Mejora genética del girasol

Helianthus annuus L. para la resistencia a Sclerotinia sclerotiorum Lib. de Bary

Mª Ángeles del Castillo Alonso

Avances en Mejora Genética Vegetal Doctorado “Ecosistemas Agrícolas Sostenibles”

Índice Introducción Consecuencias de la podredumbre blanca en el cultivo del girasol

Procesos de resistencia inducidos en la planta por el ataque del hongo Fundamentos de la mejora genética de Helianthus annuus L. para la resistencia a Sclerotinia sclerotiorum Lib. de Bary

Mejora genética clásica Mejora genética moderna Década de los noventa Primera década siglo XXI Año 2012

Híbridos de girasol comercializados actualmente con resistencia parcial a S. sclerotiorum Conclusiones Referencias

Introducción Consecuencias de la podredumbre blanca en el cultivo mundial del girasol El girasol (Helianthus annuus L.) es uno de los cultivos oleaginosos más importantes y por tanto ampliamente cultivado en todo el mundo. La extensión dedicada a este cultivo llega a sobrepasar los 23 millones de hectáreas mundiales (http://www.fao.org/), siendo su producción anual 32 millones de toneladas. El girasol es por tanto, la cuarta fuente mundial de aceites vegetales (http://www.fas.usda.gov/). Su domesticación se originó en el centro-este de Estados Unidos, hace aproximadamente 4000 años (Crites 1993; Harter et al., 2004; Smith y Yarnell, 2009). En un primer momento tenía interés como fuente de semillas comestibles, así como por una variedad de fines no alimentarios (como colorante o fines ceremoniales) (Soleri y Cleveland, 1993). El uso del girasol como cultivo productor de aceite es un desarrollo más reciente que data del siglo XVIII en Europa del Este. A través de los años, la mejora en su cría se dirige al rendimiento en aceite. El germoplasma constituyó la base de la reserva genética de semillas oleaginosas moderna y fue la causa de su retorno a América del Norte, donde la producción comercial comenzó en la segunda mitad del siglo XX. En los últimos años, las líneas de híbridos de semillas oleaginosas han representado entre el 80-85% de la producción de girasol en Estados Unidos, siendo el destino del resto el consumo como fruto seco. El moho blanco provocado por el hongo Sclerotinia sclerotiorum es uno de los patógenos más devastador y cosmopolita de los cultivos que además, persiste durante años en el suelo, lo que hace su tratamiento mucho más complicado. Afecta a más de 400 especies distintas de plantas entre ellas, el girasol. La podredumbre blanca causada por Sclerotinia sclerotiorum provoca limitaciones muy importantes en cuanto al rendimiento del cultivo en las regiones templadas de todo el mundo. Este hongo puede atacar a muchas partes distintas de la planta, siendo las más importantes en cuanto a disminución de producción, la pudrición del tallo y fundamentalmente la pudrición del capítulo (Gulya et al., 1997). Su infección provoca el secado rápido de las hojas y el desarrollo de lesiones en las raíces primarias y en la parte basal del tallo derivando a la muerte pocos días después de la aparición del marchitamiento (Dorrel y Huang, 1978). Las pérdidas de rendimiento están entre un 10 y un 20% aunque pueden llegar incluso al 100% cuando las condiciones climáticas son las óptimas para el desarrollo del hongo patógeno (Sackston, 1992). En Irán, por ejemplo, las infecciones provocadas por S. sclerotiorum se consideran una amenaza potencial para el cultivo de girasol. El control químico es posible pero es muy difícil, debido a la enorme persistencia de este hongo en el suelo, siendo esta medida por lo tanto, no muy viable. El desarrollo de variedades resistentes se convierte así, en un objetivo fundamental. A día de hoy se han conseguido bastantes genotipos de Helianthus annuus L con diferentes grados de resistencia a S. sclerotiorum que se encuentran disponibles en el mercado, pero todavía no hay ninguno con una resistencia total (Davar et al., 2010) (Hahn, 2002) siendo éste un objetivo primordial en el campo de la mejora actual en el cultivo del girasol.

Procesos de resistencia inducidos en la planta por el ataque del hongo Una vez que se ha inducido un contacto entre el huésped y el patógeno, los inductores producidos y liberados por el mismo, inducen las defensas adicionales del huésped. Éstas comprenden desde el refuerzo de las paredes celulares hasta la producción de fitoalexinas y la síntesis de proteínas relacionadas con dicha defensa (Slusarenko et al., 2000). Los genes relacionados con la defensa se activan para la síntesis de gran variedad de proteínas, incluyendo enzimas que controlan el metabolismo secundario, proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) y proteínas reguladoras que controlan la expresión de los genes relacionados con la defensa (Dixon et al., 1994). La respuesta inducida por la planta a las enfermedades se correlaciona perfectamente con la acumulación de proteínas PR. Éstas están relacionadas con la degradación de la pared celular causando la lisis de la célula fúngica. La quitina y el glucano que son oligómeros liberados durante la degradación de la pared celular del hongo, actúan como elicitores que provocan diversos mecanismos de defensa en las plantas (Frindlender et al., 1993). Las proteínas PR se localizan en zonas extracelulares. Cuando los microorganismos patógenos invaden al huésped inicialmente se multiplican en los espacios intercelulares de las células de la planta. Por lo tanto la acumulación de estas proteínas antimicrobianas en el espacio intercelular es imprescindible para inhibir la acción del patógeno. La inducción y la acumulación de proteínas de defensa solubles hace que la planta sea resistente a la invasión de patógenos (Van Loon, 1997) correlacionándose con la defensa dicha invasión en numerosos cultivos tales como: pepino (Rasmussen, 1991), tabaco (Beaudoin-Eagan y Thorpe, 1985) o tomate (Bashan et al., 1985). Fundamentos de la mejora genética de Helianthus annuus L para la resistencia a Sclerotinia sclerotiorum Lib. de Bary

- Mejora genética clásica: Helianthus annuus L. es una especie diploide con un tamaño de genoma estimado de unos 3,6 billones de bp y 17 pares de cromosomas (2n = 34) (Arumuganathan y Earle, 1991). La resistencia según Agrios (1988) es la capacidad de un organismo para excluir o superar, completamente o de manera parcial, el efecto perjudicial de un patógeno. Existen así, dos tipos generales de resistencia a la enfermedad (Plank, 1968): (i) una resistencia completa, condicionada por genes mayores y (ii) una resistencia incompleta, condicionada por genes múltiples, cada uno con un efecto parcial. Una limitación de los genes múltiples de la resistencia, es la falta de durabilidad ya que ésta se puede ver modificada por un cambio en la población del patógeno (Talukder et al, 2004). Debería ser posible extender así, la durabilidad de los principales genes a los múltiples genes (Hittalmani et al, 2000) con el fin de conseguir variedades con resistencia duradera. En definitiva, la resistencia de genes menores o parcial reduce el crecimiento y reproducción del patógeno pero no activan la reacción hipersensible que es indicativa de la incompatibilidad conferida por los genes mayores de resistencia. La resistencia parcial involucra muchos genes, cada uno de ellos individualmente hace una contribución relativamente pequeña a la resistencia global. Dado que la resistencia se puede medir cuantitativamente, estos genes se conocen como

caracteres de resistencia cuantitativos, y los loci genéticos asociados con ellos se llaman loci cuantitativos de resistencia (QTL) (Young, 1996). La herencia cuantitativa a menudo resulta de la segregación de los múltiples factores genéticos, y estos caracteres poligénicos están fuertemente influenciados por las condiciones ambientales (Kearsey y Pooni, 1996). Se han realizado muchos estudios en el girasol para determinar los QTL que determinan otras características agronómicas y de desarrollo muy importantes tales como: días de floración y la respuesta de fotoperíodo (León et al., 2001), embriogénesis somática (Flores Berrios et al., 2000), Phoma macdonaldii (Rachid al-Chaarani et al., 2002; Bert et al., 2004…), mildiu (Plasmopara halstedii) (Rachid al-Chaarani et al., 2002). Aunque se han propuesto a lo largo de los años diferentes procedimientos de control para limitar el daño de Sclerotinia sclerotiorum, la más alentadora es la siembra directa de cultivares genéticamente resistentes que disminuyen el riesgo de epidemias. Actualmente existen muchos programas públicos y privados para la resistencia a la pudrición blanca en todo el mundo. La base de dichos programas está en el uso de infecciones artificiales tanto para evaluar líneas endogámicas e híbridos y seleccionar tanto plantas individuales como familias en generaciones segregantes ya que el ataque de S. sclerotiorum como se acaba de mencionar, está fuertemente relacionado con las condiciones ambientales. Una de las pruebas con S. sclerotiorum que se empleaba en los programas de mejora clásica era la inoculación del patógeno con ascosporas del hongo sobre capítulos secos de girasol para la evaluación la resistencia a la enfermedad en campo. Años más tarde y con el fin de agilizar los procesos de selección, se sugirió la posibilidad de aplicar una prueba con micelio además de con ascosporas ya que la respuesta del capítulo a estas pruebas, se hereda de forma independiente (Castaño, 1992). Si la selección de planta se puede realizar de acuerdo con los resultados a estas dos pruebas, se podían combinar los genes para la resistencia a la pudrición blanca en capítulos. Por desgracia este programa de cría no era muy viable debido al requerimiento de demasiado tiempo ya que dichas pruebas tenían que ser aplicadas individualmente en cada estación experimental, duplicándose el número de años por ciclo de selección. Fue necesario entonces, desarrollar una nueva estrategia que incluyera la selección simultánea de ambas pruebas de resistencia. El primer paso fue obtener una fuente de variabilidad genética del rasgo en estudio, la resistencia a la pudrición blanca. Los criadores de girasol utilizaban una amplia gama de recursos de germoplasma en sus programas de mejora. El tipo más común de población era el cruzamiento endogámico (Fick y Miller, 1997). La población obtenida debía ser caracterizada genéticamente con el fin de determinar los parámetros genéticos que permitían a los mejoradores seleccionar la metodología más eficiente para mejorar las características seleccionadas y desarrollar líneas que combinaran los rasgos deseables. Los estudios preliminares (Castaño et al., 1989) estudiaron la eficiencia de la selección simultánea para la resistencia a varias formas de infecciones por S. sclerotiorum aplicado en la misma estación en diferentes líneas endogámicas. La respuesta de plantas infectadas por una combinación de ambas pruebas aplicados durante la floración y madurez fisiológica, respectivamente, mostraron que no había diferencia entre la aplicación de ambas pruebas de forma simultánea o correlativa.

De todos modos fueron necesarios estudios genéticos para la determinación de la herencia ante esta nueva estrategia de selección a través de combinados de dos pruebas distintas. Para estos estudios se emplearon dos líneas puras, CD y SD, descrita por Castaño et al. (1993), se utilizaron como padres en el estudio. La línea CD fue seleccionada de la línea endogámica USDA HA 89, y la línea de SD fue generado a partir de la variedad híbrida de edad INRA 6501. Estas líneas endogámicas se eligieron de acuerdo a sus diferentes orígenes genéticos y sus diferentes respuestas a S. sclerotiorum en infecciones del capítulo. La línea CD tiene un nivel de resistencia menor que la línea SD (Castaño et al., 1989). Se llegó a la conclusión de que este tipo de estrategia podía resultar ventajosa ya que reduce significativamente el tiempo necesario para la selección de poblaciones con mayor resistencia al ataque de S. sclerotiorum. Se llegó a la conclusión además en varios estudios realizados de estos tests, que el retrocruzamiento entre SD x (CD x SD) producía más cantidad de compuestos fenólicos, dando un mayor nivel de resistencia a S. sclerotiorum. Es desde este momento y hasta la nueva generación de estrategias genéticas en la primera década del siglo XXI, que se emplearon estos tipos de tests para la determinación de genotipos que incorporaban genes de resistencia a la podredumbre blanca.

- Mejora genética moderna: Década de los noventa La cría hasta este momento se basaba en tests de resistencia con infecciones artificiales simulando condiciones “semi-naturales” de ataque. Tal y como se venía haciendo tradicionalmente. Como ya dijimos anteriormente, dichas pruebas, aunque son combinadas entre micelio y ascosporas, acortándose el tiempo requerido, siguen siendo muy costosas y dependientes de las condiciones ambientales. Por lo tanto, surge la hipótesis de que sería muy útil encontrar marcadores de resistencia que hicieran posible reducir el número de pruebas necesarias y aumentar la eficiencia de las llevadas a cabo. En esta década se produce el esplendor de técnicas relacionadas con RFLP’S y marcadores isoenzimáticos que se utilizaron para investigar loci de caracteres cuantitativos involucrados en la resistencia a la extensión del micelio de S. sclerotiorum, tanto en hojas como en capítulos. Se demostró (Mestries E. et al., 1998) que existen cuatro loci de caracteres cuantitativos para la resistencia en hoja y dos para la resistencia en capítulo. Además una de estas zonas parecía participar en la resistencia a ambos tipos de ataque de S. sclerotiorum mientras que las otras parecían específicas de la resistencia sólo de una parte de la planta. El carácter cuantitativo de los loci de forma individual explicaba entre un 9% y un 48% de la variabilidad fenotípica aparecida, por lo que se confirmaba que hay una base poligénica de dichos rasgos cuantitativos. Los loci de rasgos cuantitativos explicaban el 60% de la variación genética para la resistencia de la hoja y 38% para el capítulo. Comprobaron además que caracteres como el peso de la semilla, el contenido en aceite de la misma y la floración de la planta tenían una relación más que directa con la resistencia a S. sclerotiorum puesto que se detectó un grupo de enlace que incluía los loci de los cinco caracteres cuantitativos medidos: dos de resistencia y tres sobre características ajenas a dicha resistencia.

Por lo tanto la hipótesis de una vinculación pleiotrópica puede dar la explicación de la relación existente entre esos caracteres y la resistencia a la podredumbre blanca. Sabiendo que la resistencia a S. sclerotiorum es poligénica y de un genotipo dado, el nivel de resistencia de cada parte de la planta puede ser y es muy diferente (Wendel J., Weeden M., 1989). Es por tanto necesario considerar cada forma de ataque como una enfermedad diferente para mejorar simultáneamente la resistencia de cada parte de la planta a fin de obtener variedades con un nivel satisfactorio de resistencia general. Además, el conocimiento acerca de los marcadores de resistencia a S. sclerotiorum (QTL) comienza a proporcionar información sobre el número de segmentos cromosómicos involucrados en dicha resistencia. Existen dos tipos de resistencia en girasol en función del grado de penetración del patógeno en el huésped: (i) la primera a la penetración del hongo dentro de la planta y la segunda resistencia (ii) a la extensión del micelio por los tejidos de la planta. Basándose en el mapa de ligamiento consensuado desarrollado en 1995 (Gentzbittel L. et al. 1995) se pudieron detectar los QTL asociados con el último tipo de resistencia, en particular en hojas y capítulo, usando isoenzimas y RFLP’s (Mestries E., Gentzbittel L. et al., 1998). El análisis con RFLP’s se basó en la elección de 73 sondas distintas que se utilizaron en la creación del mapa de ligamiento de 1995, tanto por su polimorfismo entre líneas parentales como por su distribución a lo largo del genoma. El procedimiento que se siguió fue la extracción de ADN, su digestión por enzimas de restricción (EcoRI, HindI, BgIII y EcoRV) y por último la hibridación de Southern blot. Se analizaron 82 marcadores que formaron 18 grupos de ligamiento. Se observó que hay una muy alta significación entre los caracteres fecha de floración y peso de la semilla con la reacción a S. sclerotiorum tanto de la hoja como del capítulo.

Tabla 1. Coeficientes de Pearson de correlación fenotípica entre los cinco caracteres cuantitativos observados en la progenie del girasol (GH x PAC2).

En la tabla 2 se muestra que todos los marcadores enumerados son codominantes. Para la reacción al test de resistencia en hoja, el QTL detectado fue ubicado en diferentes grupos de ligamiento dependiendo de la generación. Así en F2 se encuentra en el grupo A, en F3 en los grupos G y P y en la F4 en el grupo I. Dicha variación podría tener relación con la variación ambiental (condiciones climáticas) ya que las tres generaciones se hicieron crecer en tres años diferentes mientras que la prueba del capítulo se realizó en cámara de crecimiento en condiciones estándar. Es por esto que en la reacción en el capítulo hay mucha mejor correspondencia entre generaciones, con los mismos QTLS identificados en los grupos de ligamiento A y M. El alelo favorable fue siempre el paterno PAC2 en contraste con la hoja que en la F2 y F4 es el mismo, pero en la F3 varía siendo el del progenitor materno susceptible. Tabla 2. Localización y efecto del QTL que afecta a los cinco caracteres cuantitativos de la progenie del girasol (GH x PAC2).

En la figura número 1 se muestra el mapa de los grupos de ligamiento con la posición relativa de los QTL detectados. Se puede observar cómo forman grupos QTL relacionados con la resistencia a S. sclerotiorum y QTL relacionados con otros caracteres como el peso de la semilla, el contenido en aceite y la fecha de floración (para el grupo de ligamiento A). Hay que tener en cuenta que el hecho de que el mapa genético empleado incluya muchos marcadores dominantes puede conducir a un resultado impreciso de localización de QTL, tanto en el número de los mismos como en su importancia relativa, especialmente para aquellos con efectos aditivos. Fue de interés por tanto incrementar la densidad del mapa con marcadores codominantes con el fin de mejorar la cobertura del genoma de girasol y así poder detectar con mayor precisión los QTL. De todos modos fueron demostrados 4 QTL para las tres generaciones estudiadas en cuanto a la resistencia de la hoja y del capítulo a S. sclerotiorum. El grupo de ligamiento A comprende una zona implicada en ambos tipos de resistencia. Mientras que hay otras zonas en los grupos G, I y P que parecen ser específicos para la resistencia de una parte concreta de la planta, la hoja siendo un locus en el grupo M específico para el capítulo. Además sólo el 40% de la variación fenotípica para la resistencia se explica por los QTL detectados por lo tanto, casi el 50% de dicha variación es una incógnita a día de hoy. Estos resultados además han informado de la resistencia al mildiu velloso en mijo (Jones ES., Liu CJ. Et al., 1995) y para el rendimiento del grano de maíz (Veldboom LR, Lee M, Woodman WL, 1994). En conclusión diremos que estos estudios de la década de los noventa confirmaron la compleja naturaleza de la resistencia a S. sclerotiorum en girasol e indicaba que la identificación de QTL involucrados en este carácter es posible en genotipos de girasol cultivados hasta ese momento. Se detectaron cinco zonas genómicas implicadas en la resistencia a la extensión del micelio del hongo en los tejidos de las plantas. Algunos se presentan comunes tanto en la hoja como en el capítulo, mientras que otros son específicos para la resistencia en partes concretas de la planta. Este estudio mostraba, en definitiva, que las mediciones de otros caracteres cuantitativos (peso de la semilla, fecha de floración y contenido en aceite) son particularmente importantes con el fin de determinar el QTL para la resistencia a S. sclerotiorum que se podría seleccionar en combinación con otras características agronómicas favorables, consiguiendo variedades comerciales que incorporaran mejoras de resistencia a la vez de mejoras en caracteres muy importantes desde el punto de vista de calidad. Primera década siglo XXI Conforme las técnicas de detección y procesamiento de datos fueron evolucionando, se publicaron sucesivos artículos con nuevas visiones sobre la resistencia a S. sclerotiorum que muestra el girasol. El reciente desarrollo de nuevos marcadores moleculares ha sido un factor importante en el establecimiento de densos mapas moleculares. Las especies con un gran genoma, como es el caso del girasol (2n =34), necesitan técnicas con un gran número de dichos marcadores. Surge la aplicación de AFLP como una técnica poderosa para la identificación genética del girasol. De la misma manera se comienzan a utilizar los SSR como otro marcador cuyos polimorfismos son muy eficaces en la cartografía genética, en estudios evolutivos, huellas dactilares y análisis de pedigrí (Paniego et al., 2002; Tang et al., 2003). Éstas son por tanto herramientas muy eficaces para el estudio de la resistencia a enfermedades genéticamente complejas, como la resistencia parcial que nos ocupa.

Figura 1. Mapa de los grupos de ligamiento para la progenie de girasol (GH x PAC2).

Nos referimos por tanto a un nuevo mapeo de QTL relacionados con dicha resistencia (Davar R, Darvishzadeh R. et al., 2010) en el que se cartografían 7 QTL localizados en 7 grupos de ligamiento que confirman el control poligénico del que se sospechaba en 1995. En este estudio se emplean microsatélites (SSR) y AFLP’s, técnicas mucho más novedosas que las empleadas en la década de los noventa. Se utilizan 116 líneas endogámicas recombinantes organizándose completamente al azar con 6 repeticiones. Se establecen dos candidatos adecuados LG8 y LG16, para poder desarrollar marcadores moleculares para la resistencia a S. sclerotiorum que nos sirvan para una posterior selección asistida por marcadores moleculares (MAS) base de la mejora del girasol para este carácter. La población de RILs fue desarrollado por descendencia de una sola semilla de un cruce entre las líneas parentales de girasol PAC2 y RHA266. RHA266 se obtuvo a partir de un cruce enre Helianthus annuus y Peredovik por el USDA, mientras que PAC2 proviene de un cruce entre H. petiolaris y ‘HA61’ desarrollado por el INRA de Francia (Gentzbittel et al., 1995). Esta población ha sido muy empleada para el análisis genético de rasgos complejos en girasol (Rachid al-Chaarani et al., 2004; 2005; Abou Al Fadil et al., 2007; Darvishzadeh et al., 2007; Poormohammad Kiani et al., 2007; 208;2009). Cada grupo de ligamiento se enumera de acuerdo con el mapa de referencia de girasol actualmente considerado como el más detallado (Tang et al., 2002) tal y como se muestra en la figura número 2. Figura 2. Grupos de ligamiento derivados del cruce entre (cmsHA89) x (H. annuus var. Annuus) mapeo de la población en F3.

Figura 2. Grupos de ligamiento derivados del cruce entre (cmsHA89) x (H. annuus var. Annuus) mapeo de la población en F3. (CONTINUACIÓN). Se presume que corresponden a uno de los 17 cromosomas del genoma haploide del girasol (n=17). El mapa mejorado incluye como ampliación de éste, 157 marcadores nuevos SSR que determinan la resistencia a S. sclerotiorum tal y como se muestra en la figura número 3 incorporando los nuevos QTLs. En la tabla 3 se definen dichos QTLs para la resistencia a S. sclerotiorum. El análisis reveló 7 QTLs localizados en 7 grupos de ligamiento 1, 2, 4, 6, 8, 14 y 17. Todos los QTLs detectados se encuentran en grupos diferentes. La varianza fenotípica explicada por cada QTL varía de un 5% a un 8%. Como muestra el signo del efecto aditivo, la

resistencia parcial a S. sclerotiorum proviene en unos casos el alelo correspondiente a la línea materna (PAC2) y en otros a la línea paterna (RHA266).

Figura 3. Grupos de ligamiento del genoma del girasol presentando los QTLs para la resistencia parcial a Sclerotinia sclerotiorum.

Tabla 3. QTLs que confieren resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en RILs de girasol. Los RILS estudiados tenían una gran variación genética para la resistencia parcial a S. sclerotiorum lo que indica que hay una gran potencial para aumentar la resistencia a dicha enfermedad. La susceptibilidad a la podredumbre muestra un patrón continuo, lo que reafirma la teoría de que esta resistencia está controlada

por un sistema poligénico. Algunos RILS sufrieron una enfermedad menos grave que sus padres, pero otros producen mayor gravedad de la enfermedad que éstos, lo que sugiere que la segregación transgresiva de la resistencia se produjo en este cruzamiento. El signo de los efectos de los genes demostró que ambas líneas parentales contribuyen a la resistencia a este patógeno. Como comentamos en la mejora genética de los noventa Mestries et al., 1998 analizó QTLS asociados a la resistencia en girasol a S. sclerotiorum encontrando una segregación transgresiva para este carácter. Esto sugiere que cada padre posee alelos de resistencia y susceptibilidad para los loci que controlan este carácter. El padre resistente probablemente posee alelos de susceptibilidad para loci implicados en este rasgo, ya que las transgresiones se produjeron hacia una mayor susceptibilidad. Todo esto nos muestra que la selección fenotípica convencional para este carácter es una tarea muy compleja y que por tanto la selección asistida por marcadores (MAS), es una herramienta eficaz en los futuros programas de mejora. Sin embargo, los QTLS y marcadores relacionados deben ser validados antes de su aplicación en MAS. Algunos MAS ya han sido reportados con éxito en programas de mejoramiento de arroz (Cho et al., 1994) utilizando marcadores moleculares para seleccionar para el carácter semienano, o (Wang et al., 2005) que descubrió 3 QTLS con grandes efectos sobre la fertilidad de la espiguilla. Hasta el momento, varios son los estudios que se han realizado ya para QTL que controlan la resistencia parcial del girasol a S. sclerotiorum algunos (Mestries et al., 1998; Bert et al., 2002; Micic et al, 2004; Rönicke et al, 2005). Sin embargo, la falta de marcadores SSR y la nomenclatura común en los mapas de ligamiento hace muy difícil comparar estudios como (Davar R et al., 2010) con otros tales como (Mestries et al., 1998). En definitiva, la selección asistida por marcadores (MAS) para la resistencia a S. sclerotiorum, aún no es posible debido a la falta de marcadores moleculares efectivos. Son necesarios más estudios para desarrollar tales marcadores estrechamente ligados. Mediante el uso de grandes tamaños de población y un mayor número de marcadores, será posible identificar más QTLs que estén estrechamente vinculados, este proceso se denomina “cartografía de alta resolución de los QTLS que puede ser utilizado para desarrollar marcadores fiables para MAS y también para discriminar entre un solo gen o varios genes ligados. LG8 y LG16 son buenos candidatos para los análisis adicionales para el desarrollo de marcadores moleculares para la resistencia a la enfermedad S. sclerotiorum, ya que la resistencia QTL que confiere a S. sclerotiorum ya ha sido identificados en estos dos grupos de vinculación en varios estudios independientes. Año 2012 Debido a la velocidad con que las técnicas y procedimientos evolucionan en mejora genética, es interesante reseñar ciertos trabajos publicados este año que incorporan novedades importantes en cuanto a la resistencia a S. sclerotiorum en girasol, se refiere. Primero es importante destacar el trabajo de Bowers JE. et al., 2012 publicado en abril de 2012 que actualmente se considera como el mapa genético base del girasol. En él se incorporan a dicho mapa 10000 locus nuevos obtenidos mediante el análisis simultáneo de múltiples poblaciones de girasol, empleando como marcadores SNPs. Aunque ya hemos visto que existe una amplia colección de mapas de ligamiento para el girasol desarrollados a partir de diversos marcadores moleculares, incluyendo RFLPs ( Berry et al., 1995; Gentizbittel et al., 1995), ADN amplificado al azar, RAPD (Rieseberg et al. 1993), AFLP (Gedil et al., 2001) y SSR (Heesacker et

al., 2008; Tang et al., 2002; Yu et al. 2003), la densidad de estos mapas es relativamente baja hasta el momento, con un promedio de menos de un marcador por 2 Mb de ADN en los mejores casos, que ha limitado su utilidad para ciertas aplicaciones, entre ellas la mejora contra el ataque a S. sclerotiorum. Teniendo en cuenta por ejemplo que el genoma de Arabidopsis se basó en un mapa genético con una densidad media de un marcador por 151 kb (Kaul et al., 2000), el genoma del arroz con densidades de un marcador por 171 kb (Harushima et al., 1998) o de un marcador por 290 kb en el caso del sorgo (Paterson et al., 2009), un genoma con 3,6 billones de bp (Kane et al., 2011) requeriría un mapa genético que contubiese al menos 10000 loci para acercarse a esas densidades de marcadores. De ahí la importancia del trabajo de Bowers et al. En la tabla número cuatro se pueden observar el número de loci definidos en cada uno de los cromosomas de girasol en cada una de las poblaciones estudiadas en el trabajo. La tasa de error estimada para estos mapas fue mucho menor que el nivel estimado demostrando la alta reproducibilidad de SNP empleados, con los que el total de tasa de error fue aproximadamente de un 1%. Así pues diremos que la disponibilidad de plataformas de alto rendimiento que permite el análisis con SNP hace posible la generación de grandes cantidades de datos en gran parte libre de errores. En el trabajo de Bowers, se pudo generar más de 5 millones de datos moleculares en cuatro poblaciones de mapeo. Una hazaña que hubiera sido imposible de realizar con los enfoques tradicionales de genotipado. Se demuestra el valor de analizar simultáneamente múltiples poblaciones de mapeo que permite la asignación de muchos más marcadores, incluyendo el relleno de lagunas de datos existentes hasta el momento. El resultado es un mapa genético de alta densidad que tiene el valor potencial de facilitar el nuevo montaje del genoma que actualmente está en desarrollo. La disponibilidad de un gran conjunto de SNPa hace posible la caracterización genotípica eficiente y detallada de colecciones de germoplasma, lo que proporciona un medio para evaluar el genoma. Pero los avances no se quedan en el uso de SNPs. Un estudio todavía más reciente del mismo autor (Bowers JE. et al., 2012) de diciembre de 2012, da un paso más allá en la búsqueda de una mayor densidad de marcadores. Si bien el empleo de SNPs es una herramienta que produce datos de muy alta calidad, el requerimiento de la previa identificación de dichos SNPs a través de re-secuenciación de genotipos concretos, limita su utilidad si el objetivo es producir un mapa de alta densidad a partir de una población particular. Es la aparición de métodos de genotipado basado en micro matrices y extracción de información genotípica directamente de la secuencia de datos hace posible y económicamente viable el genotipado de decenas de miles e incluso millones de polimorfismos dentro de un mapeo genético de una población única. En este nuevo trabajo se describe la caracterización genotípica de un subconjunto de la población de mapeo RHA280RHA801, utilizando un chip de genes Affymetrix. Es una población muy caracterizada en el mapeo del girasol. Es una línea endogámica recombinante (RIL) derivada de un cruzamiento entre cultivares de girasol RHA280 y RHA801. Debido a que contiene una fracción sustancial de todos los genes en el genoma de girasol, este mapa también servirá como una valiosa herramienta para la identificación de genes candidatos subyacentes (QTL) que se han ido asignando en otros estudios. Uno de los más recientes relacionados con la identificación de genes candidatos para la resistencia a S. sclerotiorum es el publicado también en el año 2012 (Fusari CM. et al., 2012). En este trabajo se plantea la asociación de mapas (AM) como una opción prometedora para la cartografía de QTLs, ya que detecta relaciones entre

Tabla 4. Resumen del número de loci mapeados en cada población de girasol estudiada.

la variación fenotípica y polimorfismos de genes en los actuales bancos de germoplasma sin el desarrollo del mapeo de poblaciones. Este método consiste en proponer una serie de genes candidatos para la resistencia a S. sclerotiorum en función de los QTLs ya descritos en artículos anteriores. En total se analizaron 94 líneas endogámicas de girasol para la resistencia a este patógeno. Dado que para el ataque de S. sclerotiorum no existen mecanismos biológicos o bioquímicos identificados claramente, fueron seleccionados 43 genes candidatos en base a estudios previos de girasol y Brassica napus infectados con el hongo. Se eligió Brassica napus puesto que es uno de los estudios más complejos que se han realizado hasta el momento mediante el análisis de microarrays en genotipos tanto resistentes como susceptibles a la infección con S. sclerotiorum (Zhao J, Udall JA, et al., 2006). Se encontraron 686 genes expresados después de lainfección en genotipos resistentes y 1586 genes en genotipos susceptibles, respectivamente. Aumentando esta diferencia con el tiempo. Las funciones de estos genes incluyen la síntesis de proteínas relacionadas con la patogénesis, con la explosión oxidativa entre otras. Sin embargo la extrapolación de esta información para el girasol y su uso para evaluar nuevas fuentes de resistencia requiere la identificación de genes ortólogos entre Brassica napus y Helianthus annuus. La asociación de mapas (AM) fue sugerida como una prometedora alternativa vinculada íntimamente con la cartografía clásica con el fin de dilucidad la base genética de los rasgos complejos en el girasol. El principal inconveniente de AM es la posibilidad de obtener falsos positivos debido a que la estructura de la población no está reconocida. Aún así esta herramienta se está empleando con éxito en la cartografía de genes involucrados en varios rasgos en diferentes especies como el tiempo de floración y la tolerancia al aluminio en el maíz o la resistencia al tizón del grano en el trigo o la resistencia la muerte descendente en la lechuga (Breseghello F, Sorrells ME, 2006; Simko I et al., 2009).

Tabla 5. Genes candidatos para la resistencia a S. sclerotiorum: fuentes de selección y características para el mapeo de asociación del genotipo de la población.

Tabla 6. Valores de “P” de la asociación entre el gen candidato y la incidencia de S. sclerotiorum en el girasol. Este enfoque permitió la detección de una asociación significativa, de entre los 43 genes candidatos, del gen HaRIC_B y la incidencia de S. sclerotiorum (P<0,01) lo que representa la reducción de dicha incidencia en un 20% aproximadamente. Estos resultados sugieren por tanto, que dicho gen es un posible candidato a tener muy en cuenta en estudios sucesivos relacionados con programas de mejora del girasol que puedan incorporar genes para el carácter de resistencia a S. sclerotiorum. La AM será de utilidad así, en la disección de otros rasgos complejos del girasol, proporcionando en definitiva, una herramienta muy valiosa para ayudar en el mejoramiento de cultivos en el futuro. Híbridos de girasol comercializados actualmente con resistencia parcial a S. sclerotiorum. Las herramientas de manejo actualmente utilizadas en el cultivo de girasol se basan en una buena elección del cultivar (basado en mejora genética), una fecha de siembra que permita escapar a los momentos más peligrosos y en la aplicación de desecantes para anticipar la cosecha de cultivos infectados. Otras herramientas en estudio pero que requieren desarrollo son el uso de fungicidas o microorganismos biocontroladores de la enfermedad (Escande et al, 2002). La caracterización del comportamiento de los cultivares de girasol frente a la podredumbre en condiciones naturales es dificultosa debido a la alta influencia que

tienen las condiciones meteorológicas sobre la capacidad de este hongo para instalarse y producir la enfermedad. Por lo que el estudio de variedades mejoradas genéticamente parece ser la clave del cultivo de girasol en el futuro. En la tabla 7 aparecen los híbridos de girasol detectados como de alta resistencia a la podredumbre causada por S. sclerotiorum que actualmente se comercializan y que han sido desarrollados en programas de mejora a partir de los estudios genéticos sobre la interacción del girasol y el ataque de este patógeno, realizados en las dos últimas décadas.

HÍBRIDO EMPRESA COMERCIAL ACA 884 ACA

AGROBEL 972 LA TIJERETA MG 50 DOW MORGAN P64A51 PIONEER

ALBISOL 2 RIESTRA CAUQUÉN EL CENCERRO CF 17 ADVANTA

CONSUS 102 CONSUS DEKASOL 3920 MONSANTO

JAGUEL KWS PAIHUEN EL CENCERRO PAN 7001 PANNAR PARAÍSO 20 NIDERA

PROTON ER 301 PRODUSEM SPS 3103 SPS SPS 4530 SPS VDH 481 ADVANTA

Tabla 7. Híbridos de buen comportamiento ante la podredumbre blanca del capítulo por S. sclerotiorum. Caracterización realizada a partir de por lo menos tres ensayos de inoculación asistida con ascosporas. A día de hoy los híbridos disponibles en el mercado son cada vez más resistentes a S. sclerotiorum pero aún así, debido a la enorme influencia de los factores ambientales, y a la dificultad para determinar con exactitud su base genética por tener carácter poligénico, queda mucho camino por recorrer en el campo de la mejora de este cultivo.

Conclusiones El objetivo de este trabajo fue el estudio de la evolución de la mejora genética en el cultivo del girasol para el carácter de resistencia al ataque y proliferación del hongo S. sclerotiorum, desde sus comienzos allá por los años ochenta hasta nuestros días. La importancia de conocer la base genética de los mecanismos de resistencia del girasol frente a este patógeno radica en las importantes pérdidas en la producción que ocasiona anualmente en este cultivo (pudiendo llegar incluso al 100% si las condiciones climáticas son las más adecuadas para esclerotinia). La solución a este problema parece estar en programas de mejora ya que es una infección muy difícil de combatir por otras vías como el tratamiento con productos químicos (debido a su enorme persistencia en el suelo). Aunque también es interesante complementar el uso de variedades mejoradas genéticamente con, por ejemplo, el momento de siembra para evitar que se solapen el estado más vulnerable del cultivo con las mejores condiciones de desarrollo del patógeno. Los estudios preliminares (Castaño et al., 1989) estudiaron la eficiencia de la selección simultánea para la resistencia a varias formas de infecciones por S. sclerotiorum aplicado en la misma estación en diferentes líneas endogámicas. La respuesta de plantas infectadas por una combinación de ambas pruebas aplicadas durante la floración y madurez fisiológica, respectivamente, mostraron que no había diferencia entre la aplicación de ambas pruebas de forma simultánea o correlativa. Esto permitió agilizar las pruebas de resistencia que se venían haciendo hasta el momento para la selección fenotípica de variedades de resistencia por retrocruzamiento. En la década de los noventa se produce el esplendor de técnicas relacionadas con RFLP’S y marcadores isoenzimáticos que se utilizaron para investigar loci de caracteres cuantitativos involucrados en la resistencia a la extensión del micelio de S. sclerotiorum, tanto en hojas como en capítulos. Además, el conocimiento acerca de los marcadores de resistencia a S. sclerotiorum (QTL) comienza a proporcionar información sobre el número de segmentos cromosómicos involucrados en dicha resistencia. En 1995 se elabora el primer mapa de grupos de ligamiento para la resistencia a esclerotinia consensuado a nivel internacional (Gentzbittel L. et al. 1995). Estos estudios con marcadores moleculares, confirmaron la compleja naturaleza de la resistencia a S. sclerotiorum en girasol. Se detectaron cinco zonas genómicas implicadas en la resistencia a la extensión del micelio del hongo en los tejidos de las plantas. El reciente desarrollo de nuevos marcadores moleculares, relacionado con la primera década del s. XXI, ha sido un factor importante en el establecimiento de densos mapas moleculares. Surge la aplicación de AFLP como una técnica poderosa para la identificación genética del girasol. De la misma manera se comienzan a utilizar los SSR como otro marcador cuyos polimorfismos son muy eficaces en la cartografía genética, en estudios evolutivos, huellas dactilares y análisis de pedigrí (Paniego et al., 2002; Tang et al., 2003). Se establecen dos genes candidatos adecuados LG8 y LG16, para poder desarrollar marcadores moleculares para la resistencia a S. sclerotiorum que nos sirvan para una posterior selección asistida por marcadores moleculares (MAS) base de la mejora del girasol para este carácter. En el afán de identificar con cada vez más detalle la base genética de la resistencia a la podredumbre blanca, surgen los últimos trabajos del 2012 enfocados a elaborar mapas de grupo de ligamientos más precisos. Esto es posible gracias al surgimiento de nuevas técnicas genéticas como el uso de SNPs y en última instancia, el empleo de chips de genes, que permiten la

extracción de información genotípica directamente de la secuencia de datos haciendo posible y económicamente viable, el genotipado de decenas de miles e incluso millones de polimorfismos dentro de un mapeo genético de una población única. Por último surge el plantear la asociación de mapas (AM) como una opción prometedora para la cartografía de QTLs, ya que detecta relaciones entre la variación fenotípica y polimorfismos de genes en los actuales bancos de germoplasma sin el desarrollo del mapeo de poblaciones. Esta herramienta se está empleando con éxito en la cartografía de genes involucrados en varios rasgos en diferentes especies. La AM será de utilidad así, en la disección de otros rasgos complejos del girasol, proporcionando en definitiva, una herramienta muy valiosa para ayudar en el mejoramiento de cultivos en el futuro. Es cierto que en estos últimos años la evolución de las tecnologías al alcance de la genética, está dando frutos interesantes con respecto al conocimiento de los mecanismos genéticos involucrados, por lo que es presumible encontrar con cierta prontitud, un mapa genético completo que permita establecer programas de mejora adecuados para la obtención de genotipos 100% resistentes a S. sclerotiorum. Muchos son los trabajos publicados relacionados con la mejora genética del girasol para el ataque de S. sclerotiorum, aunque se han citado una buena cantidad, no están recogidos todos los que son, pero sí se ha intentado mostrar una visión clara de la situación pasada, presente y futura de este campo en la investigación que todavía tiene demasiadas incógnitas por resolver.

Referencias Davar R. et al (2012). Sclerotinia-Induced Accumulation of Protein in the Basal Stem of Resistant and Susceptible Lines of Sunflower. Not Bot Horti Agrobo, 2012, 40(1):119-124. Godoy M. et al (2005). Sclerotinia resistance in sunflower: I. Genotypic variations of hybrids in three environments of Argentina. Euphytica (2005) 145: 147–154. Godoy M. et al (2012). Sclerotinia resistance in sunflower. II. Combining ability and midparent heterosis for reaction to ascospore infections at flowering. Euphytica (2012) 188:299–307. Fusari CM., Di Rienzo JA., et al., (2012). Association mapping in sunflower for sclerotinia head rot resistance. BMC Plant Biology 2012, 12:93. Castaño F., Vear F. et al. (2001). The genetics of resistance in sunflower capitula to Sclerotinia sclerotiorum measured by mycelium infections combined with ascospore tests. Euphytica 122: 373–380, 2001. Mestries E., Gentzbittel L. et al. (1998). Analyses of quantitative trait loci associated with resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflowers (Helianthus annuus L.) using molecular markers. Molecular Breeding 4: 215–226, 1998.

Davar R. et al (2010). QTL mapping of partial resistance to basal stem rot in sunflower using recombinant inbred lines. Phytopathol. Mediterr. (2010) 49, 330-341. Kiani S.P., et al. (2006). Genetic variability for physiological traits under drought conditions and differential expression of water stress-associated genes in sunflower (Helianthus annuus L.). Theor Appl Genet DOI 10.1007/s00122-006-0419-7. Burke JM. Tang S. et al (2002). Genetic Analysis of Sunflower Domestication. Genetics 161: 1257–1267. Bowers JE. et al. (2012). Development of an Ultra-Dense Genetic Map of the Sunflower Genome Based on Single-Feature Polymorphisms. PLoS ONE 7(12): e51360. doi:10.1371. Bowers JE. et al. (2012). Development of a 10,000 Locus Genetic Map of the Sunflower Genome Based on Multiple Crosses. Gene/Genomic/Genetics 10.1534/g3.112.002659.