Medios de Cultivo

7/16/2019 Medios de Cultivo

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Medios de cultivo.

Los nutrientes son necesarios para los microorganismos. Un medio de cultivo esun conjunto de nutrientes que crean las condiciones necesarias para que crezcaun microorganismo. Son preparados artificiales que intentan imitar las condicionesambientales presentes en la naturaleza y se presentan en forma de:

Desecados: en forma de polvo, tienen una mayor durabilidad

Hidratados: preparados ya, listos para usar, la vida media de las placas es mascorta.

Tienen 4 componentes:

Agua

Fuente de carbono y energía

Fuente de Nitrógeno, Fósforo y Azufre

Sales minerales.

También pueden llevar algunas otras sustancias como:

Factores de crecimiento.

Agentes tamponantes.

Agentes gelificantes.

Colorantes.

Indicadores de pH.

Indicadores Redox.

Etc.

La función de estos compuestos es porque cada microorganismo crece bajodeterminadas condiciones.

Principales componentes de los medios de cultivo.

Agua

Todos los medios de cultivo tienen agua, se utiliza agua destilada sin Cloro, Calcioo magnesio, estos cationes podrían precipitar con el PO42- de las peptonasdurante la esterilización, limitando la disponibilidad de estos elementos. Esta aguaestá a pH neutro.

Productos orgánicos

Digeridos proteicos o pectonas.

Entre los más comunes están las peptonas, ya que la mayoría de losmicroorganismos no tienen proteasas, y son hidrolizados de proteínas de distintasfuentes, pueden ser de la carne, de la leche (caseína), o de las plantas. Sedegradan mediante ácidos o álcalis, o mediante la hidrólisis enzimática.Dependiendo de la fuente de la proteína, como del mecanismo de hidrólisis,incluso de un lote a otro, obtendremos distintas características:



Digeridos enzimáticos de caseína.

Son aminoácidos libres y pequeños péptidos, ricos en Triptófano, y pobres enCarbohidratos. Son útiles para la fermentación de azúcares. Los más utilizadosson Casitone, Trypticase peptone y Tryptone.

Digeridos enzimáticos de carne.

Son aminoácidos y péptidos similares a los digeridos de caseína, aunque deproporciones más variadas. Los mas utilizados son Bacto peptona, Proteosapeptona y Peptona bacteriológica

Digeridos enzimáticos de plantas.

Proceden de plantas como la soja, son ricos en carbohidratos, proteínas yvitaminas. Los más utilizados son Phytone, Soytone y Soya peptone

Hidrolizados ácidos de caseína.

Aminoácidos libres son pobres en Triptófano y Cisteína porque la hidrólisis ácida

destruye aminoácidos y vitaminas. Se utilizan sobre todo Acidicase y Casaminoacids.

Hidrolizados mixtos.

Se han desarrollado porque dan mejores resultados que las peptonas que usanuna sola fuente.

Biosate: Extracto de levadura y digerido de caseína.

Polypeptone: Digeridos de caseína y carne.

Tryptone: Digeridos de distintas fuentes.

Extractos e infusiones.

Son concentrados de productos hidrosolubles de carne, órganos o tejidos deanimales o vegetales, se obtienen mediante maceración, ebullición, y unaposterior concentración y desecación hasta obtener una pasta o polvo.

Extracto de carne.

Sin carbohidratos fermentables, pero con ácido glicólico y láctico y creatinina quepueden servir como fuentes de Carbono.

Extracto de levadura.

Se pueden obtener mediante autólisis de levadura de panadería, incubando lascélulas a temperatura alta y también por hidrólisis ácida o enzimática. Es rico en

aminoácidos, péptidos, vitaminas hidrosolubles del complejo B y carbohidratos.Extracto de glóbulos rojos.

Aparte de otros nutrientes, suministra los factores X o hemina y los factores V(difosfo - piridín - adenín nucleótido) encargado de la coagulación de la sangre.

Infusiones de hígado, corazón y cerebro.

Ricos en aminoácidos azufrados que reducen el potencial redox.



Extracto de suelo.

Cultivo como la esporulación de microorganismos del suelocomo Azotobacter , Rizhobium,...

Carbohidratos.

Son fuente de carbono y energía, estos compuestos suelen ser glúcidos: Monosacáridos: Glucosa.

Disacáridos: Lactosa.

Polímeros: Almidón.

Hidrolizados: Extracto de malta.

A la hora de esterilizar los carbohidratos, tenemos que tener en cuenta la reacciónde Maillard. Esta reacción tiene lugar por interacción de los aminoácidos ypeptonas con los grupos hidroxilo de los azúcares dando lugar a un marcadooscurecimiento de los medios, en este caso, los carbohidratos se esterilizan por

filtración, y una vez estériles, se adicionan en condiciones asépticas y no por temperatura.

Fluidos corporales.

Se trata de sangre completa, desfibrinada, inmunizada, plasma o suerosanguíneo. La sangre no puede ser esterilizada, debe ser obtenida en condicionesasépticas directamente del animal sano (conejo, rata, caballo, cordero,...). Hay dostipos de medios de cultivo con sangre.

Agar-sangre:

Se adiciona la sangre al medio estéril en sobrefusión (45-50ºC). Es útil para

pruebas de hemólisis (pruebas de patógenos). Agar-chocolate:

Los glóbulos rojos hemolizados, se adiciona la sangre desfibrinada al medio estérila 80ºC, a esta temperatura, se produce la hemólisis y se liberan los factores X y V,es útil para el crecimiento de Neisseria y Haemóphilus.

Otros suplementos.

Otros compuestos utilizados para la elaboración de medios de cultivo, en forma desuplementos son:

Leche descremada (bacterias lácticas).

Zumo de frutas o tomate (bacterias aisladas de vegetales). Suplementos vitamínicos.



Compuestos inorgánicos.

Aquí incluimos el NaCl, que regula la osmolaridad del medio (proporciona unequilibrio osmótico).

También encontramos K, Mg, Fe, Ca, etc.

La fuente de Fósforo, a veces es incorporada como PO42-.La fuente de Azufre como SO42-.

Nitrógeno como NO3-, o como NH4+.

Agentes gelificantes.

Se usan para preparar medios de cultivo sólidos o semisólidos, gracias a estos,los primeros microbiólogos aislaron microorganismos en cultivo puro. Tenemos:

Agar-agar:

Es el más utilizado, es un polímero polisacarídico, se obtiene de algas rojas delgénero Gelidium. Un 70% de agarosa, constituye el agente gelificante y un 30% deagaropectina.

Es insoluble en agua fría pero se disuelve en agua hirviendo, durante elenfriamiento se mantiene líquido entre los 45-50ºC para solidificar a 38-40ºC.Cuando solidifica forma geles transparentes y pocos microorganismos puedendegradarlo. Como inconveniente es caro, pero es el más utilizado. Se usa enalimentación como E-406.

Carragenina:

Se extrae de algas rojas marinas, polímero muy utilizado en alimentos como E-407, es menos usado, solidifica a 50-60ºC y no es útil para la adición de

compuestos en sobrefusión. Gelatina:

Fue el primer agente gelificante usado por R. Koch, procede del colágeno. Este selicua fácilmente por encima de los 28ºC, no se utiliza con frecuencia y también por la por la facilidad de degradación por parte de muchos microorganismos, mediantela actividad proteolítica.

Gel de sílice o silicogel:

De origen inorgánico de silicato Na y K, se emplea al 10%, es raro su empleo por su dificultad de manejo y su elevado coste, su uso está restringido a la elaboraciónde medios definidos para el cultivo de bacterias autótrofas estrictas anaerobias.



Agentes selectivos.

Son compuestos que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, peropermiten el crecimiento de otros, pero solo a una concentración determinada. Losmás utilizados son:

Colorantes (cristal violeta, azul de metileno, verde brillante...).

Bilis o sales biliares.

Laurilsulfato sódico.

NaCl.

Azida sódica, selenito, telurito potásico, cloruro de litio, ...

Antibióticos.

Antifúngicos, que inhiben el crecimiento de los hongos y las levaduras.

El medio de McConkey contiene cristal violeta para inhibir el crecimiento debacterias Gram - y sales biliares para favorecer el crecimiento de lasenterobacterias.

Agentes reductores.

Permiten crear condiciones anaerobias para favorecer el desarrollo de gérmenesmicroaerofílicos o anaerobios, reducen el O2 y lo convierten en H2O. Tenemosagentes reductores como:

Cisteína.

Tioglicolato sódico.

Sulfuro ferroso.

Sulfuro sódico. Ditioteitrol.

Citrato de Titanio (III).

Sistemas de amortiguación del pH.

Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pHdentro de unos rangos óptimos para el crecimiento de los microorganismos. Losmicroorganismos más comunes son los neutrófilos (pH = 7), aquí se empleansales como los fosfatos disódicos o bipotásicos/monopotásicos.

Cuando se requieren pH ácidos, sobre todo para hongos y levaduras, se emplean

tampones a base de citrato, acetato o succinato.Indicadores de pH.

Son colorantes sensibles al cambio de pH y cambian de color según el pH, cadacolorante tiene un rango de pH donde actúa.



Indicadores redox.

Son colorantes sensibles a los cambios de potencial redox del medio, nos informasobre la capacidad de los microorganismos a aceptar o ceder electrones. El azulde metileno, cuando se oxida por completo, llega a 78 y es azul, mientras que sise reduce por completo, tiene un poder redox de -49 y es incoloro.

2.10 Sustancias cromogénicas o fluorogénicas.

Son sustancias que emiten color o fluorescencia al ser hidrolizados y nos informansobre la utilización del sustrato por parte de la bacteria.

Clasificación de los medios de cultivo.

Según su estado físico:

Sólidos: Contienen un solidificante (Agar) a una concentración de 1,5-2%. El Agar nutritivo contiene también 10g de peptona.

Semisólidos: También tienen solidificantes pero en una concentración inferior al

0,5%. Líquidos: Son denominados “caldos”, no llevan agentes gelificantes como el agar;

Ej.: agua de peptona.

Según su composición química:

Medios indefinidos

Son naturales o complejos, son aquellos en los que se desconoce su composiciónprecisa, ya que están preparados con peptonas, extractos de levadura, de carne,agar...; Ej.: Agar nutritivo.

Medios definido.

Son sintéticos, se conoce de forma exacta su composición química tantocualitativa como cuantitativamente. Ej.:

Agua Peptona:

. Peptona: 10 g.

. NaCl: 5g.

. Agua destilada: 1000 ml.

Según su finalidad:

Medios ordinarios o generales: Tiene nutrientes que permiten el crecimiento de

una amplia variedad de microorganismos. Ej.: TSA. Medios de enriquecimiento: Son líquidos, ya que estos favorecen el crecimiento

bacteriano sobre la base de una caracterización física o química de los mismos.Ej.: el Agua de peptona alcalina, con pH básico, permite enriquecer al VibrioCholerae.



Medios diferenciales: En su composición existen algunas sustancias que ponende manifiesto una determinada actividad metabólica de la bacteria. Ej.: Mediopara favorecer la fermentación de la lactosa.

Medios selectivos: Son sólidos, con un a sustancia (selector) que inhibe elcrecimiento de algunos microorganismos pero el no el crecimiento de otro. Ej.:

Medio de McConkey, intervienen sales biliares y selecciona el crecimiento deEnterobacterias a partir de una muestra heterogénea.

Preparación de un medio de cultivo.

Se pueden preparar de distintas maneras:

Estos medios se suministran deshidratados y se hidratan con agua destilada,según el fabricante, después se esterilizan.

fórmula preestablecida. Ej.: Medio YM.

A veces, algunos componentes no soportan la esterilización en autoclave, y hayque adicionarles al medio, una vez en sobrefusión, y se esterilizan por filtración.

Ejemplo práctico: Preparación del medio Agar de Bard Parkes.

50 ml de yema de huevo 1:1

25 ml de yema de huevo

25 ml de suero salino

50ºC

3 ml de telurito potásico al 3,5%.

Conservación Una vez estériles y fríos, los medios se refrigeran a unas temperaturas de unos 4-8ºC para evitar la deshidratación. Evitar la deshidratación es crucial para que loscomponentes no lleguen a alcanzar unas concentraciones demasiado altas y elmedio de cultivo quede inservible, para ello también las placas con el medio decultivo se ponen boca abajo y en bolsas de plástico para evitar la contaminación yevitar en todo lo posible la excesiva evaporación.



Tema 2: Cul t ivo de micro organism os.

Cult ivo de microo rganismos

Introducción.

Una vez que ya tenemos los medios de cultivo preparados, hay que inocularlos, ypara ello se necesita:

Medio de cultivo.

Condiciones óptimas de incubación como temperatura, pH, presión, condicionesatmosféricas (concentración de O2).

Estos medios de cultivo son sólidos (cultivos en reposo), o líquidos (para cultivosen agitación)

Temperatura de incubación.

Según a la temperatura en la que los microorganismos puedan desarrollarse de

manera adecuada, tenemos 5 grupos de microorganismos en función de latemperatura.

Psicrófilos: Crecen bien a 0º C y tienen una temperatura óptima de 15ºC omenos, y la máxima temperatura es de 20ºC. Estos microorganismos viven enhábitats como en el Ártico o el Antártico.

Psicrotolerantes: También llamados Psicrótrofos, toleran bien el frío, crecen a 0ºCy su temperatura óptima es de 20-30ºC, con una máxima de 35ºC.

Mesófilos: Viven en animales de sangre caliente y ambientes acuáticos terrestresde latitudes tropicales, crecen a una temperatura óptima de 20-45ºC, siendo latemperatura mínima de 15-20ºC y la máxima de 45ºC.

Termófilos: Viven en ambientes calientes, como las fuentes termales, etc., crecena una temperatura de 55ºC o más, siendo su temperatura mínima de 45ºC y unóptimo de entre 55-65ºC.

Hipertemófilos: Crecen en ambientes muy calientes, tienen una temperaturaóptima de 80-113ºC.

pH

Cada especie tiene un rango de pH definido para su crecimiento, y un pH óptimopara su crecimiento. Según esto, podemos clasificar a los microorganismos en:

- 5,5.

- 8.

- 11,5.



Presión.

La mayoría de los microorganismos crecen a presión atmosférica, sin embargoexisten microorganismos que viven en las profundidades, donde la presiónaumenta 1 Atm. cada 10 metros, por tanto estos microorganismos que en elmedios haya presión, estos microorganismos son los barófilos. Los barotolerantes

crecen tanto a presión atmosférica como a altas presiones.Condiciones atmosféricas.

Aquí nos referimos a la concentración de Oxígeno, existen microorganismos queviven en O2 y otros que no. En cuanto a sus requerimientos de Oxígeno tenemos:

Aerobios estrictos: Exigen la presencia de Oxígenos para su crecimiento.

Microaerófilos: Son aerobios, pero necesitan una proporción menor de Oxígenoque en el aire (21%), aquí la concentración de Oxígeno es del 2-10%. Esto sedebe a que tienen una capacidad limitada de respiración o bien a que tienenalguna molécula sensible al Oxígeno. Estos microorganismos viven en la

superficie. Anaerobios facultativos: Viven tanto con Oxígeno como sin él, pero crecen

mejor en presencia de oxígeno.

Anaerobios aerotolerantes: No usan el Oxígeno cuando está presente, aunqueviven tanto en presencia como en ausencia de éste. Estos microorganismos sonfermentadores, la diferencia está en que los facultativos si usan el Oxígeno, perolos tolerantes no.

Anaerobios estrictos: No viven en presencia de Oxígeno porque le es tóxico.

Para poner de manifiesto los requerimientos de Oxígeno, se usa un caldo detioglicolato sódico que permite tener condiciones de anoxia y también se añade unpotencial redox.

El cultivo en condiciones de anaerobiosis se consigue:

Siembra en profundidad en placa, aquí se trasfiere 1ml de inóculo a una placa depetri vacía y estéril, a continuación se añade un medio de cultivo con agar fundidoy atemperado. Una vez sólido, se le añade una 2ª capa del medio de cultivo.

Siembra en tubo con medio sólido fundido. Se trasfiere 1ml de inóculo a un tubocon medio fundido y atemperado que previamente a sido hervido para permitir laexpulsión del Oxígeno presente en el medio (cuando se solidifica se le añadevaselina estéril, pero es opcional). Los medios utilizados incluyen algún agente

reductor como la cisteína o el tioglicolato sódico.Siembra en tubo con medio líquido. Aquí el medio se hierve para expulsar elOxígeno, una vez frío, se inocula con 1ml de cultivo y no se agita, se cubre conuna capa de vaselina de 1cm. Esta capa impide la difusión del Oxígeno al medio.

Jarras de anaerobiosis. Sembramos como aerobiosis, son recipientesherméticamente cerrados, donde se colocan los cultivos donde se permite crear en su interior unas condiciones adecuadas. El Oxígeno se transforma en agua, lascondiciones de anaerobiosis se producen por procesos químicos.



Se introduce un sobre comercial con borohidrato sódico y ácido cítrico, con uncatalizador de Paladio. El sobre se abre y se le añaden 10ml de agua destiladaestéril para generar la liberación de CO2 y H2 mediante las siguientes reacciones:

C6H6O7 + 2NaHCO2 Na (C6H5O7) + 3H2O + 3CO2

NaBH4 + 2H2O NaBO2 + 4H2.

El Paladio cataliza la reacción entre el H2 y el O2 presente en la jarra, estareacción produce agua que se condensa en las paredes de la jarra.

Para los anaerobios estrictos, estos se cultivan e incuban en condicionesanaeróbicas, por lo que se incuban en cámaras de anaerobiosis, que permiten elmanejo de estos microorganismos en condiciones de anaerobiosis.

Mantenimiento y con servación.

En cualquier laboratorio es fundamental el mantenimiento y conservación de lascolecciones de microorganismos para investigar, educar, uso industrial...

El mantenimiento se hace para conservar los microorganismos durante cortosperiodos de tiempo, generalmente días. La conservación se usa para conservar estos microorganismos durante largos periodos de tiempo, años. El principalobjetivo de la conservación de las cepas es mantenerlas viables, mantenerlas encultivo puro y evitar que sus caracteres genéticos y fenotípicos cambien, es decir,mantener la cepa lo más próximo posible a su estado original.

Métodos de mantenimiento a corto plazo.

Subcultivo.

Es el más utilizado, consiste en una resiembra periódica del microorganismo cadacierto tiempo en un medio de cultivo adecuado. El intervalo de tiempo depende del

tipo de microorganismo, como de las condiciones externas y del medio utilizado.La resiembra se realiza en un agar inclinado. Los medios utilizados usan agar inclinado, ya que se detectan mejor los contaminantes en medio sólido que enlíquido. Al hacerlo inclinado, tiene por objetivo evitar la desecación rápida delmedio, ya que se evapora menos.

La composición química tiene una composición mínima, son los más adecuadosporque soportan una tasa metabólica menor. Algunas bacterias requieren medioscomplejos para su correcto crecimiento y almacenamiento, por tanto los periodosde conservación son cortos.

El periodo de resiembra es válido para cortos periodos de tiempo, generalmente

15- 20 días, ya que pierden la viabilidad al emitir toxinas producto de su actividadmetabólica residual, a la pérdida de agua, o bien al aumento en la concentraciónde solutos, más de tres meses no se pueden tener así.

La refrigeración está entre los 4-8ºC porque la tasa metabólica disminuye exceptoen pscrofilos, además, así también disminuye la evaporación del agua, evitando elaumento en la concentración de sales y otros componentes.



Bajo aceite de parafina.

Es el método más antiguo aunque todavía se utiliza hoy día, es útil paramicroorganismos que no se pueden conservar por otros métodos como losprotozoos. Aquí el aceite se esteriliza a 130ºC durante 1 o 2 horas, se usa uncultivo en fase logarítmica de crecimiento del microorganismo, y se le añade una

capa de 10mm de aceite de parafina estéril.El aceite impide la difusión del Oxígeno al medio de cultivo, por lo que se evitanlas oxidaciones y reducciones de la tasa de crecimiento. Los tubos se conservanen frío para evitar la evaporación de agua y que haya un acceso excesivo y unadifusión de Oxígeno.

Métodos a largo plazo.

Entre estos métodos está la desecación, que es la eliminación de agua mediantedeshidratación que permite reducir drásticamente el metabolismo. No todos losmicroorganismos sobreviven a estos procesos, salvo sus formas de resistencia, esdecir las esporas.

Desecación sobre tierra.

Es útil para microorganismos productores de esporas. En cuanto a soportes,usamos una mezcla de arena y tierra, aquí se toma una muestra de tierra de jardíny se mezcla con arena. La mezcla se esteriliza a 130ºC durante 2-3 horas 3 vecescon aire caliente, no en autoclave. Una vez estéril, se le añade unas gotas de lasuspensión de esporas y se deja secar a temperatura ambiente, a continuación deconservan a 4ºC.

Para la recuperación del cultivo, tomamos una pequeña cantidad de la fracción detierra y la suspendemos en un medio de cultivo adecuado.

Se pueden usar otros materiales en vez de tierra como el silicogel, bolas deporcelana o incluso vidrio poroso.

Desecación sobre papel.

Método fácil y barato, consiste en usar discos o tiras de papel estériles y acontinuación se le añaden los microorganismos y se seca al vacío. Hay unavariante que consiste en usar gelatina en ves de papel que protege losmicroorganismos de la desecación. Aquí el cultivo se centrifuga, y el pélet semezcla con gelatina nutritiva fundida a 28-30ºC y después se echan las gotas dela mezcla en el papel de filtro y se deja solidificar. Posteriormente se lleva a 10-15ºC a un desecador.

Congelación. Es útil porque deprime el metabolismo al bajar la temperatura hasta el punto decongelación o por debajo se reduce el metabolismo drásticamente hasta casianularlo con Nitrógeno líquido a -192ºC. Pero la congelación acarrea una serie deproblemas como la formación de cristales de hielo, que pueden romper las células.Otro problema es que al eliminar el agua líquida y transformarse en hielo, existeuna concentración de sales que puede ser perjudicial para la célula.



Para solucionar estos problemas se usan agentes crioprotectores(anticongelantes) que son productos que protegen la célula impidiendo el dañocelular durante los procesos de congelación y descongelación. Estas sustanciasson muy solubles y poco tóxicas. Las sustancias que normalmente se usan son:

Penetrantes: entran en el interior celular, glicerol al 25% o dimetilsulfóxido

(DMSO) al 10%. No penetrantes: protegen desde fuera, albúmina de suero, leche descremada al

20%, sacarosa al 12% o dextrano al 10%, además de glucosa, lactosa, manitol,poliglicol, polivinilpirrolidona, ...

En cuanto a la forma de congelar, hay una controversia, ya que algunosrecomiendan una congelación rápida y otros, gradual que consiste en bajar 1ºC/min. Hasta los -20ºC, para luego bajar rápido. Sin embargo la descongelacióndebe ser rápida.

También se puede congelar a una temperatura de -30ºC en congeladoresnormales o bien a -70ºC con nieve carbónica, este el método más utilizado en los

laboratorios para la conservación de microorganismos.La ultracongelación consiste en congelar con nitrógeno líquido a -196ºC, se usapara congelar bacterias, virus y líneas celulares.

Liofilización.

Es el método más empleado para el mantenimiento de colecciones de cultivo. Seha usado para muchas bacterias y virus reteniendo la viabilidad hasta 50 años.Consiste en una congelación y posterior desecación al vacío (el agua sublima abaja presión).

Para evitar los daños del frío, se usan agentes crioprotectores como la leche o la

albúmina. Aquí el cultivo se centrifuga y el sedimento se resuspende en unasolución crioprotectora y se congela con nieve carbónica, a continuación se hacesublimar el agua.

Una vez desecado, la ampolla se cierra a la llama, manteniendo el vacío. Paraevitar su oxidación, se llana de nitrógeno y después se guarda a 4ºC o atemperatura ambiente.

Para recuperar los microorganismos, rompemos la ampolla, adicionamos mediofresco e incubamos los viales a una temperatura adecuada. Para comprobar si lacepa es pura, se siembra o disemina una muestra.

Conservación de los distintos microorganismos.

Algas y cianobacterias:

Subcultivos a temperatura de 10-15ºC

Algunas cianobacterias se pueden conservar bien desecadas ya que presentanakinetos.

Las algas no aguantan bien la desecación ni la liofilización. La congelación es elmejor resultado con Nitrógeno líquido.



Bacterias.

Se han usado todos los métodos conocidos con malos y buenos resultados, elmejor método es la liofilización debido a su facilidad de transporte.

Virus.

Se recomienda para su conservación en mucho tiempo el Nitrógeno líquido. Hongos.

La mayoría se conservan por desecación en suelo ya que tienen formas deresistencia.



Condiciones generales para el cultivo demicroorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una

serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo alpropio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como

mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán

necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar

presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para

las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne,

extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias

para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos

lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar

peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que

la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales,

tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno

presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios

sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos

carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y

sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de

ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos

de ciertos microorganismos.



2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como

albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos

microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión

de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay

también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el

laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal.Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los

microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera

sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor

en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida),

mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de

las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para

un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que preveer el

mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC

proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el

crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz

solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque

los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de

ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo

inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.



7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros

como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores

(hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura

mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de

formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano

normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar

los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente

esterilizante)

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