i

UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Análisis de la expresión génica dependiente de Mn+2 en el

basidiomicete ligninolítico Ceriporiopsis subvermispora.

Memoria para optar al título de Bioquímico

Matías Ricardo Gutiérrez Mostafá

Director de Memoria Profesor Patrocinante Dr. Sergio Lobos Camus Dr. Sergio Lobos Camus

Departamento de Bioquímica y Departamento de Bioquímica y

Biología Molecular Biología Molecular

Facultad de Ciencias Químicas Facultad de Ciencias Químicas

y Farmacéuticas y Farmacéuticas

Universidad de Chile Universidad de Chile

Santiago, Chile

2007

ii

“We haven't got the money,

so we've got to think!”

Ernest Rutherford

iii

AGRADECIMIENTOS

Llegar a este momento no ha sido fácil, y de no ser por todos los que me han motivado, acompañado y apoyado durante los últimos años no sería posible.

Quiero agradecer en primer lugar a Karen Johnson, profesora de ciencias en

mis últimos años de colegio, de no ser por ella nunca hubiese estudiado Bioquímica ni desarrollado la vocación por la ciencia que me permitió sobrellevar los momentos

difíciles de la carrera.

Quiero especialmente agradecerles a Sergio y Daniela por abrirme las puertas

de su laboratorio y hacerme sentir como en mi casa. Fue un agrado trabajar con los recursos otorgados y que nunca faltara nada. Ha sido muy grato compartir con ustedes

ya que juntos hacen un excelente equipo, con la mejor calidad científica y humana.

Gracias por la amistad y por haberme guiado y enseñado durante el último año y

medio. Dentro de esta gran familia, les doy las gracias por la ayuda, buena onda,

amistad y compañerismo a los estudiantes del Laboratorio de Bioquímica: Alejandro,

Rodrigo, Ares, Monserrat, Constanza, Aníbal y Sebastián. Así también agradecerles a

quienes conforman el BOX1 en la PUC por el apoyo, ganas de discutir sobre ciencia y

la amistad, gracias Loreto, Alexis, Alejandro, José Miguel, Rodrigo, Paulina, Paulo y

Rafael.

A mis amigos, quienes estuvieron conmigo durante los buenos y malos

momentos, gracias Daniel, Francisco, Ro, Pancho, Erick, Pablo, Andrés, Leo, Juan

Antonio, Seba V., Seba L., Francisca, Iván, Manuel, Maru, Esteban y los que falten,

ustedes saben quienes son.

Gracias Bárbara por todo tu amor y amistad, eres parte importante de este logro

y siempre haz sido mi razón para seguir adelante con ganas y la ambición de un futuro

mejor.

Finalmente quiero agradecerles a mis padres por el apoyo incondicional que

siempre me han brindado, sin duda, no estaría donde estoy si no fuera por sus

consejos, amor, amistad y generosidad. También agradecer a mis hermanos y familia

por acompañarme durante este camino que llega a su fin, gracias Felipe, Javiera,

Gilda, Nona, Jeannette, Cecilia, Cristian, Galeb, Armando y Rebeca.

iv

FINANCIAMIENTO

Esta memoria fue realizada en el Laboratorio de Bioquímica del Departamento

de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas de la Universidad de Chile y en el Laboratorio de Bioquímica del

Departamento de Genética Molecular y Microbiología de la Facultad de Ciencias

Biológicas de la Pontificia Universidad Católica, bajo la dirección del Dr. Sergio Lobos

Camus. El financiamiento para realizar esta investigación provino del proyecto

FONDECYT Nº 1070558, titulado “Mecanismos de regulación de la expresión génica

por metales en hongos basidiomicetes que degradan lignina,” y del proyecto del

Instituto Milenio de Biología Fundamental y Aplicada (MIFAB) P04-007-F, titulado

“Genetics of ligninolytic enzymes of fungi.”

v

INDICE GENERAL AGRADECIMIENTOS……………………………………………………………………..iii FINANCIAMIENTO………………………………………………………………………...iv ÍNDICE GENERAL……………………………………………………………………...….v ÍNDICE DE TABLAS……………………………………………………………………...vii ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………....viii ABREVIATURAS…………………………………………………………………………..ix RESUMEN……………………………………………………………..…………………...xi SUMMARY………………………………………………………………………………...xiii 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………. 1 HIPÓTESIS…………………………………………………………………………………. 7 OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………………...... 7 OBJETIVOS ESPECÍFICOS……………………………………………………………… 7 2. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………..... 9 2.1 Materiales 9 2.1.1 Cepa fúngica 9 2.1.2 Cepa bacteriana 9 2.1.3 Medios de cultivo 9 2.1.3.1 Medio de cultivo estacionario para C. subvermispora 9 2.1.3.2 Medio de cultivo estándar para C. subvermispora 10 2.1.3.3 Medio de cultivo para bacterias 10 2.1.4 Plasmidios 11 2.1.5 Enzimas 11 2.1.6 Oligonucleóticos 11 2.1.7 Sistemas comerciales 13 2.1.7.1 Extracción de DNA plasmidial de E. coli 13 2.1.7.2 Purificación de mRNA poli(A) 13 2.1.8 Reactivos radioactivos 13 2.1.9 Reactivos generales 13 2.1.10 Material fotográfico 13 2.2 Métodos 14 2.2.1 Condiciones de cultivo 14 2.2.1.1 Crecimiento de C. subvermispora en medio estacionario 14 2.2.1.2 Crecimiento de C. subvermispora en medio estándar 14 2.2.2 cDNA-AFLP para C. subvermispora 15 2.2.2.1 Extracción de RNA de micelio congelado 15 2.2.2.2 Geles desnaturantes para ARN 16 2.2.2.3 Purificación de ARNs poli(A) 16

vi

2.2.2.4 Síntesis de cDNA de doble hebra 16 2.2.2.5 Digestión con enzimas de restricción 17 2.2.2.6 Preparación y ligación de adaptadores 17 2.2.2.7 Pre-amplificación mediante PCR 18 2.2.2.8 Marcación radioactiva de partidores para la amplificación selectiva 18 2.2.2.9 Amplificación selectiva mediante PCR 18 2.2.2.10 Visualización de cDNA-AFLP 19 2.2.3 Identificación de TDFs visualizados mediante cDNA-AFLP 19 2.2.3.1 Aislamiento y reamplificación de TDFs 19 2.2.3.2 Ligación de amplificados de PCR al vector pCR2.1-TOPO TA 20 2.2.3.3 Preparación de células electrocompetentes y transformación

de E. coli mediante electroporación 20 2.2.3.4 Extracción de DNA plasmidial para secuenciación 20 2.2.3.5 Análisis bioinformático de secuencias obtenidas 20 2.2.4 Análisis de expresión comparativa por PCR en tiempo real 21 2.2.5 Análisis bioinformático de elementos reguladores de unión a

factores de transcripción en regiones río arriba de genes involucrados en la homeostasis de manganeso 22

2.2.6 Microscopía óptica 22 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………….….. 23 3.1 Definiendo un criterio de clasificación para genes regulados por

Manganeso 23 3.2 Inducción en respuesta al pulso corto de manganeso 27 3.3 Represión en respuesta al pulso corto de manganeso 34 3.4 Análisis de elementos reguladores en secuencias río arriba del

sitio de inicio de la traducción 37 3.5 Comentarios finales 41 4. PROYECCIONES……………………………………………………………. 46 5. CONCLUSIONES……………………………………………………………. 49 6. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………….……. 50

vii

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Partidores utilizados en todos los estudios realizados en este trabajo…. 11 Tabla 2. Perfiles de expresión de TDFs, clasificación en respuesta a pulso y

concentraciones estacionarias de Mn+2, e identificación bioinformática utilizando BLASTX y TBLASTX……………………………. 24 Tabla 3. Expresión relativa de TDFs y genes estudiada por PCR en tiempo real comparativo………………………………………………………………. 25 Tabla 4. Análisis de elementos reguladores en regiones río arriba de homólogos de TDFs inducidos por el pulso de Mn+2 y homólogos de genes relacionados con la homeostasis de manganeso en Phanerochaete chrysosporium o Saccharomyces cerevisiae y la Manganeso peroxidasa 2B de Ceriporiopsis subvermispora ………… 38

viii

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Esquema de la técnica de cDNA-AFLP …………………………………….5 Figura 2. Esquema de la estructura de los adaptadores utilizados para cDNA-AFLP…………………………………………………………………... 18 Figura 3. C. subvermispora cultivado en madera………………………………….. 26 Figura 4. Efecto del manganeso en la acumulación de vesículas intracelulares… 33 Figura 5. Modelo explicativo de la respuesta celular a un aumento en la concentración de Mn+2……………………………………………………….42 Figura 6. Perfil de expresión diferencial de TDFs en respuesta a diferentes Concentraciones de Mn+2…………………………………………………… 46 Figura 7. Esquema de propuesta para técnica cDNA-AFLP acoplado a 3’ RACE………………………………………………………………………. 47

ix

ABREVIATURAS [γ-32P]-ATP Adenosina trifosfato marcada radiactivamente en el fosfato γ con

32P. ABC ATP binding cassette. Cassette de unión a ATP. ACE1 Activation of CUP1 expression. Activación de la expresión de

CUP1. ADAPT Oligonucleótido adaptador. DNA Deoxyribonucleic acid. Ácido desoxirribonucleico. cDNA Complementary DNA. DNA complementario. A-NN Partidor para cDNA-AFLP, con dos nucleótidos variables en el 3’ ARN Ácido ribonucleico. mRNA Messenger RNA. RNA mensajero. ATP Adenosine triphosphate. Adenosina trifosfato. BSA Bovine serum albumin. Albúmina de suero bovino Bsd2 Bypass SOD defects number. 2. Bypass los defectos de SOD no.

2 cDNA-AFLP cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism CFMR Center for Forest Mycology Research CIA Cytosolic iron-sulfur assembly. Ensamblaje de núcleos Fe-S

citosólicos. CoA Coenzima A. DEPC Dietilpirocarbonato. DTT Ditiotreitol. EDTA Ácido Etilendiaminotetraacético. EF3 Elongation factor 3. Factor de elongación 3. Erd2 ER retention defective 2. Defectiva en la retención en el RE. FAS Fatty acid synthetase. Sintetasa de ácidos grasos. Fur Ferric uptake regulator GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa HAP1 Heme activator protein 1. Proteína activadora de hem 1. Hrk1 Hygromycin resistance kinase 1. Quinasa de resistencia a

higromicina1. IPTG Isopropilgalactósido IRE Iron responsive element. Elemento de respuesta a hierro. Irp1 Iron regulatory protein 1. Proteína reguladora del hierro 1. LB Luria-Bertani lcs gen de la lacasa mCi miliCurie mnp Gen de manganeso peroxidasa MnP Manganeso peroxidasa MnSOD Superóxido dismutasa dependiente de manganeso Mntr Manganese transport regulator. Regulador del transporte de

manganeso. MRE Metal Responsive Elements. Elementos de respuesta a metales. MRS Mur-responsive Sequence. Secuencia de respuesta a Mur.

x

Mur Manganese uptake regulator. Regulador de la incorporación de manganeso.

NADH Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide. Dinucleótido de adenina nicotinamida. Nar1 Nuclear architecture related 1. Relacionado con la arquitectura

nuclear 1. NAT1 N-terminal Acetyltransferase 1. Acetiltransferasa N-terminal. NATH N-terminal Acetyltransferase Human. Acetiltransferasa N-terminal

humana. Nbp35 Nucleotide binding protein 35. Proteína de unión a nucleotidos

35. NCBI National Center for Biotechnology Information. NRAMP Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins. oligo-dT Oligómero de desoxitimina. PAL Phenylalanine Ammonia-Lyase. L-fenilalanina amonio liasa. PCR Polymerase Chain Reaction. Reacción en cadena de la

polimerasa. Pma1 Plasma membrane ATPase 1. ATPasa de membrana plasmática. Pmr1 Plasma membrane ATPase related 1. Relacionada con la

membrana plasmática 1. PR-5 Pathogenesis-related 5. Relacionado con patogénesis 5. QPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction. PCR cuantitativo. RACE Rapid Amplification of cDNA ends. RE Retículo endoplásmico. ROS Reactive Oxygen Species. Especies reactivas del oxigeno. rpm revoluciones por minuto. RT Reverse Transcription, Transcripción inversa. Smf Suppressor of mitochondria import function. Supresor de la función importadora de la mitocondria. Sod1 Súper oxido dismutasa 1. SSD1 Suppressor of SIT4 deletion. Supresor de la deleción de SIT4. TAA Ácido trans-aconítico. TDF Transcript Derived Fragment. Fragmento derivado de transcripto T-NN Partidor para cDNA-AFLP, con dos nucleótidos variables en el 3’ Tris Tris-(hidroximetil)-aminoetano. UTR Untranslated Terminal Region. Región terminal no traducida. X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido YEF3 Yeast Elongation Factor 3. Factor de elongación de levaduras 3.

xi

RESUMEN

La expresión génica dependiente de manganeso no se comprende del todo en

organismos eucariontes. Decidimos intentar comprender de mejor forma este proceso

utilizando el basidiomicete Ceriporiopsis subvermispora, ya que el manganeso cumple

un rol importante en su metabolismo degradante de lignina. Dado que el genoma de

este organismo no se encuentra disponible, utilizamos la técnica de cDNA-AFLP para

realizar un estudio global de la expresión génica dependiente de manganeso el cual dio

interesantes resultados. De 37 fragmentos derivados de transcriptos (TDFs)

secuenciados, 21 fueron analizados, identificados y clasificados en razón a su

expresión diferencial en respuesta a manganeso. El análisis de estos resultados nos

permitió encontrar varios genes cuya expresión se encuentra regulada por este metal y

además postular posibles roles homeostáticos para varios de ellos. Entre los hallazgos

más importantes podemos mencionar que el estrés por manganeso produce cambios a

nivel celular tales como: (1) un aumento en la actividad traduccional, (2) un aumento en

la biosíntesis de membranas celulares para la compartamentalización, almacenamiento

y destoxificación del manganeso con la concomitante activación de la vía secretora, y

(3) un aumento en la biosíntesis de “núcleos Fe-S”. Además, postulamos que existen

dos proteínas que participarían como reguladores de la expresión de factores

homeostáticos para el estrés por manganeso. La proteína SSD1 participaría

activamente regulando la expresión de factores homeostáticos de forma post-

transcripcional en respuesta a concentraciones ascendentes del metal, mientras que la

proteína Erd2 tendría la misma función, pero en respuesta a concentraciones

descendentes. Estudiamos las regiones reguladoras río arriba del sitio de inicio de la

xii

traducción de genes relacionados con la homeostasis de manganeso derivados de este

estudio y de la literatura. Esto nos permitió identificar la presencia de sitios de unión

para los factores de transcripción ACE1 y HAP1, los cuales podrían mediar un efecto

sinérgico en la activación de la transcripción manganeso-dependiente, siendo

putativamente ACE1 el factor principal.

xiii

SUMMARY

Analysis of manganese-regulated gene expression in the ligninolytic basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora

Manganese-dependent gene expression is not fully understood in eukaryotic

organisms. This study aims to understand this process in a better way utilizing the

basidiomycete C. subvermispora, since manganese plays an important role in its lignin

degrading metabolism. Since the genome of this organism is not available, we used

cDNA-AFLP technique to perform a global manganese-dependent gene expression

profiling that yielded interesting results. Out of 37 sequenced transcript derived

fragments (TDFs), 21 were further analyzed, identified and classified according to their

differential expression profile in response to manganese. The analysis of these results

allowed us to find various genes whose expression is regulated by this metal, and also

postulate possible homeostatic roles for some of them. Among the most important

findings we describe that manganese stress produces changes at the cellular level,

such as: (1) increased cellular translational rate, (2) increased biosynthesis of cellular

membranes for the compartmentalization, storage and detoxification of manganese with

a concomitant increased activity of the secretory pathway, and (3) an increased

biosynthesis of Fe-S clusters. Even more, we postulate that there are two proteins that

participate as regulators of manganese homeostatic expression of factors in response

to manganese stress; SSD1 protein would actively regulate post-transcriptionally the

expression of homeostatic factors in response to increasing metal concentration, while

Erd2 would have the same function yet in response to decreasing concentrations.

xiv

We studied upstream regulatory regions of genes related to manganese

homeostasis by this study or the literature; this allowed the identification of repetitively

found transcription factor binding sites for ACE1 and HAP1, which may mediate a

synergic effect on the activation of manganese-dependent gene expression, where

ACE1 would be the main putative synergic mediator.

1

1. INTRODUCCIÓN

La homeostasis del manganeso

El manganeso (Mn) es el 13er elemento más abundante en la tierra y el 3ro entre

los elementos de transición. Este elemento esencial juega un importante rol en varios

procesos fisiológicos; prácticamente todos los compartimentos celulares poseen al

menos una enzima cuya actividad es dependiente de Mn+2. Este metal actúa como co-

factor de oxidasas, deshidrogenasas, polimerasas de DNA y ARN, quinasas,

descarboxilasas y transferasas de azúcares (Crowley y cols., 2000; Keen y cols., 2000;

Culotta y cols., 2005). El Mn+2 está involucrado directamente en la destoxificación de

especies reactivas del oxígeno (ROS, por su sigla en inglés) como cofactor de la

superóxido dismutasa dependiente de Mn+2 (MnSOD) y también a través de su propia

capacidad atrapadora de radicales superóxido (Cho y cols., 2005).

La homeostasis del Mn+2 se comprende de mejor forma en organismos

procariontes, donde se han descrito diferentes factores, proteínas y metaloreguladores.

La familia de metaloreguladores conocidas como reguladores de la incorporación de

hierro (Fur, por sus siglas en inglés) contiene proteínas con especialización funcional.

Un ejemplo de estas proteínas es el regulador de la incorporación de Mn+2 (Mur, por su

sigla en inglés), el cual regula la expresión de factores homeostáticos del Mn+2 (Lee y

Helmann, 2007). Mntr es un factor de transcripción que regula la expresión de

proteínas transportadoras de Mn+2 similares a proteínas naturales de macrófagos

asociadas a resistencia (NRAMP, por sus siglas en inglés). Ambos reguladores

evolucionaron y están muy relacionados a nivel estructural con reguladores de la

homeostasis del hierro (Fe) (Moore y Helmann, 2005).

2

Han existido numerosos esfuerzos por comprender de forma similar la

homeostasis de este metal en eucariontes, sin embargo, aún no ha sido posible

comprender a cabalidad este proceso (Malecki y cols., 1999; Pittman 2005; Aschner y

cols., 2007; Lei y cols., 2007). No se ha descrito ningún factor transcripcional capaz de

regular la expresión de factores homeostáticos del Mn, más aún, en algunos casos se

ha demostrado una regulación post-traduccional (Moore y Helmann 2005). Este es el

caso de los transportadores de Mn+2 eucariontes, similares a NRAMPs, Smf1p y

Smf2p, los que han sido caracterizados principalmente en su relación con Mn+2 y otros

metales en Saccharomyces cerevisiae. Estos simportadores protón-metal están

ampliamente conservados desde bacterias a humanos y tienen la capacidad de

movilizar varios cationes metálicos, tales como Mn+2, hierro, cadmio y cobre (Culotta y

cols., 2005). Smf1p es un transportador de alta afinidad para Mn+2 localizado en la

membrana plasmática. Resulta interesante el que cepas de levaduras mutantes que no

poseen este transportador acumulen Mn+2 de forma muy similar a las cepas silvestres

(Supek y cols., 1996; Luk y Culotta, 2001). De forma opuesta, defectos en Smf2p

provocan problemas en la acumulación y biodisponibilidad de este metal, los cuales se

extienden por toda la célula. Smf2p ha sido localizado en vesículas intracelulares

pertenecientes al aparato de Golgi, las cuales no son el resultado de una endocitosis

de Smf2p desde la superficie celular (Portnoy y cols., 2000; Luk y Culotta 2001).

Cuando el Mn+2 es limitante en el medio de cultivo, la actividad de Smf1p y Smf2p

aumenta para así lograr la acumulación suficiente de este metal esencial; sin embargo,

cuando Culotta y su grupo midieron los niveles de transcriptos de estos

transportadores en esta situación, se encontraron con que no había un aumento,

indicando así la regulación post-traduccional de su actividad. El mecanismo que opera

3

cuando el Mn+2 es limitante es una estabilización de los polipéptidos de estas enzimas,

la cual produce un cambio en su localización celular y aumento en su actividad. La

disminución de la actividad de estos transportadores en situaciones donde hay

suficiente Mn+2 en el medio depende de la proteína Bsd2p, proteína que es

responsable de reclutar a la E3 ubiquitina ligasa y de la concomitante ligación de

ubiquitina para la degradación de ambas proteínas (Liu y Culotta 1999). Otro mediador

de la homeostasis de Mn+2 en eucariontes es Pmr1p, cuyo rol ha sido estudiado en

Caenorhabditis elegans y S. cerevisiae. Esta proteína es una ATPasa de Ca2+/Mn2+ de

tipo P que bombea Ca2+ y Mn2+ desde el citosol hacia el Golgi. En C. elegans, un doble

mutante Δpmr-1 Δsod1 muestra un aumento en Mn+2 citosólico de 4 a 5 veces (Cho y

cols., 2005). La ATPasa Pmr1p es requerida para los procesos de la vía secretora de

glicosilación, destinación, y la degradación de proteínas asociada al retículo

endoplásmico. Al suplementar mutantes pmr-1 con Mn+2 se compensan los defectos en

glicosilación N- y O-asociadas producidos por la baja concentración de Mn+2

intraorganelar (Dürr y cols., 1998). En cuanto a la regulación transcripcional, el año

2004 Ma y colaboradores describieron una nueva secuencia promotora que es

requerida para la regulación depediente de Mn+2 de la expresión génica de la Mn+2

peroxidasa 1 (mnp1) de P. chrysosporium; este hallazgo no se ha validado para otros

genes u organismos (Ma y cols., 2004). Hasta hoy, no se ha descubierto un factor de

transcripción que se una a esta secuencia u otra en respuesta a Mn+2.

Culotta y colaboradores mencionan en su revisión bibliográfica que al realizar

un análisis de perfilamiento de transcripción global en levaduras, no se encuentra

ningún regulón transcripcional obvio para Mn+2 (Culotta y cols., 2005).

4

La evidencia experimental de nuestro grupo de investigación en relación a la

expresión génica dependiente de Mn+2 nos instó a estudiar esta respuesta con mayor

detalle (Rüttimann y cols., 1992; Manubens y cols., 2003). Por más de una década,

nuestro grupo de investigación ha estado interesado en la biología molecular de P.

chrysosporium y Ceriporiopsis subvermispora, hongos de pudrición blanca

extensamente estudiados por su capacidad de degradar lignina. Varios de nuestros

hallazgos anteriores indican que el Mn+2 juega un rol central en la ligninolisis como

sustrato de la Mn+2 peroxidasa (Rüttimann y cols., 1992; Lobos y cols., 1994; Urzúa y

cols., 1995; Lobos y cols., 1998; Urzúa y cols., 1998; Tello y cols., 2000; Larrondo y

cols., 2001; Manubens y cols., 2003). C. subvermispora fue elegido para este estudio

por la importancia que tiene el Mn+2 en su metabolismo degradante de lignina. Este

organismo no cuenta con lignina peroxidasas como otros hongos degradadores de

lignina y sus peroxidasas dependientes de Mn+2 serían responsables de esta

capacidad metabólica (Rüttimann y cols., 1992; Lobos y cols., 1994). Este

basidiomicete no ha sido secuenciado aún, lo que hace difícil realizar estudios

transcriptómicos. La técnica de cDNA-AFLP nos permitió sobrellevar esta dificultad. En

general, esta técnica consiste en la digestión del cDNA con dos endonucleasas de

restricción diferentes, seguida de la ligación de 2 adaptadores complementarios a los

extremos cohesivos producidos durante la digestión (ver figura 1) (Bachem y cols.,

1996). Estos adaptadores nos permiten amplificar selectivamente fragmentos

derivados de transcriptos (TDF, por su sigla en inglés) y así buscar cuales son

expresados diferencialmente. El cDNA-AFLP es una técnica robusta y reproducible que

permite explorar el transcriptoma aún cuando no se dispone de la secuencia del

genoma, por lo que ha sido utilizada para realizar perfiles de expresión diferencial,

5

principalmente en plantas. Esta técnica ha atraído gran interés recientemente,

viendose reflejado en el número de publicaciones durante este año (Kadota y cols.,

2007; Leymarie y cols., 2007; Sarosh y Meijer, 2007; Yao y cols., 2007).

En este trabajo se realizará una exploración global y no dirigida del

transcriptoma de C. subvermispora a través de la cual se intentará identificar TDFs que

Figura 1. Esquema de la técnica de cDNA-AFLP

6

sean inducidos a nivel transcripcional por Mn+2. Luego se procederá a identificar a qué

gen corresponden, para finalmente relacionar la respuesta observada con su

participación en la homeostasis del metal a través de un análisis de la literatura. Se

estudiará también la presencia de elementos de respuesta a metales en las regiones

río arriba del sitio de inicio de la traducción de homólogos a los genes identificados

para así intentar comprender de mejor forma cómo se regula la homeostasis de este

metal.

7

Hipótesis

El ión Mn+2 ejerce un efecto regulador sobre la transcripción de genes de

Ceriporiopsis subvermispora que regulan su homeostasis y/o cuyos productos génicos

lo requieren para su actividad; las regiones promotoras de los genes que son inducidos

poseen elementos de respuesta a este metal.

Objetivos Generales

1. Identificar genes que sean inducidos en su expresión transcripcional por el ion

Mn+2 en C. subvermispora y relacionarlos con una función reguladora y/o

homeostática.

2. Estudiar las regiones promotoras río arriba del sitio de inicio de la traducción de

genes identificados e inducidos por un pulso de Mn+2 en busca de elementos de

respuesta a este metal.

Objetivos Específicos

1. Identificar TDFs cuya expresión se induce o reprime en respuesta a Mn+2

por medio de la técnica cDNA-AFLP.

2. Identificar a qué genes corresponden los TDFs por medio del clonamiento,

secuenciación y análisis bioinformático de sus secuencias.

3. Validar alguna de las respuestas observadas en el cDNA-AFLP por medio

del estudio por PCR en tiempo real comparativo.

4. Definir criterios de clasificación para las respuestas observadas por cDNA-

AFLP y PCR en tiempo real.

8

5. Analizar las secuencias regulatorias río arriba de los sitios de inicio de la

traducción de genes identificados como inducidos por el pulso de Mn+2.

9

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Materiales

2.1.1. Cepa fúngica

Ceriporiopsis subvermispora cepa FP-105752 fue obtenida del Center for

Mycology Research, CFMR (Forest Products Laboratory, Madison, WI, EEUU). Este

hongo fue mantenido a 4 °C en placas de Petri con medio agar papa-dextrosa (39 g/L)

Difco, (Sparks, MD, EEUU) y periódicamente fue traspasado a medio fresco.

2.1.2. Cepa bacteriana

Escherichia coli cepa DH5α F’ fue adquirida de Gibco BRL, Life Technologies

(Gaithersburg, MD, EEUU). Esta cepa fue mantenida a -20°C en glicerol 50%.

2.1.3. Medios de cultivo

2.1.3.1. Medio de cultivo estacionario para C. subvermispora

El medio estacionario se utilizó para la propagación de este hongo y para la

obtención del material inicial usado para la generación de los inóculos. Su composición

es la siguiente: 2,0 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de MgSO4, 0,1 g/L de CaCl2, 10 g/L de

glucosa, 1,74 g/L de ácido trans-aconítico (TAA) pH 4,5 usado como amortiguador, 1,0

g/L de tiamina-HCl, 0,2 g/L de tartrato de amonio, 194 µM de MnSO4*H2O y 1,0 mL/L

de solución de elementos trazas. La solución de elementos trazas 1.000X, contenía por

litro: 15 g de ácido nitrilotriacético, 1,0 g de FeSO4*7H2O, 0,85 g de CoCl2*6H2O, 1,0 g

de ZnSO4*7H2O, 1,0 g de CuSO4*5H2O, 0,07 g de Al2(SO4)3*18H2O, 0,1 g de H3BO3,

0,1 g de Na2MoO4*2H2O, 30 g de MgSO4·*7H2O, 10 g de NaCl y 1,0 g de CaCl2*2H2O.

Una vez disueltos todos los componentes, la mezcla se autoclavó a 121 ºC durante 30

10

min para su esterilización. Todos los componentes de este medio fueron adquiridos de

Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EEUU) o de Merck (Darmstadt, Alemania).

2.1.3.2. Medio de cultivo estándar para C. subvermispora

El medio estándar se utilizó para el crecimiento del hongo con agitación y su

composición es la siguiente: 2,0 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de MgSO4, 0,1 g/L de CaCl2,

10 g/L de glucosa, 1,74 g/L de ácido trans-aconítico (TAA) pH 4,5 usado como

amortiguador, 1,0 g/L de tiamina-HCl, 2 g/L de tartrato de amonio, 0,1 % de Tween 20

y 1,0 mL/L de solución de elementos trazas. La mezcla fue autoclavada a 121 ºC

durante 30 min para su esterilización. Todos los componentes fueron adquiridos de

Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EEUU) o de Merck (Darmstadt, Alemania). Las

variaciones en la concentración de Mn2+ (1,92 µM, 5 µM, 20 µM, 160 µM, 320 µM) en

los experimentos se realizaron manteniendo constante el resto de los componentes del

medio estándar.

2.1.3.3. Medio de cultivo para bacterias

Las cepas de E. coli DH5α F’ fueron cultivadas en caldo Luria: 10 g/L de

triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de NaCl, pH 7,0 ajustado con NaOH y

suplementado con 1 g/L de glucosa. En el caso de medios sólidos se usó como agente

solidificante agar-agar en una proporción de 15 g/L. Todos los medios fueron

esterilizados en autoclave a 121 ºC durante 30 min. Cuando se utilizó el antibiótico

ampicilina para preparar medios selectivos, se esterilizó una solución de 100 mg/mL

mediante filtración y se agregó a la mezcla autoclavada antes de su uso a una

concentración de 100 μg/mL. En algunos casos se utilizó IPTG y/o X-Gal a

concentraciones finales de 0,5 mM y 40 μg/mL, respectivamente. El agar-agar, la

triptona y el extracto de levadura fueron obtenidos de Difco (Sparks, MD, EEUU). Las

11

sales y la ampicilina de Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO, EEUU). El IPTG y X-Gal

se obtuvieron de US Biological (Swampscott, MA, EEUU). El resto de los componentes

proviene de Merck (Darmstadt, Alemania).

2.1.4. Plasmidios

En el transcurso de esta memoria se utilizó el plasmidio pCR2.1-TOPO de

Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU).

2.1.5. Enzimas

Para los procedimientos se utilizaron las enzimas de restricción EcoRI, VspI y

TaqI, y la DNA polimerasa GoTaq obtenidas de Promega (Madison, WI, EEUU).

También se utilizó DNA polimerasa Taq, DNA polimerasa I, ARNasa H y transcriptasa

inversa “SuperScript II” obtenidas de Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU).

2.1.6. Oligonucleótidos

Los oligonucleótidos utilizados durante esta memoria se muestran en la tabla 1.

Todos fueron obtenidos de Integrated DNA Technologies , IDT, (Coralville, IA, EEUU).

Tabla 1. Partidores utilizados en todos los estudios realizados en este trabajo. Partidor Secuencia Síntesis cDNA Oligo(dT)-ADAPT 5' GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT 3' cDNA-AFLP A-TOP 5' CTC GTA GAC TGC GTA CC 3' A-BOT 5' TAG GTA CGC AGT C 3' A-0 5' CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3' A-AA 5' GAC TGC GTA CCT AAT AA 3' A-AC 5' GAC TGC GTA CCT AAT AC 3' A-AG 5' GAC TGC GTA CCT AAT AG 3' A-AT 5' GAC TGC GTA CCT AAT AT 3' A-CA 5' GAC TGC GTA CCT AAT CA 3' A-CC 5' GAC TGC GTA CCT AAT CC 3' A-CG 5' GAC TGC GTA CCT AAT CG 3' A-CT 5' GAC TGC GTA CCT AAT CT 3' A-GA 5' GAC TGC GTA CCT AAT GA 3' A-GC 5' GAC TGC GTA CCT AAT GC 3' A-GG 5' GAC TGC GTA CCT AAT GG 3'

12

Continuación tabla 1 A-GT 5' GAC TGC GTA CCT AAT GT 3' A-TA 5' GAC TGC GTA CCT AAT TA 3' A-TC 5' GAC TGC GTA CCT AAT TC 3' A-TG 5' GAC TGC GTA CCT AAT TG 3' A-TT 5' GAC TGC GTA CCT AAT TT 3' T-TOP 5' GAC GAT GAG TCC TGA C 3' T-BOT 5' CGG TCA GGA CTC AT 3' T-0 5' GAC GAT GAG TCC TGA CCG A 3' T-AA 5' GAT GAG TCC TGA CCG AAA 3' T-AC 5' GAT GAG TCC TGA CCG AAC 3' T-AG 5' GAT GAG TCC TGA CCG AAG 3' T-AT 5' GAT GAG TCC TGA CCG AAT 3' T-CA 5' GAT GAG TCC TGA CCG ACA 3' T-CC 5' GAT GAG TCC TGA CCG ACC 3' T-CG 5' GAT GAG TCC TGA CCG ACG 3' T-CT 5' GAT GAG TCC TGA CCG ACT 3' T-GA 5' GAT GAG TCC TGA CCG AGA 3' T-GC 5' GAT GAG TCC TGA CCG AGC 3' T-GG 5' GAT GAG TCC TGA CCG AGG 3' T-GT 5' GAT GAG TCC TGA CCG AGT 3' T-TA 5' GAT GAG TCC TGA CCG ATA 3' T-TC 5' GAT GAG TCC TGA CCG ATC 3' T-TG 5' GAT GAG TCC TGA CCG ATG 3' T-TT 5' GAT GAG TCC TGA CCG ATT 3' 3’ RACE ACT-5- 5’ GCG CAA TGG TAA ATC TGG AGG TAC 3’ PCR en tiempo real CsGAPDH Fw2 5’ TCC ACG ACA AGT TCG GCA TTG 3’ CsGAPDH Rv2 5’ CCA CCA CGC CAG TCC TTG ATT 3’ CsMn02 Fw 5’ TGA GTC TAA TAT GGA AAT TCT TCA GAG CTG G 3’ CsMn02 Rv 5’ CCC ACC TTG TGG TAC ACC AAG TAT T 3’ CsMn04 Fw 5' TGC TGT AAA CTC TGA AGC TGG GCT 3' CsMn04 Rv 5' AGC TGG CGT ATC AAT GGT GGT GTT 3’ CsMn06 Fw 5’ TCG TTG GAT GGG TGA TTT GGG TCA 3’ CsMn06 Rv 5’ AGT GCG AGT TGC TTA GCC CAC TT 3’ CsMn09 Fw 5’ TTG TAT CGT GAC ACG CTT GGG TTC 3’ CsMn09 Rv 5’ TTC AGT GAC AGG CGC ATC GCA TA 3’ CsMn34 Fw 5’ GCT AAT TGA GGC AAA CCC GAA TGC 3’ CsMn34 Rv 5’ GAA TGC CTC GGC TCA TCA TAC CAT 3’ CsMn36 Fw 5’ AGC GTC CTC AGA CCA CTG TAC ATA 3’ CsMn36 Rv 5’ GGA GAT CGG TAT CGC CAA GTT TGT 3’ CsMn41 Fw 5’ GGT TTG TCT GCC CGA ACT GTA AGA 3’ CsMn41 Rv 5’ ACT ATC CGG GTA CTC GTC CAG AAA 3’ CsMn42 Fw 5’ TAG ACA TCT TCA CGG ACT GGG TGT 3’ CsMn42 Rv 5’ TGG CCT GTA CTT CAT CTT CAT CAG G 3’ lcs1 Fw 5’ TGC GAA CTT ACT GAA CGA GGC TGA 3’ lcs1 Rv 5’ ATC GAC AGC GTC AAA GTC CTG GTT 3’ mnp2B Fw 5’ AAG TGG AGT CAC CCC TTC CC 3’ mnp2B Rv 5’ TCA CGG GCA AGA GCA AAG TC 3’

13

2.1.7. Sistemas comerciales

2.1.7.1. Extracción de DNA plasmidial de E. coli

Se utilizó el sistema “QIAprep Spin Miniprep Kit” de QIAGEN (Valencia, CA,

EEUU).

2.1.7.2. Purificación de mRNA poli(A)

Se utilizó el sistema “Dynabeads® mRNA Purification Kit” de Dynal (Oslo,

Noruega).

2.1.8. Reactivos radioactivos

El ribonucleótido [γ-32P]-ATP (3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml) se obtuvo de Perkin

Elmer Life Sciences, Inc. (Boston, MA, EEUU).

2.1.9. Reactivos generales

El papel Miracloth fue obtenido de Calbiochem (San Diego, CA, EEUU). Las

membranas de transferencia usadas fueron GeneScreen Plus de Perkin Elmer Life

Sciences, Inc. (Boston, MA, EEUU). El resto de las sales, reactivos líquidos y

compuestos orgánicos fueron adquiridos de Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO,

EEUU), de Merck (Darmstadt, Alemania) o de Fluka Chemie (Buchs, Suiza).

2.1.10. Material fotográfico

Para las fotografías en blanco y negro se utilizaron películas Polapan 667 de

Polaroid (Cambridge, MA, EEUU). Las películas para autorradiografía que se utilizaron

fueron XAR-5, BioMax MS y BioMax MR de Eastman Kodak Company (Rochester, NY,

EEUU).

14

2.2. Métodos

2.2.1. Condiciones de cultivo

2.2.1.1. Crecimiento de C. subvermispora en medio estacionario

Debido a que este hongo no produce esporas en las condiciones

experimentales en que se mantiene en el laboratorio fue necesario utilizar micelio

molido como inóculo.

C. subvermispora fue cultivado en medio sólido en placas de Petri con agar

papa dextrosa durante 10 días en una estufa a 28 ºC. Una vez crecido, se utilizaron

trozos de agar de aproximadamente 1 cm2 para inocular matraces de 500 mL con 25

mL de medio estacionario.

Después de cultivar el hongo durante aproximadamente 14 días a 28 °C y sin

agitación, el micelio fue recolectado en un frasco de 100 mL que contenía 15 g de

esferas de vidrio de 5 mm de diámetro estériles. Mediante una fuerte agitación se molió

el micelio hasta obtener una suspensión homogénea. Se agregaron alícuotas de 0,2

mL de este micelio molido sobre discos de papel filtro de 2 cm de diámetro

previamente pesados y se secaron en una estufa a 80 ºC durante dos horas para

determinar el peso seco correspondiente al micelio presente en el medio estacionario.

2.2.1.2. Crecimiento de C. subvermispora en medio estándar

Se inocularon 45 mg (determinados como peso seco en el punto anterior) de

micelio molido, obtenido a partir de cultivos estacionarios, en 100 mL de medio de

cultivo estándar contenidos en matraces de 250 mL. Los cultivos se efectuaron en un

agitador orbital con una agitación constante de 180 rpm a 28 ºC. Después de 10 días,

los cultivos fueron cosechados mediante filtración al vacío a través de papel Miracloth,

congelados inmediatamente en N2 líquido y almacenados a -70 °C.

15

Se realizaron ensayos en 5 condiciones de cultivo variando solamente la

concentración de Mn+2, las que fueron 0, 5, 20, 160 y 320 μM. Además se realizaron

ensayos en condiciones de 5 μM de Mn+2 a los que luego de su cultivo de diez días se

les agregó Mn+2 hasta una concentración de 160 μM y se cosechó a los 60 y 90

minutos posteriores a la suplementación.

2.2.2. cDNA-AFLP para C. subvermispora

2.2.2.1. Extracción de RNA de micelio congelado

Una cantidad de aproximadamente 1 mL (medido en un tubo eppendorf) de

micelio congelado en nitrógeno líquido se molió mediante mortero hasta obtener un fino

polvo blanco. Al micelio molido se le agregaron 4,0 mL de tampón de extracción frío

(Clorhidrato de guanidina 6 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM y β-mercaptoetanol 50

mM) y 4 mL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) saturado en agua, luego

se procedió a homogenizar la mezcla en el mortero. Se tomó el total del volumen

homogenizado con una jeringa de 10 mL 21G para luego vaciarla sobre el mortero.

Este procedimiento se repitió 8 veces donde la última vez se recibió la mezcla en un

tubo Falcon de 50 mL. Se agitó en el vortex la mezcla obtenida por 1 minuto para luego

traspasarla a 5 tubos eppendorf de 2 mL. Los tubos fueron centrifugados a 14000 rpm

durante 15 minutos. Luego de separar la fase acuosa, se agregó 1 volumen de

cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), agitó en vortex y centrifugó a 14000 rpm durante

15 minutos, procedimiento que fue repetido una vez más. En seguida se tomó el

sobrenadante y traspasó a un tubo eppendorf de 1,5 mL y se agregaron 2 volúmenes

de etanol absoluto frío, para precipitar el RNA a -20 °C durante 30 minutos.

Posteriormente se centrifugó a 14000 rpm durante 30 minutos y se eliminó el

16

sobrenadante. El sedimento se secó a temperatura ambiente durante 15 min, las gotas

adicionales que se encontraban en el tubo y no en el sedimento fueron removidas con

ayuda de una punta estéril y una bomba de vacío. El sedimento se resuspendió en 50

μL de agua libre de nucleasas (0,1% DEPC) y las fracciones del sedimento que no

pudieron ser resuspendidas por simple agitación fueron eliminadas. Para analizar la

integridad de los ARNs extraídos se corrió un gel de agarosa/formaldehído al 1,2% con

10 μg de RNA cuantificado mediante espectrofotometría a 260 nm.

2.2.2.2. Geles desnaturantes para ARN.

Luego de obtener el RNA total, se cuantificó espectrofotométricamente

utilizando la siguiente formula (Concentración RNA (µg/mL) = A260 * 40) y se corroboró

la integridad de éste mediante electroforesis en geles de agarosa / formaldehído al 1,2

% cargando 10 μg de muestra por carril.

2.2.2.3. Purificación de ARNs poli(A)

A partir de 75 μg de RNA total extraído anteriormente, se procedió a extraer una

fracción rica en RNA poli(A) mediante captura magnética utilizando el sistema

comercial “Dynabeads® mRNA Purification Kit” el cual mediante oligo(dT) ligado a

partículas paramagnéticas permite enriquecer nuestra solución en RNA poly(A).

2.2.2.4. Síntesis de cDNA de doble hebra

Luego de obtener los mRNA, se utilizó 10 μL (1 μg de mRNA) de esta solución

para la síntesis del cDNA. Para sintetizar la primera hebra se preparó una reacción de

transcripción inversa utilizando la enzima SuperScript II en el medio y con las

condiciones de temperatura recomendadas por el fabricante y utilizando como partidor

el oligo(dT)-ADAPT (ver tabla 1) (2 ng/μL). Para la síntesis de la segunda hebra a esta

mezcla de reacción se le agregó 35 U de DNA polimerasa I, 15 U de ARNasa H, 25

17

μmoles de nucleótidos, 150 μmoles de DTT, 15 μL de un tampón 10X (Tris-HCl 200

mM, KCl 750 mM, (NH3)2SO4 100 mM, MgCl2 50 mM, DTT 10 mM) y se llevó a 150 μL

finales con agua, reacción que se incubó 2 horas a 16ºC. Para analizar la calidad del

producto se analizaron 5 μL de esta en un gel de agarosa 1%, para luego ser purificado

mediante el sistema comercial “EZNA Cycle pure kit” y eluídos con 40 μL de agua.

2.2.2.5. Digestión con enzimas de restricción

20 μL de los cDNA preparados anteriormente se digirieron con 10 U de la

enzima de restricción TaqI en una reacción de 40 μL con el tampón indicado por el

fabricante y BSA durante 1 hora a 65ºC. Luego a esta reacción se le agregó 10 U de

VspI, el tampón indicado por el fabricante, BSA y agua hasta 50 μL totales, reacción

que se incubó durante 1 hora a 37ºC.

2.2.2.6. Preparación y ligación de adaptadores

Se prepararon dos adaptadores, uno con un extremo complementario a la

secuencia de corte de TaqI y el otro con un extremo complementario a la de VspI. Para

esto se diseñaron 2 parejas de oligonucleótidos (según el protocolo de Bachem y

cols.,, 1996) complementarios entre sí, A-TOP con A-BOT y T-TOP con T-BOT. Las

secuencias se muestran en la figura 2. Para el apareamiento se incubaron cantidades

iguales de cada uno de los oligonucleótidos adaptadores en un tampón Tris 10 mM pH

8,0, NaCl 50 mM y EDTA 1 mM, solución que se calentó a 95ºC mediante un calefactor

(seco) el cual se apagó para enfriar muy lentamente hasta temperatura ambiente. De

una solución 50 pM de oligonucleótidos adaptadores se tomó 1 μL de cada uno de

estos adaptadores y se incubaron con toda la reacción de digestión de cDNA y 400 U

de DNA ligasa de fago T4, incubando 2 horas a Tº ambiente. El producto de esta

reacción se denominó templado primario.

18

2.2.2.7. Pre-Amplificación mediante PCR

Utilizando 100 ng de cada partidor (A-0 y T-0) y 10 μL de templado primario se

llevó a cabo una reacción de PCR en presencia de 1 mM de MgCl2, 125 μM de cada

dNTP, y 2,5 U de DNA polimerasa Taq, mediante un programa de 25 ciclos con

temperatura de desnaturación de 94 ºC durante 30 segundos, apareamiento a 55 ºC

durante 30 segundos y extensión a 72 ºC durante 1 minuto.

2.2.2.8. Marcación radioactiva de partidores para amplificación selectiva

Para la etapa posterior de amplificación selectiva la marca radioactiva se

agregó mediante la marcación del partidor en el extremo 5’. La reacción de fosforilación

necesaria para llevar a cabo la posterior reacción de amplificación contenía 10 pmol de

partidor A-NN, 1 U de quinasa de fago T4, y 10 pmol de γ-32P-ATP, en un volumen final

de 2,5 μL, esta reacción que fue escalada hasta 10 veces según la cantidad a utilizar.

2.2.2.9. Amplificación selectiva mediante PCR

De una dilución 1:50 de la reacción de pre-amplificación, se utilizaron 5 μL para

la reacción de amplificación selectiva en presencia de un partidor A-NN previamente

Figura Nº2. Esquema de la estructura de los adaptadores utilizados para cDNA-AFLP. Los adaptadores luego de ser alineados fueron ligados al CDNA digerido por las enzimas TaqI y VspI, para luego ser amplificados en la etapa de preamplificación.

19

marcado radioactivamente y uno T-NN no marcado (25 nM final) (ver tabla Nº1). Las

concentraciones de los otros reactivos fueron similares a los de la pre-amplificación.

El protocolo usado para el termociclador comprende 11 ciclos de un protocolo

tipo “touchdown”: el paso de desnaturación se llevó a cabo a 94ºC durante 30

segundos, el alineamiento se llevó a cabo durante 30 segundos partiendo de una

temperatura de 65ºC y disminuyendo 0,7ºC por cada ciclo y la extensión fue de 1

minuto a 72ºC. Luego se realizaron 24 ciclos con desnaturación a 94ºC durante 30

segundos, alineamiento a 56ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 1

minuto.

2.2.2.10. Visualización de cDNA-AFLP

A 3 μL de la reacción de amplificación selectiva se le agregaron 2 μL de “Stop

Mix Solution” (NaOH 10 mM, formamida 95%, azul de bromofenol 0,05% y xilen-cianol

0,05%). Esto se cargó en geles de tipo secuenciación (acrilamida 6%, Urea 7 M) y se

realizó la electroforesis durante aproximadamente 2 horas. Luego los geles se secaron

en papeles Whatmann 3MM en un secador de geles Bio-Rad durante 30 minutos y se

colocaron en contacto con una película Kodak X-OMAT AR durante 10-36 horas

a -70ºC, la que luego fue revelada.

2.2.3. Identificación de TDFs visualizados mediante cDNA-AFLP

2.2.3.1. Aislamiento y reamplificación de TDFs

Las bandas elegidas se cortaron directamente del gel seco utilizando como

referencia la autoradiografía, y se incubaron a 65ºC en 100 μL de tampón TE (Tris-HCl

1M, EDTA 50 mM, pH 8,0) durante 2 horas, agitando periódicamente en vortex.

20

La reacción de reamplificación se realizó con 5 μL de eluído utilizando el mismo

protocolo indicado en 2.2.2.6 pero utilizando un partidor A-0 y otro T-NN, y aumentando

los ciclos a 30.

2.2.3.2. Ligación de amplificados de PCR al vector pCR2.1-TOPO TA

Para la ligación del fragmento amplificado por PCR al vector seleccionado se

siguió las instrucciones del fabricante utilizando 3 μL del producto de PCR purificado.

2.2.3.3. Preparación de células electrocompetentes y transformación

de E. coli mediante electroporación

A partir de 500 mL de cultivo de E. coli en medio LB incubado hasta alcanzar

una densidad óptica de 0,6 a 600 nm, se procedió con la preparación de las bacterias

electrocompetentes. Para esto se incubó el cultivo en hielo y cámara fría durante 30

minutos para después centrifugar a 6000 g durante 15 minutos, se eliminó el

sobrenadante y se agregó 500 mL de H2O destilada fría y estéril. Este procedimiento

se realiza 4 veces disminuyendo el volumen en 250 mL, 125 mL y en 20 mL,

resuspendiendo el último sedimento en 2 mL de glicerol 10% frío y estéril, para

posteriormente almacenar las células a -70 ºC en alícuotas de 50 μL.

2.2.3.4. Extracción de DNA plasmidial para secuenciación

Para realizar las extracciones de DNA plasmidial se utilizó el sistema “QIAprep

Spin Miniprep Kit” de QIAGEN. Las preparaciones de plasmidios se cuantificaron

espectrofotométricamente y se comprobó su integridad mediante electroforesis en

geles de agarosa al 1%.

2.2.3.5. Análisis bioinformático de secuencias obtenidas

Para el análisis bioinformático se utilizaron diversas herramientas de distintos

servidores: del servidor del NCBI se utilizaron la herramienta BLAST (blastn, tblastx, y

21

blastp) y las herramientas de predicción de dominios conservados “Conserved Domain

Search” (www.ncbi.nlm.nih.gov). La herramienta BLAST también se utilizó desde el

servidor del genoma de P. chrysosporium (http://genome.jgi-

psf.org/Phchr1/Phchr1.home.html). Para conocer la función de las proteínas con

homología a nuestros fragmentos utilizamos la base de datos de UNIPROT

(http://www.pir.uniprot.org/) de donde obtuvimos información relacionada a su función

a partir de la literatura citada en relación a cada proteína y del programa de consulta a

base de datos QuickGo (Quick Gene Ontology) (The_UniProt_Consortium 2007).

También consultamos la base de datos del genoma de S. cerevisiae “Saccharomyces

genome database” (http://www.yeastgenome.org/), desde donde obtuvimos referencias

a trabajos describiendo la función de proteínas y diversas descripciones de complejos

proteicos o las redes metabólicas en los que participa la proteína involucrada.

2.2.4. Análisis de expresión comparativa por PCR en tiempo real

Se utilizó cDNA de 7 condiciones de cultivo diferentes, donde las concentraciones

de Mn+2 utilizadas para estudiar los niveles de expresión comparativos fueron de 0, 5, 5

+ pulso 160 μM por 60 min, y 5 + pulso 160 μM por 90 min, 20, 160 y 320 μM. La

condición control fue la de 5 µM Mn+2. La mezcla de reacción contenía 2 μL de cDNA,

10 μL de Brilliant® SYBR® Green 2X QPCR Master Mix de Stratagene (La Jolla, CA),

primers Fw y Rv 100 nM, y el fluoróforo de referencia ROX a una concentración de 300

nM en un volumen final de 20 μL. Para determinar los ciclos umbrales (Ct, por sus

siglas en inglés) se utilizó el sistema y equipo MX3000P QPCR de Stratagene junto a

su software. El protocolo de cada reacción de PCR, consistía en un ciclo de partida en

caliente (hotstart) a 94ºC por 10 min, seguidos de 40 ciclos a 94ºC por 30 seg, 55ºC

22

por 30 seg y 72ºC por 30 seg. Se agregó una curva desnaturante donde se determinó

la temperatura de desnaturación del producto de PCR midiendo la emisión del SYBR

GREEN mientras aumentaba la temperatura entre el rango de 55ºC y 94ºC. Las

razones de expresión relativa fueron calculadas de acuerdo al método Pfaffl (Pfaffl,

2001).

2.2.5. Análisis bioinformático de elementos reguladores de unión a factores de

transcripción en regiones río arriba de genes involucrados en la

homeostasis de manganeso.

El análisis bioinformático para la identificación de TDFs nos otorgó sus

homólogos en P. chrysosporium. De estos modelos génicos se acotaron secuencias de

2 kb río arriba del sitio de inicio de la traducción y analizamos los sitios putativos de

unión a factores de transcripción utilizando la matriz y base de datos para hongos del

programa MatInspector de la empresa Genomatix (Munich,

Alemania) (Cartharius y cols., 2005). En otros casos utilizamos la misma metodología

pero con regiones río arriba provenientes de C. subvermispora u homólogos en P.

chrysosporium de genes relacionados previamente con la homeostasis de Mn+2. Los

resultados provenientes de MatInspector fueron incorporados a una matriz comparativa

por el programa GEMS Launcher de la misma empresa.

2.2.6 Microscopía óptica.

Se obtuvieron fotografías digitales de C. subvermispora creciendo sobre

madera utilizando un estereomicroscopio modelo SMZ1000 marca Nikon y una cámara

digital de la misma marca modelo Digital Sight DS-5Mc.

23

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Definiendo un criterio de clasificación para genes regulados por manganeso.

Para entender la expresión génica regulada por Mn+2 y su homeostasis,

diseñamos dos estrategias experimentales: la primera denominada respuesta a pulso

y la segunda, respuesta a Mn+2 estacionario. La estrategia en base a respuesta a pulso

consistió en la identificación de TDFs que variaban sus niveles de expresión 60 y 90

minutos después de aplicar un pulso de 160 μM Mn+2 a un cultivo de 14 días de C.

subvermispora con una concentración estacionaria de 5 μM Mn+2. Se utilizaron cultivos

de 14 días porque sabemos que la actividad extracelular de las peroxidasas

dependientes de Mn+2 es óptima en el día 14 (Manubens y cols., 2003; Rüttimann y

cols., 1992). Los TDFs que mostraron una tendencia a incrementar su nivel de

expresión relativa, en comparación con el cultivo estacionario control a 5 μM Mn2+,

fueron clasificados como inducidos, aquellos que tendían a bajar sus niveles como

reprimidos y los que no seguían ninguna tendencia como no regulados (ver tabla 2). El

modelo de respuesta a Mn+2 estacionario difería en las condiciones de cultivo, aquí C.

subvermispora fue cultivado bajo concentraciones estacionarias de Mn+2 que variaban

entre 5 y 160 μM.

De 37 TDFs secuenciados, 21 fueron clasificados en una de las tres categorías

antes mencionadas, sin embargo, todas las secuencias fueron publicadas por nosotros

en la base de datos dbEST del GenBank, diseñada por Benson y colaboradores, para

que en un futuro puedan ser identificados a medida que más genomas sean

secuenciados y más genes caracterizados (Benson y cols., 2006).

24

25

En base al análisis de los resultados del PCR en tiempo real comparativo (ver tabla 3),

decidimos restringir nuestro criterio de clasificación. C. subvermispora puede crecer en

condiciones de cultivo que contienen concentraciones de Mn+2 de hasta 5 mM (no

intentamos cultivar a mayor concentración), indicando la existencia de una maquinaria

homeostática y/o destoxificante muy robusta para la regulación de la biodisponibilidad

de este metal. Cuando los micelios son cultivados a concentraciones de Mn+2 iguales o

superiores a 320 μM, estos toman un color café característico. Los micelios de C.

subvermispora normalmente blancos son. El color blanco se da tanto en condiciones

de cultivo donde la concentración de Mn+2 es inferior o igual a 160 μM o cuando

crece en su medio natural, la madera (ver figura 3). El estudio de la

expresión relativa de TDFs por PCR en tiempo real incluyó inicialmente 5 condiciones

Tabla 3. Expresión relativa de TDFs y genes estudiada por PCR tiempo real comparativo.

Estrategia experimental Pulso corto de Mn+2 Concentración de Mn+2 estacionaria

Fragmento o Gen

Sin pulso (5 μM)

Pulso de 160 μM por 60 min

Pulso de 160 μM por 90 min 5 μM 20 μM 160 μM

CsMn02 1,00 ± 0,08 0,31 ± 0,01 0,99 ± 0,11 1,00 ± 0,08 1,08 ± 0,01 2,85 ± 0,42

CsMn04 1,00 ± 0,14 0,69 ± 0,01 1,33 ± 0,11 1,00 ± 0,14 1,40 ± 0,10 6,81 ± 0,27

CsMn06 1,00 ± 0,03 0,22 ± 0,01 1,09 ± 0,11 1,00 ± 0,03 1,17 ± 0,16 2,39 ± 0,34

CsMn09 1,00 ± 0,10 1,72 ± 0,09 3,27 ± 0,22 1,00 ± 0,10 1,10 ± 0,16 1,29 ± 0,30

CsMn34 1,00 ± 0,06 0,59 ± 0,03 1,19 ± 0,10 1,00 ± 0,06 1,38 ± 0,04 3,86 ± 0,27

CsMn36 1,00 ± 0,02 1,10 ± 0,05 2,06 ± 0,27 1,00 ± 0,02 0,71 ± 0,04 1,35 ± 0,09

CsMn41 1,00 ± 0,06 0,83 ± 0,17 1,88 ± 0,04 1,00 ± 0,06 0,89 ± 0,15 1,99 ± 0,09

CsMn42 1,00 ± 0,03 1,03 ± 0,11 3,28 ± 0,24 1,00 ± 0,03 1,09 ± 0,04 0,93 ± 0,02

lcs1 (gen) 1,00 ± 0,07 1,30 ± 0,03 1,27 ± 0,02 1,00 ± 0,07 1,35 ± 0,03 3,28 ± 0,17

mnp-2b (gen) 1,00 ± 0,01 2,46 ± 0,35 2,11 ± 0,22 1,00 ± 0,01 0,74 ± 0,01 1,56 ± 0,13

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Figura 3. Ceriporiopsis subvermispora cultivado en madera. Los aumentos A, B y C corresponden a un mismo fragmento tomado desde un tronco inoculado con C. subvermispora. Las fotografías fueron obtenidas por microscopía óptica y fotografía digital y tienen un aumento de 60X aproximadamente.

27

de Mn+2 estacionario (0, 5, 20, 160, 320 µM Mn2+). Para poder estudiar correctamente

el efecto de concentraciones estacionarias ascendentes sobre el transcriptoma del

hongo decidimos excluir los datos derivados de las condiciones de cultivo 0 y 320 µM

Mn2+. La expresión relativa de los TDFs en estas condiciones no seguía la tendencia

encontrada en las otras, lo que nos sugiere que estaría operando una respuesta

pleiotrópica a la toxicidad de la falta y exceso de este metal (datos no incluidos).

Evitamos condiciones de cultivo tóxicas o no fisiológicas dado que escapan el enfoque

de este trabajo.

3.2 Inducción en respuesta al pulso corto de manganeso

Los TDFs CsMn09 y CsMn42 mostraron el mayor aumento en expresión bajo

este criterio, cercanos al triple del observado en la condición control 90 minutos

después del pulso (ver tabla 3). CsMn09 fue identificado como la subunidad ARD1 del

complejo N-acetiltransferasa (ver tabla 2). Este complejo cataliza la N-acetilación de

polipéptidos nacientes de una forma co-traduccional, y de esta forma es responsable

de la N-acetilación de cerca del 85% de todas las proteínas eucariontes (Driessen y

cols., 1985; Polevoda y Sherman, 2000). ARD1 es requerida para la acetilación N-

terminal junto a NAT1, otra subunidad del complejo (Mullen y cols., 1989). NATH es el

homólogo humano de NAT1 y se describió su alta expresión en carcinomas agresivos,

lo que sugiere una relación con la proliferación celular. En una revisión bibliográfica

reciente, se sugiere que el aumento en los niveles de mRNA de NATH explicarían un

aumento en la actividad traduccional celular, lo que nosotros creemos es la razón por

la cual la transcripción del gen ARD1 se encuentra inducida en respuesta al pulso de

Mn+2 (Polevoda y Sherman 2003). CsMn09 también se encuentra literalmente inducida

28

en el escenario de Mn+2 estacionario, sin embargo, su inducción es menor y no

significativa estadísticamente (ver tabla 3). Esto puede ser indicativo del esfuerzo

biosintético que la célula debe hacer para lograr la homeostasis del Mn+2.

CsMn42, identificado como la proteína de unión a la secuencia HDEL de

Cryptococcus neoformans, fue inducido de forma similar por el pulso de Mn+2 (ver

tablas 1 y 2). Esta proteína es un receptor responsable del reconocimiento de la

secuencia peptídica HDEL, presente en el extremo C-terminal de proteínas residentes

del RE (Semenza y cols., 1990). El homólogo de este receptor en levaduras es Erd2.

En el estudio con Mn+2 estacionario, no encontramos inducción en la expresión de este

TDF (ver tabla 3). La expresión transiente de CsMn42 en respuesta al pulso de Mn+2

nos indica que la respuesta homeostática requiere una inducción de la vía secretora. El

receptor sería inducido en este caso para poder retener a las proteínas residentes del

ER en su lumen cuando la actividad de la vía secretora se encuentra aumentada. De

no inducirse la expresión de CsMn42, se produciría la secreción de proteínas

residentes del ER hacia el espacio extracelular junto con el Mn+2 que estaría siendo

secretado. Este receptor también ha sido relacionado con la biogénesis y organización

de la pared celular, lo que se correlacionaría con la actividad de CsMn04 discutida a

continuación (Hughes y cols., 2000).

CsMn04 fue identificado cómo homólogo de la proteína SSD1 de S. cerevisiae

(ver tabla 2). Esta proteína ha sido asociada a la biogénesis y organización de la

pared celular por varios autores (Tsuchiya y cols., 1996; Ibeas y cols., 2001; Kaeberlein

y Guarente 2002). En respuesta al pulso de Mn+2, la expresión de esta proteína se

redujo un 31% a los 30 minutos y luego a los 90 minutos se incrementó en un 33%

relativo al control, dando cuenta de un cambio de 64% en 30 minutos (ver tabla 3). Esta

29

inducción tardía puede deberse a la naturaleza y función de esta proteína. Uno de los

primeros estudios que buscaba caracterizar la función de SSD1 demostró que esta

proteína confería a la célula tolerancia a altas concentraciones de Ca+2, un catión

bivalente relacionado con la homeostasis de Mn+2 a través de la bomba simportadora

Pmr1p (Dürr y cols., 1998). SSD1 fue descrito como un regulador de la resistencia a la

proteína de defensa osmotina (PR-5) de plantas en S. cerevisiae, lo que está

fuertemente ligado a la respuesta estrés iónico. SSD1 media la destinación y/o síntesis

de factores de resistencia a osmotina hacia la pared celular de una forma post-

transcripcional, y es además necesaria para mantener la integridad celular durante el

estrés osmótico inducido por osmotina (Ibeas y cols., 2001). La inducción tardía de

este factor se relaciona con el rol post-transcripcional de su función reguladora.

Sorprendentemente, se encontró una inducción de un 581% cuando C. subvermispora

fue cultivada a la concentración estacionaria de 160 µM Mn2+ (ver tabla 3). Esta

evidencia sugiere que SSD1 tiene un rol crucial en la homeostasis del Mn+2 que

debiese ser estudiada en detalle.

Encontramos gran homología entre la proteína de unión a nucleótidos 35

(Nbp35 por sus siglas en inglés) de S. cerevisiae y el TDF CsMn41 (ver tabla 2). Su

expresión originalmente decreció en un 17% a los 60 minutos para luego incrementar

en un 88% relativo al control (cambio en expresión neto de un 105% en 30 minutos),

mostrando así claramente su inducción (ver tabla 3). Nbp35 es una proteína esencial

que juega un rol central en el ensamblaje de “núcleos Fe-S” (Fe-S clusters, en inglés)

citosólicos y nucleares. Como fue revisado recientemente en la literatura, Nbp35

participa en este proceso como parte de un sistema de andamio para el ensamblaje y

transferencia de “núcleos Fe-S” a apoproteínas junto a Cdf1, Nar1 y otros miembros de

30

la maquinaria de ensamblaje de “núcleos Fe-S” citosólicos (CIA, por su sigla en inglés)

(Lill y Muhlenhoff 2006). El Mn+2 no sólo converge con el hierro en la regulación de

procesos celulares en bacterias, sino que también se ha demostrado su participación

en la regulación de la proteína reguladora de hierro 1 (Irp1, por su sigla en inglés),

también conocida como aconitasa citosólica. Irp1 es una de las principales reguladoras

de la homeostasis del hierro y sensa los niveles de hierro citosólico a través de un

“núcleo 4Fe-4S,” del cual su Fe en la cuarta posición lábil puede ser remplazado por

otros metales para formar la holoenzima. Irp1 es una aconitasa citosólica activa cuando

el hierro está ampliamente disponible; este nivel de actividad puede ser replicado en

condiciones donde el Mn+2 está ampliamente disponible y el hierro es escaso. La

naturaleza reguladora de Irp1 consiste en la capacidad de esta proteína, bajo

condiciones de deficiencia de hierro, de unirse a elementos de respuesta a hierro (IRE

por sus siglas en inglés) presente en las regiones no traducidas (UTR, por su sigla en

inglés) 5’- y 3’- de los transcriptos diana. Sin embargo, se cree que esta proteína juega

un rol crucial como sensor para varios metales celulares (Oshiro y cols., 2002). La

actividad reguladora de Irp1 es dependiente del ensamblaje de “núcleos Fe-S,” lo que

al mismo tiempo depende de Nbp35 (Roy y cols., 2003; Lill y Muhlenhoff, 2006). El

Mn+2 también genera citotoxicidad a través de la inactivación de enzimas

mitocondriales que contienen “núcleos Fe-S,” entre ellas la aconitasa, NADH-

ubiquinona reductasa (complejo I), y la succinato deshidrogenasa (complejo II) (Chen y

cols., 2001). La inducción en respuesta a pulso corto de nbp35 puede deberse a la

necesidad de “núcleos Fe-S” para sensar el Mn+2 y así gatillar mecanismos necesarios

para alcanzar la homeostasis de Mn+2. El perfil de expresión en presencia de Mn+2

estacionario revela que la inducción observada a los 90 minutos después del pulso es

31

sostenida en el tiempo, ya que la condición de cultivo que posee una concentración de

Mn+2 estacionaria de 160 μM muestra un 99% de inducción relativa a la condición

control (ver tabla 3). El perfil de expresión sostenida a 160 μM Mn+2 demuestra un

requerimiento constante de la síntesis de esta proteína.

CsMn33 fue identificado como un miembro putativo de la familia de

hidrolasas/oxidoreductasas Zn-dependientes (ver tabla 2). El dominio de

hidrolasa/oxidoreductasa es conservado en al menos 81 proteínas de diferentes

organismos, principalmente procariontes (Marchler-Bauer y cols., 2007). Las únicas

conexiones encontradas entre esta familia de proteínas y el Mn+2 son: (1) el dominio de

unión a cationes y que (2) algunas de las proteínas que contienen este dominio han

sido caracterizadas como hidrolasas metal-dependiente. La inducción en la expresión

de este TDF también se observa en el estudio a Mn+2 estacionario (ver tabla 2). Este

puede ser un caso de inducción transcripcional por co-factor.

CsMn36 es otro TDF interesante. Fue identificado como Acil-Coenzima A (CoA)

deshidrogenasa, una enzima responsable de la oxidación de ácidos grasos en la

mitocondria y peroxisomas a través de un proceso conocido como β-oxidación (ver

tabla 3) (Wanders 2004). La expresión de este fragmento fue inducida 10% por el pulso

de Mn+2 a los 60 minutos y 106% a los 90 minutos (ver tabla 3). Especulamos que la

inducción del catabolismo de ácidos grasos a través de la β-oxidación en respuesta al

pulso de Mn+2 puede deberse a dos razones: (1) el requerimiento de energía adicional

para la (propuesta) mayor velocidad de traducción que suponemos ocurre en la célula

o (2) la necesidad de acetil-CoA como sustrato para la biosíntesis de novo de

fosfolípidos. El acetil-CoA es la unidad básica para la biosíntesis de ácidos grasos a

través de la ácido graso sintetasa (FAS por su sigla en inglés) junto con el malonil-CoA,

32

el cual también es producido a partir de acetil-CoA por la acetil-CoA carboxilasa. Entre

estos ácidos grasos se encuentran los componentes estructurales de los fosfolípidos

de membrana, tales como: los ácidos palmítico, palmitoleico, esteárico y otros (Itani y

Arslanian 1985; Daum y cols., 1998). Culotta y colaboradores (2005) proponen que en

situaciones donde el Mn+2 es tóxico, Pmr1p bombearía el exceso de éste hacia el Golgi

y así procedería a ser excretado a través de vesículas de la vía secretora de vuelta al

ambiente extracelular, lo que estaría de acuerdo con nuestra hipótesis que relaciona la

biosíntesis de fosfolípidos con el aumento en la concentración de Mn+2 (Culotta y cols.,

2005). Eide y colaboradores (2005) caracterizaron el “ionoma” de levadura a través de

un análisis genómico que abarcó a 4.000 mutantes en S. cerevisiae para buscar genes

involucrados en la homeostasis de elementos traza. 87% de las 113 mutaciones que

tuvieron un efecto en la concentración intracelular de Mn+2, incrementaron su

concentración. Esto claramente indica que la homeostasis de Mn+2 es lograda a través

de un proceso activo de excreción. La identificación de los genes que al ser mutados

incrementaron la concentración intracelular del metal reforzó la importancia de genes

involucrados en la biogénesis vacuolar (ver figura 4) (Eide y cols., 2005). Las

microscopias de transmisión electrónica tomadas por Rodrigo Mancilla, integrante de

nuestro grupo de investigación, concuerdan fuertemente con la hipótesis de Culotta y

cols. (2005) y las conclusiones de Eide y cols. (2005). Estos cortes muestran un

sorprendente aumento en estructuras con forma de vesículas en respuesta a

concentraciones estacionarias ascendentes del metal en cultivos de C.

subvermispora (ver figura 4).

33

34

En la figura 4d se puede ver claramente la fusión de las vesículas con la

membrana plasmática, evidenciando así un mecanismo destoxificante secretor. La

expresión de este TDF es inducida por el pulso, sin embargo, no es inducido ni

reprimido en el estudio de Mn+2 estacionario (ver tabla 2). Estos hechos concuerdan

con nuestra hipótesis de una biosíntesis de novo de membrana en respuesta al estrés

producido por el pulso de Mn+2, dado que en respuesta a Mn+2 estacionario, puede

estar operando una vía fisiológica de reciclamiento de fosfolípidos de membrana.

3.3 Represión en respuesta al pulso corto de manganeso

CsMn01 fue identificado como un homólogo de la fenilalanina amonio liasa

(PAL, por su sigla en inglés) de P. chrysosporium (ver tabla 1). Esta enzima tiene una

actividad desaminasa no oxidativa de L-fenilalanina y participa en el catabolismo de

este aminoácido. La PAL cataliza el primer paso de la vía de los fenilpropanoídes,

convirtiendo L-fenilalanina a ácido cinámico, el cual es metabolizado para biosintetizar

diferentes compuestos fenólicos a través de esta vía (Cochrane y cols., 2004). Un

estudio determinó que la respuesta bioquímica a altas concentraciones de Mn+2 en dos

poblaciones de Populus cathayana resultaba en un importante incremento (3-5 veces)

en la cantidad de L-fenilalanina disponible para la síntesis proteica, señalización celular

y quelación de metales. El tratamiento con Mn+2 también aumentó los niveles de

poliaminas y otros aminoácidos libres, especialmente prolina, histidina y la recién

mencionada L-fenilalanina. Estos datos favorecen el propuesto aumento en la

velocidad traduccional en respuesta a nuestro tratamiento con Mn+2. En su trabajo Lei y

colaboradores discuten que el aumento de la concentración de L-fenilalanina se

traduciría en una mayor actividad de la PAL, sin embargo no tienen datos

35

experimentales sobre esta enzima y el estudio citado para avalar esta postura no tiene

relación con homeostasis de metales (Cochrane y cols., 2004; Ye y cols., 2006; Lei y

cols., 2007). En respuesta a Mn+2 estacionario, el TDF CsMn01 no muestra ninguna

respuesta evidente (ver tabla 2). Creemos que la represión en la expresión de

transcriptos de la PAL y la concomitante traducción en respuesta al pulso de Mn+2 es la

razón para el aumento de L-fenilalanina observada en el trabajo de Lei y colaboradores

(2007). A pesar de que esta enzima ha sido históricamente relacionada con el

metabolismo secundario de plantas, también ha sido descrita en hongos, donde se ha

propuesto que tendría un propósito simbiótico (Nehls y cols., 1999). Sin embargo,

nuestro estudio en respuesta a Mn+2 estacionario no avala esta hipótesis, y al mismo

tiempo creemos que el aumento en biodisponibilidad puede o no estar relacionada con

la síntesis de péptidos quelantes de metales.

CsMn26 fue identificado como un homólogo al factor de elongación 3 de

Cryptococcus neoformans (EF3 por sus siglas en inglés) (ver tabla 1). La expresión de

este factor específico de hongos es reprimida por el pulso de Mn+2. Este factor ha sido

principalmente caracterizado en S. cerevisiae (yeast elongation factor 3 (YEF3)), donde

se ha descrito como una proteína indispensable para el crecimiento y la traducción in

vivo. Está clasificado como miembro de la familia de “ATPasas de tráfico”

(Chakraburtty 2001). EF3 ha sido relacionado con la homeostasis de cationes

bivalentes, al encontrarse reprimido por el zinc; su expresión disminuyó 50 veces

cuando levaduras fueron cultivadas a 100 μM Zn+2, al compararlas con un cultivo 0,1

μM Zn+2 (Yuan 2000). El 1997, Lussier y colaboradores condujeron una identificación a

gran escala de genes involucrados en la biosíntesis y arquitectura de la superficie

celular en S. cerevisiae. YEF3 fue identificado como un gen que no había sido

36

previamente relacionado con la superficie celular; entre los resultados encontramos

que una cepa mutante para EF3 es hipersensible a la zimolasa y que posee altos

niveles de N-acetilglucosamina. La hipersensividad a la zimolasa puede ser explicada,

de acuerdo a los autores, por (1) polisacáridos incompletamente N- y O-enlazados; (2)

defectos en la incorporación de proteínas de pared celular; y (3) niveles disminuidos de

polímeros ramificados de β−1,3-glucano (Lussier y cols., 1997). Es muy posible que

las células en medios de cultivos donde se ha agotado el Mn+2, las cepas mutantes

para pmr1 de levadura y las cepas mutantes para yef3 tengan todas algo en común, es

decirestando relacionadas en que comparten un defecto en la N- y O- glicosilación de

proteínas, lo que sugiere fuertemente un nuevo rol para EF3 en la homeostasis de

Mn+2 (Dürr y cols., 1998). Adicionalmente, se descubrió por medio de espectroscopía

de masa de captura por afinidad que YEF3 forma un complejo proteico con Hrk1, una

proteína quinasa involucrada en la activación de la H+-ATPasa de membrana

plasmática Pma1p, la que juega un rol en la homeostasis de Mn+2 (Goossens y cols.,

2000; Gavin y cols., 2006). A pesar de que la represión transcripcional en respuesta al

pulso de Mn+2 puede ser evidencia de una baja en la actividad traduccional celular, lo

que no concuerda con nuestra hipótesis, aquí presentamos evidencia enlazando EF3 a

procesos celulares dependientes de Mn+2. Esto nos lleva a postular que un nivel basal

de EF3 es necesario para una traducción eficiente, pero que bajo condiciones donde el

Mn+2 o el Zn+2 son limitantes, esta ATPasa ayudaría a sobrellevar defectos en las

modificaciones post-traduccionales de proteínas de pared celular. Este fragmento

también se encuentra reprimido en el estudio de respuesta a Mn+2 estacionario (ver

tabla 2).

37

Otro TDF que fue reprimido en respuesta a pulso y Mn+2 estacionario es

CsMn27. Este fragmento fue identificado como un homólogo a una proteína hipotética

de P. chrysosporium, una putativa cistationina beta-liasa (ver tabla 1). Esta enzima

participa en el metabolismo de aminoácidos sulfurados, más específicamente en la

biosíntesis de L-metionina y en la interconversión de homocisteína a L-cisteína

(Thomas y Surdin-Kerjan 1997). No encontramos información que ligara al Mn+2 con

esta proteína y por lo tanto no sabemos en que mecanismo podría estar participando.

3.4 Análisis de elementos reguladores en secuencias río arriba del sitio de inicio

de la traducción.

Los resultados obtenidos a partir del estudio de expresión comparativa en

respuesta al pulso de Mn+2 por PCR en tiempo real nos sugirieron que en los

promotores de estos genes podrían haber elementos de respuesta a Mn+2. Dado que el

genoma de C. subvermispora no está secuenciado, no contamos con secuencias

promotoras para nuestros fragmentos y la única secuencia regulatoria relacionada con

el Mn+2 que obtuvimos de este organismo fueron 673 pb río arriba del sitio de inicio de

la traducción del gen que codifica para la Mn+2 peroxidasa 2B (mnp-2B). Es por esto

que extrajimos aproximadamente 2 kb río arriba del sitio de inicio de la traducción

desde los modelos génicos de P. chrysosporium que eran homólogos a nuestros TDFs

o de genes relacionados con la homeostasis de Mn+2 como los transportadores Smf1p,

Smf2p y Pmr1p de S. cerevisiae. Una vez que contábamos con estas regiones

putativamente reguladoras, utilizamos el software MatInspector para encontrar

sitios putativos de unión a factores de transcripción. Nuestro análisis arrojó

interesantes resultados, los cuales se encuentran resumidos en la tabla 4.

38

39

Entre los sitios de unión a factores de transcripción encontrados repetitivamente en las

secuencias analizadas, dos de ellos llamaron nuestra atención: el primero de unión a

ACE1, un factor de transcripción previamente estudiado en nuestro laboratorio por su

capacidad de inducir la transcripción de genes en respuesta a cobre (Manubens y

cols., trabajo en publicación) y el segundo, de unión a HAP1, un factor que induce la

transcripción de genes en respuesta a su activación por hem en concentraciones en el

rango µM (Mense y Zhang 2006).

CsMn09 es el gen que más se induce por el pulso de Mn+2. Su inducción es de

tipo exponencial en el tiempo, llegando a aumentar la cantidad de transcriptos en un

327% a los 90 minutos post-estímulo. Sorprendentemente, el estudio de la región

reguladora putativa mostró la presencia de 4 sitios putativos de unión a ACE1 y 3 de

unión a HAP1. CsMn42 llega a un nivel muy similar de expresión relativa a los 90

minutos, sin embargo, no muestra esta cinética de inducción exponencial, sino que

mas bien tardía. La región reguladora putativa de su homólogo en levaduras posee 2

sitios putativos de unión a ACE1 y 2 para HAP1. CsMn36 muestra una cinética de

inducción tardía similar a la de CsMn42 pero llegando a un 206% de inducción a los 90

minutos. Se encontró un sitio de unión para cada factor en su región río arriba. CsMn41

responde de forma no convencional entre los fragmentos inducidos por el pulso, pues

muestra una represión inicial de un 17% y luego una inducción que llega a un 88%

relativo a la condición control a 90 minutos del pulso. A diferencia de los otro genes

analizados, esta región reguladora no posee sitios putativos de unión a ACE1, pero

posee 4 sitios putativos de unión a HAP1. Las regiones reguladoras de los genes mnp-

2B de C. subvermispora y el putativo pmr1 de P. chrysosporium poseen 1 sitio putativo

de unión a ACE1 y 2 para HAP1, sin embargo, dado que la región analizada en el caso

40

del gen mnp-2B es significativamente menor a la de pmr1 es probable que existan más

sitios de unión para ambos factores en su región reguladora que den cuenta de la

rápida inducción de un 256% en la expresión de su transcripto, 60 minutos después de

aplicado el pulso, la que se mantiene a los 90 minutos en 211%.

El hallazgo de la presencia de sitios de unión a ACE1 no sería tan sorprendente

para nosotros sino fuera porque no encontramos ninguno de estos sitios en las

regiones reguladoras putativas de los homólogos para los transportadores Smf, los

cuales se sabe que no responden transcripcionalmente al estímulo por Mn+2 (Liu y

Culotta 1999). Es por esto que proponemos un nuevo rol para el factor de transcripción

ACE1 en C. subvermispora, el cual podría ser activado por Mn+2 para inducir la

expresión de genes relacionados con su homeostasis.

Respecto a la función de los elementos de unión a HAP1 putativos, este factor

se activa mediante la unión del grupo hem, la hierro protoporfirina IX. Creemos que

también podría ser activado por la Mn+2 protoporfirina IX en concentraciones altas de

Mn+2. De esta forma se explicaría su potencial participación en la activación tardía de la

transcripción de los genes que posean estos sitios en sus secuencias reguladoras río

arriba. La activación de HAP1 por hem ocurre cuando esta biomolécula se encuentra

presente en concentraciones del orden µM, de esta forma la concentración de Mn+2 de

160 µM aplicada en forma de pulso es introducida podría dar cuenta de este fenómeno

activador (Mense y Zhang 2006). La transcripción del gen para la Mn+2 superóxido

dismutasa (SOD2) es activada por heme a través de HAP1 en levaduras. Nuestro

estudio bioinformático mostró 6 sitios putativos de unión a HAP1 y un sitio putativo de

unión a ACE1. Así se podría postular un sistema hipotético donde ACE1 y HAP1

participarían sinérgicamente en la activación transcripcional por Mn+2.

41

3.5 Comentarios finales

La inducción dependiente de Mn+2 de CsMn04 (homólogo de SSD1) constituye

un hallazgo importante. El conocimiento actual de la homeostasis de Mn+2 discutido en

este trabajo, junto con el sorprendente aumento en un 581% de la expresión relativa de

este TDF bajo la condición de cultivo de concentración estacionaria de 160 µM Mn2+,

indican que SSD1 participa en un proceso de destoxificación constante de este metal.

Noventa minutos después del pulso de 160 µM Mn2+, la expresión de CsMn04 sólo

aumento un 33%, sin embargo, sabemos que la expresión relativa en condiciones de

homeostasis a 160 µM Mn2+ es de 581%. Se ha descrito que esta proteína tiene

capacidad de unión a ARN, lo que no ha sido relacionado con su participación en la

morfología celular o la tolerancia a altas concentraciones de Ca+2 (Uesono y cols.,

1997). Ibeas y colaboradores reportaron que la deleción de los alelos de SSD1

impidieron la destinación de factores de resistencia a osmotina sin alterar sus niveles

de mRNA (Ibeas y cols., 2001). Este rol de regulador post-transcripcional, junto con

nuestro hallazgo de inducción relativa en la expresión de su transcripto, sugiere que

SSD1 perfectamente podría ser un regulador homeostático de Mn+2 (ver figura 5). En

este escenario en el cual este factor regularía la expresión de factores homeostáticos

relacionados con el remodelamiento de la pared celular en un proceso post-

transcripcional. De forma opuesta, encontramos que CsMn26 (homólogo de EF3) se

encuentra inducido en condiciones de deficiencia de Mn+2. A pesar de que esta

proteína ha sido caracterizada como un factor esencial de elongación de la traducción,

existe evidencia que la relaciona con la homeostasis de metales. EF3 está involucrado

en la biogénesis y arquitectura de la pared celular, y además forma un complejo junto a

una quinasa activadora de un transportador de membrana plasmática (Hrk1) que

42

43

participa en la homeostasis de Mn+2. Estos dos potenciales reguladores, actuarían de

forma recíproca para contrarrestar los efectos de un aumento (SSD1) o baja (EF3) en

la concentraciones extracelulares de Mn+2.

Encontramos durante nuestra investigación que el Mn+2 converge y altera

procesos previamente no relacionados a este metal, pero sí a otros cationes metálicos

bivalentes, tales como la biosíntesis de “núcleos Fe-S”, regulación transcripcional

mediada por HAP1 y ACE1, tolerancia a altas concentraciones de Ca2+ e

hidrólisis/oxidorreducción Zn-dependiente. Las interacciones catión-proteína permiten

cierta flexibilidad y creemos que ésta juega un rol importante en la homeostasis de

metales. El estudio bioinformático de las secuencias reguladoras putativas en el punto

3.3 nos propone que esta flexibilidad permite la regulación de la homeostasis de

diferentes metales a través de vías convergentes y que no existe un sistema de

regulación homeostática exclusivo para Mn+2.

Entre los TDFs estudiados, CsMn04, CsMn09, CsMn36 y CsMn42 mostraron el

mayor grado de inducción en su expresión relativa durante el tiempo del pulso. La

caracterización de los