Comparación entre sistemas extractantes en extracciones de lípidos de semillas

Fundamento:

Como ensayo de optimización de la extracción de los lípidos, se determinará la variación en lacomposición de ácidos grasos de los extractos de aceite de semillas, obtenidos con diferentesmezclas extractantes.

Los sistemas extractantes empleados en estas pruebas serán:

A. Cloroformo/metanol/agua (1:2:0,8, v/v/v)B. Hexano/etanol (1:2,5, v/v)C. n-Butanol D. Etanol (96%)

Con los sistemas A y B se utilizará el método de Kates (1988), que consiste en unamodificación del de Bligh y Dyer (1959). Mediante este procedimiento, los lípidos son extraídosprimeramente en un sistema monofásico a partir del cual se forma seguidamente un sistema bifásicopara la separación y purificación final. Este sistema bifásico está compuesto por dos fases: una ricaen lípidos (extracto) y otra fase hidroalcohólica pobre en lípidos (refinado). Para los sistemas Cy Dno es preciso este último paso de purificación final en sistema bifásico.

Los ácidos grasos se determinan como ésteres metílicos tras una reacción de metilación, paraa continuación ser inyectados en el C.G., y mediante comparación de sus tiempos de retención conotros obtenidos de patrones puros, cuantificar e identificar el contenido.

La reacción de metilación se produce con cloruro de acetilo y metanol. Se trata de unacatálisis ácida:

CH3-COCl + CH3OH (exceso) ÿ CH3-COO-CH3 + HClcloruro de acetilo

El ácido clorhídrico queda disuelto en el exceso de metanol. En medio ácido fuerte, losácidos grasos se esterifican para producir los ésteres metílicos:

H+

R-COOH + CH3-COO-CH3 ÿ R-COO-CH3 + CH3-COOH

Material:

- Pipetas de 5 y 1 mL- Pipetas Pasteur- Soluciones extractantes- Tubos de rosca- Cloruro de acetilo- Metanol- Patrón interno- Cromatógrago de gases

Procedimiento:

En estas pruebas, se usarán 1 mL de cada uno de los sistemas extractantes por cada 50 mg debiomasa liofilizada y homogeneizada y se realizará la extracción a 60/C durante 10 min bajoconstante agitación y en atmósfera de nitrógeno. La mezcla obtenida se filtrará mediante filtros de

fibra de vidrio (100-160 mm). El residuo se lavará con el sistema extractante ensayado, añadiendoseguidamente este lavado al filtrado anterior.

El sistema A (cloroformo/metanol/agua, 1:2:0,8), monofásico, se transforma en bifásicoañadiendo 1,9 ml de cloroformo y 1,9 mL de agua, resultando el sistema bifásicocloroformo/metanol/agua 1:1:0,9, (v/v/v), compuesto por una capa superior hidroalcohólica(refinado) y una capa inferior clorofórmica (extracto) donde quedan disueltos la mayoría de loslípidos.

El sistema B aparece representados en el diagrama de fases hexano/etanol/agua (Figura)basado en los datos de equilibrio para este sistema (Bonner, 1910). El sistema B se transformará enel bifásico B' añadiendo 0,5 mL de hexano y 0,5 mL de agua, de manera que puedan separarse unrefinado o capa inferior hidroetanólica y una capa superior hexánica (extracto) con la mayoría delípidos.

Las disoluciones lipídicas finales son evaporadas en corriente de nitrógeno y metiladas parasu análisis mediante cromatografía gaseosa.

Metilación de los ácidos grasos

En un tubo de ensayo de rosca, ubicar aproximadamente 1 mg de aceite, y 5 :L patrón internoC19:0 (25 mg/mL tolueno) 1 mL mezcla metilante 1:20 (CH3COCl: CH3OH). Observar todaprecaución al formar la mezcla metilante, se trata de una reacción muy exotérmica.

Realizar la metilación a 100 ºC durante 1h, con agitación cada 10 minutos. A continuación,enfriar e interrumpir el proceso.

Cuando los tubos estén fríos, añadir 1 mL de H2O. Realizar la extracción: 3x1 mL dehexano: extracto conjunto (ésteres metílicos-hexano), reservar el extracto. A continuación, llevar asequedad, con N2, a continuación, resuspender en 0,5 mL de hexano, y ubicar esta solución en unvial, con pipeta Pasteur..

La muestra del vial que se inyecta en el cromatógrafo es 5 :l; por lo que debe de haber 1,25:g de patrón.

Condiciones de operación en el cromatógrafo de gases:

El método para analizar los ácidos grasos requiere unas condiciones especiales. El programa debede adquirir los siguientes datos:

Columna capilar usada: Supelco, alta polaridad (SP2330).Flujo del gas portador (N2): 0,75 L, min-1.T inyector: 220 ºC T inicial del horno: 150 ºCT detector: 260 ºC T final del horno: 206 ºC

Programa de temperaturas en el horno:

T inicio:205 ºCrampa: 6 ºC/minT final: 240 ºCtiempo final a Tf = 205 ºC: 10 min.

Esquema simplificado de un cromatógrafo de gases

140

150

160

170

180

190

200

210

1 5 9 13 17

tiempo (min.)

T ºC

Programa de temperaturas en el horno del cromatógrafo

C á lculos:

R e solver el cromatograma porc o mparación de los tiempos deret ención de cada pico con otrosest ándar de tiempo de retenciónc o nocido.

área total de picos: Aárea del patrón: Bárea real: a-b = C

lípidos saponificables (p/p): 0,00125 x (C u.a./B u.a.) x (0,5 mL hexano/0,005 mL hexano)

% de un ácido graso en particular de área d: d x A/C

Diagrama de Fases para las mezclas hexano-Etanol-Agua

0 5 10 15 20

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1.0e4

1.1e4

1.2e4

Tiempo ( min .)

2.09

9 2.

230

2.85

6 3.

196

3.55

2

4.61

4 5.

206

5.37

3

6.09

7

6.91

7

7.66

1 8.

206

8.44

4 8.

661

9.13

9 9.

456

9.88

2

10.5

84

10.7

98

10.8

75

11.2

24

11.4

21

11.6

53

11.8

63

12.0

74

12.1

78

12.5

27

12.6

25

13.4

41

13.6

18

13.7

98

13.9

99

14.1

64

14.4

23

14.5

89

14.9

62

15.3

05

15.6

51

15.9

22

16.4

98

16.7

82

17.6

90

18.0

67

20.5

62

Señal del detector 16:014:012:010:0 18:018:1n9 19:0 (patrón interno)

18:2n6

Cromatograma de aceite de oliva

Resultados y cálculos:

- Representar gráficamente en el diagrama ternario los sistemas monofásico y bifásico,respectivamente

- Realizar tablas con porcentajes de pureza y recuperación para cada ácido graso en cada sistemaextractante.