Upload
hanyavila1429
View
48
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Produccin de metabolitos secundarios
en biorreactores
Alejandro Mentaberry
Departamento de Fisiologa, Biologa Celular y Molecular
FCEN-UBA
Conceptos y Tcnicas de BiotecnologaCurso 2010
Sumario
Potencial econmico de los metabolitos secundarios
Referencias
Estrategias para incrementar la produccinde metabolitos secundarios.
- Seleccin de especies vegetales apropiadas- Seleccin de lneas celulares mejoradas- Optimizacin de las condiciones de cultivo- Agregado de precursores- Suspensiones, rganos y clulas inmovilizadas- Uso de elicitores microbianos y de estreses abiticos- Permeabilizacin y remocin in situ
Diseo de procesos. Ejemplos
Ingeniera metablica y biotransformacin
Potencial econmico de los metabolitos secundarios
El metabolismo secundario regulamuchas de las relacionesde la planta con el medio circundante
Concepto general
La produccin de metabolitos secundarios est estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.
- Generalmente no est asociada al crecimiento.- Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y rganos
(races, tallos, hojas y glndulas).- La biosntesis y acumulacin suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidosy de rganos.
Los metabolitos secundarios se producen ante situacionesde estrs o enfermedad.
- Factores biticos- Factores abiticos
Cultivode tejidos y metabolismo secundario
- Insecticidas- Saborizantes- Colorantes
Las plantascomo fuentede metabolitos secundarios de inters comercial
Potencial
- 75% de las nuevas estructuras qumicas descubiertas provienen de las plantas.
- Slo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta.
- 25% de los medicamentos de las industrias farmacuticas son de origen vegetal.
- 75% de la poblacin mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.
- Desarrollo creciente de fitoteraputicos y nutracuticos
- Medicinas- Herbicidas- Proteasas
- Fragancias- Antimicrobianos- Enzimas
Ejemplos de terpenoides producidos en plantas Se conocen
unos 25.000 terpenoides presentes en plantas
Taxol (droga anticancergena)
Forbol (irritante y cocarcinognico)
Costunlido (repelente de inserctos;
antinutriente de mamferos)
Azadiractina A (antinutrientede insectos) -Ecdisona
(disruptor de la muda de insectos)
Hecogenina(aglicona de una saponina;
detergente)
Digitoxigenina(aglicona de digitoxina; tratamiento
de congestiones cardacas)
Taxol(droga anticancergena)
Forbol(irritante y cocarcinognico)
Azadiractina A (antinutrientede insectos)
Costunlido(repelente de inserctos;
antinutrientede mamferos)
Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales
Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas
Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina
Cocana
CafenaCoffea arabicaErythroxylon coca
Cinchona officinalis
Quinina
Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina
Cocana
CafenaCoffea arabicaErythroxylon coca
Cinchona officinalis
Quinina
Ejemplos de fenlicos derivados de fenilpropanoides
Unos 8.000 fenlicos se forman en las plantas por las rutas del cido shikimico o del malonato/acetato
gingeroles
Rizoma de ginger
Pimiento rojo y negro
piperina
norhidrocapsaicina
capsaicinaGranos de caf
Corteza de canela
cinnamaldehido
cido clorognico
Algunas de las medicinas ms importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso teraputico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$ Hiosciamina, escopolamina
Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinrgicos
Camptotecina Alcaloide indlico Camptotheca acuminata
Antineoplsico
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgsico local Codena, morfina Alcaloide opiceo Papaver somniferum Analgsico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa Pilocarpina Alcaloide imidazlico Pilocarpus jaborandi Colinrgico Nicotina Alcaloide pirrolidnico Nicotiana spp. Terapia antitabaco Quinina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Antimalrico Quinidina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Cardiotnico Reserpina Alcaloide indlico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrpico Vinblastina, vincristina
Alcaloide indlico Catharanthus roseus Antineoplsico
Yohimbina Alcaloide indlico Apocynaceae, Rubiaceae
Afrodisaco
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpnica Artemisia annua Antimalrico Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicsidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$ Digoxina, digitoxina Glicsidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotnico Sennsidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de
ipecacuana Cephaelis ipecacuanha
Emtico
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplsico
Antitumoral
Produccinde metabolitos secundariospor cultivo in vitrode clulas y rganos vegetales: por qu?
- Independizarse de factores externos, tales como:cambios de temperatura, sequas, plagas,variabilidad de la produccin, factores polticosy sociales, etc.
- Evitar la extincin de especies vegetales.
- Disponer de condiciones controladas en el procesode produccin y extraccin.
- Hacer viable la produccin de compuestos complejos con uno o ms C quirales en forma mseconmica respecto de la sntesis qumica
- Posibilitar la obtencin de nuevos compuestosno presentes en la planta madre.
- Establecer procesos de biotransformacin slorealizables por enzimas provenientes de plantas.
Procesos industriales
Tipo de compuesto
Farmacuticos
PigmentosFragancias
SaborizantesDepigmentadores
Producto
ShikoninaBerberina
SanguinarinaGingsensidos
TaxolCartaminaGeraniolCitronerolVanillinaArbutina
Compaa
Mitsui Petrochemical Ind.Mitsui Petrochemical Ind.
Vigont Researol Lab.Nitto Denko Co.
Phyton USAKibun Kyoto University
Kanedo Co.Kanedo Co.Kanedo Co.
Mitsui Petrochemical Ind.
20 M
0,6 M
4.800
340.000
1.000
n/a
3.250
4.500
-
-
Precio (U$S/kg)
18PigmentosMorinda citrifoliaAntraquinonas
12,4Antibacteriano, colorante
Lithospermunerythrorhizon
Shikonina
10,6AntibacterianoThalictrum minusBerberina
8,9PigmentoPerilla frutescensAntocianinas
3,8EsteroideDioscorea deltoideaDiosgenina
0,025AnalgsicoPapaver somniferumMorfina
2,5AntibiticoPapaver somniferumSanguinarina
0AntileucmicoCatharanthus roseusVincristina
0,06AnticancergenoTaxus brevifoliaPaclitaxel (Taxol)
21-36AntiinflamatorioCloeus blumeiAcido rosmarnico
Rendimiento (%)AplicacinEspecieProducto
Tomado de: Scragg. Agricultural Biotechnology, 1998.
Productos comerciales potenciales y rendimientos de algunos cultivos de clulas vegetales
Condiciones econmicas:- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)
- Alto rendimiento y productividad del cultivocomparado con la planta entera
- Buen crecimiento en biorreactores
- Crecimiento lento de la planta enteracomo fuente alternativa
Parmetros principales:- Productividad: g de producto/L/da
- Concentracin mxima de producto: g de producto/L
- Rendimiento: g producto/g sustrato
Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial
Estrategias para incrementarla produccin de metabolitos secundarios
Esquema del patrn de crecimientode una suspensin celular vegetal
Rendimiento de biomasa en sustrato
Cuantificaciny cinticade un proceso Td: tiempo de duplicacin de la biomasa : velocidad especfica de crecimiento del organismo
Y: rendimientoX: biomasaS: sustrato
Asociado al crecimiento No asociado al crecimiento
Patrones de formacin de producto
Seleccin de especies vegetales apropiadas
Seleccin de lneas celulares mejoradas
Optimizacin de las condiciones de cultivo
Agregado de precursores
Tipo de cultivo: suspensiones, rganoso clulas inmovilizadas
Uso de elicitores microbianosy estrs abitico
Permeabilizacin y remocin in situ
Metodologas utilizadas para optimizarla produccin de metabolitos secundarios
Screening y seleccin de lneas sobreproductoras
- Se facilita cuando el metabolito de inters es unpigmento, ya que puede hacerse una seleccin visual.
- Es importante contar con un mtodo rpido y sencillopara seleccionar lneas ms productoras (por ejemplo,ELISA).
Optimizacin del medio de cultivo (variables msensayadas)
- Fuente de carbono- Limitacin en nitrgeno- Limitacin en fosfato- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)- Relacin C/N
Agregado de precursores
- Bajo costo- Baja toxicidad- No muy alejado del producto final en la ruta metablica
Metodologas utilizadas para optimizarla produccin de metabolitos secundarios
Diferencias entre suspensiones de clulas vegetalesy de clulas microbianas
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Consecuencias paracultivos a gran escala
Sedimentacin rpida;sensibilidad a fuerzas de corte;
formacin de gradientes;dificultad para tomar muestras
Largos tiempos de proceso;baja productividad
Necesidad de grandescantidades de inculo;
escalado ms largo
Bajas velocidadesde agitacin
Baja demanda de oxgeno:fermentadores con bajatransferencia de oxgeno
Permeabilizacin;remocin in situ
Clulasvegetales
Agregados de 10-200 m y
de hasta 2 mmde dimetro
Lenta; td ~ 2-5 das
5-20%
Sensible /Tolerante
Baja
Intracelular /a veces extracelular
Clulasmicrobianas
ClulasIndividuales
2-10 m
Rpida;td ~ 1-2 h
Pequea
Insensible
Alta
Extracelular
Caracterizacin
Tamaoy morfologa
Velocidadde crecimiento
Densidad de inoculacin
Sensibilidad a fuerzas de corte
Aireacin
Acumulacindel producto
Problemas a considerar:
- Tasa de crecimiento
- Volumen del inculo
- Tamao y agregacin de las clulas
- Oxigenacin
- Agitacin
Cultivos en suspensin
2,30,3080 L (EA)Helianthus annuus5,90,127 L (EA)Picrasma quassioides
0,720,9615, 30, 130 L (AG)Nicotiana tabacum0,631,1015, 500 L (AG)Nicotiana tabacum1,40,4810 L (EA)Morinda citrifolia2,20,3230 L (EA)Catharanthus roseus
5,20,137 L (EA)Quassia amara
1,70,42600 L (AG)Nicotiana tabacum
Tiempo de duplicacin (d)
Tasa de crecimientoespecfica (d-1)BioreactoresLnea celular
AG: bioreactor con agitacinEA: bioreactor de elevacin por aire (airlift)
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Ejemplos de tasas de crecimiento de suspensiones de clulas vegetales en biorreactores
La densidad el inculo y del diseo del biorreactor inciden en el desarrollo de las suspensiones celulares
Tamao y distribucin de agregadosde Helianthus annuus en variosbiorreactores y en Erlenmeyer
Efecto de la densidad de inculo en el crecimiento de cultivos de Picrasma quassiodides.
Tomado de: Scragg. Secondary products from plant tissue culture, 1990.Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Porcentaje de callos de Vitis viniferaque contienen pigmentos de acuerdo
con el tamao de los agregados
Tomado de: Nagamori et al., Biochemical Engineering Journal, 2001.
Distribucin del tamaos obtenido en biorreactores con medio en presencia de carboximetilcelulosa (crculos cerrados)
y en medio control (crculos abiertos)
Tomado de: Honda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002.
Tamao de agregado y acumulacin de metabolitos secundarios
Patrn de flujo de dos diseos de propulsor Agitador de paletas inclinadas
(flujo axial)Agitador de paletas planas o de Rushton
(flujo radial)
Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.
deflector deflector
Adaptado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles,1998.
Diseos de distintos propulsores
Columna de burbujeo Airlift con tubo interno Airlift con loop externo
Biorreactores de agitacin neumtica
El biorreactor ms grande del mundo es de tipo air-lift
ICI, Ltd. factory, Billingham, UK
Instalada en 1980, produce 6.000 Tm de protena bacteriana (Methylophilus methylotrophus) por mes.
Biorreactor de tambor rotatorio Biorreactor de membranas
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Bhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.
Diseos alternativos para biorreactores con agitacin mecnica
Cultivo de rganos: races transformadas
Propiedad
Forma de crecimientoPatrn de crecimiento
Tiempo de duplicacinBiomasa final (peso seco/L)Background genticoFormacin inicial de productoMedio de crecimiento
Localizacin del producto Tipo de proceso
Suspensiones
Clulas simples-agregadosDesorganizado; cada clulapuede dividirse y expandirse
15 h-das30-60 g
HeterogneoUsualmente bajo
Complejo; hormonasy vitaminas
Intracelular- extracelularBatch; continuo, deben
ser inmovilizadas
Races transformadas
Red de ramificacionesDivisin celular localizada;
crecimiento linear conramificaciones laterales
36 h-das 30-60 g
EuploideSimilares a la planta madre
Simple, sales y azcar
Intracelular- extracelularBatch o continuo, no haynecesidad de inmovilizar
Fenotipo de raz transformada con
Agrobacterium rhizogenes
Gnero
NicotianaCatharanthus
CinchonaDuboisiaDatura
BetaLippia
ArtemisiaCoreopsis, Bidens
Tagetes
DigitalisCassiaPanax
ChaenactisPodophyllum
LinumLithospermum
Solanum
Metabolito
AlcaloidesAlcaloides piridnicosIndoles
Tropano
OtrosBetalainaSesquiterpenos
PoliacetilenosTiofenos
Glicsidos cardioactivosAntraquinonasSaponinasPolyinesLignanos
NaftoquinonasEsteroides
Algunos metabolitos secundarios producidospor races transformadas
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Biorreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)
Biorreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las races
Biorreactores para el cultivo de races
Bomba de aire
Rot
met
ro
B
o
m
b
a
p
e
r
i
s
t
l
t
i
c
a
Generador de niebla
Cmarade cultivoControlador Controlador
On OffIntensidad
Filtro de aire
Condensadorde niebla
Adicin de nutrientes
Bomba
Salida de aire
AireAire
Inculo
Reservorio
Malla de inmovilizacin
Tomado de:Hairy Roots, Culture and Applications,
1997.
Compuesto
PiretrinasCardenlidosArtemisinina
Aceites esencialesAceites esenciales
Planta
Chrysanthemum spp. Digitalis spp.
Artemisia annuaMentha spp.
Pelargoium spp.
Cultivode tallos Ventajas
- Cultivos gentica y bioqumicamente estables- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos
presentes en tallos y hojas (glndulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales
- Niveles similares a los de la planta (no siempre se cumple).
Desventajas- Slo para productos sintetizados en tallos y hojas- Vitrificacin
Airlift modificados: A: airlift con placas para sostener los cultivos de tallos; B: Igual que A, pero con alimentacin por
goteo; C: Igual que A, pero con alimentacin por niebla.
Produccin de artemisinina en los distintos bioreactoresTomado de: Liu et al., Process Biochemistry, 2003.
Cultivo de tallos de Artemisia annuapara la produccin de artemisinina
La inmovilizacin se define comoel confinamiento de un biocatilizador, enzimtico o celular, dentro o sobre una matriz slida para favorecer la liberacin del producto y la reutilizacin del propio biocatilizador.
Unin a una matriz:- Covalente - Inica- Por crosslinking- Por adsorcin
Entrampamiento:- Geles o polmeros- Membranas: microencapsulacino reactores de membrana
Inmovilizacin
Ventajas- Posibilita la reutilizacin del biocatalizador y una
rpida separacin del medio de cultivo.- Las clulas vegetales permanecen viables
por largos perodos de tiempo.- Es posible establecer sistemas de cultivo continuo,
con el consiguiente aumento en la productividad. - Es posible establecer cultivos de alta densidad
permitiendo el uso de biorreactores ms pequeos.- La inmovilizacin favorecera la interaccin entre
las clulas, favoreciendo cierto gradode diferenciacin con el consiguiente incrementoen la produccin.
- Es compatible con otras estrategias de optimizacin. (elicitacin, permeabilizacin y remocin de producto)
- En muchos casos, la misma inmovilizacin inducela secrecin del producto al medio de cultivo.
Inmovilizacin
Desventajas
- Se agrega una etapa ms al proceso,con el consiguiente aumento en los costos operativos. Esto incluye el costo de la matriz y de toda la maquinaria necesariapara la inmovilizacin.
- Al agregar un barrera ms al sistema, aumentan los problemas relacionadoscon la transferencia de nutrientesy de oxgeno.
- El agregado de otra etapa en el proceso aumenta los riesgos de contaminacin.
Inmovilizacin
Efectos de la inmovilizacin en la produccin de metabolitos secundarios
Efectos de la inmovilizacin en la liberacin de metabolitos secundarios
Tomado de: Payne et al., Plant cell and tissues culture en liquid ssytem. 1991.
Inmovilizacin
Compuesto
FerruginolSolasodinaL-DOPACapsaicina
Planta
Salvia miltiorrhizaSolanum surattense
Mucuna pruriensCapsicum frutescens
Clulas Libres
267-
Trazas
Inmovilizadas
4547-59
90100
% Producto en el medio
Especie
Capsicum frutescensCapsicum frutescensCofffea arabicaCatharanthus roseusTagetes patula
Producto
CapsaicinaCapsaicina
MetilxantinasAjmalicinaTiofenos
Incremento
> 100> 100
133,520
Tipo de inmovilizacin
PoliuretanoGelGelGel
Agregados naturales
Biorreactores para clulas inmovilizadas
Lecho empaquetado Lecho fluidizadoAgitacin mecnica
Tomado de: Payne et al. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1991.
La inmovilizacin en el contexto de distintas opciones de cultivos de tejidos
Elicitacin
Agentes biticos
- Extractos de paredes de hongos o bacterias- Acido araquidnico- Quitosano- Metil jasmonato
Agentes abiticos
- Metales pesados- Radiacin UV- Presin osmtica- Ultrasonido
Tomado de: Singh. Hairy Roots, Culture and Applications, 1997.
Incremento de la produccin de metabolitos secundariospor elicitacin en diferentes cultivos in vitro
Producto despusde elicitacin
75 mol / L
4,27 mg / g peso seco
1 mg / frasco
2% peso seco
15 mg / g peso fresco
28 g / 10 mL
9 mg / g peso seco
160 g / g peso fresco
0,55 g / 100 gpeso seco
Elicitor
Phytium aphanidermatum(extracto crudo)Phytophtora megasperma(extracto crudo)Trichoderma virideae(extracto crudo)Saccaromyces cereviseae(extracto crudo)Verticilium dahliae(extracto crudo)Endgeno(extracto crudo)Penicilinum spp.(extracto crudo)Glutation abitico
Fusarium conglutanis(extracto crudo)
Especie
Catharanthus roseus(suspensiones)Datura stramonium(suspensiones)Capsicum annum(suspensiones)Thalictrum rugosum(suspensiones)Sanguinaria canadensis(suspensiones)Lithospermum erythrorizon(suspensiones)Catharanthus roseus(races transformadas)Lotus corniculatus(races transformadas)Tagetes patula(races transformadas)
Producto
Alcaloidesindlicos
Alcaloidesdel tropano
Capsidiol
Berberna
Dopamina
Shikonina
Alcaloidesindlicos
Isoflavonoides
Tiofenos
Concentracindel elicitor
10 ml / 50 mLde cultivo
55 mg / L de cultivo
20 g / mL
0,2 mg / g peso fresco
1 ml / 15 mLde cultivo
1 mg / mL
0,01 g / L peso seco
10 mM
0,2 mg / mLde medio
Productoen control
50 mol / L
0,85 mg / g peso seco
0
0,5% peso seco
3 mg / g peso fresco
0
3 mg / g peso seco
0
0,2 g /100 gpeso seco
Dosaje de elicitor necesario para biorreactor en columna de burbujeo
y para biorreactores de lecho de goteo o de niebla en funcin de la constante de
equilibrio entre el elicitor y receptor
Gastos de elicitor por biorreactor para biorreactor en columna de burbujeo y para
biorreactor de lecho de goteo o niebla.
Efecto de la configuracin del biorreactor sobre el proceso de elicitacin
Tomado de: Singh, Hairy root Culture and Applications, 1997.
DMSO
Shock trmico
Cambios de pH
Limitacin de fosfato y oxgeno
Elicitacin
Detergentes y aceites de siliconas
Electropermeabilizacin
Liberacindel productoal medio
Lquido-lquido:Compuestos inmiscibles en agua: Se utilizan solventesorgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico).Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.
Compuestos miscibles en agua: Se utilizan sales o solucionesde polmeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG.
Slido-lquido:La segunda fase es un material slido como resinas u otrosabsorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.
Requerimientos:- Autoclavables- No txicos- Fcil separacin del producto de inters
de la segunda fase- No modificacin del medio de cultivo- Permanencia de las clulas en la fase acuosa
Remocin de producto in situ
Diagrama de un tanque de agitacin mecnica modificado para operar con remocin in situ del producto
1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar races; 3: sensor de oxgeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor
DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;
12: marco de la malla
Diagrama de un biorreactor de agitacin por lquido con loop externo
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Adaptaciones para la extraccin in situ del producto
Extraccin in situ de alcaloides con aceite de silicona a partir de un cultivo de clulas de Eschscholtzia californica
A: particin de alcaloides con diferentes cantidades de polimetil-silanos. Los alcaloides se acumulan en la fase superior.B: Extraccin in situ de alcaloides en la parte superior de un fermentador de elevacin por aire de 2 L.
Secuencia en laoptimizacin de un proceso para la produccinde metabolitos secundarios
Seleccin de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro
Establecimiento de cultivos in vitro
Estabilizacin y seleccin de cultivosin vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,
liberacin al medio
Optimizacin de medio de cultivo para produccinpor diseo factorial: nutrientes, precursores, elicitacin,
liberacin y remocin in situ
Optimizacin en biorreactores: escaladoSistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusin,
en dos etapas. Extraccin y purificacin del producto
Ingeniera metablica y biotransformacin
Estrategiaspara modificarel metabolismo secundariomediante manipulacin gentica
Completar rutas metablicas mediante insercin de genes heterlogos
Amplificar rutas normales
Bloquear rutas alternativas
Bloquear rutas normales
Modificar la regulacin de rutas normales
Modificar los mecanismos de secreciny exportacin
Bloquear rutas de degradacin
Ingeniera metablica del metabolismo secundario
Enzima
Triptofano decarboxilasa(TDC)
Hiosciamina-6-hidroxilasa(H6H)
Triptofano decarboxilasa (TDC)y estrictosidina sintasa (STR)
ORCA3 (factorDe transcripcin)
(S)-esculerina 9-O-metiltransferasa (SMT)
Desoxixilulosa fosfatoreductoisomerasa (DXR)
C1 y R (factoresde transcripcin)
Especie
Peganum harmala(suspensiones y races)
Hyosciamus muticus(races transformadas)
Catharanthus roseus(suspensiones)
Catharanthus roseus(suspensiones)
Coptis japonica(suspensiones)
Mentha spp.(planta)
Zea mays(callos)
Producto
Serotonina
Escopolamina
Alcaloides indlicos(TIAs)
Alcaloides indlicos(TIAs)
Berberina
Aceites esenciales
Antocianinas
Observaciones
Incremento de 10-20 vecesen producto
Contenido de producto 4 vecessuperior a planta control
Contenido de TIAs de 300 mg/Lcomparado con control 50mg/L.Lneas inestables
Incremento de la concentracin de TIAsde 3 veces despus de agregarel precursor secologanina
Incremento del flujo hacia la produccinde berberina de 15%
Incremento del 50% ene l contenidode aceites esenciales
Produccin de antocianinas y fenolesque no se producan en los callos sin transformar.
Ingeniera metablica delmetabolismo secundario
Problemas- Clonado de genes
- Estabilidad de lneas transgnicas
- Compartimentalizacin de productos
- Transporte y acumulacin de productos
- Limitaciones y arquitecturade la ruta metablica
- Canales metablicos (limitacin del flujo metabolico por la capacidad de las enzimas participantes)
La biotransformacin es la conversin de un sustrato (natural o sinttico) por medio de un biocatalizador (enzima, clula, tejido, rgano, clulas inmovilizadas) en un producto complejo. Generalmente involucra uno o pocos pasos enzimticos.Requerimientos:
- Se requiere la presencia de las enzimas necesarias en la clulas y de sus cofactores.- La velocidad de formacin del producto debe ser mayor que su metabolizacin.- El cultivo debe tolerar al precursor y al producto formado.- El precursor debe poder ingresar en la clula y el producto debe ser preferentemente secretado.
- El precursor debe tener un valor mucho menor al del producto formado.Planta Precursor ProductoCapsicum frutescens(clulas inmovilizadas)
Acido protocatecuicoy cido cafeico
Vainillina y capsaicina
Catharanthus roseus(clulas inmovilizadas)
Vinblastina Vincristina
Daucus carota(clulas inmovilizadas)
Codeinona Codena
Mucuna puriens(clulas inmovilizadas)
Tirosina L-DOPA
Rauwfolia serpentina(clulas inmovilizadas)
Hidroquinona Arbutina
Mentha spp.(clulas inmovilizadas)
Mentona Neomentol
Coffea arabica(clulas inmovilizadas)
Teobromina Cafena
Adaptado de: Giri et al., Biotechnology Advances, 2001.
Biotransformacin
Ejemplos de diseo de procesos
Operacin Productoasociado
Productono-asociado
Batch + +Batch alimentado + +Batch alimentadorepetitivos
+ +
En dos etapas - +Continuo + -Perfusin - +
Relacin entre el sistema de cultivo y el patrn de sntesis del metabolito secundario
Esquema de un proceso completo para la produccin de un metabolito secundario por cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales
Shikonina
Planta entera- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.
Suspensiones celulares- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin.- Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducen
la produccin de shikonina.- Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio.- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Produccin de shikonina por suspensiones celularesde Lithospermum erythrorhizon
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulasde Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.
Berberina
Planta entera- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente de 5-6 aos.
Suspensiones celulares- Las lneas celulares productoras se seleccionaron a travs de
. protoplastos y screening de por fluorescencia.- El sistema de cultivo utilizado es el de batch alimentado y el producto est
. asociado al crecimiento.
Tomado de: Yamasaki Plant Photo Gallery
Produccin del alcaloide berberinapor suspensiones celulares de Coptis japonica
Ginsensidos
Planta entera- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 5-7 aos .- Se requieren perodos prolongados de cuidado que exponen a los cultivosa riesgos de pestes y cambios drsticos de clima.
- La concentracin de saponinas es de 0,5 % peso seco.
Suspensiones celulares- La concentracin de saponinas es de 0,65 % peso seco.- La productividad de biomasa es de 700 mg/L/da.- El medio de cultivo contiene bajas concentraciones de amonio.- A gran escala se emplean tanques agitados mecnicamente a bajas velocidades.
Races transformadas- La concentracin de saponinas es de 0,95 % peso seco.- El medio de cultivo requiere del agregado de 2 mg/L de IBA y de 0,1 mg/L de quinetina.- A gran escala se emplean tambores rotatorios.
Produccin de ginsensidos por Panax ginseng
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Taxol
Planta entera- La edad de los rboles para extraer el producto es de 50-100 aos.- La concentracin de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.- Este mtodo de produccin podra llevar a la extincin de la especie.
. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difcil la purificacin del taxol.
. - El material vegeta empleado presenta variacin en la concentracin de precursores.- Las plantas empleadas crecen lentamente.
Tomado de: Schoepke Plant Image Gallery
Produccin de taxol por Taxus spp
Taxol
Suspensiones celulares de T. brevifolia- Se emplean metiljasmonato o extractos fngicos como elicitores.- La composicin ptima de gases es 10% (v/v) oxgeno, 0,5% (v/v) dixido de carbono y 5 ppm de etileno.- El incremento de la presin osmtica, sacarosa (60 g/L), estimula la produccin.- Los precursores como la fenilalanina y el cido benzoico incrementan la productividad.
- El taxol puede ser removido in situ con resinas como XAD y el solvente dibutilftalato.
- El sistema de operacin se realizan en dos etapas: la primera para el crecimiento y la segunda en un medio de produccin con elicitacin.
- Los reactores que se utilizan son de tipo airlift, columna de burbujeo u otros que produzcanpoco estrs hidrodinmico (escalado hasta 75.000 L).
Schoepke Plant Image Gallery
Produccin de taxol por Taxus spp
Planta entera- La planta tiene bajas concentracionesde alcaloides.
- La purificacin y extraccin son costosas. Suspensiones celulares
- La limitacin de fosfato y nitrgeno combinado con la elictacin, inducen la produccin de del precursor ajmalicina (utilizado para tratar hipertencin y problemas cardiolgicos).
- Las lneas celulares seleccionadas son resistentes a las fuerzas de corte, posibilitandoel desarrollo de cultivos a gran escala,
- En los cultivos a gran escala es necesario re-circular los gases de salida.- Las suspensiones no acumulan alcaloides indlicos dimricos: vinblastina y vincristina.- Se necesitara aumentar la productividad 40 veces respecto de la productividad especfica obtenida actualmente (0,26 mg/g peso seco/da) para que el proceso sea viable.
Vinblastina
Tomado de: Manhart Plant Image Gallery
Produccin de alcaloides indlicos de Catharantus roseus:vincristina y vinblastina
Estructuras de vainillina y de distintasantocianinas
Vainillina (1)Pelargonidina-3-glucsido R2=OH (1)Cianidina-3-glucsido R2+R3=OH (2)Delfinidina-3-glucsido R1+R2+R3=OH (3)
Wescott et al., 19940,7B5Races areas transfectadasWescott et al., 19940,002-Fruto
Referencia% Peso SecoMedioMaterial
Wescott et al., 19940,7B5Races areas transfectadasWescott et al., 19940,002-Fruto
Referencia% Peso SecoMedioMaterial
Produccin de vainillina en clulas y tallos de Vanilla planifolia cultivados in vitro
a Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/Lb Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L NAA, 0,1 mg/L cinetina, y 15 mM total Nc Medio de Murashige y Skoog (1962) con 5 mg ANA y 0,5 mg/L cinetina
Do y Cormier, 1991B5bSuspensin celularVitis viniferaOxalis reclinata
Aralia cordataEspecie
Crouch et al., 1993MScSuspensin celular
Sakamoto et al., 1994cianidin 3-xilosilglucosido 10,3B5aSuspensin celularReferencia% Peso SecoMedioMaterial
Do y Cormier, 1991B5bSuspensin celularVitis viniferaOxalis reclinata
Aralia cordataEspecie
Crouch et al., 1993MScSuspensin celular
Sakamoto et al., 1994cianidin 3-xilosilglucosido 10,3B5aSuspensin celularReferencia% Peso SecoMedioMaterial
Produccin de antocianinas por clulas cultivadas in vitro
Tomado de: Kurtz and Constabel, Agricultural Biotechnology, 1998.
Fenilpropanoides y flavonoides: algunos casos tpicos...
Conclusiones Aspectos bioingenieriles a resolver:
- Diseo de biorreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales
- Instrumentacin y control de los bioprocesos- Diseo de biorreactores ms econmicos- Mtodos no letales para liberacin
de los metabolitos secundarios- Mtodo adecuado para la remocin in situ
Aspectos biolgicos a resolver:
- Conocimiento de la regulacin de las rutas biosintticas: enzimas y factores de transcripcin
- Conocimiento de la regulacin del transportey acumulacin de los metabolitos secundarios
- Conocimientos de los mecanismosde degradacin del producto
1. Plant Biotechnology. Fowler, M., Gwarren,G.S. andMoo-Young, M. (eds.). Pergamon Press, 1992.
2. Plant cell and tissues culture en liquid system. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L. Munich Hanser Publishers, 1991.
3. Secondary products from plant tissue culture. Charlwood, B. and Rhodes, M.J.C. (ed.). Oxford University Press, 1990.
4. Design, formulation, and optimization of media. In: Bioreactor System Design. Asenjo, J. and Merchuk, J. (ed.) Marcel Dekker Publishers, 1995.
5. Hairy Roots, Culture and Application. Doran, P. (ed.). Harwood Academic Publishers, 1997.
6. Bioprocess Engineering Principles. Doran, P. AcademicPress, Harcout Brace and Company Publishers, 1998.
Referencias