UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO

MECANISMOS DE ACTIVACIÓN POR CALCIO DE LOS FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN NF-κB Y NFAT EN

MÚSCULO ESQUELÉTICO.

JUAN ANTONIO VALDÉS MUÑOZ

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS

Directora de Tesis: Prof. Dra. María Angélica Carrasco Friz

2007

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO

INFORME DE APROBACION TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS

Se informa a la Comisión de Grados Académicos de la Facultad de Me-dicina, que la Tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas presentada por el candidato

JUAN ANTONIO VALDÉS MUÑOZ

ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biomédicas en Examen de Defensa de Tesis rendido el día 26 de enero de 2007.

Dra. María Angélica Carrasco Friz Directora de Tesis

Programa de Fisiología y Biofísica, Facultad de Medicina, Universidad de Chile

COMISION INFORMANTE DE TESIS

PROF. DRA. ANA MARÍA CARDENAS PROF. DRA. JENNY FIEDLER PROF. DRA. JIMENA SIERRALTA PROF. DR. OMAR ORELLANA Presidente Comisión de Examen

Este trabajo está dedicado con todo mi amor a

Lilian, Ignacio y Helena.

Agradecimientos A mi directora de Tesis Dra. María Angélica Carrasco por su gran apoyo, dedicación y

amistad. Gracias por toda la confianza brindada y el conocimiento entregado.

A la comisión integrada por la Dra. Jimena Sierralta, Dra. Ana María Cárdenas, Dra.

Jenny Fiedler y el Dr. Omar Orellana por sus valiosos aportes y consejos que

enriquecieron el desarrollo de esta tesis.

Al Dr. Jorge Hidalgo por su amistad, colaboración y disposición.

A los Drs. Enrique Jaimovich, Cecilia Hidalgo, Ricardo Bull y Paulina Donoso por su

muy buena disposición y ayuda.

A mis camaradas del laboratorio: Compadre Pepe, compañero de tantos años al servicio

de la ciencia. Cesar Osorio, por tu amistad e invaluable aporte. Nancy por tu gran

simpatía y buen humor. Mónica por tu valiosa ayuda en la preparación de cultivos y por

tu amistad. Lalito nunca tendré un estudiante como tú.

A mi maestro Jonás, porque después de tantos años todavía tiene consejos para mi.

A mis amigos de fisiología: Alejandra Espinosa, Marioly, José Miguel, Lidia, Nevenka,

Mariana, Verónica, Alejandra, Mario, Profe Liberona, Carlitos, Luchito, Alexis, José

Luis, Genaro, Paola Llanos, Tatiana, Denisse, Paola Haeger, Agustín, Luz, Natalia,

Álvaro, Chamorro, Rafaela, Juan Ríos, JP, Gina, Zully.

Al Dr. Martin Schneider, por haberme permitido trabajar en su laboratorio. A Erick y

Minerva por su cariño y amistad durante mi estancia.

A Soledad y Fernando por su simpatía, amistad y ayuda.

INDICE

Abreviaturas 1

Resumen 3

Abstract 5

Introducción

Señalización mediada por calcio 7

Señales de calcio en músculo esquelético 8

Señales de calcio y transcripción 12

Activación de los factores de transcripción NF-κB y NFAT por calcio 14

Oscilaciones de calcio y activación de NF-κB y NFAT 18

Resumen de los antecedentes más relevantes 20

Hipótesis 21

Objetivos 21

Materiales y Métodos

Cultivo primario de músculo esquelético 22

Cultivo de línea celular C2C12 22

Preparación de fibras FDB (flexor digitorum brevis) 22

Despolarización de cultivo por potasio externo 23

Mediciones de calcio intracelular y estimulación eléctrica 23

Inmunocitoquímica 25

Plasmidios reporteros 26

Preparación de DNA plasmidial 27

Transfección de mioblastos 28

Transducción de adenovirus recombinante para NFATc1 28

Ensayos luciferasa 28

Lisados celulares y Western blots 29

Fraccionamiento celular y Western blots 29

Determinación de actividad Calcineurina 30

Resultados

ii

Optimización de condiciones de transfección 32

Activación de vector reportero para NF-κB y NFAT inducida por

despolarización por potasio externo en cultivo primario de miotubos 35

Activación de vector reportero para NF-κB y NFAT inducida por diversos

protocolos de estimulación eléctrica en cultivo primario de miotubos. 38

Participación de señales de Calcio rápida y lenta en la transcripción

dependiente de NF-κB 41

Participación de señales de Calcio rápida y lenta en la transcripción

dependiente de NFAT 43

Participación de calcio externo en la activación de la transcripción dependiente

de NF-κB y NFAT en cultivo primario de miotubos 45

Activación de la translocación de NF-κB (p65) y NFAT (NFATc1) al núcleo

celular inducida por despolarización en cultivo primario de miotubos y línea celular

C2C12 47

Estandarización de fraccionamiento subcelular en C2C12 50

Activación de translocación de NF-κB (p65) al núcleo celular inducida por

despolarización en línea celular C2C12 52

Activación de translocación de NFAT (NFATc1) al núcleo celular inducida por

despolarización en línea celular C2C12 54

Participación de señales de Calcio rápida y lenta en la translocación de NF-κB

(p65) al núcleo celular 56

Participación de señales de calcio rápida y lenta en la translocación de NFAT

(NFATc1) al núcleo celular 58

Contribución de Calcineurina y otras probables cascadas de señalización que

participan en la activación de NF-κB y NFAT en cultivo 63

Determinación del mecanismo de activación de NF-κB frente a

despolarizaciones en cultivo primario de miotubos 66

Determinación del mecanismo de activación de NFAT frente a

despolarizaciones en cultivo primario de miotubos 68

Señales de calcio en fibra muscular 70

iii

Translocación de NFATc1 en fibras lentas sometidas a estimulación eléctrica

73

Discusión 76

Conclusiones 93

Anexo 95

Referencias 100

1

ABREVIATURAS 2-APB: 2-aminoetoxidifenil borato

AP-1: Proteína activadora 1

Ara C: Arabidósido de citosina

ATP: Adenosin trifosfato

BAPTA-AM: 1,2-bis(2 aminofenoxi) etano-N,N,N,N-acido tetraacético

Bp: pares de bases

BSA: Albúmina de suero de bovino

BS: suero de bovino

cAMP: AMP cíclico

Ca+2: ion calcio

CaMK: Calcio/calmodulina kinasa

CBP: Proteína de unión a CREB

CRE: elemento de respuesta a cAMP

CREB: proteína de unión al elemento CRE

DAG: diacilglicerol

DMEM: Dulbecco’s modified Eagle medium

DMEM-F12: Dulbecco’s modified Eagle medium-F12

DNA: acido desoxirribonucleico

DHPR: Receptor de dihidropiridinas

DMSO: dimetilsulfoxido

DTT: ditiotreitol

EC: excitación-contracción

EDTA: Acido etilendiaminotetraacético

EGTA: Acido etilenglicol-bis-(b-aminoetileter)-N,N,N,N-2 etanosulfonico

ERK: Proteína kinasa regulada extracelularmente

EROS: especies reactivas del oxigeno

FBS: suero fetal bovino

FITC: isotiocianato de fluoresceína

Fluo 3-AM: fluo 3-acetometilester

GAPDH: Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa

2

HEPES: Acido N-2 hidroxietilpiperazina N-2-etanosulfónico

IgG: Inmunoglobulina G

IL-6: interleuquina 6

IP3: Inositol 1,4,5- trifosfato

IP3R: Receptor de IP3

JNK: quinasa N-terminal de c-jun

LB: Medio Luria

Luc: Luciferasa

MAPK: proteína kinasa activada por mitógenos

MOI: multiplicidad de infección

NAFT: factor nuclear de células T activadas

NF-κB: factor nuclear kappa B

P38 MAPK: proteína kinasa de 38 Kda activada por mitógenos

PBS: tampón fosfato salino

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

PI3K: fosfatidilinositol 3-kinasa

PKC: proteína kinasa C

PLC: Fosfolipasa C

RLU: Unidades relativas de luz

RS: Retículo sarcoplasmático

Rya: Ryanodina

RyR: Receptor de ryanodina

SDS: dodecil sulfato de sodio

SER: elemento de respuesta a suero

TBE: tris-borato- EDTA

TBS: Tampón tris salino

TE: tris EDTA

TNFα: factor de necrosis tumoral tipo alfa

Tris: Tris-(hidroximetil)-aminoetano

3

RESUMEN

La despolarización de células de músculo esquelético inducida por una alta

concentración de K+ externo o por estimulación eléctrica induce la liberación de calcio

desde reservorios intracelulares. Los dos componentes de esta liberación de calcio son

mediados por receptores de ryanodina (señal rápida) o por receptores de IP3 (señal lenta)

mostrando diferencias en cinética, amplitud y localización subcelular de dichas señales.

En este trabajo se describe la activación de los factores de transcripción NF-κB y NFAT

en respuesta a la despolarización inducida por K+ externo (despolarización crónica) o

mediante pulsos eléctricos (despolarización fluctuante). NF-κB se activa frente a la

despolarización por K+ o mediante diversos protocolos de estimulación eléctrica variando

la frecuencia y el número de pulsos con una respuesta aumentada frente a protocolos de

estimulación con un incrementado número de pulsos independientemente de la frecuencia

de estimulación. Por el contrario, la respuesta de NFAT frente a protocolos de

estimulación eléctrica se mantiene constante dentro de un rango de frecuencias

independientemente del número de pulsos, y se incrementa específicamente a bajas

frecuencias de estimulación.

La activación de NF-κB es dependiente de la liberación de calcio mediada por el

receptor de ryanodina y del receptor de IP3, y es independiente del calcio extracelular. La

activación de NFAT es dependiente de la liberación de calcio mediada por el receptor de

ryanodina y del calcio extracelular. La activación de NF-κB es mediada por la

degradación de IκBα y por la translocación de p65 al núcleo. La activación de NFAT es

mediada por la actividad de calcineurina y por la translocación de NFATc1. Otras vías de

4

señalización además de calcineurina que podrían contribuir a la activación de NF-κB, son

la generación de especies reactivas de oxigeno y PKC.

Estos resultados proveen nuevas ideas e información acerca de cómo la

estimulación crónica y fluctuante son decodificadas para activar las respuestas de NF-κB

y NFAT mediante un complejo sistema de señales de calcio evocadas por

despolarización.

5

ABSTRACT

Depolarization of skeletal muscle cells either by high external K+ or by electrical

stimulation induces calcium release from internal stores. The two components of this

release are mediated by either ryanodine receptors (fast component) or IP3 receptors

(slow component) showing differences in kinetics, amplitude and subcellular localization.

We describe the activation of the transcription factors NF-κB and NFAT in response to

depolarization induced either by high K+ (chronic depolarization) or by electrical pulses

(fluctuating depolarization). NF-κB responds to K+ and to electrical stimulation protocols

varying in frequency and number of pulses with particular enhanced response to long-

term duration of calcium transients independently of the frequency stimulation, on the

other hand, the NFAT response to the electrical protocols is maintained constant within a

range of frequencies independently of the number of pulses, and is specifically increased

by enduring low frequency.

NF-κB activation is dependent on calcium released by the ryanodine receptor and

IP3 receptor and independent of extracellular calcium. NAFT activation is dependent on

calcium released by the ryanodine receptor and extracellular calcium. NF-κB activation is

mediated by IκBα degradation and p65 translocation to the nucleus. NFAT activation is

mediated by induced calcineurin activity and NFATc1 translocation. Other signaling

pathways such as those linked to calcineurin, reactive oxygen species and PKC also

contribute to NF-κB activation by depolarization, as assessed by blockade with

pharmacological agents.

6

These results provide new information and insight as how chronic and transient

stimulation are decoded to activate the NF-κB and NFAT response by the complex

calcium signals evoked by depolarization.

7

INTRODUCCIÓN

Señalización mediada por calcio:

La señalización mediada por calcio desempeña un importante papel en la

regulación de una amplia variedad de procesos celulares básicos tales como fertilización,

adhesión, movilidad, proliferación y muerte celular (Petersen 2002, Carafoli 2002,

Berridge et al. 2000). La generación de señales de calcio en respuesta a estímulos

extracelulares implica cambios transitorios en la concentración citoplasmática de iones

calcio, jugando un papel fundamental en la mediación de procesos celulares adaptativos

que involucran cambios en la expresión génica (Berridge et al. 2003, Carafoli 2002,

Dolmetsch 2003). La regulación de la expresión génica por calcio es un proceso

complejo, regulado por mecanismos citosólicos y nucleares que descodifican las

características de las señales de calcio en términos de amplitud, frecuencia, duración,

oscilaciones además de sus propiedades espaciales (Dolmetsch et al. 1997, Dolmetsch et

al.1998, Petersen 2002, Lewis 2003). A nivel transcripcional se han delineado al menos

tres mecanismos mediante los cuales el calcio se encontraría regulando el proceso de

expresión génica: a) activación de cascadas que llevan a fosforilaciones y

desfosforilaciones que modifican las propiedades transactivantes de factores de

transcripción o afectan la estructura del nucleosoma, b) interacciones proteína-proteína

entre sensores de calcio y factores de transcripción, c) cambios inducidos por calcio en

las propiedades de unión de sensores de calcio a sitios específicos en el DNA (Mellström

& Naranjo 2001, Dolmetsch 2003). Si bien en diversos sistemas celulares existe amplia

información que correlaciona cambios de expresión con variaciones de niveles de calcio

intracelular, se desconoce en la actualidad de que manera las distintas señales de calcio

8

son decodificadas para modificar diferencialmente la actividad de una diversa gama de

factores de transcripción los cuales son elementos fundamentales en procesos de

remodelación génica.

Señales de calcio en músculo esquelético:

La señalización mediada por calcio adquiere un papel fundamental en músculo

esquelético ya que la contracción de la fibra muscular esquelética depende del aumento

de calcio intracelular. Brevemente, la liberación de acetilcolina desde la terminal

presináptica de la unión neuromuscular induce eventos que llevan a la despolarización de

la fibra muscular (Figura 1). La despolarización de la membrana de los túbulos T activa

canales de calcio presentes en el retículo sarcoplasmático (RS), produciendo la liberación

de calcio al citoplasma (Ríos & Pizarro 1991). Se ha postulado que los receptores de

dihidropiridinas (DHPR) que forman parte de la familia de canales de calcio tipo L y que

están presentes en el túbulo transversal del músculo, detectan estos cambios de voltaje y

sufren un cambio conformacional que provoca la apertura de canales asociados al

receptor de ryanodina (RyR), presentes en el retículo sarcoplasmático (Dirksen y Beam,

1999). Las concentraciones de calcio alcanzadas en el citosol durante este proceso

desencadenan la activación de la maquinaria contráctil, proceso denominado

acoplamiento excitación-contracción (E-C) (Melzer et al. 1995).

Los cultivos primarios de músculo esquelético y la línea celular C2C12 son

modelos de trabajo que han resultado de gran utilidad para estudiar los fenómenos de

señalización mediada por calcio asociada a cambios de la expresión génica en músculo

esquelético. En nuestro grupo se han estudiado las señales de calcio producidas por

9

Figura 1: Inducción de la contracción muscular. 1. La acetilcolina liberada desde terminales sinápticos

despolariza a la célula muscular y gatilla un potencial de acción. 2. El potencial de acción se propaga por el

túbulo transverso. 3. La despolarización del túbulo transverso gatilla la liberación de calcio desde el

retículo sarcoplasmático. Imagen tomada desde Neurobiology, Gary Mathews 2003.

10

despolarización, ya sea por una alta concentración de potasio externa como por

estimulación eléctrica, en ambos modelos. Se ha detectado una primera señal de calcio

(señal rápida) producida en toda la célula, responsable del acoplamiento excitación-

contracción, y una segunda señal (señal lenta) que presenta tanto un componente

citosólico como nuclear en que la concentración de calcio citosólico alcanzada durante

esta segunda señal no gatilla la contracción muscular (Figura 2) (Jaimovich et al. 2000,

Estrada et al. 2001, Eltit et al. 2004).

El calcio liberado durante la señal rápida asociado al acoplamiento excitación -

contracción, proviene del retículo sarcoplasmático a través del canal de calcio receptor de

Ryanodina (RyR). Esto es evidente ya que en miotubos 1B5 dispédicos, que no expresan

RyR, la señal rápida de calcio se pierde completamente, no así la señal lenta en particular

la localizada en el núcleo. Resultados equivalentes se obtienen al exponer un cultivo

primario y la línea de células musculares C2C12 a ryanodina en concentraciones

inhibidoras del RyR (Jaimovich et al. 2000, Estrada et al. 2001).

Se ha determinado que la señal lenta de calcio se genera por la liberación de

calcio a través de los canales de calcio que responden a Inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3)

también llamados receptores a IP3 (IP3R), ya que los inhibidores de la vías del IP3 como

U73122 (inhibidor de fosfolipasa C, PLC), xestospongina (bloqueador de IP3R) y 2-

aminoetoxidifenil borato (2-APB), bloqueador del sistema del IP3, inhiben

completamente la señal lenta sin afectar la señal rápida de calcio (Estrada et al. 2001).

Tanto la señal de calcio rápida como la lenta son dependientes del receptor a

Dihidropiridinas (DHPR) e independientes del calcio extracelular, por lo tanto el calcio

11

liberado durante la despolarización proviene de reservorios intracelulares (Araya et al.

2003, Eltit et al. 2004).

Figura 2: Señales de calcio rápida y lenta inducidas por estimulación eléctrica y por despolarización por

potasio. Los niveles de calcio intracelulares se midieron en regiones de interés de miotubos cargados con

Fluo 3AM por microscopia confocal. La figura muestra ΔF/F min para A) La estimulación eléctrica a 45 Hz

con 400 pulsos B) La estimulación eléctrica a 45 Hz con 1000 pulsos C) La estimulación eléctrica a 45 Hz

con 400 pulsos seguida por la estimulación eléctrica a 45 Hz con 1000 pulsos D) La estimulación eléctrica

a 1 Hz con 1000 pulsos (Valdés et al 2007) E) despolarización por potasio (Carrasco et al. 2003).

0 1 2 3

0.0

0.5

1.0

0 2 4 6 8 10 12 14

0.0

0.5

1.0

1.5

0 5 10 15 20 25 30

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 1 2 3

0

1

2

3

4

TIME (min) TIME (min)

ΔF/

F min

TIME (min)

ΔF/

F min

ΔF/

F min

ΔF/

F min

TIME (min)

A B

C

D

E

12

Señales de calcio y transcripción:

Si bien se desconoce el significado fisiológico de la señal lenta de calcio, se ha

postulado que estaría involucrada en la activación diferencial de la transcripción mediada

por distintos elementos de respuesta sensibles a calcio, a través de activación selectiva de

cascadas de señalización (Carrasco et al. 2003). En un primer paso para determinar el

papel de la señal lenta en los procesos de expresión génica, se analizaron intermediarios

clásicos de vías de expresión génica: ERKs fosforilados, miembros de la familia de MAP

quinasas que pueden activar factores de transcripción, y la forma fosforilada del factor de

transcripción CREB. Además, se analizó los niveles de RNA mensajero de los genes

tempranos c-fos, c-jun y egr-1. Se determinó que la despolarización de células

musculares resulta en aumentos transitorios de fosforilación de ERKs, CREB y de los

mensajeros de los genes tempranos, respuestas que son inhibidas por inhibidores

específicos de la señal lenta y que se mantienen en presencia de ryanodina en

concentración inhibitoria del RyR (Powell et al. 2001, Carrasco et al. 2003, Araya et al.

2003).

Se ha demostrado que la fosforilación de CREB inducida por despolarización

depende de ERKs (Carrasco et al. 2003) y de PKCα (Cárdenas et al. 2004). La activación

de PKCα y su translocación al núcleo, así como la fosforilación de ERKs, que participan

en la fosforilación de CREB inducida por despolarización, son dependientes de la

liberación de calcio mediada por IP3R (Carrasco et al. 2003, Cárdenas et al. 2004).

Además se ha determinado mediante RT-PCR que la despolarización por potasio en

miotubos de rata y células C2C12 aumenta los niveles de mRNA para IL-6, efecto que es

inhibido por inhibidores de la señal lenta (Juretic et al. 2006). También se identificó

13

mediante la técnica de Microarrays de oligonucleótidos la participación de la señal lenta

de calcio inducida por despolarización por potasio externo en la regulación de la

expresión del gen tardío Tnni (Juretic et al. 2007). Es conveniente mencionar, respecto a

la señal rápida de calcio, que si bien su función se ha asociado al proceso de contracción

muscular, no se descarta su participación en otro tipo de eventos celulares, como por

ejemplo, en procesos de remodelación génica, hecho que se ha reportado recientemente

en músculo esquelético (Rosenberg et al. 2004).

NFAT y NF-κB en músculo esquelético.

Los factores de transcripción NFAT y NF-κB han mostrado tener una

participación importante en eventos de respuesta frente a diversos estímulos que implican

cambios transitorios en las concentraciones intracelulares de calcio (Crabtree & Olson

2002, Hogan et al. 2003, Dolmetsch et al. 1998). Se ha asociado la participación de

Calcineurina-NFAT en procesos de proliferación, diferenciación y fusión de miotubos,

además de la participación de la isoforma NFATc1 en procesos que llevan tanto a la

hipertrofia de músculo esquelético como a la remodelación y regulación de genes

específicos de fibras musculares lentas (Abbott et al. 1998, Chin et al. 1998, Delling et al.

2000, Allen & Leinward 2002, Kubis et al. 2003, Liu et al. 2001, McCullagh et al. 2004,

Schiaffino & Serrano 2002, Olson & Williams 2000).

Por otra parte se ha reportado que NF-κB se encuentra involucrado en los

procesos de proliferación y diferenciación del miotubo, describiéndose además que en

músculo adulto NF-κB se encuentra activado por ejercicio físico, contracción in vitro y

por desgaste muscular. Se ha propuesto que NF-κB podría estar jugando un papel en la

regeneración muscular después de un daño producido por ejercicio intenso (Cai et al.

14

2004, Ji et al. 2004, Ho et al. 2005, Kumar & Boriek 2003, Jackman et al. 2004, Hunter et

al. 2002).

Activación de los factores de transcripción NF-κB y NFAT por calcio.

El calcio es una de las señales que juega un papel fundamental en la activación de

los factores de transcripción NFAT y NF-κB a través de la regulación de diversas

proteínas quinasas y fosfatasas (Figura 3).

NF-κB representa un grupo de proteínas estructuralmente relacionadas y

evolutivamente conservadas identificándose 5 miembros en mamíferos: c-rel, Rel A

(p65), Rel B, NF-κB1 (p50 y su precursor p105) y NF-κB2 (p52 y su precursor p100).

Las proteínas NF-κB pueden existir como homodímeros o heterodímeros, siendo el

prototipo de la familia el heterodímero p50/p65. En ausencia de un estímulo apropiado

NF-κB permanece en el citoplasma unido a una proteína inhibitoria, IκB (IκBα, IκBβ,

IκBε) y en presencia de un estímulo IκB es fosforilado por el complejo IKK,

posteriormente IκB es ubiquitinada y degradada en el proteasoma. Una vez libre el

dímero, NF-κB se transloca al núcleo donde ejerce su función efectora. La subunidad p50

o p52 se une al DNA, y las subunidades p65 o Rel B actúan como transactivantes de la

transcripción (Ghosh & Karin 2002; Israël 2003, Tian & Brasier 2003). Se ha descrito

una segunda forma de regulación de la actividad NF-κB mediante la fosforilación de la

subunidad p65 en los residuos S529 y S536. Este proceso conocido como transactivación

ocurre en el núcleo una vez que el dímero se ha translocado y es requerido para una

eficiente activación transcripcional (Okazaki et al. 2003, Vermeulen et al. 2002).

15

Figura 3: Diagrama que muestra diversas vías de señalización propuestas para la activación de NF-κB y

NFAT mediadas por calcio. Calcineurina es activada por un aumento de calcio intracelular, induciendo la

desfosforilación de NFAT. Además se ha postulado su participación en la activación de NF-κB ya sea de

una manera indirecta actuando en forma conjunta con PKC para activar al complejo IKK o mediante

participación directa sobre la degradación de IκBβ (Feske et al. 2003).

16

Si bien existen muy pocos estudios en células de músculo esquelético que

correlacionen la activación de NF-κB con vías dependientes de calcio, existen

antecedentes de estudios realizados en otros tipos celulares que indicarían potenciales

redes de cascadas de señalización activadas por calcio que llevarían a la activación de

NF-κB. Por ejemplo se ha determinado en células neuronales que el influjo de calcio a

través de canales dependientes de voltaje activa las cascadas Ras-PI3K-Akt, calmodulina

– CaMKII, PKCs atípicas (Lilienbaum & Israël 2003). También para calcineurina, una

fosfatasa de serina/treonina dependiente de calcio-calmodulina, se ha mostrado una

contribución importante en la activación de NF-κB en células musculares (Alzuherri et al.

2003). Sin embargo, no está claro el mecanismo mediante el cual calcineurina pueda

conducir a la activación de NF-κB. En este sentido se han descrito varias posibles vías de

acción, por ejemplo, se ha demostrado en células neuronales estimuladas con IGF-1 que

calcineurina estabiliza a IκBα, inhibiendo la translocación de NF-κB al núcleo

(Alexanian et al. 1999, Pons et al. 2000). En forma completamente contrapuesta se ha

mostrado en linfocitos T que calcineurina activa NF-κB vía activación de IKKα, al

sinergizar con PKC (isoformas α y β1) (Trushin et al. 1999). Se ha descrito

recientemente una tercera vía en células musculares sometidas a estrés mitocondrial que

presentan niveles de calcio citoplasmático altos y sostenidos; estos niveles altos de calcio

producen una activación permanente de calcineurina que desfosforila a IκBβ,

inactivándola y permitiendo la translocación del heterodímero p50/cRel al compartimento

nuclear (Biswas et al. 2003).

La familia de factores de transcripción NFAT abarca cinco proteínas (NFATc1,

NFATc2, NFATc3, NFATc4 y NFAT5) evolutivamente relacionadas a la familia Rel/

17

NF-κB. En estado de reposo NFATc permanece fosforilado en el citoplasma, y bajo

estimulación varios residuos de serina son desfosforiladas por calcineurina, exponiendo

una secuencia de localización nuclear (NLS) y gatillando una rápida importación al

núcleo (Tomida 2003, Crabtree & Olson 2002, Hogan et al. 2003). La desfosforilación se

encuentra contrapuesta por una agresivo sistema de quinasas en el núcleo, por lo que

después que la concentración de calcio intracelular cae a niveles bajo el umbral, NFAT es

refosforilado, exponiendo una señal de exportación nuclear (NES) lo cual direcciona

rápidamente su exportación. Al igual que otros factores de transcripción, la actividad

transcripcional de NFAT puede ser regulada por modificación de sus dominios de

transactivación, aunque este punto no ha sido estudiado en detalle (Hogan et al. 2003).

Utilizando animales knock out y otras aproximaciones experimentales se ha determinado

que las isoformas de NFATc1, c2 y c3 se encontrarían regulando la especificidad y

desarrollo del miotubo, es decir, NFTAc3 participa en la diferenciación del mioblasto,

NFATc2 participa en la formación del miotubo naciente y NFATc1 participa en la

formación del miotubo maduro así como en eventos de remodelación de músculo adulto,

desde el tipo de fibras rápidas a fibras lentas (Abbott et al. 1998, Kubis et al. 2003, Liu et

al. 2001, McCullagh et al. 2004). Antecedentes indirectos que apoyan esta observación

provienen de estudios de mutagénesis de los genes Cna a y Cna b (que codifican para las

subunidades α y β de calcineurina) que conducen a una reducción del número de fibras

lentas (Chin et al. 1998). Existe una amplia gama de trabajos que describen la activación

de NFATc1 en células de músculo esquelético por diversos estímulos, incluida la

despolarización (Glass et al. 2003, Liu et al. 2001, Kubis et al. 2003, Rosenberg et al.

2004, Stiber et al. 2005).

18

Oscilaciones de calcio y activación de NF-κB y NFAT.

La contribución de señales de calcio diferentes en términos de amplitud,

frecuencia, duración y oscilaciones sobre la especificidad de respuestas transcripcionales

ha sido un tema importante en los últimos años. Reveladores han sido los estudios

realizados por Dolmetsch en células Jurkat, modelo en que se determinó que el factor de

transcripción NF-κB es estimulado por un aumento rápido y de gran amplitud en la señal

de calcio, mientras que NFAT responde a un aumento lento pero sostenido, de baja

amplitud. Al manipular la frecuencia de la señal se determinó además que oscilaciones de

alta y baja frecuencia activan a NF-κB, no así a NFAT cuya activación requiere de

oscilaciones de alta frecuencia; la activación de ambos factores es completamente

inhibida por ciclosporina A, un inhibidor de calcineurina (Dolmetsch et al. 1998).

Notablemente las diferencias en las frecuencias de las señales de calcio parecen reflejar

los diferentes mecanismos bioquímicos para la regulación de estos factores de

transcripción (Figura 4): La cinética rápida de importación y exportación de NFAT es

consistente con la necesidad de periodos de oscilaciones menores a 6 minutos para su

acumulación nuclear y activación. En forma contrapuesta, NF-κB es regulado por un

mecanismo de degradación de IκB permitiendo la entrada de NF-κB al núcleo donde

reside hasta que se ha sintetizado suficiente IκB y recaptura a NF-κB transportándolo al

citoplasma. Debido a que la nueva síntesis de IκB toma decenas de minutos, la salida de

NF-κB desde el núcleo es lenta (Lewis et al. 2003).

19

Figura 4: La activación de los factores de transcripción NFAT y NF-κB es dependiente de las frecuencias de las oscilaciones de calcio. El esquema muestra los procesos de activación y desactivación de NAFT y NF-κB. Las oscilaciones rápidas activan a ambos factores pero oscilaciones lentas activan únicamente a NF-κB (Lewis et al 2003).

20

Resumen de los antecedentes más relevantes

La despolarización de miotubos ya sea con una elevada concentración de potasio

extracelular o mediante estimulación eléctrica, produce un incremento bifásico en la

concentración de calcio intracelular.

El primer componente o señal rápida de calcio se localiza en toda la célula, es regulado

por RyR y se asocia al proceso contráctil. El segundo componente o señal lenta de calcio

posee tanto un componente nuclear como uno citoplasmático, en el cual los niveles de

calcio liberado no gatillan la contracción muscular, es regulado por IP3R y se postula que

estaría involucrada en la regulación de la expresión génica.

Nuestro laboratorio ha demostrado que la señal lenta de calcio produce un aumento

transitorio en los niveles de mRNA de los genes tempranos c-fos, c-jun y egr-1, y en la

fosforilación de los reguladores transcripcionales ERK y CREB, en cultivo primario de

miotubos de rata despolarizados con potasio. No se descarta la participación de la señal

rápida en la activación de cascadas de transducción de señales que lleven a eventos de

remodelación génica.

Hasta la fecha existe poca información que describa cambios en la actividad de factores

de transcripción producto de variaciones intracelulares de calcio generadas en forma

fisiológica.

21

Hipótesis:

En el músculo esquelético las señales transitorias de calcio, rápida y lenta,

contribuyen diferencialmente a la activación de los factores de transcripción NFAT y NF-

κB, y las propiedades de ambas señales de calcio en magnitud y temporalidad modulan la

respuesta de estos factores de transcripción.

Objetivo general:

Determinar como los factores de transcripción NFAT y NF-κB responden a

diferentes señales de calcio.

Objetivos específicos.

1) Analizar la participación de la señal rápida y la señal lenta en la activación de NFAT y

NF-κB.

2) Determinar la contribución de calcineurina y otras probables cascadas de señalización

que participan en la activación de NF-κB.

3) Determinar los mecanismos de activación de NF-κB y NFAT frente a despolarización.

22

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo primario de músculo esquelético

Se realizó a partir de músculo esquelético de ratas neonatas Sprague-Dawley de 21 días

de gestación. El tejido fue finamente disectado, disgregado mecánicamente y tratado con

colagenasa por 15 minutos a 37°C, obteniéndose una suspensión que fue filtrada y

sedimentada a baja velocidad. Las células fueron preplaqueadas por 15 min para

enriquecer la preparación de mioblastos y sembradas en medio DMEM-Ham F-12, 10%

suero bovino (SB), 2.5% suero fetal de bovino (SFB). Para eliminar los fibroblastos

restantes, al tercer día de cultivo se agregó arabinósido de citosina que se mantuvo

durante 24 horas. Posteriormente para inducir la diferenciación de los miotubos se incubó

en medio DMEM-Ham F-12 libre de suero.

Cultivo de línea celular C2C12

Las células almacenadas en nitrógeno liquido, se descongelaron y se mantuvieron en

medio DMEM-F12 (1:1) suplementado con 10% de BS, 2,5% de FBS, antibióticos y

antimicóticos. Cuando los cultivos presentaron un 80% de confluencia, se cambiaron a un

medio DMEM-F12 suplementado con 5% de suero de caballo (HS) para inducir la

diferenciación.

Preparación de fibras FDB (flexor digitorum brevis)

Fibras musculares fueron disociadas enzimáticamente desde músculos FDB de ratones

CD1 de 4 a 5 semanas de edad. Se incubó el músculo FDB en 5 ml de MEM conteniendo

10% SFB y colagenasa 10%, por 3 horas. Las fibras fueron liberadas a través de pipeteos

23

suaves con una pipeta Pasteur modificada. Se cultivaron las fibras en placas de cultivo

previamente tratadas con laminina (Sigma) por 2 horas. Las fibras musculares fueron

cultivadas en MEM con 10% SFB y 50 μg/μl de gentamicina en CO2 5% a 37ºC.

Despolarización de cultivo por potasio externo

Los cultivos celulares se mantuvieron por 24 horas en medio DMEM-F12 sin suero y

luego se equilibraron por 30 minutos en medio de reposo (NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM,

CaCl2 3,0 mM, MgCl2 1 mM, Hepes 20mM, Glucosa 10 mM, pH 7,4) antes de

someterlos a despolarización. Transcurrido este tiempo las células se incubaron durante 1

minuto en presencia o ausencia de una solución que contiene KCL 84 mM (con una

reducción equimolar de NaCl) y luego por tiempos variables en medio de reposo. Para

evaluar el efecto de los agentes capaces de bloquear o inhibir la señal rápida (ryanodina

50 μM) y lenta (2-APB 50 μM) de calcio intracelular, estos se adicionaron al medio 30 a

45 minutos previamente y durante la despolarización. Para evaluar el efecto del calcio

extracelular se incubaron las células en medio de reposo libre de calcio (NaCl 118 mM,

KCl 4,7 mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2 1 mM, Hepes 20mM, Glucosa 10 mM, pH 7,4).

Mediciones de calcio intracelular y estimulación eléctrica

Para las mediciones de calcio intracelular, las fibras se cargaron con el compuesto

fluorescente permeable Fluo-3-acetoximetilester (Fluo-3 AM, 5,5 μM, Molecular Probes)

en medio Krebs (NaCl 145 mM, KCl 5mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, Hepes 10mM,

Glucosa 5,6 mM, pH 7,4). Las fibras sembradas sobre cubreobjetos se montaron en una

cámara de perfusión, se lavaron 3 veces y se incubaron en medio Krebs en presencia o

24

ausencia de los inhibidores de la señal rápida y señal lenta. De esta forma, las células

fueron posteriormente estimuladas. Alternativamente para la condición libre de calcio,

después de los lavados se cambió el medio por uno sin calcio (NaCl 145 mM, KCl 5 mM,

EGTA 0,5 mM, MgCl2 2 mM, Hepes 10 mM, Glucosa 5,6 mM, pH 7,4).

Las fibras se colocaron sobre la platina de un microscopio confocal Zeiss Live. La

adquisición de las imágenes se controló por un software proporcionado por el fabricante.

El mismo programa controló la generación de pulsos eléctricos por un estimulador en

donde se pudo controlar fácilmente la frecuencia, duración, número y magnitud de cada

pulso. Los pulsos se aplicaron a las células mediante un par de electrodos de platino

separados por una distancia de 3 mm. Los electrodos se pusieron 1-2 mm por sobre las

células con un micromanipulador, situando a las células que están en el campo focal entre

los dos electrodos. Durante el protocolo de estimulación y posterior a este, se adquirió

una secuencia de imágenes, cada imagen tuvo una exposición de 100 ms y con un periodo

de cada 1 segundo. La iluminación se limitó al periodo de exposición (100 ms) para

minimizar la descomposición del colorante por la luz (photobleaching). Las imágenes se

procesaron posteriormente con el programa ImageJ (Rasband 1997). El ajuste de la señal

y gráficos se realizaron mediante Prism 3.0.

Para una estimulación eléctrica homogénea de miotubos sembrados en placas de 60

mm, se construyó un electrodo que consiste en 9 cables de platino paralelos a una

distancia de 0,5 cm entre ellos, con polaridad alternada, montados sobre un soporte

plástico circular que calzaba en la placa de cultivo. Los dos terminales se conectaron a un

estimulador con control manual de frecuencia, intensidad y duración de los pulsos. Los

pulsos cuadrados se midieron mediante un osciloscopio. Para verificar la efectividad del

25

sistema de estimulación, las células se sometieron a una estimulación de baja frecuencia

(1 Hz) y se visualizó la contracción de las células en un microscopio de contraste de fase.

Este sistema induce contracción celular sobre el 85% de la placa.

Inmunocitoquímica:

La técnica de inmunocitoquímica se utilizó para determinar la localización

subcelular específica de la isoforma NFATc1 (Affinity Bioreagent) y de p65 (Cell

Signaling). Como control de localización nuclear se utilizó el anticuerpo LAP-2(Cell

Signaling).

Miotubos de rata fueron cultivados en placas de 60 mm sobre cubreobjetos de

vidrio hasta alcanzar un 70% de confluencia. Luego del estímulo los miotubos fueron

lavados con PBS, fijados con metanol frío a -20°C durante 15 minutos y lavados con

PBS. Posteriormente los miotubos fueron bloqueados con PBS/BSA 1 %, para luego ser

incubados con el anticuerpo primario (anti-NFAT o anti-p65). La incubación de los

anticuerpos primarios se llevó a cabo sin remover la solución bloqueadora durante toda la

noche a 4°C en cámara húmeda. Luego se lavó y se incubó con el anticuerpo secundario

conjugado con el fluorocromo por 2 horas. Después de 3 lavados de 10 min, los

cubreobjetos que contenían a los miotubos fueron montados sobre portaobjetos y se

agrego líquido de montaje Vectashield H-1000 para retardar el decaimiento de la

fluorescencia. Los controles se realizaron incubando el anticuerpo secundario en ausencia

del anticuerpo primario. La observación microscópica se llevó a cabo en un microscopio

confocal (Carl Zeiss Axiovert 135 M-LSM Microsystem) y para el análisis de imágenes

se utilizó el programa ImageJ.

26

Plasmidios reporteros:

Para realizar este estudio se dispuso de las siguientes construcciones:

NF-κB 6X: Plasmidio que contiene seis secuencias consenso de unión para NF-κB

clonadas en el sitio de policlonamiento en el vector pGL3. Brevemente, el vector pGL3

promoter (Promega) fue digerido por alrededor de 16 h (durante la noche) con la enzima

de restricción Xho I de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Posteriormente fue

desfosforilado y ligado con un oligonucleótido que contiene seis sitios en tandem para la

unión de NF-κB. La orientación del inserto fue chequeada por PCR del DNA plasmidial

aislado desde los diversos clones.

NFAT 3X: Plasmidio que contiene tres secuencias consenso de unión para NFAT

clonadas río arriba del promotor mínimo para IL-2 en el entorno de pGL3. Este plasmidio

fue donado por el Dr. Gerald Crabtree (Crabtree Lab, Stanford University)

NFAT 15X: Plasmidio que contiene el promotor del gen que codifica para la proteína

MCIP1 que cuenta con 15 sitios naturales de unión para NFAT. Brevemente, utilizando

partidores degenerados en su extremo 5´ se logró amplificar una zona de 951 pb

correspondiente al promotor del gen MCIP1 que codifica para una proteína endógena

inhibitoria de Calcineurina (Rosenberg et. Al. 2004). Posteriormente este fragmento fue

digerido utilizando Xho I y clonado en el sitio de policlonamiento de pGL3 Basic. La

orientación del inserto fue chequeada por PCR del DNA plasmidial aislado desde los

diversos clones.

27

Reportero de normalización cotransfectado: pRL-TK que contiene el gen para Renilla

luciferasa bajo el promotor para tirosina kinasa.

Preparación de DNA plasmidial:

Transformación de bacterias: Bacterias E. coli DH5α electrocompetentes (25 μl D.O. 0,6-

0,8 nm) fueron electroporadas en presencia de 0,01 μg del plasmidio. A esta mezcla se

agregó 1 ml de medio TB (Terrific Broth) y se incubó a 37°C por 30 minutos con

agitación. 10 y 50 μl de la suspensión de bacterias se esparcieron sobre una placa con

agar 1% en medio Luria (LB) que contenía ampicilina 50 μg/ml. Como antibiótico de

selección y se incubó toda la noche a 37°C. Las bacterias que completaron exitosamente

la transformación formaron colonias discretas, las cuales se seleccionaron y expandieron

en medio LB con ampicilina para luego ser congeladas a -80°C en glicerol al 50%.

Amplificación de plasmidios: La amplificación de plasmidios se llevó a cabo según

procedimientos estándares. Brevemente, 500 ml de medio LB con ampicilina 50 μg/ml se

inocularon con bacterias almacenadas en glicerol y se incubaron durante toda la noche a

37°C con agitación. Posteriormente las bacterias se colectaron por centrifugación a 3000

rpm por 10 minutos a 4°C.

Purificación del DNA plasmidial: Se llevó a cabo mediante el kit “Plasmid Midi Kit”

(QIAGEN). La determinación de la concentración de la concentración de cada plasmidio

28

se realizó determinando su absorbancia a 260/280 nm. La calidad del DNA plasmidial se

evaluó en gel de agarosa al 1% en presencia de bromuro de etidio y se compararon con el

estándar 1 Kb DNA Mass Ladder.

Transfección de mioblastos: Los mioblastos de rata fueron sembrados y crecidos hasta

alcanzar un 70% de confluencia aproximada al tercer día post-plaqueo. La transfección

se realizó en medio DMEM-F12 sin suero y sin antibióticos, utilizando 3 μl de FuGENE

6 (Roche), 0,9 μg de vector reportero y 0,1 μg de vector de normalización por placa en un

volumen de 1,5 ml de medio DMEM-F12 por placa de 60 mm. Transcurrido 16 horas

(durante la noche) a 37°C, el medio fue reemplazado por medio de diferenciación.

Transducción de adenovirus recombinante para NFATc1

El vector adenoviral para NFATc1 se propagó y purificó como se ha descrito

previamente (Liu et al. 2001). Las fibras se infectaron con el vector adenoviral a una

multiplicidad de infección de 1.000 al menos 48 h antes de ser usados para los

experimentos indicados.

Ensayos luciferasa :

Para los ensayos luciferasa se utilizó el kit de ensayo Promega “Dual-luciferase reporter

assay system” y la detección de luz se realizó en luminómetro Berthold F12. Brevemente

10 μl de extracto celular se incubaron con 25 μl de sustrato comercial LAR2 y

cuantificado en forma inmediata en el luminómetro, obteniéndose de esta manera la

actividad luciferasa de cada lisado expresado como unidades relativas de luz (URL/s). La

29

actividad del vector de normalización se midió sobre el mismo extracto agregando 25 μl

del reactivo Stop & Glo. Los resultados se expresaron como el porcentaje de actividad

luciferasa (razón LUC firefly/Renilla) de los miotubos sometidos a despolarización con

respecto de aquellos sin estímulo.

Lisados celulares y Western blots:

Posterior al protocolo de las estimulaciones las células fueron solubilizadas en 0,1

ml de buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 1%,

Na3VO4 5 mM, NaF 20 mM, cocktail de inhibidores de proteasas), sonicados los restos

celulares y removidos por centrifugación a 15.000 rpm a 4ºC. Las proteínas se separaron

en geles PAGE-SDS al 10% y se transfirieron a membranas de PDVF. La incubación con

el anticuerpo primario anti-IκBα (Cell Signaling), anti-IκBβ (Cell Signaling) y anti-β

actina (Sigma) fueron realizadas durante la noche a 4ºC. Posteriormente las membranas

fueron lavadas por 15 minutos en TBS a temperatura ambiente e incubadas con el

anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa y reveladas utilizando un kit ECL

(Amersham Pharmacia) según las indicaciones de los fabricantes. Las películas fueron

escaneadas y analizadas utilizando el programa Image J.

Fraccionamiento celular y Western blots

Posterior al protocolo de las estimulaciones las células fueron solubilizadas en 50

μl del buffer de lisis (sacarosa 0,3 M, Tris–HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 10 mM, MgCl2 3

mM, EDTA 0,2 mM, Na3VO4 5 mM, NaF 20 mM, pirofosfato de sodio 10mM y cocktail

inhibidor de proteasas), utilizando jeringa con punta 15 G de diámetro. Los núcleos

30

celulares fueron colectados por centrifugación a 1500 g for 5 min a 4°C. El sobrenadante

obtenido correspondió a la fracción citoplasmática la cual fue centrifugada a 10000 g por

10 min a 4°C. La fracción nuclear fue lavada en la misma solución de lisis que contiene

NP-40 0,5%, lisada en buffer hipotónico y centrifugada a 17000 g por 15 min para

remover la cromatina. Las proteínas se separaron en geles PAGE-SDS al 10% y se

transfirieron a membranas de PDVF. Se utilizaron los anticuerpos anti-LAP 2 y anti-

IκBβ para verificar la limpieza de las fracciones colectadas, y los anticuerpos anti-beta

actina y anti-histona H3 (Santa Cruz Biotechnology) para normalizar la carga de

proteínas. La incubación con el anticuerpo primario anti-NFATc1 (Affinity BioReagents)

y anti-p65 (Cell Signaling) fueron realizadas durante la noche a 4ºC. Posteriormente las

membranas fueron lavadas por 15 minutos en TBS a temperatura ambiente e incubadas

con el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa y reveladas utilizando un kit ECL

(Amersham Pharmacia) según las indicaciones del fabricante. Las películas fueron

escaneadas y analizadas utilizando el programa Image J.

Determinación de actividad Calcineurina:

Se utilizó el kit comercial “BIOMOL GREEN CELLULAR CALCINEURIN

ASSAY KIT PLUS” de Biomol, según el protocolo descrito por el fabricante.

Brevemente, posterior al protocolo de las estimulaciones las células son resuspendidas en

100 μl de buffer de lisis (Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, EGTA 0,1 mM, DTT 1

mM, NP-40 0,2%, cocktail de inhibidores de proteasas). Las muestras fueron sonicadas

por 1 minuto, y ultracentrifugadas a 180.000 x g a 4ºC por 45 minutos en una centrífuga

Sorvall Combi. Se recuperó el sobrenadante el cual fue guardado a –70ºC. Se removieron

31

los fosfatos libres desde los extractos utilizando la resina provista por el fabricante. Se

cuantificó la cantidad de proteína por muestra. Para la determinación de los niveles de

actividad calcineurina, se realizaron los siguientes puntos para cada muestra en una placa

de ensayo para ELISA: Background: 20 μl H2O + 25 μl buffer de ensayo 2X con

calmodulina. Actividad fosfatasa total: 10 μl H2O + 25 μl buffer de ensayo 2X con

calmodulina. Actividad fosfatasa sin calcineurina: 10 μl H2O + 25 μl buffer EGTA. Se

agregó a cada punto 10 μl de substrato fosfopéptido excepto para el background, y se

incubó a 30ºC por 10 minutos. Se agregó 5 μg de extracto de proteínas desde cada punto,

y se incubó por 30 minutos a 30ºC. Para detener la reacción se adicionaron 100 μl de

reactivo Biomol Green, y se les permitió desarrollar coloración verde por

aproximadamente 30 minutos. Se leyó la densidad óptica a 620 nm en un lector de placa

ELISA. Para calcular la actividad de calcineurina se utilizó la siguiente fórmula: CaN =

Total – EGTA buffer.

32

RESULTADOS

Optimización de condiciones de transfección:

Debido a que la técnica de vector reportero es muy sensible a los parámetros

utilizados durante los procesos de transfección y estimulación, se procedió a realizar una

caracterización minuciosa de varios parámetros:

a) Determinación de la edad óptima del cultivo primario para obtener la máxima

eficiencia de transfección.

b) Determinación del porcentaje de eficiencia de transfección de miotubos.

c) Determinación del tiempo óptimo de expresión del plasmidio reportero luego de

aplicado el estímulo despolarizante.

d) Determinación de otros parámetros que pueden afectar la eficiencia de detección del

gen reportero.

Como primer parámetro se determinó en qué periodo de crecimiento del cultivo

primario los miotubos son más receptivos al plasmidio reportero, para esto se probaron

cultivos entre 2 a 7 días post-plaqueo. Se transfectó cultivo primario de miotubos

utilizando el vector pGL3 promoter en una relación 1 μg DNA plasmidial/ 3 μl Fugene

(de acuerdo a las recomendaciones del fabricante) y se incubó 16 horas en medio

DMEM-F12 en ausencia de antibióticos y suero. Luego de transcurrido este tiempo se

reemplazó el medio de transfección por medio DMEM-F12 en presencia de antibióticos,

con o sin suero dependiendo del estadío de diferenciación en el que se encontraban. La

actividad luciferasa se ensayó a las 48 horas post-transfección. Los resultados muestran

que las células de cultivo primario son más receptivas a DNA exógeno al segundo y

33

tercer día post-plaqueo, siendo muy baja su transfección después del cuarto día post-

plaqueo, donde ya se detecta la presencia de miotubos diferenciados (Figura 5A).

Para determinar el porcentaje de eficiencia de transfección del cultivo primario, se

transfectó al tercer día post-plaqueo cultivo primario utilizando el vector pN11 que

codifica para la proteína fluorescente verde aumentada (eGFP). Para el recuento de

células transfectadas por campo se utilizó un microscopio de fluorescencia invertido. Para

el recuento total de células presentes por campo se utilizó el lente para contraste de fases.

Se determinó que el porcentaje total de transfección de cultivo primario corresponde al

5% (Figura 5B, 5C).

Se determinó el tiempo óptimo de expresión del plasmidio reportero luego de

aplicado el estímulo despolarizante. Para este objetivo, el cultivo primario se transfectó

según las condiciones determinadas previamente con el vector reportero para NF-κB 6X

y NFAT 15X. Una vez diferenciados los miotubos (séptimo día post-plaqueo), estos

fueron incubados en medio de reposo al menos 30 minutos y posteriormente

despolarizados con una alta concentración de potasio externa en presencia de calcio. Las

células fueron lisadas a las 0, 3, 6, 12 y 24 horas post-estímulo. Los resultados se

resumen en las figuras 5D y 5E obteniéndose las máximas expresiones a las 6 horas post-

estímulo.

Como último punto se evaluaron diversos factores adicionales que podrían afectar

la expresión del gen reportero: osmolaridad del medio de cultivo y de reposo, actividad

espontánea de contracción de miotubos, respuesta de contracción de miotubos frente a

despolarización, número mínimo de estímulos despolarizantes para obtener una respuesta

34

A

B D Figura 5. Optimización de las condiciones de transfección. A) Se transfectó cultivo primario de miotubos utilizando una relación 1 μg DNA pGL3 promoter/ 3 μl Fugene durante 16 horas y se ensayó la actividad luciferasa 48 horas post-transfección. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en dos experimentos independientes, expresadas como unidades relativas de luminiscencia (URL). B y C) Se transfectó cultivo primario de miotubos utilizando el vector pN11 que codifica para eGFP (proteína fluorescente verde aumentada). El cultivo fue visualizado al séptimo día post-plaqueo mediante microscopía de fluorescencia y microscopía de luz transmitida. D y E) Se transfectó cultivo primario de miotubos con los vectores reporteros NF-kB 6X y NFAT 15 X respectivamente, los que fueron despolarizados por aumento de potasio externo y su actividad luciferasa fue determinada a las 0, 3, 12 y 24 horas post estimulo. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en dos experimentos independientes, expresadas como las razones del nivel normalizado en células no estimuladas.

C

0 3 6 12 240.0

0.5

1.0

1.5

2.0

horas post estimulo

vece

s de

indu

cció

n

0 3 6 12 240.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

horas post estimulo

vece

s de

indu

cció

n

2 3 4 5 6 70

20000

40000

60000

80000

100000

120000

Día transfección

UR

L

E

35

óptima, entre otros. Se determinó que para el vector reportero NF-κB 6X su actividad es

influenciada por la osmolaridad del medio, por la actividad espontánea de contracción de

miotubos y por la respuesta de contracción de miotubos frente a las despolarizaciones.

Por otra parte, se determinó que en el caso del vector reportero para NFAT su actividad

es influenciada por la actividad espontánea de contracción de miotubos y por la respuesta

de contracción de miotubos frente a los estímulos despolarizantes (resultado no

mostrado).

Activación de vector reportero para NF-κB y NFAT inducida por despolarización

por potasio externo en cultivo primario de miotubos.

Para analizar la transcripción mediada por elementos de respuesta a NF-κB se

utilizó el vector reportero NF-κB 6X el cual contiene 6 secuencias de consenso de unión

de NF-κB río arriba del promotor para pGL3. Por otra parte, para analizar la transcripción

mediada por elementos de respuesta a NFAT se utilizaron dos vectores reporteros, NFAT

3X que posee 3 sitios de unión para NFAT río arriba del promotor mínimo para IL-2 y

NFAT 15X, en el cual se encuentra el promotor para el gen MCIP1 que contiene 15 cajas

de unión para NFAT.

Basándose en los parámetros de transfección previamente determinados, se

transfectaron miotubos utilizando la siguiente relación: 3 μl FuGene: 0,9 μg de vector

reportero: 0,1 μg de pRL-TK. Los miotubos diferenciados (séptimo día post-plaqueo)

fueron incubados en medio de reposo al menos 30 minutos y posteriormente

despolarizados con una alta concentración de potasio externa durante 1 minuto

(despolarización crónica), las células fueron lisadas 6 horas post-estímulo y se determinó

36

su actividad Firefly y Renilla luciferasa. Como control positivo de la inducción de la

actividad NF-κB se estimuló un cultivo primario con H2O2 100 μM (5 minutos), un

conocido activador de NF-κB. Para NFAT se utilizó como control positivo el ionóforo de

calcio A23187 (10 -7 M) y una forma constitutivamente activa de NFATc1.

Los resultados señalan que la despolarización inducida por potasio activa la

transcripción dependiente de NF-κB 1,95 veces sobre el control sin estimular. Al

aumentar el número de estímulos despolarizantes a 3 veces se activa la transcripción

dependiente de NF-κB en 2,74 veces. Al utilizar H2O2 como control positivo de

activación de NF-κB, se obtuvo un incremento de 4,64 veces sobre el control sin

estimular (Figura 6A).

Respecto a la transcripción dependiente de NFAT los resultados señalan que tres

despolarizaciones inducidas por potasio externo activan 1,70 veces al vector reportero

NFAT 3X y una despolarización por potasio externo activa 2,42 veces al vector reportero

NFAT 15X. Utilizando como control positivo al ionóforo de calcio A23187 (10 -7 M) y

una forma constitutivamente activa de NFATc1, se obtuvo 9,41 y 15,02 veces la

activación de la transcripción dependiente de NFAT, respectivamente (Figura 6B).

37

Figura 6. Activación de los vectores reporteros para NF-κB y NFAT inducida por despolarización por potasio externo en cultivo primario de miotubos. A) Cultivos primarios de miotubos fueron co-transfectados con el vector reportero NF-κB 6X y con pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados en presencia de potasio externo (1 o 3 veces) y estimulados en presencia de H2O2 (100 μM) por 5 minutos. Las células fueron lisadas 6 horas post-estímulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. B) Cultivos primarios de miotubos fueron co-transfectados con el vector reportero NFAT 15X o NFAT 3X y pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados en presencia de potasio externo (1 o 3 veces), estimulados en presencia de A23187 (10 -7 M) y transfectados con NFATc1 constitutivamente activo. Las células fueron lisadas 6 horas post estimulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , p < 0,05, p < 0,01 y p < 0,001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por el post test de Bonferroni.

C Despol K+ Despol K+ 3 Despol K+ A23187 Cotranf. NFATc10

1

2

3

10

20

*

***

***

*

NFAT-3XNFAT-15X

vece

s de

indu

cció

n

control Despol K+ 3 Despol K+ H2O2

0

1

2

3

4

5

6

7

***

****

vece

s de

indu

cció

nA

B

38

Activación de vector reportero para NF-κB y NFAT inducida por diversos

protocolos de estimulación eléctrica en cultivo primario de miotubos.

Con el objetivo de determinar la respuesta de los factores de transcripción NF-κB

y NFAT frente a diversos protocolos de estimulación eléctrica (despolarización

fluctuante), células en cultivo primario se transfectaron en las condiciones ya

mencionadas, incubadas en medio de reposo al menos 30 minutos y posteriormente

fueron sometidas a diversos protocolos de estimulación variando la frecuencia y el

número de pulsos aplicados. Las células fueron lisadas 6 horas post-estímulo y

determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa.

Los resultados muestran que en casi todos los protocolos de estimulación

aplicados es posible observar un incremento significativo en la actividad dependiente de

NF-κB a excepción de 1 Hz-400 pulsos. Para una estimulación eléctrica a 10 Hz y 45 Hz

(400 pulsos) es posible observar un incremento de 1,95 y 2,22 veces respecto al control.

Al incrementar el número de pulsos a 1000 es posible observar un aumento en la

actividad del vector reportero de 3,49, 3,92 y 3,64 veces para frecuencias de 1, 10 y 45

Hz, respectivamente. Al comparar los grupos es posible determinar que existe una

diferencia estadística significativa en la activación de NF-κB al incrementar el número de

pulsos (Figura 7A).

Respecto a la activación de la transcripción dependiente de NFAT en todos los

protocolos de estimulación utilizados es posible observar un incremento significativo en

la actividad del vector reportero (tanto para el vector reportero NFAT3X como para

NFAT15X). Se observa un incremento de 3,42, 3,97 y 5,08 veces la actividad del vector

39

reportero NFAT 15X al estimular a frecuencias de 45, 10 y 1 Hz respectivamente (400

pulsos). Al aumentar el número de pulsos a 1000 se observa un incremento en la

activación del vector reportero de 4,05, 4,07 y 6,98 veces a frecuencias de 45, 10 y 1 Hz

respectivamente. Al comparar grupos es posible determinar que existe una diferencia

estadística significativa en la activación de NFAT con el protocolo de 1 Hz-1000 pulsos

respecto al resto de los protocolos aplicados, además se observan tendencias muy

similares al utilizar distintos reporteros (Figura 7B y 7C).

40

Figura 7. Activación de vectores reporteros para NF-κB y NFAT inducida por diversos protocolos de estimulación eléctrica en cultivo primario de miotubos. Cultivos primarios de miotubos fueron co transfectados con el vector reportero NF-κB 6X (A) o NFAT 15X (B) o NFAT 3X(C) y pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados utilizando diversos protocolos de estimulación eléctrica variando la frecuencia (1, 10 y 45 Hz) y el número de pulsos (400 y 1000 pulsos). Las células fueron lisadas 6 horas post-estímulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. Los datos corresponden al promedio + error standard de determinaciones realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p< 0.01 y p< 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por el post-test de Bonferroni. A) &&&, p< 0.001 al comparar los grupos de 400 pulsos versus 1000 pulsos (frecuencias de 45, 10 y 1 Hz). B) &&&, p< 0.001 al comparar 1 Hz-1000 pulsos versus las frecuencias 45 Hz y 10 Hz (400 y 1000 pulsos) y despolarización por potasio.

Control 400 1000 400 1000 400 1000 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

*** *** *** ******

***

45 Hz 10 Hz 1 Hz

&&&

vece

s de

indu

cció

n

Control 400 1000 400 1000 400 10000

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

45 Hz 10 Hz 1 Hz

** ** ** ** **

***

Vece

s de

indu

cció

n

control 45 Hz 10 Hz 1 Hz 45 Hz 10 Hz 1 Hz0

1

2

3

4

5

400 pulsos 1000 pulsos

***

******

***

*

&&&

vece

s de

indu

cció

n

A

B C

41

Participación de señales de calcio rápida y lenta en la transcripción dependiente de

NF-κB : Con el objetivo de determinar la participación de la señales rápida y lenta de

calcio en la activación de los factores de transcripción NF-κB, se transfectó miotubos con

el plasmidio NF-κB 6X, los cuales fueron despolarizados en presencia o ausencia de

ryanodina 50 μM y/o 2APB 50 μM que interfieren con la liberación de calcio mediada

por RyR y la liberación por calcio mediada por IP3R, respectivamente. Las células fueron

lisadas 6 horas post-estímulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa

(Figura 8).

Los resultados muestran que en prácticamente todos los protocolos de

despolarización utilizados, el sistema de liberación de calcio mediado por RyR participa

en la activación de la transcripción dependiente de NF-κB. Se obtienen inhibiciones de

0,44, 0,34, 0,81 y 0,56 veces para protocolos de despolarización por potasio, 45 Hz- 400

pulsos, 45 Hz- 1000 pulsos y 1Hz- 1000 pulsos, respectivamente, en presencia de

ryanodina. De igual forma, el sistema de liberación de calcio mediado por IP3R participa

en la activación de la transcripción dependiente de NF-κB mostrando inhibiciones de

0,61, 0,45, 0,69 y 0,71 veces para protocolos de despolarización por potasio, 45 Hz- 400

pulsos, 45 Hz- 1000 pulsos y 1 Hz- 1000 pulsos, respectivamente en presencia de 2-APB.

Al combinar ambos inhibidores se observan en algunos casos (despolarización por

potasio y 45 Hz- 400 pulsos) una potenciación del efecto indicándonos que ambas vías de

liberación de calcio son independientes entre si, sin embargo en ninguno de los casos se

alcanza una inhibición total de la activación del vector reportero.

42

Control RyA 2-APB Rya + 2-APB0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.2

Despolarizacion K +

**

***

vece

s de

indu

cció

n

Control Rya 2-APB Rya + 2-APB0.0

0.5

1.0

1.5

45 Hz- 400 pulsos

***

*

***

vece

s de

indu

cció

n

control Rya 2-APB 2APB+Rya0.0

0.5

1.0

1.5

45Hz-1000 pulsos

* ***

vece

s de

indu

cció

n

control Rya 2-APB 2APB+Rya0.0

0.5

1.0

1.5

1Hz-1000 pulsos

**** *

vece

s de

indu

cció

n

Figura 8. Participación de las señales de calcio rápida y lenta en la activación de la transcripción dependiente de NF-κB. Cultivos primarios de miotubos fueron co transfectados con el vector reportero NF-κB 6X y pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados utilizando diversos protocolos en presencia o ausencia de ryanodina 50 μM y/o 2-APB 50 μM. Las células fueron lisadas 6 horas post estímulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. A) Despolarización por potasio B) Estimulación eléctrica 45 Hz 400 pulsos C) Estimulación eléctrica 45 Hz 1000 pulsos D) Estimulación eléctrica 1 Hz 1000 pulsos. Los datos corresponden al promedio + error Standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 respectivamente, determinado por t-test de Student.

A B

C D

43

Participación de señales de calcio rápida y lenta en la transcripción dependiente de

NFAT:

Con el objetivo de determinar la participación de la señal rápida y lenta de calcio

en la activación del factor de transcripción NFAT, se transfectaron miotubos con el

plasmidio NFAT 3X o NFAT 15X, los cuales fueron despolarizados en presencia o

ausencia de Ryanodina 50 μM y/o 2APB 50 μM que interfieren con la liberación de

calcio mediada por RyR y la liberación por calcio mediada por IP3R, respectivamente.

Las células fueron lisadas 6 horas post-estímulo y determinada su actividad Firefly y

Renilla luciferasa (Figura 9).

Los resultados muestran que en prácticamente todos los protocolos de

despolarización utilizados, exclusivamente el sistema de liberación de calcio mediado por

RyR participa en la activación de la transcripción dependiente de NFAT mostrando

inhibiciones de 0,09, 0,26, 0,18 y 0,29 veces para protocolos de despolarización por

potasio, 45 Hz- 400 pulsos, 45 Hz- 1000 pulsos y 1Hz- 1000 pulsos, respectivamente, en

presencia de Ryanodina. Al utilizar el vector reportero NFAT 3X se corrobora este

efecto, ya que al despolarizar miotubos utilizando potasio externo en presencia de

ryanodina se observa una inhibición de 0,5 veces. Por otra parte, el sistema de liberación

de calcio mediado por IP3R no participa en la activación de transcripción dependiente de

NFAT, no mostrando efectos significativos al utilizar un inhibidor de la señal lenta.

44

control Rya 2-APB0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1

K+ despol.

***

vece

s de

indu

cció

n

control Rya 2-APB0.0

0.5

1.0

1.5

45Hz-400 pulsos

***

vece

s de

indu

cció

n

control Rya 2-APB0.0

0.5

1.0

1.5

45Hz-1000 pulsos

***

vece

s de

indu

cció

n

control Rya 2-APB0.0

0.5

1.0

1.5

1Hz-1000 pulsos

***

*

vece

s de

indu

cció

n

Control Rya 2-APB0.0

0.5

1.0

1.5

3 x K+ despol.

*

vece

s de

indu

cció

n

Figura 9. Participación de las señales de calcio rápida y lenta en la activación de la transcripción dependiente de NFAT. Cultivos primarios de miotubos fueron co transfectados con el vector reportero NFAT 15X (A a D) o NFAT 3X (E) y pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados utilizando diversos protocolos en presencia o ausencia de ryanodina 50 μM y/o 2-APB 50 μM. Las células fueron lisadas 6 horas post estímulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. A) Despolarización por potasio B) Estimulación eléctrica 45 Hz- 400 pulsos C) Estimulación eléctrica 45 Hz- 1000 pulsos D) Estimulación eléctrica 1 Hz- 1000 pulsos E) Despolarización por potasio (NFAT 3X). Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 respectivamente, determinado por t-test de Student.

A B

C D

E

45

Participación de calcio externo en la activación de la transcripción dependiente de

NF-κB y NFAT en cultivo primario de miotubos

Con el objetivo de determinar la contribución de calcio externo en la activación de

los factores de trascripción NFAT y NF-κB se transfectaron miotubos con los plasmidios

reporteros NF-κB 6X o NFAT 15X, los cuales fueron incubados en medio de reposo con

y sin calcio al menos 30 minutos y posteriormente despolarizados con una alta

concentración de potasio externa sin calcio (despolarización crónica) o sometidos a

diversos protocolos de estimulación eléctrica (despolarización fluctuante). Las células

fueron lisadas 6 horas post-estimulo y determinada su actividad Firefly y Renilla

luciferasa.

Los resultados muestran que el calcio externo no participa en la activación de NF-

κB ya que al despolarizar cultivo en ausencia de calcio no existe una inhibición

significativa de la transcripción dependiente de NF-κB (Figura 10A). Sin embargo, se

determinó que el calcio externo es necesario para la activación de NFAT, ya que al

despolarizar miotubos en ausencia de calcio existe una inhibición significativa de la

transcripción dependiente de NFAT (Figura 10 B).

46

Figura 10. Participación de calcio externo en la activación de la transcripción dependiente de NFAT y de NF-κB en cultivo primario de miotubos. A) Cultivos primarios de miotubos fueron co-transfectados con el vector reportero NF-κB 6X y pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados utilizando diversos protocolos ya sea en presencia o ausencia de calcio extracelular. Las células fueron lisadas 6 horas post estimulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. B) Cultivos primarios de miotubos fueron co-transfectados con el vector reportero NFAT 15X y pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados utilizando diversos protocolos ya sea en presencia o ausencia de calcio extracelular. Las células fueron lisadas 6 horas post estimulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

+ Ca - Ca + Ca - Ca + Ca - Ca + Ca - Ca0

1

2

3

4

5

6

7

control K+ 45 Hz-400 45 Hz-1000

vece

s de

indu

cció

n

+ Ca - Ca + Ca - Ca + Ca - Ca + Ca - Ca0

1

2

3

4

5

6

7

control K+ 45 Hz-400 1 Hz-1000

* *

***

vece

s de

indu

cció

n

A

B

47

Activación de la translocación de NF-κB (p65) y NFAT (NFATc1) al núcleo celular

inducida por despolarización en cultivo primario de miotubos y línea celular C2C12.

De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la técnica de vector reportero la

despolarización induce una activación significativa de la transcripción dependiente de los

factores de transcripción NF-κB y NFAT, hecho que debiese reflejarse como

acumulación en el núcleo de ambos factores luego de aplicados los diversos estímulos

despolarizantes. Basándonos en los antecedentes descritos en la literatura se estudiaron

las isoformas NFATc1 y p65 para analizar que sucede con la translocación de NFAT y

NF-κB respectivamente, utilizando la técnica de inmunocitoquímica. Miotubos en cultivo

primario de músculo esquelético de rata y la línea celular C2C12 se sometieron a diversos

protocolos de estimulación eléctrica así como a despolarización por potasio. Para analizar

NFATc1 las células fueron fijadas en metanol a los 0, 1, 5, 15, 30, 45 y 60 minutos luego

de aplicado el estimulo despolarizante y para analizar p65 las células fueron fijadas en

metanol a los 0, 30, 60, 90, 120 y 240 minutos luego de aplicado el estímulo

despolarizante. Como controles positivos de translocación se utilizó la estimulación con

H2O2 (100 μM) para p65 y el ionóforo de calcio A23187 (10 -7 M) para NFATc1.

Las imágenes obtenidas mediante microscopia confocal (Figura 11) indican que

existe una leve translocación de p65 en cultivo primario de miotubos, la cual es máxima

a los 90 min al estimular eléctricamente a 45 Hz-1000 pulsos. Respecto a NFAT se

obtiene un resultado muy similar donde es posible observar una leve translocación de

NFATc1 la cual es máxima a los 5 minutos después de despolarizar con potasio y

máxima a los 15 minutos al estimular eléctricamente a 45 Hz-1000 pulsos. El control

48

positivo utilizado (A23187) indica que es posible obtener una translocación total de

NFATc1 al núcleo celular mediante esta metodología. Es conveniente mencionar en base

a los resultados obtenidos, que si bien es posible observar una leve translocación de

NFATc1 y p65 al núcleo celular, no es posible cuantificar esta translocación y menos aún

en presencia de inhibidores de señales rápida y lenta, descartándola como técnica para

analizar la contribución de señal rápida y señal lenta en la actividad NFAT y NF-κB.

49

Figura 11. Activación de la translocación de NF-κB (p65) y NFAT (NFATc1) al núcleo celular inducida por despolarización en cultivo primario de miotubos y línea celular C2C12. A) Análisis por inmunofluorescencia de p65 en cultivos primarios de miotubos de rata 90 minutos después de la estimulación eléctrica de 45 Hz 1000 pulsos. Las células se fijaron en metanol y fueron incubadas con el anticuerpo anti-p65 (1:100) y anti LAP-2. Posteriormente se realizó la incubación con un anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado a rodamina (1:200) y anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado a FITC(1:200). B) Análisis por inmunofluorescencia de NFATc1 en celulas C2C12: 0, 5, 15 y 30 minutos después de despolarización por potasio, estimulación eléctrica 45 Hz 1000 pulsos y tratamiento con A23187 (10 -7 M) respectivamente. Las células se fijaron en metanol y fueron incubadas con el anticuerpo anti-NFATc1 (1:100). Posteriormente se realizó la incubación con un anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado a rodamina (1:200). Para la captura de imágenes se utilizó un microscopio confocal Carl Zeiss, con un modulo de escáner LSM5 PASCAL. El análisis de las imágenes se realizó en el programa Image J.

control 45 Hz- 1000

p65

LAP2

fusión

control Depol K+

45 Hz 1000 A23187

NAFTc1

NAFTc1

A

B

50

Estandarización de fraccionamiento subcelular en C2C12

Como alternativa a la técnica de inmunocitoquímica se optó por separar

citoplasma de núcleos de miotubos previamente sometidos a estimulación, y realizar

Western blots para NFATc1 y p65 en estas fracciones. Esta aproximación experimental al

estudio de translocación de NFAT se ha descrito en la literatura en experimentos

equivalentes (Rosenberg et al. 2004).

Para llevar a cabo el fraccionamiento, se utilizaron dos técnicas descritas:

Williams et al. (2004) y de Biswas et al. (2003) respectivamente, con el objetivo de

determinar la más adecuada para células musculares. Se compararon ambos protocolos a

través de análisis por Western blot de LAP-2, proteína de localización perinuclear. Los

resultados muestran que utilizando la técnica descrita por Biswas et al., es posible obtener

fracciones citoplasmáticas libres de contaminación nuclear. También se compararon

ambos protocolos a través de Western blot de IκBβ, una proteína de ubicación

exclusivamente citoplasmática (Biswas et. al. 2003) mostrando que en ambos

procedimientos es posible obtener fracciones nucleares libres de contaminación

citoplasmática (Figura 12). En base a este análisis se optó por el protocolo descrito por

Biswas et al., para realizar el fraccionamiento subcelular.

51

Figura 12. Estandarización de fraccionamiento subcelular en cultivo de C2C12. Western blot de fracciones citoplasmáticas y nucleares de células C2C12 no estimuladas, mediante la metodología descrita por Williams et al., 2004 y por Biswas et al., 2003. LAP 2 corresponde a una proteina de localización perinuclear e IkBβ una proteina de localización citoplasmática. FN corresponde a la fracción nuclear y FC corresponde a la fracción citoplasmática.

Williams et al. Biswas et al. FN FC FN FC

LAP2->

IkBβ−>

NFATc1->

52

Aumento en los niveles nucleares de NF-κB (p65) inducidos por despolarización en

la línea celular C2C12: Se estimularon células C2C12 con los siguientes protocolos:

Despolarización por potasio externo, estimulación eléctrica de 45 Hz-400 pulsos y

estimulación eléctrica de 45 Hz-1000 pulsos. Las fracciones citoplasmáticas y nucleares

fueron obtenidas a 0, 60, 90, 120 y 240 minutos después de aplicado el estímulo

despolarizante. Las fracciones obtenidas fueron analizadas mediante Western blot y las

bandas fueron cuantificadas densitométricamente. Como controles de carga se utilizó

anticuerpo anti-Histona H3 para la fracción nuclear, anticuerpo anti-beta actina para la

fracción citoplasmática o en su defecto se tiñeron las membranas con Coomasie blue.

Los resultados obtenidos (Figura 13) muestran que en ausencia de estímulo gran

parte de p65 tiene ubicación citoplasmática. Al aplicar un estimulo despolarizante se

observa un leve incremento en los niveles de p65 nuclear lo cual nos sugiere

translocación de NF-κB al núcleo, observación que concuerda con los resultados

obtenidos mediante la técnica de Inmunocitoquímica. Respecto a los niveles de p65 que

translocan, sus valores varían levemente de acuerdo al estímulo aplicado, sin embargo no

se observan diferencias en la cinética y tiempos de permanencia de p65 en el núcleo. En

el caso de la despolarización inducida por potasio externo, estimulación eléctrica 45 Hz-

400 pulsos y estimulación eléctrica de 45 Hz-1000 pulsos se observa un nivel máximo en

el núcleo de 2,5, 2,8 y 3,5 veces mayor que el control respectivamente a los 90 minutos

luego de estimuladas las células.

53

0 60 90 120 2400.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5

Despol. K+45 Hz- 400 pulsos45 Hz- 1000 pulsos

* *

**

* *

**

Tiempo (min)

Niv

eles

nuc

lear

esde

p65

Figura 13. Aumento en los niveles nucleares de NF-κB (p65) inducidos por despolarización en la línea celular C2C12: A) Western blots para p65 de fracciones citoplasmáticas y nucleares de células C2C12 obtenidas a diversos tiempos estimuladas por despolarización por potasio 1 minuto, estimulación eléctrica 45 Hz-400 pulsos y estimulación eléctrica 45 Hz-1000 pulsos. B) Análisis densitométrico de Western blot para p65 para las fracciones nucleares obtenidas a los diversos tiempos post estímulo. Los datos corresponden al promedio + error Standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

p65

p65

Fracción C N C N C N C N C N Tiempo (min) 0 60 90 120 240

p65

Despol. K+

45 Hz-400 pulsos

45 Hz-1000 pulsos

A

B

54

Aumento en los niveles nucleares de NFAT (NFATc1) inducidos por despolarización

en la línea celular C2C12: Células C2C12 fueron estimuladas utilizando los siguientes

protocolos: Despolarización por potasio externo, estimulación eléctrica 45 Hz-1000

pulsos y 1 Hz-1000 pulsos. Las fracciones citoplasmáticas y nucleares fueron obtenidas a

0, 5, 15, 30, 45 y 60 minutos después de aplicado el estímulo despolarizante. Las

fracciones obtenidas fueron analizadas mediante Western blot y las bandas fueron

cuantificadas densitométricamente. Como controles de carga se utilizó anticuerpo anti-

Histona H3 para la fracción nuclear, anticuerpo anti-beta actina para la fracción

citoplasmática o en su defecto se tiñeron las membranas con Coomasie blue (Figura 14).

Los resultados obtenidos muestran que en ausencia de estímulo gran parte de

NFATc1 tiene ubicación citoplasmática, sin embargo al aplicar un estímulo

despolarizante se observa un incremento en los niveles de NFATc1 nucleares

sugiriéndonos que una pequeña fracción transloca al núcleo, observación que concuerda

con los resultados obtenidos mediante la técnica de Inmunocitoquímica. Respecto a la

cinética de translocación, los tiempos de permanencia de NFAT en el núcleo celular y la

cantidad de NFATc1 que transloca, sus valores varían de acuerdo al estímulo aplicado.

En el caso de la despolarización inducida por potasio externo se observa una máxima

translocación de 3,56 veces a los 5 minutos luego de estimuladas las células; respecto a la

despolarización inducida por estimulación eléctrica de 45 Hz-1000 pulsos se observa una

máxima translocación de 4,31 veces a los 15 minutos luego de estimuladas las células.

Respecto a la despolarización inducida por estimulación eléctrica de 1 Hz-1000 pulsos, se

observa una máxima translocación de 5,58 veces a los 45 minutos luego de estimuladas

las células.

55

Figura 14. Aumento en los niveles nucleares de NFAT (NFATc1) inducidos por despolarización en la línea celular C2C12. A) Western blots para NFATc1 de fracciones citoplasmáticas y nucleares de células C2C12 obtenidas a diversos tiempos estimuladas por despolarización por potasio por 1 minuto, estimulación eléctrica 45 Hz-1000 pulsos, estimulación eléctrica 1 Hz -1000 pulsos. B) Análisis densitométrico de Western blot para NFATc1 para las fracciones nucleares obtenidas a diversos tiempos. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

Fracción C N C N C N C N C N C N 0 5 15 30 45 60

NFAT

NFAT

NFAT

Despol. K+ 45 Hz- 1000 pulsos

1 Hz- 1000 pulsos

0 5 15 30 45 600

1

2

3

4

5

6

7 Despol. K+45 Hz -1000 pulsos1 Hz - 1000 pulsos***

**

**

Niv

eles

de

NFA

Tc1

nucl

ear

B

A

56

Participación de señales de calcio rápida y lenta en la translocación de NF-κB (p65)

al núcleo celular.

Con el objetivo de determinar la participación de la señal rápida y la señal lenta de

calcio en la translocación del factor de transcripción NF-κB, se obtuvieron fracciones

nucleares de células C2C12 despolarizadas en presencia o ausencia de ryanodina 50 μM

y/o 2APB 50 μM que interfieren con la liberación de calcio mediada por RyR y la

liberación por calcio mediada por IP3R, respectivamente. Previamente, mediante los

ensayos de vector reportero, se determinó que tanto la señal de calcio dependiente de

RyR (señal rápida) como la señal de calcio dependiente de IP3R (señal lenta) participan

en la activación de la transcripción dependiente de NF-κB. Células C2C12 fueron

estimuladas utilizando los siguientes protocolos: Despolarización por potasio externo

(Figura 15), estimulación eléctrica de 45 Hz-400 pulsos (Figura 16) y estimulación

eléctrica de 45 Hz-1000 pulsos (Figura 17). Las fracciones nucleares fueron obtenidas a

0, 60, 90, 120 y 240 minutos después de aplicado el estimulo despolarizante. Las

fracciones obtenidas fueron analizadas mediante Western blot y las bandas cuantificadas

densitométricamente. Como controles de carga se utilizó anticuerpo anti-Histona H3 para

la fracción nuclear.

Los resultados muestran que en los tiempos en los cuales hubo una máxima

translocación del factor de transcripción NF-κB (90 y 120 minutos), se observó una

inhibición significativa de la translocación en presencia de un inhibidor de la señal rápida

(ryanodina 50 μM) así como también en presencia del inhibidor de la señal lenta (2-APB

50 μM) indicandonos participación de ambas señales en la activación de la translocación

de p65 al nucleo celular.

57

Figura 15. Participación de las señales de calcio rápida y lenta en la translocación de p65 al núcleo en miotubos despolarizados por potasio externo .A) Western blots para p65 de fracciones nucleares de células C2C12 obtenidas a diversos tiempos estimuladas por despolarización por potasio en presencia o ausencia de ryanodina (50 μM) o 2-APB (50 μM). B) Análisis densitométrico de Western blot para p65 para las fracciones nucleares obtenidas a diversos tiempos. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

Despol. K+ Tiempo (min) 0 60 90 120 240

Control Ryanodina 2-APB

0 60 90 120 2400

1

2

3ControlRyanodina2-APB

Tiempo (min)

nive

les

nucl

eare

sde

p65

* ** *

A

B

58

Figura 16. Participación de las señales de calcio rápida y lenta en la translocación de p65 al núcleo en miotubos despolarizados por estimulación electrica 45 Hz- 400 pulsos.A) Western blots para p65 de fracciones nucleares de células C2C12 obtenidas a diversos tiempos estimuladas eléctricamente 45 Hz- 400 pulsos en presencia o ausencia de Ryanodina (50 μM) o 2-APB (50 μM). B) Análisis densitométrico de Western blot para p65 para las fracciones nucleares obtenidas a diversos tiempos. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

45 Hz- 400 pulsos Tiempo (min) 0 60 90 120 240

Control Ryanodina 2-APB

0 60 90 120 2400

1

2

3ControlRyanodina2-APB

Tiempo (min)

nive

les

nucl

eare

sde

p65

* ** *

A

B

59

Figura 17. Participación de las señales de calcio rápida y lenta en la activación de la translocación de p65 al núcleo en miotubos despolarizados por estimulación eléctrica de 45 Hz-1000 pulsos.A) Western blots para p65 de fracciones nucleares de células C2C12 obtenidas a diversos tiempos estimuladas eléctricamente con 45 Hz-1000 pulsos en presencia o ausencia de Ryanodina (50 μM) o 2-APB (50 μM). B) Análisis densitométrico de Western blot para p65 para las fracciones nucleares obtenidas a diversos tiempos. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

45 Hz- 1000 pulsos Tiempo (min) 0 60 90 120 240

Control Ryanodina 2-APB

0 60 90 120 2400

1

2

3

4

5

6

ControlRyanodina2-APB

Tiempo (min)

nive

les

nucl

eare

sde

p65

* *

* *

A

B

60

Participación de señales de calcio rápida y lenta en la translocación de NFAT

(NFATc1) al núcleo celular.

Con el objetivo de determinar la participación de la señal rápida y la señal lenta de

calcio en la translocación del factor de trascripción NFATc1, se obtuvieron fracciones

nucleares de células C2C12 despolarizadas en presencia o ausencia de ryanodina 50 μM

y/o 2APB 50 μM. Previamente mediante los ensayos de vector reportero se determinó

que la señal de calcio dependiente de RyR (señal rápida) participa en la activación del

factor de transcripción NFAT no así la señal dependiente de IP3R (señal lenta). Células

C2C12 fueron estimuladas utilizando los siguientes protocolos: Despolarización por

potasio externo (Figura 18), estimulación eléctrica de 45 Hz-1000 pulsos (Figura 19) y

estimulación eléctrica de 1 Hz-1000 pulsos (Figura 20). Las fracciones nucleares fueron

obtenidas a 0, 1, 5, 15, 30, 45 y 60 minutos después de aplicado el estímulo

despolarizante. Las fracciones obtenidas fueron analizadas mediante Western blot y las

bandas cuantificadas densitométricamente. Como controles de carga se utilizó anticuerpo

anti-Histona H3 para la fracción nuclear.

Los resultados muestran que en los tiempos en los cuales hubo una máxima

translocación del factor de transcripción NFATc1, se observó una inhibición significativa

de la translocación en presencia del inhibidor de la señal rápida (ryanodina 50 μM), no

así en presencia del inhibidor de la señal lenta (2-APB 50 μM), indicándonos únicamente

participación de la señal rápida en la activación de la translocación de NFATc1 al núcleo

celular.

61

Figura 18: Participación de las señales de calcio rápida y lenta en la activación de la translocación de NFATc1 en células C2C12 sometidas a despolarización por potasio A) Western blots para NFATc1 de fracciones nucleares de células C2C12 obtenidas a diversos tiempos estimuladas por despolarización por potasio 1 minuto en presencia o ausencia de ryanodina (50 μM) o 2-APB (50 μM). B) Análisis densitométrico de Western blot para NFATc1 para las fracciones nucleares obtenidas a diversos tiempos. Los datos corresponden al promedio + error Standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , P < 0.05, P< 0.01 y P< 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

t(min) 0 1 5 15 30 0 1 5 15 30

NFATc1->

Histona H3->

NFATc1->

Histona H3->

control Ryanodine

t(min) 0 1 5 15 30 0 1 5 15 30

control 2-APB

0 1 5 15 300

1

2

3

4ControlRyA2-APB

**

Time (min)

NFA

Tc1

nucl

ear

B

A

Ryanodina

Tiempo (Min)

62

Figura 19: Participación de las señales de calcio rápida y lenta en la activación de la translocación de NFATc1 en células C2C12 sometidas a despolarización por estimulación eléctrica 45 Hz-1000 pulsos A) Western blots para NFATc1 de fracciones nucleares de células C2C12 obtenidas a diversos tiempos estimuladas eléctricamente 45 Hz – 1000 pulsos en presencia o ausencia de Ryanodina (50 μM) o 2-APB (50 μM). B) Análisis densitométrico de Western blot para NFATc1 para las fracciones nucleares obtenidas a diversos tiempos. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , P < 0.05, P< 0.01 y P< 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

t(min) 0 1 5 15 30 0 1 5 15 30

NFATc1->

Histona H3->

NFATc1->

Histona H3->

control Ryanodine

t(min) 0 1 5 15 30 0 1 5 15 30

control 2-APB

0 1 5 15 300

1

2

3

4

5controlRyA2-APB

**

Time (min)

NFA

Tc1

nucl

ear

B

A Ryanodina

Tiempo (Min)

63

Figura 20: Participación de las señal de calcio rápida y lenta en la activación de la translocación de NFATc1 en células C2C12 sometidas a despolarización por estimulación eléctrica 1 Hz-1000 pulsos. A) Western blots para NFATc1 de fracciones nucleares de células C2C12 obtenidas a diversos tiempos estimuladas eléctricamente 1 Hz -1000 pulsos en presencia o ausencia de ryanodina (50 μM) o 2-APB (50 μM). B) Análisis densitométrico de Western blot para NFATc1 para las fracciones nucleares obtenidas a diversos tiempos. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , P < 0.05, P< 0.01 y P< 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

t(min) 0 15 30 45 60 0 15 30 45 60

NFATc1->

Histona H3->

NFATc1->

Histona H3->

control Ryanodina

t(min) 0 15 30 45 60 0 15 30 45 60

control 2-APB

0 15 30 45 600

1

2

3

4

5

6ControlRyA2-APB

**

time (min)

NFA

Tc1

nucl

ear

B

A

Tiempo (Min)

64

Participación de calcineurina y otras probables cascadas de señalización en la

activación de NF-κB y NFAT en cultivo de miotubos: Con el objetivo de determinar la

participación de Calcineurina y otras cascadas de señalización en la activación de la

transcripción dependiente de NF-κB, se transfectaron miotubos con el plasmidio NF-κB

6X, los cuales fueron despolarizados en presencia o ausencia de los siguientes

inhibidores: CsA, Gö 6976, BIM I, KN93, U0126 y NAC que interfieren con la

activación de las vías de calcineurina, PKC dependientes de calcio, PKCs, CaM quinasa

II y IV , ERKs y especies reactivas de oxígeno (ROS), respectivamente. Las células

fueron lisadas 6 horas post-estímulo y se determinó su actividad Firefly y Renilla

luciferasa (figura 21).

Los resultados muestran que en presencia de los inhibidores CsA, Gö 6976, BIM

I, KN93, U0126 y NAC no es posible observar una inhibición significativa en la

activación de la transcripción dependiente de NF-κB, sin embargo, si es posible observar

una cierta tendencia a la inhibición hecho que es mucho más pronunciado al utilizar CsA,

Go 6976, BIM I y NAC sugiriendonos que las vías calcineurina, PKC y ROS estarían

probablemente activadas río abajo de la generación de señales de calcio y participando en

la activación de NF-κB.

Si bien se reconoce a la fosfatasa calcineurina como única activadora de NFAT,

se realizaron ensayos de vector reportero para NFAT en presencia de ciclosporina A,

inhibidor de la actividad calcineurina. Los resultados muestran que en presencia de CsA

existe una inhibición significativa de la transcripción dependiente de NFAT (Figura 22).

65

0

1

2

3

4SEEstímuloCsA

Despol. K+ 45 Hz-400 45 Hz-1000

Vece

s de

indu

cció

n

Figura 21. Participación de calcineurina y otras probables cascadas de señalización en la activación de NF-κB en cultivo de miotubos. Cultivos primarios de miotubos fueron co transfectados con el vector reportero NF-κB 6X y pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados utilizando diversos protocolos de estimulación en presencia o ausencia de A) ciclosporina A (10 μM), B) Gö6976 (10 μM), c) BIM I (2,5 μM), D) KN93 (10 μM), E) U0126 (10 μM), F) NAC (30 mM). Las células fueron lisadas 6 horas post estímulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , P < 0.05, P< 0.01 y P< 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

0

1

2

3

4SEEstímuloGö 6976

Despol. K+ 45 Hz-400 45 Hz-1000

Vece

s de

indu

cció

n

0

1

2

3

4SEEstímuloBIM I

Despol. K+ 45 Hz-400 45 Hz-1000

vece

s de

indu

cció

n

0

1

2

3

4SEEstímuloKN93

Despol. K+ 45 Hz-400 45 Hz-1000

vece

s de

indu

cció

n

0

1

2

3

4SEEstímuloU0126

Despol. K+ 45 Hz-400 45 Hz-1000

vece

s de

indu

cció

n

0

1

2

3

4SEEstímuloNAC

Despol. K+ 45 Hz-400 45 Hz-1000

vece

s de

indu

cció

n

A B

CD

E F

66

Figura 22.Participación de calcineurina en la activación de la transcripción dependiente de NFAT. Cultivos primarios de miotubos fueron co transfectados con el vector reportero NFAT 15X y pRL-TK. Los miotubos diferenciados fueron despolarizados utilizando diversos protocolos (despolarización por potasio y estimulación eléctrica 45 Hz -1000 pulsos) en presencia o ausencia de ciclosporina A (10 μM). Las células fueron lisadas 6 horas post estímulo y determinada su actividad Firefly y Renilla luciferasa. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , P < 0.05, P< 0.01 y P< 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

0

1

2

3

4

5SEEstímuloCsA

despol. K+ 45 Hz-1000

* *

vece

s de

indu

cció

n

67

Inducción de la degradación de la proteína inhibitoria IkBα frente a diversos

protocolos de despolarización en cultivo primario de miotubos.

Con el objetivo de determinar el mecanismo subyacente a la activación de NF-κB

se decidió analizar si de acuerdo al tipo de protocolo de despolarización utilizado existían

diferencias en los patrones de degradación de las proteínas inhibitorias IκBα o IκBβ,

tanto entre ellas como en sus niveles y cinéticas de degradación. Para este fin, miotubos

en cultivo primario fueron estimulados eléctricamente variando la frecuencia y el número

de pulsos, obteniéndose extractos totales de las células a los 0, 15, 30, 45 y 60 minutos

después de aplicada la despolarización. Los extractos fueron sometidos a Western blot

utilizando los anticuerpos anti-IκBα y anti-IκBβ, y analizadas las bandas

densitométricamente. Para normalizar los controles de carga se utilizó el anticuerpo anti-

β actina o en su defecto se tiñeron las bandas con Coomasie blue.

Los resultados muestran (Fig.23) que en forma independiente al estímulo aplicado

existe únicamente degradación de la proteína inhibitoria IκBα, no así de la proteína

inhibitoria Iκbβ. Al analizar la cinética de degradación de la proteína IκBα esta varía

entre los 30 -60 minutos después de realizada la despolarización. Al graficar los niveles

normalizados de la proteína IκBα se observa que la degradación es mayor a frecuencias

más altas de estimulación, observación que coincide con los resultados obtenidos con la

técnica de vector reportero.

68

Figura 23. Inducción de la degradación de la proteína inhibitoria IkBα frente a diversos protocolos de despolarización en cultivo primario de miotubos. A y B) Western blots para IκBα e IκBβ de fracciones totales de cultivo primario obtenidos a diversos tiempos post estímulo mediante varios protocolos de estimulación eléctrica. C) Análisis densitométrico de Western blot para IκBα para las fracciones totales obtenidas a tiempos en los cuales se detecta la máxima degradación. Los datos corresponden al promedio + error standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , P < 0.05, P< 0.01 y P< 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

control 45 Hz 10 Hz 1 Hz 45 Hz 10 Hz 1 Hz0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.2

400 pulsos 1000 pulsos

***

*

degr

adac

ión

IkB

α

C

69

Determinación del mecanismo de activación de NFAT frente a despolarizaciones en

cultivo primario de miotubos.

NFAT es altamente dependiente del calcio ya que su actividad es regulada por

calcineurina, sin embargo no existen trabajos que hayan relacionado un incremento de

calcio intracelular con la activación de esta fosfatasa. Por lo tanto se analizó si de acuerdo

al tipo de protocolo de despolarización utilizado existían diferencias en los niveles de

actividad de calcineurina. Para este fin, miotubos en cultivo primario fueron

despolarizados por potasio externo o mediante estimulación eléctrica a 45 Hz-400 pulsos,

obteniéndose extractos totales de las células a los 0, 1, 5, 10 y 30 minutos después de

aplicada la despolarización (Figura 24).

Los resultados muestran que después de despolarizados los miotubos existe una

activación transitoria de la actividad de esta fosfatasa, observando una inducción en la

actividad de 2,0 y 3,5 veces a los 1 y 5 minutos después de despolarizados los miotubos

con potasio y con estimulación eléctrica, respectivamente. Estos resultados están de

acuerdo con los resultados obtenidos en las cinéticas de translocación de NFAT, la

activación de calcineurina antecede a la translocación de NFAT.

70

Figura 24. Despolarización por potasio y por estimulación eléctrica (45 Hz 400 pulsos) inducen la activación de calcineurina. Cultivo primario de miotubos fue despolarizado mediante potasio externo (A) o estimulación eléctrica 45 Hz 400 pulsos (B) y determinada su actividad calcineurina a diversos tiempos. Los datos corresponden al promedio + error Standard de medidas realizadas en duplicado en al menos 3 experimentos independientes, expresadas como las fracciones del nivel normalizado en células no estimuladas. *, ** y *** , P < 0.05, P< 0.01 y P< 0.001 respectivamente, determinado por test ANOVA seguido por post test de Bonferroni.

0 0.5 1 5 10 300

1

2

3

4

5

**

**

**

Tiempo (minutos)

activ

idad

cal

cine

urin

a(v

eces

de

activ

acio

n)

0 0.5 1 5 10 300

1

2

3

4

5

***

*

Time (minutes)

Cal

cine

urin

act

ivity

(fold

act

ivat

ion)

B

A

71

Señales de calcio en fibra muscular adulta.

La despolarización de miotubos con una alta concentración de potasio extracelular

o mediante estimulación eléctrica resulta en un aumento bifásico en los niveles de calcio

intracelular en cultivo celular de miotubos. Sin embargo existen muy pocos antecedentes

en la literatura que indiquen que este fenómeno se observe también en fibras musculares

aisladas. Para ello, fibras musculares en cultivo aisladas de ratón fueron cargadas con

Fluo-3 AM (fluoróforo sensible a calcio), y estimulados con diversos protocolos de

estimulación eléctrica variando la frecuencia y el número de pulsos. En la figura 25 se

muestran señales transitorias de calcio obtenidas con los diversos protocolos de

estimulación. Estas señales se asemejan a las descritas previamente por otros autores que

han utilizado métodos similares de estimulación. Durante la estimulación eléctrica las

fibras muestran una señal de calcio rápida que es mediada por la activación del RyR.

Durante la estimulación tetánica (45 Hz y 10 Hz) se observa un plateau de calcio que

depende del tiempo durante el cual se aplica el estímulo. Una vez que el estímulo tetánico

ha finalizado, rápidamente el calcio intracelular vuelve al nivel basal, sin embargo no se

detecta la presencia de alguna otra señal de calcio, como es el caso de la señal lenta. En el

caso de la estimulación a bajas frecuencias es posible observar que después de cada pulso

eléctrico aplicado, los niveles de calcio vuelven a los niveles de reposo, indicándonos la

repolarización de la membrana.

72

Figura 25. Señales de calcio inducidas por diferentes protocolos de estimulación eléctrica en fibras musculares. Los niveles de calcio intracelular se midieron en fibras cargadas con Fluo3 AM por microscopía confocal y sus valores normalizados y corregidos fueron graficados. Las imágenes se adquirieron cada 1 segundo y los protocolos de estimulación eléctrica fueron de A) 400 pulsos de 1ms de duración a 45 Hz. B) 1000 pulsos de 1ms de duración a 45 Hz C) 400 pulsos de 1ms de duración a 10 Hz D) 1000 pulsos de 1ms de duración a 10 Hz E) 400 pulsos de 1ms de duración a 1 Hz.

A B

C D

E

73

Con el fin de corroborar que RyR se encuentra involucrado en la generación de la

señal rápida de calcio, se estimularon fibras eléctricamente a una frecuencia de 45 Hz

1000 pulsos en presencia o ausencia de ryanodina 50 μM, observándose un efecto similar

de inhibición de la liberación de calcio respecto a cultivo primario de miotubos y células

C2C12 (Figura 26).

A pesar de no registrarse la señal de calcio lenta, se realizaron medidas en

presencia del Xestospongina C, un inhibidor de la señal lenta, y no se observa variación

en los niveles de fluorescencia respecto al control.

Figura 26. Señales de calcio inducida por estimulación eléctrica en presencia o ausencia de ryanodina 50 μM y xestospongina C 50 μM. Los niveles de calcio intracelular se midieron en fibras cargadas con Fluo3 AM por microscopia confocal y sus valores normalizados y corregidos fueron graficados. Las imágenes se adquirieron cada 1 segundo y el protocolo de estimulación eléctrica fue de 1000 pulsos de 1ms de duración a 45 Hz.

A B

C

74

Translocación de NFATc1 en fibras lentas sometidas a estimulación eléctrica.

Una vez caracterizadas las señales de calcio presentes en fibra muscular, se

procedió a estimular eléctricamente (45 Hz-1000 pulsos, 10 Hz-1000 pulsos y 1 Hz-1000

pulsos) fibras transducidas con un vector adenoviral que codifica para la proteína

NFATc1-GFP. El análisis por microscopía confocal no evidenció translocación de la

proteína NFATc1-GFP al núcleo celular (Figura 27). Previamente fue descrito que este

sistema requiere estimulación eléctrica constante a frecuencias de 10 Hz (Liu et.al 2001),

por lo cual se procedió a estimular las fibras eléctricamente por 15 minutos a una

frecuencia de 10 Hz. En estas condiciones se corrobora que la translocación de NFAT

comienza a los 10 minutos y es máxima a los 30 minutos (Figura 28A). Al realizar el

mismo ensayo en presencia de ryanodina (inhibidor de la señal rápida de calcio) se

observa una notable inhibición de la translocación de NFATc1 (inhibición en 4 de 8

nucleos, no mostrado) (Figura 28B), la cual no es afectada por inhibidores de la señal

lenta (no mostrado). Estos resultados se encuentran de acuerdo con los obtenidos en

cultivo primario de miotubos y en células C2C12, donde se observó que la translocación

de NFAT es dependiente de la señal rápida de calcio.

75

Figura 27:Efecto de la estimulación eléctrica en fibras musculares que expresan NFATc1-GFP. Fibras musculares fueron transducidas con un vector adenoviral que codifica NFATc1-GFP y sometidas a diversos protocolos de estimulación eléctrica y analizados a diversos tiempos mediante microscopía confocal. (A) 45 Hz 1000 pulsos (B) 10 Hz 1000 pulsos (C) 1 Hz 1000 pulsos. Las flechas blancas indican las posiciones de núcleos de la fibra muscular.

control 15 min 30 min 45 min

A

B

C

76

Figura 28: Translocación de NFATc1-GFP es dependiente de la liberación de calcio por RyR. Fibras musculares fueron transducidas con un vector adenoviral que codifica NFATc1-GFP y sometidas a estimulación eléctrica continua a una frecuencia de 10 Hz en ausencia (A) o presencia de Ryanodina 50 μM (B). Se analizaron las fibras a diversos tiempos mediante microscopía confocal. Las flechas blancas indican las posiciones de núcleos de la fibra muscular.

0 min.

20 min.

30 min.

10 min.

20 min.

30 min.

0 min.

A

B

77

DISCUSIÓN

El músculo esquelético es capaz de responder al ejercicio y a otros estímulos a

través de cambios en la expresión de genes que modifican la masa y el tipo de fibra,

proceso conocido como plasticidad muscular (Pette 1998, Pilegaard et. al. 2000, Meissner

et. al. 2000, Meissner et. al. 2001, Goldspink 2003). Si bien las vías moleculares que

median las adaptaciones del músculo no han sido del todo dilucidadas, numerosos

estudios demuestran que el calcio intracelular participa en la transducción de señales que

relacionan la actividad muscular con las respuestas bioquímicas y la regulación de la

expresión génica. Las propiedades de las señales de calcio como son la frecuencia y

amplitud de las oscilaciones de calcio, la ubicación subcelular de dicha señal o vía de

entrada de calcio, regularían la especificidad de las respuestas (Carrasco et. al. 2004,

Berridge et al. 2003, Dolmetsch et al. 2003, Sakamoto & Goodyear 2002). De esta

manera los diversos patrones de calcio son decodificados para reprogramar determinadas

vías de expresión génica, entre estas, la actividad de factores transcripcionales (Berridge

et al. 2003, Dolmetsch et al. 2003). Nuestro interés se ha enfocado en el estudio de la

activación de los factores de transcripción NF-κB y NFAT por diversas vías de

señalización mediadas por calcio dado que antecedentes de la literatura indican que

cumplen roles fundamentales en procesos de remodelación muscular frente a estímulos

fisiológicos como patológicos. Se ha observado que NF-κB se encuentra involucrado en

la proliferación y diferenciación de miotubos (Baeza-Raja & Muñoz-Canoves 2004, Li &

Schwantz 2001). En músculo adulto la activación de este factor de transcripción puede

ser inducida por extensión mecánica, ejercicio, contracción in vitro, stress mitocondrial y

citoquinas proinflamatorias (Ji et al. 2004, Ho et. al. 2005, Kumar et al. 2003, Biswas et

78

al. 2003, Jackman et. al. 2004, Glass et al. 2005, Li et al. 2000, Langsen et al. 2001).

También se ha observado la participación de este factor de transcripción en eventos de

pérdida de masa muscular, distrofias y atrofias musculares (Monici et al. 2003, Hunter et

al. 2002, Guttridge et al. 2000), y se ha descrito que en ratones transgénicos que expresan

IKKβ en músculo, existe una sostenida actividad de NF-κB lo que deriva en una gran

pérdida de masa muscular (Cai et al. 2004). Por otra parte se ha descrito la participación

de diversas isoformas de NFAT en diferentes estadios de la transición mioblasto a

miotubo maduro (Abbott et al.1998, Horsley et al. 2004). En músculo adulto la activación

de este factor de transcripción puede ser inducida por estimulación eléctrica, ejercicio,

contracción in vitro (Liu et al. 2001, Mc Cullagh et al. 2004, Kubis et al. 2002, Tothova

et al. 2006, Rauch & Loughna 2004). También se ha observado la participación de este

factor de transcripción en eventos de remodelación de fibra e hipertrofia muscular (Liu et

al. 2001, Chin et al. 1998, Semsarian et al. 1999, Glass et al. 2003), y se ha descrito que

en ratones knock out para el gen de calcineurina hay una reducción en el número de

fibras lentas (Chin et al. 1998).

En una primera aproximación para estudiar ambos factores transcripcionales de

una manera cuantitativa y comparativa, se utilizó la técnica de vector reportero. Se

determinó que existe activación de la transcripción dependiente de NF-κB y NFAT al

despolarizar cultivo primario de miotubos ya sea por una alta concentración de potasio

externa (despolarización crónica) como por estimulación eléctrica (despolarización

fluctuante), sin embargo las diferentes magnitudes de activación detectadas en ambos

vectores reporteros revelan sutilezas respecto a los mecanismos dependientes de calcio

que llevan a su activación. Para poder racionalizar los resultados obtenidos es necesario

79

analizar en detalle los mecanismos mediante los cuales se generan estas fluctuaciones de

calcio obtenidas con los diversos protocolos de despolarización utilizados.

Nuestro laboratorio previamente describió que la despolarización de miotubos de

rata inducida por medio de una alta concentración de potasio extracelular genera una

señal de calcio rápida (transitoria) de unos pocos segundos de duración sensible a

ryanodina que está relacionada con el acoplamiento excitación-contracción. Algunos

segundos más tarde se observa la aparición de una segunda señal de calcio lenta sensible

a inhibidores de la vía del IP3, y se ha propuesto al DHPR que actuando como sensor de

voltaje es responsable de la activación de los mecanismos que conducen al desarrollo de

esta señal (Jaimovich et al. 2000, Estrada et al. 2001, Araya et al. 2003). Ha sido descrito

que la despolarización por potasio, fija el potencial de membrana a valores

despolarizados, y que cuando los canales operados por voltaje como por ejemplo DHPR

son expuestos a potenciales despolarizados por periodos prolongados, inicialmente ocurre

una transición desde una conformación cerrada a una abierta y posteriormente a una

conformación de estado inactivado (Bezanilla et al. 2000, Ríos & Pizarro 1991). En este

estado los canales permanecen en estado no conductor hasta que se recupere el potencial

de reposo. Esta rápida transición de un estado activo a inactivo del DHRP explica una

activación transitoria de PLC para generar IP3 suficiente para promover la apertura de

canales activados por IP3 liberando calcio desde reservorios intracelulares por unos pocos

segundos, que es el tiempo de duración de señal lenta (Figura 1 anexo) (Carrasco et al.

2003).

Por otra parte la utilización de estimulación eléctrica permite aplicar un número

controlado de estímulos a las células que imita en parte a la actividad inducida por la

80

unidad motora. Este hecho induce potenciales de acción que permiten alternar los estados

de conformación de cerrado a activo del DHPR (Eltit et al. 2004). Esto permite activar a

la PLC para generar IP3 de una manera más prolongada, induciendo la liberación de

calcio desde reservorios intracelulares por cuestión de minutos con una cinética distinta a

la señal lenta producida por potasio (Figura 2, anexo). Respecto a las señales de calcio

generadas utilizando diversos protocolos de estimulación eléctrica trabajos anteriores

mostraron que se requiere mas de 200 pulsos (de 1 ms de duración) a una frecuencia

mínima de repetición de estimulo de 10 Hz para obtener señal lenta (Figura 3, anexo)

(Eltit et al 2004). De esta manera se optó por trabajar a frecuencias de 1, 10 y 45 Hz, es

decir, a 1 Hz se obtienen únicamente señales rápidas durante el periodo que dura la

estimulación (Figura 4, anexo) y a frecuencias de 10 y 45 Hz se obtienen tanto señales

rápidas durante el periodo que dura la estimulación como señal lenta de calcio posterior a

la estimulación eléctrica (Figura 3, anexo), ambos eventos son independientes de la

presencia o ausencia de calcio extracelular (Figura 5, anexo). Es necesario indicar que si

bien en la actualidad conocemos la temporalidad de las señales de calcio generadas

(cinéticas), desconocemos la cantidad (magnitud) de calcio liberado durante ambos tipos

de despolarización (por potasio y por estimulación eléctrica), debido a que la técnica

utilizada únicamente permite realizar comparaciones cualitativas respecto a los niveles de

calcio liberados. Por esta razón, gran parte de nuestro análisis se basan únicamente en los

componentes cinéticos de las señales.

De esta manera se despolarizó cultivo primario de músculo esquelético ya sea por

una alta concentración de potasio externo o mediante estimulación eléctrica variando el

número de pulsos (400 y 1000) y la frecuencia (1, 10 y 45 Hz). Posteriormente se

81

determinaron los niveles de activación de los vectores reporteros para NF-κB y NFAT. El

detalle de los resultados fueron expuestos en Resultados pero se pueden resumir de la

siguiente forma: para NF-κB se observa que en casi todos los protocolos utilizados, con

excepción de 1Hz 400 pulsos existe un aumento significativo de la actividad del vector

reportero respecto al control sin estimular (Figuras 6 y 7). No se observan diferencias

significativas al comparar la activación del reportero producto de la despolarización por

potasio versus la activación producto de una estimulación eléctrica mínima (400 pulsos a

1, 10 y 45 Hz) (resultado no mostrado). Al realizar comparaciones entre grupos

estimulados eléctricamente se determinó que existen diferencias significativas al

aumentar el número de pulsos de 400 a 1000, por otra parte al mantener el número de

pulsos constante y variar la frecuencia no existen diferencias significativas (Figura 7).

Una posible interpretación para este resultado puede estar relacionada con el

mecanismo de activación de NF-κB. Se ha descrito que la vía canónica de activación de

este factor de transcripción requiere de la siguiente secuencia: fosforilación y degradación

de la proteína inhibitoria IκBα, translocación del dímero p50-p65 al núcleo donde activa

sus genes blanco, resíntesis de la proteína inhibitoria IκBα y recuperación de NF-κB

desde el núcleo por parte de IκBα (Ghosh & Karin 2002, Tian & Brasier 2004). Se podría

especular que una vez alcanzado un nivel mínimo o basal de calcio (despolarización por

potasio o estimulación eléctrica 400 pulsos), se activan de manera similar todas las vías

dependientes de calcio que llevan a la fosforilación-degradación de IκBα

independientemente de como es generada esa señal de calcio y sus tiempos de duración.

Al incrementar a 1000 el número de pulsos, debiese existir una mayor cantidad de calcio

liberado que exacerbará la respuesta de las vías dependientes de este, traduciéndose en

82

mayores niveles de fosforilación-degradación de IκBα y por tanto mayor cantidad de

translocación de p65. Evidencia experimental que apoya esta conjetura se observa en la

figuras 23 y 13, donde efectivamente se detectan mayores niveles de degradación de la

proteína IκBα y translocación de p65 respectivamente al incrementar el número de

pulsos.

Para estudiar la activación de la transcripción dependiente de NFAT se utilizaron

dos vectores reporteros: NFAT 15X el cual posee el promotor completo de gen MCIP1 y

NFAT 3X el cual posee tres secuencias consenso de union para NFAT clonadas rio arriba

del promotor mínimo para IL-2. La diferencia entre ambos vectores reporteros radica en

que el primero posee sitios naturales de unión para el factor de transcripción NFAT y el

segundo posee sitios óptimos de unión para el factor de transcripción, convirtiéndolos en

excelentes herramientas de comparación para analizar la respuesta transcripcional en

condiciones hipotéticas ideales como reales. Respecto a los resultados obtenidos

utilizando el vector reportero NFAT 15X se observan activaciones significativas respecto

al control en todos los protocolos de despolarización utilizados (Figuras 6 y 7). También

se observan diferencias significativas al comparar la activación del reportero producto de

la despolarización por potasio versus la activación producto de una estimulación eléctrica

a frecuencias de 1 Hz (resultado no mostrado), a diferencia de lo recién expuesto para

NF-κB. Además al comparar grupos se encontraron diferencias significativas al estimular

a baja frecuencia, es decir a frecuencias de 1 Hz se incrementa significativamente la

activación del vector reportero, por otra parte al incrementar el número de pulsos a una

frecuencia constante no existen diferencias significativas entre grupos. Respecto a los

resultados obtenidos utilizando el vector reportero NFAT 3X tambien existen activación

83

significativa respecto al control en todos los protocolos de despolarización utilizados

(figura 7C) observandose una tendencia muy similar respecto al vector reportero NFAT

15X.

Una posible explicación para este fenómeno la podemos encontrar en el

mecanismo de activación de NFAT. Ha sido descrito en la literatura que un aumento de

calcio activa la fosfatasa calcineurina, que tiene como blanco la desfosforilación de

NFAT (Hogan et al 2003). Una vez desfosforilado NFAT transloca al núcleo donde

activa la transcripción de sus genes blanco (Crabtree et al 1999). También se ha descrito

que para una eficiente activación de NFAT se requiere de alzas periódicas de calcio ya

que en el núcleo celular existe un agresivo sistema de quinasas, si los niveles de calcio

caen, NFAT es rápidamente refosforilado lo cual induce su retorno al citoplasma (Hogan

et al. 2003). De esta manera la despolarización a frecuencias de 1 Hz dan el entorno

óptimo de alzas de calcio para una permanencia de NFAT en el núcleo durante mayor

tiempo (Kubis et al 2002). Evidencia experimental que apoya esta conjetura se observa en

la figura 14, donde efectivamente se detectan mayores tiempos de permanencia de

NFTAc1 en el núcleo celular al estimular a frecuencia de 1 Hz. Esta observación también

fue previamente descrita por Kubis et al. en un sistema análogo de cultivo de músculo de

conejo, encontrando que a frecuencias de 1 Hz existe una notable translocación de

NFATc1 con periodos de permanencia superiores a los 30 minutos (Kubis et al 2002).

También fue descrito por Rosenberg et al (2004), que en línea celular C2C12 la

despolarización por potasio induce la translocación de NFATc1 con tiempos de

permanencia no superiores a los 10 minutos, hecho que apoya la hipótesis de un

84

requerimiento constante en alzas de calcio para mantener a NFATc1 en el núcleo

(Rosenberg et al 2004).

La pregunta de cómo diferentes patrones de calcio son responsables de una

respuesta diferencial en la activación de diversos factores de transcripción, ha sido

estudiada en células Jurkat, utilizando la técnica de fijación de niveles de calcio. Se

describió que NFAT requiere de oscilaciones con periodos menores a los 6 minutos, y

NF-κB siendo menos estricto mostraba requerimientos de calcio a intervalos de 30

minutos, concluyéndose que oscilaciones rápidas activan a ambos factores pero

oscilaciones lentas activan únicamente a NF-κB (Dolmetch et al 1998, Lewis et al 2003).

Por lo tanto estos resultados apoyan nuestras observaciones experimentales, es decir, para

NF-κB se requiere únicamente de un incremento de calcio para activar la cascada de

transducción que llevará a la degradación de IκBα y translocación de p50-p65, su

permanencia en el núcleo será el tiempo que toma a la célula sintetizar nuevamente IκBα.

Por otra parte una vez producido un incremento de calcio que gatilla la translocación de

NFAT, se requerirá de alzas periódicas, en nuestro caso, de al menos 1 minuto para

mantenerlo presente en el núcleo (Tomida et al 2003).

Para estudiar el curso temporal de la activación de los factores de transcripción

frente a los diferentes estímulos, se utilizó inmunocitoquímica y Western blots de

fracciones subcelulares. Para el caso de NF-κB se analizó la translocación de p65 y la

degradación de IκBα. Para NFAT se determinó la translocación de NFATc1 y además la

actividad de calcineurina.

Para NF-κB se observó degradación de la proteína inhibitoria IκBα entre los 30 a

60 minutos después de aplicado el estímulo despolarizante, cuyos mayores niveles de

85

degradación se obtenían al incrementar el numero de pulsos independientemente de la

frecuencia utilizada. Si bien no podemos asegurar con certeza que la degradación de

IκBα es reponsable de la activación del factor transcripcional NF-κB existe una muy

buena correlación en sus cinéticas, detectándose la máxima disminución en sus niveles

entre los 30 a 60 minutos despues de aplicado el estímulo despolarizante. Por otra parte,

se observa una aumento de los niveles nucleares de p65 entre los 90 a 120 minutos

despues de aplicado el estímulo despolarizante, es decir, la degradación de IκBα antecede

la translocación de p65. Posteriormente, al máximo nivel de degradación determinado es

posible observar una resíntesis de esta proteína (Figura 23A). Esta cinética de

degradación y resíntesis de IκBα ha sido observada en muestras de músculos aislados

sometidos a estiramiento mecánico y de músculo de ratas sometidas a entrenamiento

físico (Ho et al 2005). Como se mencionó anteriormente, los niveles de degradación de

IκBα estuvieron acorde a los resultados obtenidos para el vector reportero (Figura 7).

Además se analizó la posible degradación de IκBβ descartándose su participación en los

eventos de respuesta, a diferencia de los observado en células C2C12 sometidas a estrés

mitocondrial (Biswas et al. 2003).

También se determinó que existe un aumento en los niveles de p65 nuclear al

despolarizar línea celular C2C12 y cultivo primario, observándose en todos los casos un

máximo a los 90 minutos después de aplicado el estímulo (Figuras 13 y 11

respectivamente), sin embargo no podemos asegurar con certeza que este aumento en los

niveles nucleares corresponda a la translocación del factor de transcripción, ya que no fue

posible cuantificar la disminución de p65 desde la fracción citoplasmática debido a la

saturación de pixeles. Este resultado también ha sido observado en muestras de músculos

86

de rata sometidos a estiramiento mecánico y ejercicio físico (Ho et al. 2005, Ji et al

2004). Esta secuencia de eventos: degradación de IκBα, translocación de NF-κB,

resíntesis de la proteína IκBα y recaptura de NF-κB por parte de IκBα desde el núcleo ha

sido descrita como un fenómeno denominado “oscilaciones en la señalización de NF-

κB”, fenómeno que tendría participación directa en la activación de un subset específico

de genes únicamente regulando los tiempos de permanencia de NF-κB (Nelson et al.

2004, Hoffmann et al. 2002, Ihekwaba et al. 2004).

Para NFAT ha sido previamente descrito en la literatura que al despolarizar

cultivo de músculo de conejo se observa una notable translocación de NFAT al núcleo

(Kubis et. al 2002), resultado que no fue reproducible en nuestro sistema celular como

cultivo primario de rata o línea C2C12 utilizando la técnica de Inmunocitoquímica, con la

cual solo se observó un leve incremento de la marca nuclear (Figura 11). Efectivamente,

este leve aumento se detecta utilizando la técnica de fraccionamiento subcelular (figura

12), ya que al despolarizar línea C2C12 se observa que únicamente una pequeña fracción

de NFATc1 citoplasmático se desplaza al núcleo, sin embargo nuevamente no podemos

asegurar que haya translocación de NFAT ya que no es posible cuantificar la

concomitante disminución en los niveles citoplasmáticos de NFAT (Figura 14). El

máximo de la hipotética translocación varia según el estímulo utilizado: en el caso de la

despolarización por potasio su máximo se alcanza a los 5 minutos post estímulo, en el

caso de la despolarización por estimulación eléctrica a 45 Hz-1000 pulsos su máximo lo

presenta a los 15 minutos, y en el caso de la despolarización por estimulación eléctrica. a

1 Hz-1000 pulsos presenta su máximo a los 30-45 minutos. Esto nos indica mayores

tiempos de permanencia de NFATc1 en el núcleo celular, hecho que es concordante con

87

los niveles de activación observados para el vector reportero. Evidencia experimental que

apoya la relación entre el tipo de estímulo y temporalidad en la translocación de NFATc1

es obtenida desde ensayos en los cuales se determinó la actividad de la fosfatasa

calcineurina (Figura 24). Se determinó que al despolarizar por potasio cultivo primario de

miotubos, presenta un máximo en su actividad 1 minuto post estímulo y al estimular

eléctricamente se presenta un máximo en la actividad calcineurina a los 5 minutos. En

ambos casos el incremento en la actividad de la fosfata antecede la hipotética

translocación de NFATc1. Queda aún por determinar las contribuciones de los diferentes

pools de calcio en la activación de calcineurina.

Entre los objetivos planteados en esta tesis, está el análisis de la contribución de

las señales de calcio rápida y señal lenta en la activación de ambos factores de

transcripción. Además se incluyó como parámetro adicional analizar si la presencia de

calcio externo contribuye en la activación de ambos factores de transcripción, si bien fue

previamente descrito por nuestro laboratorio que la ausencia de calcio extracelular no

influye en la generación de la señales rápidas y lenta, si se ha descrito en otros sistemas

celulares la importancia de un influjo de calcio para la actividad de algunos factores

transcripcionales (Kumar et al. 2003, Rosenberg et al. 2004). Se trabajó con los siguientes

tipos de estímulos: despolarización por potasio, despolarización por estimulación

eléctrica a 45 Hz, despolarización por estimulación eléctrica a 1 Hz realizando los

análisis mediante la técnica de vector reportero y fraccionamiento subcelular. El detalle

de los resultados ya fue expuesto en Resultados, sin embargo se pueden resumir de la

siguiente manera.

88

En el caso de NF-κB tanto para estimulación por potasio, como para estimulación

eléctrica a alta y baja frecuencia se observó un efecto significativo en la inhibición de la

actividad del vector reportero al despolarizar músculo esquelético en presencia de

ryanodina 50 μM, indicándonos la participación de la señal rápida en la activación de este

factor de transcripción (Figura 8). Al realizar el mismo experimento en presencia de 2-

APB 50 μM también se encontró un efecto significativo en la inhibición de la actividad

del vector reportero, indicándonos que el sistema de liberación por calcio mediado por

IP3R también se encuentra participando, sin embargo mediante la aproximación utilizada

somos incapaces de distinguir respecto a la señal lenta si es el calcio liberado desde

reservorios del retículo sarcoplasmático o el calcio liberado desde reservorios nucleares o

ambos los que contribuyen a la actividad de NF-κB. Al combinar ambos inhibidores se

observa en la mayoría de los casos existe un efecto mayor al que se obtiene al aplicarlos

en forma separada, esta observación nos conduce a la conclusión que son vías

independientes de liberación de calcio (Lilienbaum et al 2003). Sin embargo en ninguno

de los casos se obtiene una inhibición total al combinar inhibidores, sugiriéndonos que

participa algún factor adicional independiente del calcio via RyR e IP3R. También se

analizó la contribución del calcio externo en la activación del factor de transcripción NF-

κB (Figura 10), observándose una tendencia en su participación pero no significativa en

los casos analizados, aunque ha sido reportado que un influjo de calcio es importante en

la activación de NF-κB en fibras musculares sometidas a estiramiento mecánico (Kumar

et al 2003). Estos resultados se apoyaron utilizando fraccionamiento subcelular,

determinándose que en todos los casos analizados ya sea por despolarización por potasio,

como por estimulación eléctrica a alta y baja frecuencia, en presencia de RyR o 2APB

89

hay inhibición en los niveles de p65 nuclear sin afectar su cinética (Figura 15, 16, 17).

Esta observación es concordante con una disminución en los niveles de activación del

vector reportero apoyando la conclusión que tanto la señal rápida como la señal lenta de

calcio se encuentran participando en la activación de NF-κB. Existen pocos antecedentes

en la literatura respecto a la participación de distintos pools de calcio en la activación de

NF-κB en músculo esquelético, sin embargo se ha descrito en neuronas granulares de

cerebelo que la actividad de NF-κB es proporcional a la concentración de calcio

extracelular utilizado, involucrando la actividad de canales tipo L y receptores para IP3

(Lilienbaum et al 2003). Por otra parte se ha descrito que en células hipocampales existe

un requerimiento de calcio extracelular y un incremento local para la activación de NF-

κB (Meffert et al 2003) y que en células pancreáticas beta, la activación de NF-κB

depende del influjo de calcio desde compartimientos extracelulares a través de canales

tipo L (Bernal-Mizrachi et al. 2002).

Para NFAT los resultados obtenidos se pueden resumir de la siguiente forma:

tanto para estimulación por potasio, como para estimulación eléctrica a alta y baja

frecuencia se observó un efecto significativo en la inhibición de la actividad del vector

reportero al despolarizar músculo esquelético en presencia de ryanodina 50 μM,

indicándonos la participación de la señal rápida (Figura 9). Al realizar el mismo

experimento en presencia de 2-APB 50 μM no se encontró efecto, indicándonos que el

sistema de liberación por calcio mediado por IP3R no participa en la activación de este

factor de transcripción. También se analizó la contribución del calcio externo en la

actividad de NFAT observándose participación significativa en todos los casos analizados

(Figura 10) hecho que había sido reportado previamente para células C2C12

90

despolarizadas por potasio (Rosemberg et al 2004). Estos resultados se apoyaron

utilizando fraccionamiento subcelular determinándose que en todos los casos analizado,

ya sea por despolarización por potasio como por estimulación eléctrica a alta y baja

frecuencia, en presencia de RyR hay inhibición en los niveles nucleares de NFATc1 sin

afectar sus cinéticas (Figura 18, 19, 20). Esta observación es concordante con una

disminución en los niveles de activación del vector reportero apoyando la conclusión que

la señal rápida y el influjo de calcio participan en la activación de NFAT. Ha sido

previamente descrito en un modelo de cultivo primario de músculo de conejo (Kubis et

al. 2003), que la estimulación eléctrica a frecuencias de 1 Hz induce la translocación de

NFATc1 por períodos superiores a 30 minutos, y tanto su cinética como la magnitud de la

translocación no son afectadas en presencia de Xestospongina, un inhibidor altamente

especifico de IP3R, apoyando nuestras observaciones, sin embargo en este trabajo no fue

evaluada la participación de calcio liberado a través de RyR en la actividad de NFATc1.

También existen antecedentes contradictorios en literatura en un modelo de fibra de

músculo esquelético de pollo inervado en el que la inhibición de sistema de liberación de

calcio mediado por IP3R1 redujo los niveles de translocación de NFAT así como también

la inhibición de liberación por calcio mediada por RyR1 incrementó la actividad de

NFAT (Jordan et al. 2004, Jordan et al. 2005). Una posible explicación para estos

contradictorios resultados puede ser encontrada en su modelo de trabajo, es decir, fibra

muscular inervada a diferencia de cultivo primario estimulado eléctricamente. Además es

necesario destacar que los agentes inhibidores utilizados como ryanodina o xestospongina

fueron incubados por tres días (a diferencia de nuestros experimentos en los cuales la

incubación se realizó en tiempos no superiores a 1 hora). Además los autores no

91

evaluaron la variación de los niveles intracelulares de calcio durante esos tres días en

presencia de estos inhibidores.

El estudio de la participación de la señal rápida y lenta de calcio en la activación

de NF-κB y NFAT viene a complementar estudios previos realizados en nuestro

laboratorio. Anteriormente se había evaluado la participación de estas señales en la

activación de la vía ERK-CREB así como la expresión de los genes tempranos c-fos y c-

jun, determinándose la exclusiva participación de la señal lenta (Carrasco et al 2003).

Este trabajo ha sido complementado con el estudio de algunas vías de

señalización que debiesen estar involucradas en la activación de NF-κB. Sin embargo

mediante la aproximación realizada no fue posible determinar una participación

significativa de estas vías, observandose únicamente tendencias. Tomando en cuenta

estas tendencias se podría sugerir que tanto calcineurina, PKC y ROS tendrían

participación en las cascadas de eventos que llevan a la activación de NF-κB. Una posible

explicación a este fenómeno puede encontrarse en que el efecto obtenido al inhibir una

sola vía afectaría muy poco, viendose compensada por una vía alternativa. Si este fuese el

caso la solución para reconocer las vías que efectivamente participan en la activación del

factor de transcripción sería utilizar combinación de inhibidores. Por otra parte, es

conveniente mencionar que las vías analizadas son algunas de un universo mayor, por

ejemplo quedarón sin analizar vías como PI3 kinasa.

Previamente ha sido reportado un rol de calcineurina en la activación de NF-κB

en células no excitables así como también en células granulares de cerebelo (Dolmetch et

al. 1998, Lilienbaum et al. 2003). En células C2C12 que expresan calcineurina

constitutivamente activa, existe un importante incremento de la actividad NF-κB la cual

92

decrece en presencia de CsA (Alzuherri et al 2003). Otras importantes vías de

señalización calcio dependientes son las CaMKs II y IV que han sido descritas activadas

por el ejercicio (Rose et al. 2003), sin embargo en nuestro estudio no mostraron

participación al ser inhibidas en presencia de KN93. Respecto a ERKs se observa una

pequeña dependencia de NF-κB en su activación, hecho que había sido previamente

reportado en músculo esquelético y en células β pancreáticas (Ho et al. 2005, Bernal-

Mizrachi 2002).

También se determinó una contribución parcial de PKC para la activación de NF-

κB en todos los protocolos utilizados, hecho que fue previamente descrito para células

neuronales, determinándose que tanto PKC como calcineurina participan conjuntamente

en la activación de IKK (Lilienbaum et al. 2003). El tratamiento de cultivo primario con

NAC, un inhibidor de ROS, redujo considerablemente la activación de NF-κB

indicándonos que existe una generación y participación de especies reactivas de oxígeno

en eventos de despolarización. Se ha determinado en nuestro laboratorio que tanto la

despolarización por potasio como la estimulación eléctrica incrementan los niveles de

ROS (Espinosa et al 2006). En músculo esquelético de ratas sometidas a ejercicio físico

intenso como en músculo de diafragma sometidos a estiramiento mecánico se pudo

inhibir la actividad NF-κB utilizando PDTC y NAC respectivamente (Ji et al. 2004,

Kumar et al. 2003).

Respecto a las vías que participan en la activación de NFAT se conoce como su

único activador a la fosfatasa calcineurina (Crabtree 2002), sin embargo no existen

antecedentes en literatura que correlacionen el aumento de calcio intracelular producto de

la despolarización con un incremento en la actividad de esta fosfatasa. De esta manera se

93

despolarizó cultivo primario y se determinó los niveles de actividad de calcineurina,

determinándose que efectivamente hay un incremento significativo en su actividad con un

máximo a los 1 y 5 minutos de la despolarización por potasio y por estimulación eléctrica

respectivamente, cinética que antecede a la translocación de NFAT (Figura 24).

Desconocemos si este incremento de actividad se genera a nivel citoplasmático y/o a

nivel nuclear, ya que como se ha mencionado anteriormente las señales rápidas son

visualizadas en toda la célula, por lo tanto, podríamos especular que un aumento de calcio

a nivel nuclear ayudaría a calcineurina presente a mantener desfosforilado NFAT y así

prolongar sus periodos de permanencia en el núcleo, especialmente en protocolos de

estimulación de 1 Hz. También se incluyó como control analizar la actividad del

reportero para NFAT en presencia de CsA, comprobándose que efectivamente gran parte

de su inducción post estimulo es mediada por calcineurina (Figura 22). Antecedentes

obtenidos en literatura han mostrado que en células C2C12 sometidas a estiramiento

mecánico en presencia de CsA se observa una inhibición en la expresión del gen MyHC,

efecto que es atribuido en gran parte a las cajas NFAT que posee en su promotor (Rauch

& Loughna 2004).

Si bien el objetivo principal planteado en esta tesis fue determinar como los

factores de transcripción NFAT y NF-κB responden a diferentes señales de calcio en

cultivo primario y línea celular de músculo esquelético, se complementó este estudio con

el análisis de la actividad de NFATc1 frente a protocolos de estimulación similares en

fibra muscular adulta. Este modelo presenta ventajas comparativas frente a cultivo

primario ya que permite analizar en condiciones más fisiológicas que sucede con los

procesos de plasticidad muscular. En una primera aproximación se determinaron los tipos

94

de señales de calcio presente en fibra adultas luego de aplicados diversos protocolos de

estimulación eléctrica (Figura 25). El análisis de datos nos llevó a la conclusión que en

fibra adulta es posible detectar señales del tipo rápidas, sin embargo no fue posible

detectar señales del tipo lenta en mediciones realizadas en zonas nucleares de la fibra. Es

conveniente mencionar que ha sido descrito que en fibra muscular despolarizada por

potasio externo existe un componente de calcio dependiente de IP3R en las cercanías de

la unión neuromuscular (Powell et al. 2003), hecho que no fue evaluado en este estudio y

que podría dar cuenta de la diferencia observada.

También se determinó que las señales rápidas asociadas a la contracción muscular

son dependientes del canal de calcio RyR, hecho que ha sido igualmente descrito para

cultivo primario de músculo (Figura 26). Utilizando un vector adenoviral que codifica

para la proteína de fusión NFATc1-GFP fue posible analizar la respuesta de NFAT frente

a diversos protocolos de estimulación eléctrica. Aplicando 1000 pulsos a 45 Hz, 10 Hz y

1 Hz no fue posible observar la translocación de NFATc1-GFP al núcleo celular (Figura

27). Sin embargo fue previamente descrito que se requiere estimulación continua a 10 Hz

por al menos 20 minutos o trenes de estimulación a 10Hz para visualizar la translocación

de NFATc1 (Liu et. al 2001), lo cual habla de un sistema que requiere de alzas periódicas

de calcio para alcanzar una masa critica en el núcleo (Figura 28). La diferencia observada

en las respuestas de translocación de NFATc1 frente a protocolos de estimulación de 10

Hz y 1 Hz en sistema de fibras versus cultivo primario ha sido discutido por Liu et al.

2005. Según los autores, el cultivo primario de músculo esquelético poseen un desarrollo

incompleto de su estructura sarcomérica, mostrando transitorias de liberación de calcio de

mayor duración respecto a las observadas en fibra adulta, probablemente debido a un

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sistema de recaptura de calcio menos desarrollado respecto a fibras adultas. Este

fenómeno de transitorias de calcio de mayor duración debiesen explicar las diferencias

observadas.

Realizando el mismo experimento en presencia de ryanodina hay una

considerable disminución en el numero de núcleos en los cuales transloca NFAT, no así

en presencia de Xestospongina. Es conveniente mencionar que la inhibición de la

translocación de NFATc1-GFP en presencia de ryanodina fue parcial, inhibiendose en 4

de 8 núcleos, como lo revela el estudio realizado por microscopía confocal a pesar de no

contar con un marcador nuclear para contabilización total de nucleos (figura 28). Estos

resultados sugieren que similarmente a los que sucede en cultivo primario, la actividad de

NFAT es sensible a la liberación de calcio mediada por RyR.

Los resultados obtenidos en este trabajo aportan nuevos antecedentes que vienen a

complementar estudios realizados por nuestro grupo respecto a como diversas vias de

señalización mediadas por calcio producen activaciones diferenciales en elementos de

respuesta en procesos de remodelación génica (Figura 29).

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Figura 29. Modelo propuesto de las vías involucradas en procesos de remodelación génica en células de músculo esquelético despolarizadas. DHPR, receptor de dihidropiridina; PIP2, fosfatidil inositol 4,5-bifosfato; DAG, diacilglicerol; IP3, inositol 1,4,5 trifosfato; IP3R, receptor de IP3; SR, retículo sarcoplamático; RyR, receptor de ryanodina; CnA, Calcineurina; +1, sitio de inicio de la transcripción (adaptado desde Araya et al. 2003).

97

CONCLUSIÓN

-La despolarización inducida por K+ externo (despolarización crónica) y por estimulación

eléctrica (despolarización fluctuante) activa a los factores de trascripción NF-κB y NFAT

en músculo esquelético.

- El número de pulsos aplicados juega un papel importante en la activación de NF-κB, en

cambio la activación de NFAT es mayor a bajas frecuencias de estimulación (1 Hz), por

lo tanto células de músculo esquelético poseen los mecanismos necesarios para

interpretar diferentes temporalidades en aumentos intracelulares de calcio.

- La activación de NF-κB es dependiente de la señal rápida y de la señal lenta de calcio e

independiente del calcio extracelular, en cambio la activación de NFAT es dependiente

de la señal rápida de calcio y de la presencia de calcio extracelular, e independiente de la

señal lenta de calcio. Por lo tanto células de músculo esquelético son capaces de

discriminar entre distintos pools de calcio.

- Se observa una notable correlación entre la activación de NF-κB y la degradación de

IκBα lo cual no sugiere que la actividad de este factor transcripcional es regulada por la

degradación de la proteína inhibitoria IκBα, no así por la degradación de la proteína

inhibitoria IκBβ, lo que sugiere una activación transitoria de este factor de transcripción.

98

- La despolarización mediada por potasio externo y por estimulación eléctrica inducen la

activación de la fosfatasa calcineurina con diferentes cinéticas, hecho que refleja

diferentes temporalidades en aumentos intracelulares de calcio así como diferentes

cinéticas en la activación de NFAT.

- Calcineurina participa en la activación de NFAT. Por otra parte, calcineurina, PKCs y

ROS muestran una pequeña participación en la activación de NF-κB.

- En fibras musculares la actividad de NFAT es dependiente de señales rápidas de calcio,

similarmente a lo que ocurre en células musculares esqueléticas en cultivo.

99

ANEXO

Figura 1: Señales de calcio rápida y lenta inducidas por despolarización por potasio. Los niveles de calcio

intracelulares se midieron en regiones de interés de miotubos cargados con Fluo 3AM por microscopia de

fluorescencia. La figura muestra δF/F0 para despolarización por potasio (Carrasco et al. 2003).

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