Ingeniería Genética

Mercedes Goin

Laboratorios Denver Farma S.A.

Conjunto de metodologías que permite transferir

genes de un organismo a otro y expresarlos

(producir las proteínas para las cuales estos genes

codifican) en organismos diferentes al de origen.

¿Qué es la Ingeniería Genética?

1- Obtención del gen de interés

2- Clonación del gen

3- Obtención de la cepa productora

4- Producción de la proteína de interés (POI)

5- Purificación / procesamiento de la POI

6- Formulación

PRODUCTO SISTEMA DE PRODUCCIÓN INDICACIÓN TERAPÉUTICA

Factores de coagulación

Factor VIII Cultivo de células de mamífero

Hemofilia A

Factor IX Cultivo de células de mamífero

Hemofilia B

Factor VIIa Cultivo de células de mamífero

Ciertas formas de hemofilia

Anticoagulantes

Activador del plasminógeno tisular

Cultivo de células de mamífero

Infarto de miocardio

Activador del plasminógeno tisular

E. coli Infarto de miocardio

Hirudina Levaduras Trombocitopenia y prevención de trombosis

Productos farmacéuticos aplicados a la salud

humana y que provienen de organismos

genéticamente modificados

Hormonas

Insulina Levaduras Diabetes mellitus

E. coli

Hormona de crecimiento E. coli Deficiencia de la hormona en niños, acromegalia, síndrome de Turner

Folículo-estimulante Cultivo de células de mamífero Infertilidad, anovulación y superovulación

Paratiróidea E. coli Osteoporosis

Gonadotrofina coriónica Cultivo de células de mamífero Reproducción asistida

Tirotrofina Cultivo de células de mamífero Detección /tratamiento de cáncer de tiroides

Luteinizante Cultivo de células de mamífero Ciertas formas de infertilidad

Calcitonina E. coli Enfermedad de Paget

Glucagon Levaduras Hipoglucemia

Factores hematopoyéticos

Eritropoyetina (EPO) Cultivo de células de mamífero Anemia

Factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF)

E. coli Netropenia, transplante autólogo de médula

Interferón e interleuquinas

Interferón alfa (IFN alfa) E. coli Hepatitis B y C, distintos tipos de cáncer

Interferón beta (IFN beta) Cultivo de células de mamífero Esclerosis múltiple

Interferón gamma (IFN gamma 1b) E. coli Enfermedad granulomatosa crónica

Interleuquina 2 (IL-2) E. coli Cáncer de riñón

Anti-hepatitis A Levaduras Inmunización contra la hepatitis A

Anti-enfermedad de Lyme E. coli Inmunización contra la enfermedad de Lyme

Anticuerpos monoclonales recombinantes

Anti-IgE (recombinante) Cultivo de células de mamífero Asma

Anti-TNF (recombinante) Cultivo de células de mamífero Arthritis reumatoidea

Anti-IL2 Cultivo de células de mamífero Prevención del rechazo agudo de transplante de riñón

Otros productos recombinantes

Proteína morfogénica del hueso-2

Cultivo de células de mamífero Fractura de tibia

Galactosidasa Cultivo de células de mamífero Enfermedad de Fabry (deficiencia en alfa-galactosidasa)

Iaronidasa Cultivo de células de mamífero Mucopolisacaridosis

Proteína C Cultivo de células de mamífero Sepsis severa

Beta-glucocerebrosidasa E. coli Enfermedad de Gaucher

DNAsa Cultivo de células de mamífero Fibrosis quística

Fuente: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 Nº8- Cuadernillo 49de PorqueBiotecnología

Vacunas

Anti-hepatitis B Levaduras Inmunización contra la hepatitis B

Obtención del material genético

ADN

ARN

ADN

¿Por qué ARN y no ADN?

¿Cuál es la fuente del ARN?

¿Cuándo ADN?

¿Fuente?

aislamiento

Opciones

síntesis

• Ruptura celular: ruptura mecánica o

enzimática

• Remoción de lípidos: detergente

• Remoción de proteínas: proteasas, fenol

cloroformo

• Precipitación del ADN: sal + etanol

• Agentes quelantes (EDTA): remoción de

Ca 2+, Mg 2+, para inhibir DNasas

Elección de la sal

Acetato de Na+ (0,3 M)

NaCl (0.2 M): muestras con SDS

LiCl (0,8 M): para ARN (inhibe síntesis proteica y ADN polimerasa)

Acetato de NH4+: para remoción de dNTPs (inhibe T4 PNK)

Separación de fragmentos de ácidos nucleicos:

Electroforesis de ADN y ARN

La carga neta de los ácidos nucleicos es

negativa

Migración : de cátodo a ánodo

Separación de fragmentos de ácidos nucleicos:

Electroforesis de ADN y ARN

Electroforesis en gel de agarosa

Fabricación del gel Siembra de las muestras Transcurso de la electroforesis

(30-60 min)

Electroforesis en gel de poliacrilamida

* Menor rango de separación pero mayor resolución que los geles de agarosa.

Agentes intercalantes: bromuro de etidio, SIBR green.

¿Cómo vemos lo que hay en el gel?

Electroforesis de ADN

Electroforesis en gel de agarosa

Efecto de la concentración

de agarosa en la migración

-

+

DNA cromosómico digerido con EcoRI

1.0

1.62.0

3.04.05.0

kbp

DNA plasmídico digerido

con diferentes enzimas de

restricción

Electroforesis de ARN

Expresión diferencial de un gen

en diversos tejidos (Northern blot)

Resolución de muestras de

ARN total en un gel

de agarosa al 0,8%.

A partir del gel podemos aislar el

fragmento de interés

CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

ESPECTROFOTOMETRÍA UV: λ 260 nm

TriptofanoSales

Max. Abs ADN

Insolubles

A260/A280= 1,8

A260/A280 > 1,8……ARN? (A260/A280= 2- ARN puro)

A260/A280 < 1,8……Fenol? Proteínas?

ESPECTROSCOPIA UV: λ 260 nm

ADNdc: A260= 1 50 μg/ml

Una solución de ADN tiene una A260= 0,40

¿Cuál es la concentración de ADN en μg/ml?

50 μg/ml = X μg/ml

1 OD 0.4 ODX = 20 μg/ml

Coeficiente de extinción de ADNdc: E o ε= constante de absorción = coeficiente de absorción

Abs. 260 nm de una sc. 1 mg/ml de ADNdc = 20 = E(pH neutro, G+C 50%, paso de luz 1 cm)

Ley de Beer: A260= E260.l.c.

l = 1 cm A260= E260.c

C= A260/E260

Una solución de ADN tiene una A260=1

¿Cual es la concentración de ADN en μg/ml?

C= A260 C= 1 = 0.05 mg/ml = 50 μg/ml

E260 20

A260 nm de una sc. 1 mM de ADNdc = 6,7 = E260

Coeficiente de extinción, E260, para una

solución de ADNdc 1 mM

Una solución de ADN tiene una A260=0.212.

¿Cuál es la concentración expresada en milimolar?

1 mM = x mM x= 0.03 mM

6,7 OD 0.212 OD

ESPECTROSCOPIA UV: λ 260 nm

ADN simple cadena

ADNsc: Abs. 1= 33 μg/ml

Peso Molecular de deoxinucleotido: 330 daltons = g/mol

E260 ADNsc 1 mM = 8,5

Un stock de ADN del fago M13, de 7250 nucleótidos,

tiene una concentración de 412,5 μg/ml

¿Cuál es la concentración expresada en pmoles/μl?

7250 nuc x 330 g/mol = 2,39 10 6 g/mol = pg/pmol

1 nuc

412,5 μg/ml= 0.4 μg/ μl = 412000 pg/μl

0.4 pg/ μl x 1 pmol = 0.17 pmol/ μl

2.39 pg

Cuantificación de oligonucleótidos

Unidades de densidad óptica (OD u)

1 ODu = cantidad de oligonucleótido disuelto en 1 ml con A260 = 1 en

cuveta de 1 cm de paso de luz

OD u = A260 x vol. Oligonucleótido x factor de dilución

Abs260=1 = 1 OD u = 33 μg/ml ADN sc

Concentración de oligonucleótido expresada en pmol/μl

A260 x 100

C= x factor de dilución

(1,54 x nA) + (0,75 x nC) + (1,17 x nG) + (0,92 x nT)

Coeficiente de extinción de cada base

Una solución 1M de dATP tiene A260= 15400 E26015400L/mol = 0,00154 μl/pmol

Medida de la concentración de ARN

A260 = 1 40 μg/ml ARN

Agentes intercalantes: bromuro de etidio, SIBR green.

Estimación de la concentración de ADN en geles

teñidos con bromuro de etidio

Cuantificación de ADN por fluorometría

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Endonucleasas de restricción.

* Enzimas producidas de manera natural por microorganismos cuya función

es la de degradar el ADN exógeno.

* Se unen específicamente a secuencias concretas de ADN de doble cadena

y la rompen (endonucleasas).

Tipo I: poseen actividad metilasa y de restricción. ATP-dependientes. Rompen

el ADN lejos del sitio que reconocen (>1Kbp) de manera aleatoria carecen

de interés práctico.

Tipo III: poseen actividad de restricción y modificación. Cortan fuera de la

Secuencia que reconocen. Requieren dos secuencias de reconocimiento en

orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Son ATP-dependientes.

Tipo II: sólo actividad de restricción. No ATP-dependientes. Reconocen

secuencias específicas de ADN (de 4 a 8 bp, muchas de ellas palindrómicas).

Punto de rotura característico para cada una y próximo a la secuencia

reconocida fragmentos discretos. Hay cientos comercialmente disponibles.

Palindromo:

Palabra o frase que se lee igual de izquierda a derecha que de

derecha a izquierda , ej. RADAR, ANILINA, DÁBALE ARROZ A LA

ZORRA EL ABAD

TTAGCACGTGCTAA

AATCGTGCACGATT

Toman el nombre de las bacterias que las producen. Ej.

EcoRI E: género Escherichia

co: especie coli

R: cepa RV 13

I: primera endonucleasa aislada de esta cepa

Enzima Fuente Secuencia de

reconocimiento

Corte

EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC

3'CTTAAG

5'---G AATTC---3'

3'---CTTAA G---5'

Pvu II Proteus vulgaris 5'CAGCTG

3'GTCGAC

5'---CAG CTG---3'

3'---GTC GAC---5'

KpnI Klebsiella pneumoniae 5'GGTACC

3'CCATGG

5'---GGTAC C---3'

3'---C CATGG---5'

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

ISOESQUISÓMEROS

Endonucleasas de restricción que reconocen la misma secuencia

SmaI CCCGGG XmaI CCCGGG Neoisoesquisómeros

GGGCCC GGGCCC

BspDI ATCGAT ClaI ATCGAT

TAGCTA TAGCTA

Pag.295

Hay enzimas que reconocen secuencias

tetranucleotídicas

En algunos casos esas secuencias están dentro

de una secuencia de 6 nucleótidos, blanco de

otra enzima. Ej.

MboI y Sau3AI 5´…….GATC……3´

3´…….CTAG……5´

BamHI 5´……GGATCC……3´

3´……CCTAGG……5´

SalI GTCGAC …. G

CAGCTG ……CAGCT

GTCGAG No se corta

CAGCTC con XhoI ni

con SalI !!!

XhoI CTCGAG TCGAG…..

GAGCTC C…..

Ligación de fragmentos generados por 2

enzimas de restricción

MAPEO DE RESTRICCIÓN

Procariontes

Dam metilasa……………GmATC

Dcm metilasa……………CmCAGG y CmCTGG

EcoKI Metilasa…...………metila A en AAC(N6)GTGC o GCAC(N6)GTT

La mayoría de las cepas que se usan para clonado son Dam+ y Dcm+

La eficiencia de transformación puede variar con el estado de metilación del

plásmido

METILACIÓN

S-adenosilmetionina

METILACIÓN

Eucariontes:

Metilasas de sitios mCG.

Los patrones son tejido específicos,

heredables y correlacionan con la

expresión de genes.

Los patrones de metilación CpG no se mantienen cuando el ADN es clonado en bacterias

La metilación de los sitios de restricción puede

impedir la acción de la enzima de restricción

Los sitios se pueden desmetilar usando

cepas de E coli dam- dcm-

Pag 206

Dam metilasa

“overlapping site”

No corta!!!!

Corta!!!!

Pag 52

Pag.315

M. EcoRI GAATTC inhibe el corte con EcoRI

CTTAAG

M.HaeIII

M. HaeIII GCCNNNNNGGCC inhibe el corte con HaeIII y BglI

BglI

M. TaqI TCGATCGA M.TaqI TCGATCGA

AGCTAGCT AGCTAGCT

TaqI TaqI DpnI

Modificación de sitios de restricción por

metilación del ADN

Corta sólo si está metilado

Sistemas de restricción dependientes

de la metilación en E. coli

EcoKI :genes hdsRMS, ataca ADN NO protegido por

metilación en A en sitio: AA[N6]GTGC o GCAC[N6]GTT

McrA, McrBC y Mrr: genes mcrA, mcrB y mrr, atacan

ADN metilado en ciertas posiciones

Para clonar usar preferentemente cepas defectuosas

en loci hds, mcrA, mcrBC y mrr

Pag.206

FACTORES QUE INFLUENCIAN LA ACTIVIDAD DE

LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Composición del buffer

Temperatura de incubación

Metilación del ADN

“Star activity”……………pH alto (>8) , baja fuerza iónica (ej. olvido de buffer)

Cc de glicerol >5%

Cc muy alta de enzima (> 100 U/ug de ADN)

Solventes orgánicos (ej. Etanol, DMSO)

Digestión con múltiples enzimas

Variabilidad en la digestión de diferentes ADNs

Pag. 276-284

Digestión de un plásmido, preparado con kit Wizard

plus midipreps Promega, con BamHI y NotI

ADN sin precipitar ADN precipitado

REBASE Tools

•Theoretical digests with all

REBASE prototypes...

•Blast your sequence against

REBASE...

•New England Biolabs

NEBcutter...

•REBpredictor...

http://rebase.neb.com/rebase/rebtools.html

aaattgggtcccgtccacgttgcatttgtgtcaccatgct

gtcatgccctg

http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/

LIGACIÓN DE ADN

VECTOR: Moléculas transportadoras que transfieren y replican

fragmentos de ADN que llevan insertados.

LIGACIÓN DE ADN

T4 Ligasa liga extremos cohesivos y romos

Necesita ATP y Mg++

Relación molar vector:inserto

Temperatura óptima

Cantidad de enzima

Inhibición por alta sal y EDTA

Se inactiva a 65 ºC 10 min

Buffer ligasa ¡siempre frio!!!

ADN LIGASAS

Ligasa del bacteriófago T4. Requiere ATP y Mg2+.

Extremos cohesivos y romos. dsDNA o dsRNA.

Ligasa de E. coli. Requiere NAD+.

La eficiencia de ligación depende de:

La cc absoluta de ADN: La cc debe ser lo suficientemente alta para

asegurar que la ligación intermolecular esté favorecida sobre la auto

ligación pero no demasiado alta que cause la formación de

oligómeros.

Por ej. para vectores pET…1 nM, 50-100 ng vector en 20 μl de

reacción

Relación inserto/vector. La máxima eficiencia de ligación se

obtiene en general usando una relación molar de inserto/vector=2

Estrategia de clonado

Clonado dirigido

¿Qué hacemos para que el vector no

recircularice?

Desfosforilación del vector

Vector digerido con 2 enzimas distintas

y purificado por gel

Vector digerido con 2 enzimas distintas

sin purificar por gel

Vector digerido con 1 enzima y

desfosforilado

Vector digerido con 1 enzima

sin desfosforilar

Masa de inserto en ng = Tamaño del inserto en pb x Masa del vector en ng

Tamaño del vector en pb

Cálculo de la cantidad de inserto

¡¡¡¡Probar varias relaciones molares!!!!!

LIGACIÓN

extremos cohesivos extremos romos

ATP 5 mM 0,5 mM

Ligasa 0,1 uWeiss 50 uWeiss

ADN > cc….PEG

Unidad Weiss: cantidad de enzima que cataliza el intercambio de 32P

de pirofosfato a [γ,β-32P]ATP en 20 minutos a 37ºC.

ADN Polimerasas

Templado: ADN

E. coli ADN Polimerasa I (y fragmento Klenow)

T7 ADN Polimerasa

ADN Polimerasas Termoestables (Taq, Pfu, Vent, etc.)

Templado: ARN

Transcriptasas Reversas

cebador o primer

E. coli ADN polimerasa I

E. coli ADN polimerasa I

(109 KDa)

5’→ 3’ ADN polimerasa

5’→ 3’ exonucleasa

3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)

Proofreading activity = lectura de prueba

*Verifica nucleótidos después de ser añadidos.

*Permite eliminar nucleótidos desapareados en extremos 3’ y generar

extremos romos .

ADN polimerasa I

*No deseable en muchos casos por su actividad 5´ 3´ exonucleasa porque

degrada el extremo 5´de primers y remueve 5´P de extremos a ser ligados

Fragmento de Klenow de la E. coli ADN polimerasa I

5’→ 3’ DNA polimerasa

3’→ 5’ exonucleasa

Fragmento Klenow de la

E. coli ADN polimerasa I

(68 KDa)

5’→ 3’ ADN polimerasa

3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)

* Síntesis de la 2a hebra en ADNc

* Fill in o marcación de extremos 3´recesivos de ADNdc

* Marcación de ADN por el método random primer

* Secuenciación de ADN por el método de Sanger

* Mutagénesis sitio específica con oligonucleótidos sintéticos

T7 ADN Polimerasa

-Carece de actividad exo 5’-3’. Modificable química o genéticamente para

eliminar actividad exo 3’-5’ SequenaseTM)

- Muy procesiva: muy útil en secuenciación de ADN (Sequenase™) por el

método de Sanger.

T7 ADN polimerasa I

5’→ 3’ DNA polimerasa

3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)

ADN transferasa terminal

•Adición de nt’s al extremos 3’ del ADN:

- ssDNA (incluyendo extremos 3’ protuberantes de dsADN).

- Añade también homopolímeros de nucleótidos al extremo 3’ de ADN

- Con menor eficiencia en extremos romos y recesivos

Utilidades:

• Marcación de los extremos 3' del

ADN

•Añade colas de homopolímero

al ADN

ADN transferasa terminal

Nombre 3'->5‘ Exo Origen Propiedades

Taq No Thermus aquaticus Vida media a 95º C 100 min.

Alta tasa de error (10-4 a

2.10-5 por pb)

Pfu Sí Pyrococcus furiosus Baja tasa de error. 1-2.10-6

por pb)

Vent (Tli) Sí Thermococcus litoralis Vida media a 95º C aprox. 7

horas

Máxima actividad catalítica sobre 75-80 ºC. (Taq polimerasa sólo 10% activ. a 37 ºC)

Muy utilizadas en reacciones de PCR

y secuenciación de ADN

ADN Polimerasas Termoestables (Taq, Pfu, Vent, etc)

1976: Thermus aquaticus 1988: polymerase chain reaction (PCR)

Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase.Science. 1988, 239(4839):487-91

ADN polimerasas dirigidas por ARN

Codificadas por retrovirus (Moloney murine leukemia o Avian myeloblastosis)

Dos actividades:

ADN polimerasa:in vivo copia sólo RNA, pero in vitro puede usar ssRNA o ssDNA (siempre necesita cebador de

RNA o DNA)

RNase H:Ribonucleasa que degrada RNA en híbridos RNA-DNA, como los formados durante la

transcripción reversa (exo y endonucleasa)

Usos:

- generación de cDNA

- RT-PCR

Híbrido DNA-RNA5’ 3’

5’ 3’

Transcriptasas reversas

Enzima Exo 3’-5’ Exo 5’-3’ Capacidad de

polimerización

Procesividad Error

rate

(x106)

E. coli polim. I Baja Sí Media Baja 9

Frag. Klenow Baja No Media Baja 40

T7 DNA polim. (nativa)

Alta No Rápida Alta <1

T7 DNA polim. (modificada)

Baja/No No Rápida Alta

Taq DNA polim No SíRápida

Alta 285

Transcrip. reversa

No No Lenta Intermedia

Resumen de las características de las ADN Polimerasas

MARCACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Marcación de ácidos nucleicos: Síntesis de ADN uniformemente marcado.

b) Random priming

+

Desnaturalización por calor(10 ºC, 10 min)

Generación de cadenas simples

3’5’ 3’5’

Unión de oligos (6-10 nt) “random”

3’5’ 3’5’

Extensión mediante Klenow

3’5’

Generación de fragmentos Marcados (150-200 nt)

a) Nick translation

Actividad exo 5’-3’ de DNA pol. I

2

Corte (nick)por DNAsa I1

Incorporación dNTP marcadospor act. polimerasade DNA pol. I

3 dNTP

DNA duplex

c) Mediante PCR

dNTP EMPLEADO PARA LA MARCACIÓN:

Radioactivos:

32PαdNTP, 35SαdNTP, 125 I αdNTP

No radioactivos:

biotina-11-dUTP

digoxigenina-11-dUTP

α32P-ATP !!!

"nick" ruptura de un enlace éster en un fosfato 5'., con la liberación de un

grupo hidroxilo 3'. La DNAsa produce nicks

"gap" desaparición de una serie de nucleótidos contiguos

Utilidad:

1.- Marcación (p. ej. Radioactivo) de oligonucleótidos para estudios de hibridación

2.- Fosforilación de extremos 5’ no fosforilados, necesarios para ligación, de

“linkers” (adaptadores) o fragmentos de DNA.

Cataliza la transferencia de un fosfato desde el ATP hasta el extremo 5' de ADN o ARN

Comprar 32PγATP!!!!

Marcación de ácidos nucleicos: en el extremo del ADN

Polinucleótido quinasa

Nick translation (DNAsa I + DNA polimerasa I).

Random priming (Klenow)

PCR (polimerasas termoestables)

Marcación del extremo 5’ (polinucleótido quinasa)

Eficiencia

Baja

Media

Alta

Alta

DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

POR HIBRIDACIÓN

Calor

Agentes químicos

Tm: temperatura de “melting”: temperatura a la

cual el 50 % de las moléculas del oligonucleótido

están formando un dúplex con su hebra

complementaria

Td: Temperatura de disociación: temp. a la cual el

50 % del oligo y su hebra complementaria unida a

membrana están en duplex para una cc particular

de sal y ADN

longitud

Tm: depende de composición: AT vs GC

cc. de sales: cationes divalentes estabilizan.. Tm

agentes desnaturalizantes: urea, álcali

solventes orgánicos: formamida Tm

Métodos para determinar Tm

http://insilico.ehu.es/tm.php

Método de Wallace:para oligos de 14-20 nucleótidos, hibridación en

membrana.

Td = 2°C(A+T) + 4°C(G+C) agregar 8ºC para convertir en Tm

% de GC

Tm=81.5 ºC+16.6 (log10[Na+])+0.41(f% G+C)-0.63(% formamide)-

(600/length)

Vecino más cercano: no para oligos > 50 nuc.

Tm= (ΔH-3,4 kcal)/((A+ ΔS)+(R ln(c/4)))-273.15 log(sal)

Δ H:sumatoria de los cambios de entalpía de los vecinos

Δ S: sumatoria de los cambios de entropía de los vecinos

R: cte de los gases

A: cte para sec. complementarias o no complementarias

La técnica de Southern blot

La técnica de Southern blot

Southern blot

Northern Blot

Western blot

Western blot