Materiales y Métodos para anato

8/19/2019 Materiales y Métodos para anato

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Materiales y métodos:

Muestras de saliva humana:

Los protocolos de estudio recibieron la aprobación y el consentimientoinformado del Human Research Ethics Committes ( HREC) of Mater Health

Serices y !he "niersity of #ueensland ("#)$ !ambién se dio el consentimiento del estudio de la re%ulación de micro&oraoral por la interacción de los metabolitos saliales 'unto a la leche materna enel caso de adultos también se recibió el consentimiento informado de losdonadores$

El permiso para la recolección de salia de infantes fue recibido por la mismaentidad y el consentimiento informado para la recolección de salia de estosfue recibido por las madres de ellos$

La recolección de salia en ambos casos (adultos e infantes) es consideradocon el m*nimo+ ries%o de herir incluso se halló ,ue nin%uno de los infantesmostro al%una reacción de an%ustia durante la recolección en la cual se usóhisopos de al%odón durante -. se%undos$

/ara calcular el l*mite de detección de los metabolitos de nucleótidos salialesse usó H/LC 0 espectrometr*a de masas (LC 0MS 1 MS)

Como parte de los re,uerimientos éticos el poder estad*stico aceptablere,uiere de 2- participantes en el caso de estudios saliales este alor fueaumentado3 en el caso de neonatos en un alor de 4. y de adultos en 55$ 6elos 4. neonatos los padres de 7. aceptaron ,ue sus infantes participaran en unlar%o estudio de 4 semanas( n87.) seis meses ( n89) y 97 meses (n 8 9;)

después de la recolección inicial$

Otras muestras de saliva en mamíferos:

Se seleccionó mam*feros domesticados y de %ran'a$ La selección se basóesencialmente en unaló%ica relatia a la dieta (la cual es re&e'ada por la microbiota oral) y el tractodi%estio$

<ato: carn*oro obli%atoria 3 perro : omn*oro 3 caballo aca oe'a cabra ycamello : herb*oros 3 acas oe'as y cabras son rumiantes 3 caballos tienensaculación pre 0 rumiante 3 camellos son pseudo0rumiantes$

En la recolección de la salia(al babear) se dio usando hisopos de al%odón porlo ,ue no causo nin%=n da>o malestar o alarma en ellos$ !ambién hay ,uetener en cuenta ,ue la recolección de salia en animales no es su'eto deaplicación ética se%=n !he ?nimal Care and /rotection ?ct 7..9 pertenecientea la a%ricultura$Los animales domésticos se muestrean de forma no intrusia por uneterinario re%istrado



La salia de perros y %atos fue recolectada antes de ,ue sean alimentados sepreparó sus alimentos y se colocó en ta@ones para estimular la saliación lacual fue reco%ida al babear$

En el caso de mam*feros herb*oros fue problemAtico al inicio debido a lacontaminación de la e%etación$

En consecuencia se reco%ió la salia de las acas mientras esperaban para larutina de orde>o tiempo durante el cual no re%ur%itan el bolo alimenticio$Salia de oe'as caballos y camellos se recolectaron utili@ando hisoposorales de al%odón suae durante sus eBAmenes dentales re%ulares

En todos los casos se re,uiere menos de 7. se%undos para el muestreo y ennin%=n caso era un animal restrin%ido =nicamente con el propósito demuestreo$ La toma de salia se lleó a cabo en un entorno normal del d*a a d*adel animal$La salia se reco%ió de acas ( 2 de las muestras usando hisopos deal%odón - reco%idas de lababa oral) 2 oe'as ( hisopos de al%odón ) 5 perros ( hisopos de al%odón) 2%atos ( hisopos de al%odón) 2 caballos ( muestras recopilada usando pipetasde plAstico de poliestireno ) ; cabras ( hisopos de al%odón) y un solo camello(bastoncillo de al%odón)$Los estudios en animales son destinados eBclusiamente para comparar lospatrones de metabolitos saliales de sus nucleótidos con los del ser humano$

Leche materna

El permiso ético para la donación de leche materna fue cubierto por MHS HRECcon el consentimiento informado por escrito ,ue suministran las madres

donantes $ Las muestras de leche materna fueron recolectados de 7; madres de 9 a 2 d*as después del parto $ Las muestras de leche se colocaron en hielosin demora y lue%o transferidos al laboratorio en el ,ue se subdiidieron enporciones para el ensayo inmediato de H7D7 endó%eno o para elalmacenamiento a 0. C para su posterior anAlisis tales como ensayos deFD

Ensayo de la peroxidasa de hidrogeno

!odo los ensayos de H7D7 y ensayos parecidos se incubaron en placas demicrotitulación de fondo plano (Gecton 6icinson ?ustralia) a -5 C cona%itación en un &uor*metro IL"Dstar Dme%a a temperatura controlada (GM<

Labtech EE$""$) hasta ,ue la reacción se detuo$

El ensayo de produccion de H7D7 por una me@cla de salia neonatal con lechematerna para simular la succión se lo%ró mediante la me@cla de -- l de lechematerna diluida -- l de salia neonatal y -; l reactio de peroBidasa$ Lasconcentraciones de hipoBantina y Bantina en la muestra de salia neonatalfueron de 5. mM y -. mM respectiamente$ El cAlculo de la %eneración de H7D7 se basa en el supuesto de ,ue la saliade la leche materna y la neonatal se me@clan en la boca del recién nacido en



un aproBimado 9 : 9 ,ue es la relación durante el amamantamiento y ,ue 9mol de Bantina produce 9 mol de H7D7 mientras ,ue 9 mol de hipoBantina%enera 7 moles H7D7$

Actividades de la Xantina oxidasa y la enzima peroxidasa

/ara el ensayo de la actiidad de FD de leche la leche materna (almacenada a0. C) se diluyóen proporción 9:-. con el tampón !ris inmediatamente antes del ensayo$Jnmediatamente 2. l de leche diluida se me@cló con 2. l de KReactio deperoBidasaK$ Los parAmetros cinéticos se estimaron para FD en muestras deleche materna utili@ando 4 concentraciones de hipoBantina de . 97$2 722. 9.. 7.. -.. ;.. M$La producción de H7D7 se controló durante 4. min en el &uor*metro durante laoBidación de hipoBantina a Acido =rico$ /ara conrmar ,ue el H7D7 fueraproducido por la actiidad de FD solamente se a>adió el inhibidor de

oBipurinol0FD espec*co (Si%ma0?ldrich /ty Ltd ?ustralia) a la me@cla deensayo anterior con a%rupado de la leche materna en un ran%o deconcentraciones nales de hasta 72 mM$El l*mite inferior para la detección de la actiidad en las condiciones de ensayofue de .9 1 L una unidad (") se dene como la producción de 9 mol deH7D7 por min$ La actiidad de FD también se ealuó en el secado de la lechepara lactantes fórmula K?ptamil <old /lus K la leche materna pasteuri@ada yleche boina pasteuri@ada$La actiidad de la peroBidasa en la leche se atribuye %eneralmente a L/Dmientras ,ue la actiidad de la KperoBidasa saliarK (S/D) se considera ,ue esuna me@cla de mieloperoBidasa y L/D $ /ara el ensayo de la actiidad de laperoBidasa en la leche materna o en la salia 2. l de leche materna o salia

se diluyó en 9:92 de calcio 1 ma%nesio libre de fosfato0 tamponada0soluciónsalina (/GS) se me@claron con 2. micro l 9.. microM de ?mpli&u Red y 7..microM H7D7 en /GS$ Lareacción se controló en el &uor*metro como para la actiidad de FD$

El ensayo de tiocianato salial

El ensayo de tiocianato se basó en un método espectrofotométricodesarrollado para la salia humana utili@ando el método de nitrato férrico adaptada para placas de microtitulación $

Inhibición del crecimiento bacteriano por el peróxido de hidrógeno

La Escherichia coli (?!CC 727) Staphylococcus aureus (?!CC 779-) especiesde Salmonella (?!CC 9-99) y Lactobacillus plantarum ("#M 75) se obtuierona partir del cultio microbiano de la colección de la "niersidad de !ecnolo%*ade #ueensland $ /ara probar la inhibición directa de H7D7 se diluyeron las



poblaciones bacterianas en Kcaldo nutritio de DBoid K(DBoid /ty Ltd ?ustralia)a una concentración nal de 7.. unidades formadoras de colonias (CI") 1 ml acontinuación se a>adieron al*cuotas de 2. microL a los pocillos de placas demicrotitulación con diluciones en serie de H7D7 en caldo nutritio hastaconcentraciones nales de ;.. 7.. 9.. 2. 72 97 4 - 92 .52 . M portriplicado$ "n control ne%atio conten*a H7D7 y sólo caldo nutriente$ Lasplacas de microtitulación selladas se incubaron a -5 C durante 7; h o ; hcon a%itación$ Se determinó el crecimiento de bacterias usando un lector deplaca de microtitulación (FMar Gio0Rad Laboratories /ty$ Ltd$ ?ustralia) comoabsorbancia a 4.. nm$ El caldo nutritio DBoid en com=n con la mayor*a delos medios de comunicación estAndar contiene concentraciones si%nicatiasde purinas y pirimidinas: encontramos hipoBantina (979 mM) Bantina (-4 mM)adenosina (9 mM) inosina (9; mM) %uanosina (42 M) y uridina (5 mM) mAsotros nieles de tra@as de metabolitos de nucleótidos$

Preparación de saliva simulada Neonatal Na ,ue estaba disponible sólo en pe,ue>os ol=menes la salia neonatal

Ksimulado de salia neonatalK se preparó poniendo en com=n las muestrassaliales de 2. adultos reco%idos por babeo pasio$ Este a 24 C en un ba>ode a%ua durante -2 minutos con me@cla para eliminar la actiidad deanticuerpos presentes en la salia de adultos pero ,ue es insi%nicante en lasalia neonatal $ ? continuación la salia se esterili@ó por ac*o de ltración atraés de un ltro de .;2 micras (<race 6iscoery Science ?ustralia) paraeliminar las bacterias presentes en la salia de adultos as* como la materia enpart*culas pero no las mucinas y otras prote*nas$ Esta resultante de Ksalianeonatal simuladoK fue suplementado con hipoBantina y Bantina y 1o inosinaadenosina %uanosina uridina y uracilo (75 7. 99 97 5 2- 97 mMrespectiamente)con 1 sin oBipurinol 9.. M para producir cuatro controlesdiferentes$ Estos nucleósidos 1 concentraciones de base correspondieron a los

alores de la mediana de los metabolitos en la salia neonatal$ Los 75 microMde hipoBantina mAs 7. microM de Bantina pueden producir teóricamente 5;microM H7D7 (suponiendo ,ue elFD conierte cada mol de hipoBantina y Bantina a H7D7 7 y 9 molrespectiamente)$

Inhibición o estimulación del crecimiento bacteriano por lechematerna Me!cla de salivasLas especies bacterianas en stoc anteriormente se diluyeron en /GS estéril yno en caldo nutritio$ La leche materna fue diluida en relación de 9: 4 a untampón de !ris estéril$ Cada pocillo de microtitulación conten*a 2. l de cuatro

diferentes formulaciones simuladas de salia neonatal 72 micro l del diluido deleche materna 72 micro l de bacterias para dar una concentración nalde 7.. bacterias CI" 1 ml en un olumen total de 9.. l (por triplicado)$ Elselladoplacas de 4 pocillos se incubaron 7; h a -5 $ Las al*cuotas fueron entoncesinoculadas enplacas de a%ar se incubaron y CI" $ 6iluciones seriadas de la Bantina ehipoBantina también se prepararon usando este método de ensayo $ Lasconcentraciones nales de ambos Bantina y



hipoBantina eran . 4 72 y 2. micras lo ,ue teóricamente puede producir . 9 52 y 92. microM de H7D7

?nalisis estadisticos

Los datos de metabolitos de nucleótidos ,ue no se distribuyen normalmentepor lo ,ue los alores medios se compararon entre los dos %rupos diferentesutili@ando la prueba y entre mAs de dos %rupos utili@ando el test de Orusal 0Pallis de Mann0Phitney$ Se estimaron los parAmetros del modelo cinético deMichaelis0 Menten QmaB y Om para FD leche materna mediante anAlisis dere%resión no lineal$ !odos los datos para FD y estudios de inhibidoresbacterianos se reunieron la suposición de normalidad3 /or lo tanto los aloresmedios se compararon entre los dos diferentes %rupos utili@ando la prueba t yentre mAs de dos %rupos usando ?DQ? de una *a$ "n alor de p de .$.2 seutili@ó como punto de corte para la si%nicación estad*stica$

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