010). En las pruebas in vitro para detectar halos
deinhibición entre dos microorganismos enfrentados,
los efectos sobre el microorganismo antagonizado se
han concentrado en el estudio de células expuestas
al antimicrobiano en la zona de inhibición, y se han
identicado cambios en viabilidad, morfología y
siología de las células (Pastor & Cantón, 1999).
Sin embargo, una colonia puede responder en
forma concertada a la presencia de antibióticos y su
sensibilidad es diferente a la de células individuales
(Ben-Jacob & Cohen, 2000).
Este fenómeno se ha estudiando en varios tipos de
bacterias del género Bacillus que forman colonias
complejas. En esas colonias las células bacterianas
presentan mecanismos de comunicación célula a
célula que, alteran la arquitectura general de la colonia
( Ibídem ). Esa forma de la colonia representa
una
respuesta concertada a cambios ambientales, y es
una estrategia competitiva y adaptativa, en ambientes
adversos, como aquellos con baja disponibilidad de
nutrientes o en presencia de antibiosis
( Ibídem ) (Be’er
et al ., 2009).
Bacillus mycoides , es una especie bacteriana que posee
un crecimiento micelial o lamentoso característico
(Di Franco et al ., 2002), y las variaciones en su
forma
de crecimiento podrían usarse como indicadores de la
actividad antibiótica de otras bacterias. Sin embargo,
es difícil cuanticar ese tipo de crecimiento mediante
elementos de geometría clásica, aunque esos patrónes
de crecimiento complejo pueden describirse usando
dimensiones fractales (Boddy et al ., 1999), y análisis
de características espaciales en imágenes digitales(Thomas &
Paul, 1996). La cuanticación de estos
cambios en patrones de crecimiento es importante,
debido a que, esas variaciones indican respuestas
diferenciales de los microorganismos a cambios
bióticos o abióticos en el ambiente (Boddy et al .,
1999; Golinski et al ., 2008; Barry et al ., 2009;
Be’er et
al ., 2009; Sirota-Madi et al ., 2010).
Los antecedentes sugieren, que el estudio de
variaciones morfológicas en colonias de bacterias
con crecimiento lamentoso, permitiría detectarpreliminarmente
las diferencias en tipos de antibiosis
generada por diferentes aislamientos bacterianos, así
como, los mecanismos de respuesta en la bacteria
antagonizada. El objetivo general de esta investigación
fue determinar cambios en patrones de crecimiento
de una bacteria con crecimiento lamentoso como
respuesta al enfrentamiento a diferentes bacterias del
suelo productoras de antibiosis.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamientos bacterianos
Se seleccionaron cuatro asilamientos de bacterias
productoras de antibiosis denominadas: T1, T2, T3 y
T4, y un aislamiento de Bacillus mycoides , de
colecciones
de microorganismos obtenidas previamente de
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Más allá de los halos de inhibición
varios suelos de l departamento de Antioquia
(Muñoz, 2010; Castrillón, 2011), o mantenidas en
el laboratorio. Esos aislamientos se conservan en el
laboratorio de microbiología de suelos de la Escuelade
GEOCIENCIAS (Facultad de Ciencias de la
Universidad Nacional de Colombia. Sede Medellín).
Cultivos puros, preparación de inóculosy pruebas de
antibiosis
Los inóculos de los aislamientos productores de
antibiosis T1, T2 y T4, se prepararon mediante la
dilución de las colonias individuales con 24 h de
crecimiento en tubos con 0.3mL de agua estéril. Del
aislamiento T3 se usaron como inoculo coloniasindividuales con
72 h de crecimiento. Finalmente el
inóculo de Bacillus mycoides , se preparó diluyendo en
0.6mL de agua estéril un fragmento de agar nutritivode
aproximadamente 2 x 2 mm colonizado por la
bacteria.
La prueba se realizó en cajas Petri con medio agar
nutritivo (Merck), preparado según las instrucciones
del fabricante. Con ayuda de una plantilla se marcaronen el
exterior de cada caja de Petri dos puntos
separados 2cm uno del otro. En uno de los puntosde cada caja se
sembraron 0.06mL de las diluciones
de cada bacteria o colonias completas del aislamiento
T3. Las cajas se incubaron a 28ºC. Dos días después
de sembradas las bacterias se sembraron en el otropunto marcado
en la caja 0.04mL del inóculo de B.
mycoides . Las cajas se incubaron en oscuridad a 28ºC.
Para cada prueba de antibiosis se incluyeron cuatro
repeticiones.
Captura, procesamiento y análisis de
imágenesDoce horas después del inicio de la prueba se
tomaron fotografías de las colonias de B. mycoides ,
sobre un fondo negro en un estereomicroscopio
Nikon equipado con una cámara Nikon DSFI-1
con magnicación 0.8x. Las cajas se fotograaron
nuevamente nueve días después de iniciada la prueba
utilizando una cámara digital Olympus FE140 con
función de enfoque automático y a una altura ja.
Las imágenes se procesaron y analizaron en elsoftware libre
IMAGEJ (Abràmoff et al ., 2004). Los
análisis se concentraron en la morfología de partes
o colonias completas de B. mycoides . En fotografías
tomadas a las 12 h de inicio la prueba se extrajo de
cada foto una sección rectangular del mismo tamaño
(aprox. 10 x 5mm) junto a la colonia de B. mycoides , y
opuesto al lado en el que se ubicó la colonia bacteriana
productora de antibiosis. Para el procesamiento
cada sección fotográfica se convirtió en escala
de grises de 8 bits o se ajustaron directamente el
contraste y el brillo utilizando del menú image loscomandos
adjust/balance (auto) y Brightness/
contrast (auto), respectivamente. Partículas no
deseadas (interferencias del medio de cultivo o de
la caja de Petri) se eliminaron de la imagen usando
ltros disponibles en el menú process/lters/unsharp
mask (“radius=7 y mask=0.90”). En imágenes en
escala de grises se estimaron los parámetros de
textura (contraste y correlación), que indican un
patrón de crecimiento concentrado o disperso, o bien
orientado espacialmente y en sentido perpendicular a
la orientación de la imagen (Haralick et al ., 1973).
Seajusto el brillo y el contraste a las imágenes binariasy se
estimó la densidad de crecimiento utilizando el
programa accesorio FracLac_2,5, luego las imágenesfueron
esqueletonizadas con la opción disponible
en menú process/binary/skeletonize y se estimó
la dimensión fractal (D) utilizando el programa
accesorio FracLac_2,5 (Karperien, 1999-2007).
Los valores se compararon con los de una caja quecontenía sólo
B. mycoides .
Las imágenes tomadas nueve días después, se
convirtieron en imágenes de 8 bits en escala de grises.En estas
imágenes se midió en cada caja el área de la
zona de inhibición. Luego se seleccionó un polígono
de la misma forma y tamaño conteniendo una franjade 13 x 3 mm de
B. mycoides , en la interfase entre lazona de inhibición y la
colonia, en la que se midieron
los parámetros de textura ya mencionados. El área de
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la zona de inhibición y las características texturales
(contraste y correlación) se midieron usando el
software IMAGEJ (Abràmoff et al ., 2004).
Análisis estadístico
Los valores de dimensión fractal, densidad de
crecimiento, área de la zona de inhibición y parámetros
de textura, se sometieron a pruebas de distribución y
homogeneidad de varianzas para probar los supuestos
del análisis de varianza. Debido al no cumplimiento
de supuestos, los datos se sometieron a una pruebano paramétrica
de Kruskall-Wallis. Adicionalmente
se estimaron valores de error estandar para los
promedios de cada tratamiento como medida de
dispersión. Todos los análisis se realizaron en el
software Systat 12.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las áreas de las zonas de inhibición y los patrones de
crecimiento de B. mycoides , a los nueve días y a las 12h
(Figura 1), respectivamente, variaron dependiendo
del aislamiento bacteriano productor de antibiosis.La mayor
inhibición del crecimiento de B. mycoides ,se presentó con el
aislamiento T4 y la menor con el
aislamiento T3. Los aislamientos T1 y T2, presentaronzonas de
inhibición similares entre ellos, e intermedias
a las de T3 y T4 (Figura 2).
Secciones de la imagen de la colonia de B.
mycoides que se tomaron para análisis a las 12 h
(izquierda) y10 días (derecha) de crecimiento.
Figura 1.
Los patrones de crecimiento de B. mycoides , variaron
dependiendo de la posición en la colonia y el momento
en el que se analizaron. Micelios de B. mycoides , con
12 h de crecimiento y en el lado no expuesto a cada
antagonista productor de antibiosis no presentaron
diferencias en los valores de dimensión fractal o
densidad de crecimiento. Sin embargo, nueve días
más tarde los patrones de crecimiento de B. mycoides ,
en la interfase entre la colonia y la zona de inhibición,
variaron dependiendo del aislamiento bacteriano
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al que se enfrentaron. El contraste y la correlación
espacial (parámetros de la textura de la imagen) en las
imágenes tomadas a los nueve días, se diferenciaron
Efecto de varios aislamientos bacterianos en el desarrollo de
zonas de inhibición y patrones de crecimientode B.
mycoides .
Figura 2.
mejor en esta zona de avance de las colonias que, al
inicio de la prueba y en el lado opuesto al antagonista
bacteriano (Figuras 3, 4).
Estos resultados sugieren, que diferentes mecanismos
de antibiosis en esas bacterias T1 a T4, así como
las estrategias adaptativas de B. mycoides , a ese
antagonismo, pueden ser detectados medianteel análisis de
imágenes. Esta estrategia unida a la
detección de zonas de inhibición podría contribuir
signicativamente al conocimiento de los mecanismos
de inhibición y adaptación en los microorganismos
enfrentados en las pruebas, lo que a su vez aceleraría
la búsqueda y detección de microorganismos para
introducción al suelo.
Muchos microorganismos con potencial agrícola o
ambiental, que se introducen al suelo, usualmente se
seleccionan de colecciones extensas mediante pruebas
de antibiosis. Sin embargo, es difícil pronosticarel desempeño
de esos microorganismos una vez
introducidos al suelo. Esta perspectiva de selección,
sería más efectiva si se conocen los mecanismos de
acción y reacción de los microorganismos frente a
sus competidores o biocontroladores.
Las zonas de inhibición se midieron nueve días después del
inicio de la prueba. Los patrones de crecimiento se estimaronen
fotografías digitales 12 h después de iniciada la prueba. En los
análisis de dimensión fractal y densidad para elaislamiento T4 solo
se incluyeron dos repeticiones ya que el crecimiento de B.
mycoides fue completamente inhibido enlas otra dos
repeticiones. Los valores no se incluyeron en el análisis
estadístico.
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Efecto de varios aislamientos bacterianos en patrones de
crecimiento de B. mycoides en la interfaceentre su
colonia y la zona de inhibición de cada bacteria.
Figura 3.
En esta investigación el aislamiento T4, generó a los
nueve días los mayores halos de inhibición, y menores
valores de contraste y correlación, característicos de
un crecimiento muy denso y localizado en B. mycoides .
Esa mayor zona de inhibición generada por T4,
unida a un crecimiento denso de B.
mycoides , podrían
reejar alta producción de compuestos tóxicos por
T4, y mayor actividad de B. mycoides para
degradarlos
o limitar el paso hacia el centro de la colonia. Esto
también explicaría, la poca diferenciación de patrones
de crecimiento de B. mycoides al lado opuesto de
las
colonias de los aislamientos T1 a T4 a las 12 h de
crecimiento (Figura 2).
Para el aislamiento T4 solo se incluyeron dos repeticiones ya
que el crecimiento de B. mycoides fuecompletamente
inhibido. Los valores no se incluyeron en el análisis
estadístico.
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Anteriormente se ha sugerido que transformaciones
ultra estructurales en bacterias del Género
Proteus
pueden evitar el ataque de agentes antimicrobianos o
efectos antagonistas por otras bacterias (Hernández
& Rodríguez, 1993). Por otro lado, el crecimiento de
B. mycoides , frente a T1 y T2, no es diferente en las
zonas de inhibición (Figura 2), pero si es diferente en
los bordes de las colonias (Figura 3), lo que reejaría
diferentes estrategias de generación de antibiosis por
T1 y T2, y diferentes mecanismos de respuesta porB.
mycoides . No se conoce el mecanismo de antibiosis
generado por los aislamientos bacterianos incluidos
aquí, pero algunos de esos mecanismos podrían
explorarse fácilmente usando por ejemplo fuentes
especicas de carbono en estas pruebas de antibiosis.
Anteriormente, se sugirió, que la generación de
patrones variables de micelios y tasas de crecimiento
son estrategias ecológicas para buscar y capturar
nutrientes y fuentes de carbono (Boddy et al ., 1999).
En hongos, el cambio en dimensiones fractales se
presumió como un mecanismo para optimizar la
utilización de espacio y nutrientes (Bolton & Boddy,
1993), o como consecuencia de la infección con un
virus que posiblemente resultó en virulencia reducida
hacia su hospedero y un uso ineciente de nutrientes
(Golinski et al ., 2008).
En conclusión, el análisis de imágenes permitió,
detectar diferencias en la respuesta de B.
mycoides a
la generación de antibiosis por varios aislamientos
bacterianos. Esos cambios en patrones de crecimiento
de B. mycoides , posiblemente reejan diferencias en
los mecanismos de antibiosis por cada aislamiento
Aspecto general del crecimiento de B. mycoides ,
hacia la zona de inhibición según el aislamiento
bacterianoenfrentado (de izquierda a derecha aislamientos T1 a
T4).
Figura 4.
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bacteriano, que pasarían desapercibidas al medir
solamente las zonas de inhibición de crecimiento.
La estrategia combinada del uso de esta bacteria de
crecimiento lamentososo unida a las medicionestradicionales de
halos de inhibición, provee una
herramienta sensible que favorecerá la búsqueda
de microorganismos ecientes para uso agrícola o
ambiental.
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