XXVI REUNIÓN CIENTÍFICA-TECNOLÓGICA,

FORESTAL Y AGROPECUARIA VERACRUZ 2013

V REUNIÓN DE INVESTIGACIÓN AGRÍCOLA, PECUARIA,

FORESTAL Y ACUÍCOLA EN EL TRÓPICO MEXICANO

XLIX REUNIÓN NACIONAL DE INVESTIGACIÓN

PECUARIA

VIII REUNIÓN NACIONAL DE INNOVACIÓN

AGRÍCOLA

VIII REUNIÓN NACIONAL DE INNOVACIÓN

FORESTAL

IV REUNIÓN NACIONAL DE INNOVACIÓN

ACUÍCOLA Y PESQUERA

MEMORIAXLIX REUNIÓN NACIONAL

DE INVESTIGACIÓN

PECUARIA

XLIX Reunión Nacional de Investigación Pecuaria Veracruz 2013

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ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES METODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN EN FOLICULO

PILOSO BOVINO.

COMPARATIVE STUDY OF ADN EXTRACTION FOR THREE METHODS IN BOVINE PILOSE FOLLICLE.

Castro FE, Cervantes AP, Hernández BA, Salazar CM, Domínguez MB, Barrientos MM.

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana. pcervantes@uv.mx

La amplificación de genes a través de la técnica de PCR, requiere contar con ADN de excelente calidad. El uso de técnicas no invasivas como la obtención de pelo con folículo piloso garantiza la cantidad adecuada de células nucleadas para la extracción del material genético, con ventajas en su manejo. El objetivo de este trabajo fue evaluar tres protocolos de extracción de ADN nuclear desde folículo piloso, determinar su concentración y calidad por electroforesis, cuantificación y comprobación con ensayo por PCR. Se obtuvieron muestras de pelo arrancadas de raíz sin cortar desde 7 bovinos jóvenes y adultos. Se utilizaron 3 métodos de no afinidad: método 1, con tampón de extracción alcalino/precipitación salina (10 pelos), método 2, con tampón de extracción alcalino/precipitación salina/proteinasa K (10 pelos), y método 3, con tampón de extracción alcalino/ congelación (-20 grados Celsius) (30 pelos). La cuantificación fue por espectrofotometría UV/Luz Visible (260/280 nm). La integridad y calidad del ADN se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Las muestras de ADN obtenidas en cada técnica (n=21), se utilizaron para amplificar por PCR fragmentos del locus ATP1 A1 exón 14 (320 pb) y exón 19 (265 pb). Para cada ensayo se utilizó un ADN testigo obtenido en glóbulos blancos. La amplificación del locus ATP 1 A1 exones 14 y 19 fue verificada por electroforesis en agarosa al 1.5%, teñido con SYBR Safe (Invitrogen

®) y TBE 1X como buffer de

corrida. Las tres técnicas presentaron desviación estándar alta, que se asoció al número de muestras y calidad de folículo piloso. Tanto la técnica de extracción alcalina con precipitación salina, como la � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �pero con mayor pureza que el método de extracción alcalina y congelación a -20 grados centígrados. La variabilidad por muestra se asoció a la cantidad y el tamaño del folículo piloso, en los métodos 1 y 2 dos muestras con características de tamaño mayor de folículo tuvieron concentración de ADN más alta; mientras que el método 3 con mayor número de muestras y mejores folículos, fue el más eficiente en 3 de las muestras. En los métodos 1 y 3 el problema común fueron las impurezas presentes en el ADN, que al análisis del cociente 260/280 nm, el valor fue menor a 1.7. Con los tres métodos fue posible obtener ADN de calidad para PCR, la concentración aumenta cuando el folículo piloso posee las características de tamaño para contar con el número de células nucleadas. La amplificación y visualización de fragmentos de los exones 14 y 19 de ATP1 A1 confirmó que el ADN obtenido corresponde a los bovinos muestreados y no a otra especie biológica.