Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Análisis semicuantitativo de la adherencia de Streptococcus pneumoniae

durante la infección latente de Citomegalovirus Humano (HCMV)

Diego Armando Lechuga Mercado

Facultad de Ciencias Químico Biológicas

Universidad Autónoma de Guerrero

Programa Delfín

Área VII: Medicina y Ciencias de la Salud

wine_diego@hotmail.com

Dr. C José Arellano Galindo

Investigador del Laboratorio de Virología del

Hospital Infantil de México Federico Gómez

jose.arellano@salud.gob.mx

Resumen

A partir de la pandemia de influenza en 1918 (Española) y 1954 (Asiática) comenzaron a

realizar estudios sobre co-infecciones (virus-bacteria) en donde observaron que tras una

infección viral los pacientes en los que se lograba aislar S. pneumoniae tenían un mal

pronóstico en el curso de la enfermedad. Lo que sugiere que existe un vínculo entre la

infección viral y la colonización bacteriana.

Citomegalovirus Humano (HCMV) es un β-herpesvirus de la familia herpesviridae

perfectamente adaptado al organismo humano, la prevalencia a nivel mundial en países

desarrollado es del 60% y en países en vía de desarrollo es de 94%. Una de las principales

características de este virus es que pueden permanecer en latencia. Por tal motivo se ha decido

estudiar si una infección previa de Citomegalovirus Humano es capaz de modular la

adherencia de Streptococcus pneumoniae en células con infección latente.

Palabras Clave: Citomegalovirus Humano (HCMV), co-infección, Infección latente,

adherencia, Streptococcus pneumoniae.

Introducción

Streptococcus pneumoniae es una bacteria comensal de las vías respiratorias

superiores, con la colonización asintomática de la nasofaringe. Para sobrevivir S. pneumoniae

en la población humana ha colonizado las mucosas de las vías respiratorias altas, donde el

neumococo puede propagarse exitosamente a otro hospedero. El éxito del neumococo de

sobrevivir y persistir en la población humana es demostrado por aproximadamente de 1.9 a

5.9 billones de personas que son colonizadas con S. pneumoniae en un tiempo indefinido. A

pesar de la habilidad de neumococo para causar severas enfermedades invasivas a la mayoría

de individuos colonizados que no desarrollan sintomatología clínica (Short, 2015).

El neumococo es un coco grampositivo encapsulado, tiene aproximadamente un diámetro de

0,5 a 1,2 µm, con forma ovalada o de lanceta, y se disponen en parejas (diplococos) o en

cadenas cortas (Murray, 2009). La incidencia de la enfermedad neumocócica es

desproporcionadamente alto en neonatos, niños y ancianos (Krone, et al., 2015). En las

mayorías de las investigaciones sobre las enfermedades infecciosas se ha centrado en las

infecciones con patógenos individuales. Sin embargo, las infecciones con patógenos a

menudo se producen en el contexto de infecciones virales (Short, et al., 2012). Hay

evidencias epidemiológicas que las infecciones por el virus de la gripe y virus sincitial

respiratorio (RSV) aumentan la incidencia y la gravedad de las complicaciones bacterianas,

principalmente la neumonía, sugiriendo que existe un vínculo entre la infección viral y la

colonización bacteriana (Avadhanula, et al., 2006). Uno de los factores claves en la

colonización neumocócica en las vías respiratorias altas es la co-infección con virus

respiratorios (Short, 2015).

La infección primaria por Citomegalovirus humano (CMVH) inicia cuando existe contacto

directo con fluidos corporales (saliva, la orina y leche materna) de persona a persona, a través

de la sobrepoblación y la falta de higiene, favoreciendo así la transmisión de CMV, de tal

manera que el virus tiene la capacidad de evadir la inmunidad innata (Knipe & M. Howley,

2013). HCMV es responsable de aproximadamente el 8% de los casos de mononucleosis

infecciosa. (Steininger, 2007). Aunque la infección con este virus es asintomática en personas

sanas, puede causar graves enfermedades sobre todo en personas inmunodeprimidas

(Ioudinkova, et al., 2006).

HCMV es un β-herpesvirus de la familia herpesviridae perfectamente adaptado al organismo

humano. El virión está compuesto por el genoma de ADN bicatenario, 235 kb encerrado en

una cápside icosaedrica proteica, que a su vez está rodeado por una capa proteínica

denominada tegumento y, finalmente una envoltura lipídica. Una de las principales

características de este virus es que pueden permanecer en latencia y aun que no existe una

definición molecular de CMV latencia, se ha definido operacionalmente como la incapacidad

para detectar virus infeccioso mediante métodos convencionales conocidos (Hummel & M.

Abecassis, 2002). En ciertos tipos de células, los genes Inmediatamente tempranos (IE) son

silenciados por la infección de HCMV, dando como resultado una infección latente. Durante

la latencia, la expresión del gen viral se reduce al mínimo, presumiblemente para evitar la

detección inmune (Sinclair et. al. Sissons, 2006).

Materiales y Métodos

Material biológico: células THP-1 (ATCC TIB-202), Citomegalovirus humano

towne (ATCC VR-977) y Streptococcus pneumoniae (Klein) chester (ATCC 49619).

Cultivo celular: Las células THP-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 enriquecido con 10%

de suero fetal bovino (SFB) en cajas de cultivo celular a 37°C con tensión de CO2 al 5%

manteniendo una confluencias no mayor a 1x106 células/mL.

Manejo de la cepa bacteriana: S. pneumoniae fue cultivado en gelosa sangre durante 18

horas mediante estría masiva, posteriormente fue resembrado en medio Todd Hewitt e

incubado por 13 horas, enseguida se recuperó el botón celular mediante centrifugación a 1000

xg por 10 minutos. La cuantificación se realizó con el Nefelómetro de Mac Farland a 0.5.

Las bacterias se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) a una concentración final

de 10 µM, se incubó por 20 minutos a 37°C en oscuridad. Subsecuentemente la bacteria fue

lavada 3 veces con PBS estéril.

Cinética de adherencia bacteriana: Se infectaron 1.5 X 106 células con 50 genomas de

CMV towne a las 96, 72, 48, 24, 2 y 0 horas, tras la infección con CMV towne se infecta con

S. pneumoniae.

Citometría de flujo: Las muestras se fijaron con paraformaldehido 0.3 %, posteriormente se

analizaron en el citometro de flujo FACSCanto™ y se analizaron por medio de flowing software 2.5

Formato de Gráficas y Figuras:

Gráfica 1. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa a CMV

concentrado con una mayor población a diferencia de las demás, lo que indica que hay más

bacterias adheridas a las células. B) Infección de CMV 0 horas, representando la Media de

Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente: Elaboración propia

Counts

B

A

Gráfica 2. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa a CMV

concentrado con una mayor población a comparación de las demás, lo que indica que hay

más bacterias adheridas a las células. B) Infección de CMV 2 horas, representando la Media

de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente: Elaboración propia

Counts

A

B

Gráfica 3. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa la

dilución CMV-1, CMV-2, CMV-3 con una mayor población de células a comparación de

CMV concentrado que aunque tienen una menor población de células, se observa una mayor

adherencia de las bacteria en las células. B) Infección de CMV 24 horas, representando la

Media de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente: Elaboración propia

Counts

A

B

Gráfica 4. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa a CMV

-1, CMV-2, CMV-3 con una mayor población de células a comparación de CMV concentrado

y THP1- S.pneumoniae que aunque tienen una menor población de células, se observa una

mayor adherencia de la bacteria en las células. B) Infección de CMV 48 horas, representando

la Media de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente: Elaboración propia

Counts

A

B

Gráfica 5. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa a

CMV-4 con una mayor población de células que CMV concentrado, el cual tiene una menor

población, pero una mayor adherencia de la bacteria en las células. B) Infección de CMV 72

horas, representando la Media de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente:

Elaboración propia

Counts

A

B

Gráfica 6. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde no se observa

diferencia cualitativa, en cambio CMV concentrado muestra un mayor desplazamiento, lo

que indica que hay una mayor adherencia de la bacteria con las células. B) Infección de

CMV 96 horas, representando la Media de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la

población. Fuente: Elaboración propia

Counts

A

B

Resultados

Gráfica 7. Porcentaje de población con bacterias adheridas. Fuente: Elaboración propia

Gráfica 8. Mediana de la intensidad de la fluorescencia. Fuente: Elaboración propia

Este estudio reporta la cinética de adherencia de S. pneumoniae en células THP-1 con post-infección

de CMV Towne a las 96, 72, 48, 24, 2 y 0 horas. Al tiempo 0 horas (Gráfica 1 A) observamos la

población celular con respecto al desplazamiento de la intensidad de la fluorescencia que indica la

cantidad de bacteria adherida a la superficie celular, de ahí se observa que existe un incremento en la

adherencia cuando hay una infección (virus- bacteria) al mismo tiempo. Por lo tanto no se puede

discriminar que población tiene más bacteria adherida, entonces se gráfica la Media de la Intensidad

de la Fluorescencia (MIF) vs la población (Gráfica 1 B) en donde el control negativo (células THP-

1) representan la autoflorescencia de la célula, posteriormente en las células con S. pneumoniae

representan nuestra adherencia normal, a partir de ello se observa un aumento lineal en la adherencia

en las diluciones CMV-4, CMV-3 y CMV-2. En cambio en la dilución CMV-1 se observa una caída

en la adherencia de S. pneumoniae, enseguida CMV concentrado aumenta la adherencia bacteriana.

Mientras tanto en el tiempo 2 horas (Gráfica 2 A) se representa la población celular con respecto a

un gran desplazamiento de la fluorescencia de CMV concentrado, indicando que existe una mayor

adherencia por parte de la bacteria en la célula. También en este caso no se debe discriminar que

población tiene más bacteria adherida, por lo tanto se realizó una gráfica MIF vs la población

(Gráfica 2 B) en donde el control negativo (células THP-1) representan la autoflorescencia de la

célula, posteriormente en las células con S. pneumoniae representan nuestra adherencia normal, donde

a partir de los controles se muestra un aumento en CMV atenuado (UV) y un descenso por parte de

la dilución CMV-4 y enseguida se observa un aumento lineal en la adherencia, mayormente en CMV

concentrado. Tanto en la Gráfica 3 A, 4 A, 5 A y 6 A se observa un aumento importante en la

adherencia de S. pneumoniae en la célula, una vez infectada por CMV concentrado sin dejar de tomar

en cuenta qué población tiene más bacterias adheridas, realizando así graficas de comparación MIF

vs la población Gráfica 3 B, 4 B, 5 B, 6 B. En base los resultados obtenidos se establecieron gráficas

donde se observa el porcentaje de población con bacterias adheridas (Gráfica 7) representando que

CMV concentrado mantiene una linealidad de población más alta que las demás muestras en 0, 2, 24,

48, 72, 96 horas con respecto a MIF (Gráfica 8) donde se observa que a las 2 horas CMV concentrado

alcanza su mayor intensidad, representando que existe una mayor adherencia por parte de S.

pneumoniae en la célula.

Discusión y conclusiones

Este estudio, se determinó la cinética de adherencia de S. pneumoniae en monocitos THP-1 infectadas

con CMV. Estudios previos reportan la adherencia de S. pneumoniae y H. influenzae no tipificable

en fibroblastos post-infección con Virus Sincitial Respiratorio (SRV) y Virus Parainfluenza tipo III

(HPIV-3). Se observó que dichos virus, modulan los receptores de la célula favoreciendo la

adherencia bacteriana. Además, aumentan la incidencia y la gravedad de las complicaciones

bacterianas, tales como neumonía y sepsis (Avadhanula, et al., 2006). En este estudio, se analizó la

adherencia de S. pneumoniae en una cinética de infección por CMV desde 0, 2, 24, 48, 72 y 96 hrs.

Se observó que a un título viral de 50 genomas, existe un incremento de la adherencia bacteriana;

estudios previos han demostrado que a las 2 horas de la infección existe la expresión de proteínas

Inmediatamente tempranas (IE), pudiendo ser las responsables de dicha modulación, debido a la

presencia de proteínas estructurales del tegumento propias del virus (Kalejta, 2008), lo que sugiere

que algunas de estas proteínas están involucradas directamente con la expresión de moléculas que

pueden fungir como receptores para la adherencia de S. pneumoniae. Teughels y col. (2007),

demostraron que la adherencia de Actinobacillus actinomycetemcomitans es directamente

proporcional al título de una infección activa de CMV in vitro, dependientes de un tiempo de 24 hrs.

post-infección viral, seguido de una ligera disminución. Por lo tanto, supone que la adherencia de

S. pneumoniae puede estar correlacionada con el tiempo post-infección, además del título viral; en

este experimento observamos que CMV concentrado alcanzó a mantener la mayor adherencia

bacteriana.

El modelo propuesto en este estudio, mostró un aumento importante de la adherencia con respecto al

control evidenciado, que se interpreta como un incremento de bacterias adheridas en las células, así

como un incremento de células con bacterias adheridas a un tiempo de 2 h post-infección viral.

Posteriormente, la adherencia disminuye próximo a la basal y nuevamente se observa un incremento

oscilatoriamente dependiente del tiempo de infección. Este efecto puede interpretarse como un intento

de compensación celular, una vez que las proteínas virales han secuestrado la maquinaria celular y

han contribuido al mecanismo de incremento de la adherencia bacteriana inducida por la infección

viral.

En este estudio observamos que la adherencia de S. pneumoniae es modulada por la infección de

CMV en un estado de latencia en células THP-1, en cambio al no existir una infección por CMV en

la célula, no logra modular la adherencia. Por lo que concluimos que la adherencia de S. pneumoniae

depende de una infección por CMV en células monociticas en estado de latencia (THP-1).

Existe la hipótesis que el gen UL111.5 que codifica para la interlucina-10 (IL-10) está relacionado

con la modulación de la adherencia bacteriana, proponemos investigar este efecto en S. pneumoniae.

Agradecimientos

Agradezco profundamente a mi Alma Mater la Universidad Autónoma de Guerrero

por permitirme una vez más realizar la estancia de verano, así como también al Dr. José

Arellano Galindo por el apoyo que me brindo durante la estancia, además permitirme formar

parte de un gran equipo de trabajo de investigación. Agradecer también la colaboración de

mis amigos Víctor Hugo Sánchez De Paz y Abel Tranquilino de Jesús presentes en el

Laboratorio de Virología para poder llevar a cabo y culminar este proyecto de investigación.

Referencias

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Respiratory Epithelium in a Viral Species- and Cell Type - Dependent Manner. Journal of virology

, 80(4), p. 1626.

Hummel, M. & M. Abecassis, M., 2002. A model for reactivation of CMV from latency.

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Ioudinkova, E. y otros, 2006. Control of human cytomegalovirus gene expression by differential

histone modifications during lytic and latent infection of a monocytic cell line. Elsevier, Issue 384,

p. 121.

Kalejta, R. F., 2008. Tegument Proteins of Human Cytomegalovirus. microbiology and molecular

biology, 72(2), pp. 249-250.

Knipe, D. M. & M. Howley, P., 2013. FIELDS VIROLOGY. En: VIROLOGY. Philadelphia, USA:

Wolters Kluwer health, pp. 1960-2000.

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