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Clase I: Introducción I
Prof: Guillermo R. Castro Lab de Nanobiomateriales – CINDEFI UNLP – CONICET, La Plata
Materia de Articulación CEBI - E4b Ingeniería Metabólica
La industria química en la actualidad • Produce gran variedad de compuestos
para la manufactura de productos
• Emplea muchos científicos e ingenieros
• Está basada en compuestos químicos
derivados del PETROLEO:
- fuente NO renovable - Producido en areas politicamente inestables del mundo - Produce muchos desechos tóxicos
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Estrategias
Posible solución: Usar bacterias como fábricas de compuestos
químicos
Materias Primas
Productos Con
valor agregado
Propiedades distintivas: • Catalizadores de multiples etapas autoreplicativos • Son ambientalmente benignos • Usan materias primas renovables
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Selección de la “célula”
• Capacidades metabólicas naturales • Herramientas moleculares para el uso
del organismo • Información genómica y metabólica
disponible. Page 5 Guillermo R. Castro
Elección de una “célula huesped”
Doubling Time Cost Glycosylation
E. coli 30 min Low None
S. cerevisiae 1-2 hours Low Yes, but often incompatible with human
Mammalian (CHO/BHK)
~ day Very High Yes, and more similar with human
Compatibilidad
Costo
Velocidad
Seguridad
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Ventajas de las bacterias vs. otras células
• Son relativamente pequeñas y “simples”
• Se reproducen rapidamente • Poseen una diversidad catalíticas y metabólica elevada
www.milebymile.com/main/United_States/Wyoming/
- Pueden vivir en ambientes extremos
- Pueden usar nutrientes no disponibles para otros organismos
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Ingenería Metabólica
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Puede considerarse como un proceso de
2 etapas:
Modificación de vías metabólicas
Establecimiento del estado fisiológico
del organismo transformado
Esquema de Ing. Met
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Metabolic Networks
MODIFICACION Tecnología ADN recombinante
ANALISIS Cuantificación del
flujo Analisis del control
de flujo
Celulas modificadas
Análisis computacional
• Omics técnicas… • Simulación de vías metabólicas complejas
(“circuitos genéticos”) – Análisis de flujos Metabólicos:
Balances de flujos, Restricciones de los flujos, etc).
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Limitaciones de “células nativas” Bacterias han evolucionado in ambientes
naturales competitivos, no para la
produccion de compuestos quimicos
deseados por los seres humanos!
El metabolismo ha sido optimizado para bajas concentraciones de nutrientes
Poseen sistemas de defensa
No hacen naturalmente lo que nosotros queremos!
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Rediseño de la célula huesped
Objetivos
optimizar parámetros industrialmente relevantes.
• Redireccionar el metabolismo a productos específicos
• Remover productos indeseables
- Almacenamiento de productos
- Excreción de productos
- Sistemas de defensa
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Ingeniería Metabólica
DNA
Gen 1 Gen 2 Gen 3
Enzima 1 Enzima 2 Enzima 3 A B C D
A Page 14 Guillermo R. Castro
DNA Gen 1 Gen 2
Enzima 1 Enzima 2 A B C D
A
“volando” a un gen
DNA
X
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Enzima 3 X
Gen 3 X
DNA Gen 1 Gen 2 Gen 3
Enzima 1 Enzima 2 Enzima 3 A B C D
A
DNA
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Agregando un nuevo gen
Agregando un nuevo gen
DNA Gen 1 Gen 2 Gen 3
Enzima 1 Enzima 2 Enzima 3 A B C D
A
Gen 4 Enzim
a 4
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Como se pueden realizar los cambios genéticos?
Estrategia más común:
1. Colocar el gen de interés en un vector (transportador) estable. Ej.: un AND pequeño se denomina plásmido.
2. Introducir el plásmido dentro de la célula huesped.
Gen 4
plásmido
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plásmido
Gen 4
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Estrategia más común:
1. Colocar el gen de interés en un vector (transportador) estable. Ej.: un AND pequeño se denomina plásmido.
2. Introducir el plásmido dentro de la célula huesped.
Como se pueden realizar los cambios genéticos?
Gene 4
plasmido
Gen 4
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Como se pueden realizar los cambios genéticos?
Estrategia más común:
1. Colocar el gen de interés en un vector (transportador) estable. Ej.: un ADN pequeño denominado plásmido.
2. Introducir el plásmido dentro de la célula huesped.
Gen 4
plasmido
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Estrategia más común:
1. Colocar el gen de interés en un vector (transportador) estable. Ej.: un AND pequeño se denomina plásmido.
2. Introducir el plásmido dentro de la célula huesped.
Como se pueden realizar los cambios genéticos?
Como los cambios genéticos se realizan?
DNA Gen 1 Gen 2 Gen 3
Gen 4
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DNA Gen 1 Gen 2 Gen 3
Gen 4 X X
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Como los cambios genéticos se realizan?
DNA Gen 1 Gen 2 Gene 3 Gen 4
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Como los cambios genéticos se realizan?
Ing Met. inconvenientes: maximizar la prod. de etanol
PFK Etanol glucosa
PFK fue pensada como la enzima que limita la velocidad de produccion de etanol => aumentaron su expresión por Ing. Genetica.
Problema:
La velocidad de producción de etanol no aumenta!
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CH2=H4F
Serine Cycle
CH2=H4MPT
H4MPT
CH3OH
HCHO H4F
CO2 PHA
Para maximizar la producción
de PHA in M. extorquens,
se debería eliminar
la via izquierda. X
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Ing Met. inconvenientes: maximizar la prod. de PHA
(H4MPT: methenyl tetrahydro methanopterin cyclohydrolase)
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Problemas:
• HCHO es MUY toxico
• Células no pueden generar suficiente
energía para crecimiento
Gran cantidad de moleculas Vias metabolicas muy interconectadas
Modelos matemáticos pueden ayduar a predecir el efecto de los cambios genéticos.
opbs.okstate.edu/~leach/Bioch5853/
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El metabolismo celular es MUY complicado!
Análisis del balance de flujos
A A B
C
D
E
En estado estacionario, TODAS las concentraciones son constantes. Para cada compuesto:
velocidad de produccIón = velocidad de consumo. Para obtener una solución (velocidad de flujo en cada etapa) se debe definir un objetivo (e.g. produccion de E) para ser maximizado.
10 10
10
10
0
0
10
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Ej.: Edwards & Palsson (2000)
Ref: PNAS 97: 5528-33, 2000. Se empleó un análisis de balance de flujos para predecir el efecto de la delecion de genes en E. coli. El grafico muestra las predicciones de como los flujos han sido modificados en funcion de las deleciones.
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Edwards & Palsson (2000)
Fraccion de la velocidad normal de crecimiento
Delecion de genes que no afectan el crecimiento.
Delecion de genes que reducen el crecimiento.
Delecion de genes que detiene el
crecimiento.
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Edwards & Palsson (2000)
En 68 of 79 casos (86%), las predicciones
obtenidas por los modelos coinciden con los
datos experimentales.
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Aspectos éticos
• Esta bien cambiar los genes de organismos vivos? • Cuales son los posibles efectos en las celulas?
• Cuales son los posibles efectos sobre la salud humana?
• Cuales son los posibles efectos en el ambiente?
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Productos potenciales
• Combustibles
• Productos Natural (sintesis complejas)
• Productos ingenierados
- hidrogen (H2) - metano (CH4) - metanol (CH3OH) - etanol (CH3CH2OH)
- sMateriales iniciales para la S! de polimeros (gomas, plasticos, telas) - Productos quirales - Quimicos generales(C4 acids)
- vitaminas - Agentes terapeuticos - pigmentos - amino acidos - viscosificantes - enzimas de uso industrial - PHAs (plasticos biodegradable
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Biofarmacos
• insulin for diabetics • factor VIII for males suffering from hemophilia A • factor IX for hemophilia B • human growth hormone (GH) • erythropoietin (EPO) for treating anemia • three types of interferons • several interleukins • granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)
for stimulating the bone marrow after a bone marrow transplant • tissue plasminogen activator (TPA) for dissolving blood clots • adenosine deaminase (ADA) for treating some forms of severe
combined immunodeficiency (SCID) • angiostatin and endostatin for trials as anti-cancer drugs • parathyroid hormone • leptin • hepatitis B surface antigen (HBsAg) to vaccinate against the
hepatitis B virus
Mas info: Ing. Met.
depts.washington.edu/mllab
web.mit.edu/bamel
www.genomatica.com
www.metabolix.com
Lidstrom lab (UW)
Stephanopoulos lab (MIT)
Company founded by Palsson (UCSD)
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Fin 1a
Relocation mechanism
Assembly line
Central computer
Security fence
Outer and internal walls
![7-CEBI curso 2012 - clase 7 patentes [Modo de compatibilidad]](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/62dfbcd1deca602768761df5/7-cebi-curso-2012-clase-7-patentes-modo-de-compatibilidad.jpg)
![CEBI E1b-6-Cromatografías [Modo de compatibilidad]](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/62c568591658a311a900ef9b/cebi-e1b-6-cromatografas-modo-de-compatibilidad.jpg)
