Metabolismo de Carbohidratos2015-2b

II. Manual de Prácticas Laboratorio de Bioquímica

Metabólica

II. Manual de Prácticas. Laboratorio de Bioquímica Metabólica

1. Metabolismo de Carbohidratos

Todos los organismos obtienen energía de la degradación oxidativa de glucosa y otros carbohidratos. Incluso para algunas células y organismos, como las células del cerebro y muchas bacterias, esta es la principal o única fuente de energía.

Las investigaciones realizadas en la década de 1940 a 1950, en los Estados Unidos, Inglaterra y Alemania, dieron a los bioquímicos la información precisa para trazar las rutas importantes del metabolismo de carbohidratos (Véase la figura 1.1). La glucólisis, la ruta más importante de este proceso, transforma la glucosa a piruvato en condiciones anaeróbicas junto con una pequeña producción de energía en forma de ATP y NADH. El piruvato todavía tiene mucha energía potencial, y sólo se puede extraer por metabolismos aeróbico. En la ruta de fosfogluconato, una ruta auxiliar de la oxidación de la glucosa en los animales, se produce la pentosa ribosa 5-fosfato y el cofactor reducido NADPH. La glucosa excedente, que no se requiere en el catabolismo, se almacena en forma de almidón (en las plantas) o de glucógeno (en los animales) o en algunos organismos se utiliza para formar grasas. La glucosa almacenada en esos depósitos se puede liberar cuando hay una demanda de energía. Los niveles de glucosa también se pueden aumentar mediante síntesis (gluconeogénesis) partiendo del piruvato o lactato. Además de su función tan importante en el metabolismo energético, la glucosa también es un precursor en la síntesis de polisacáridos estructurales como celulosa, disacáridos como sacarosa y lactosa y de otros monosacáridos como galactosa y fructosa. A continuación se exponen los detalles dela ruta glucolítica.3

Figura 1.1 Principales vías del metabolismo de glucosa en plantas y animales.3


GlucólisisLa glucólisis es la vía metabólica

por la que se degrada la glucosa (figura 1.2); filogenéticamente, es la vía más antigua y consiste en una secuencia de reacciones enzimáticas en las cuales se degrada la glucosa. La glucólisis puede dividirse en dos fases: una de activación y una oxidativa. La fase de activación consiste en la transferencia de fosfatos a la glucosa con gasto de dos ATP y en su ruptura en dos moléculas de gliceraldehído 3 fosfato; en la fase oxidativa, el gliceraldehído 3 fosfato es transformado en piruvato con la obtención de cuatro moléculas de ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

Las reacciones de la glucólisis ocurren en el citoplasma y no están ligadas a estructuras celulares. El producto de la vía es el piruvato, el cual puede seguir diversos destinos según las condiciones de la célula. En condiciones

de anaerobiosis, el piruvato se transforma en lactato por acción de la lactato deshidrogenasa en presencia del NADH obtenido de la oxidación del gliceraldehído 3 fosfato. En las levaduras, el piruvato se descarboxila a acetaldehído y se forma etanol por la reducción del acetaldehído con el NADH mediante la acción de la deshidrogenasa alcohólica. Bajo condiciones aerobias, el piruvato se descarboxila por un complejo multienzimático, la piruvato deshidrogenasa, en presencia de la HSCoA y produce NADH y acetil CoA, la cual es el sustrato principal del ciclo de Krebs.

Sólo una pequeña parte de la energía almacenada en la molécula de la glucosa se libera en la glucólisis (2 ATP netos por cada molécula de glucosa). En estricta anaerobiosis, la glucólisis es la única fuente de energía de la célula.

La regulación de la vía glucolítica se realiza a nivel de la transformación de la

fructosa 6P en fructosa 1-6 bisP. Esta reacción es catalizada por la fosfofructocinasa. La fosfofructocinasa es una enzima alostérica cuya actividad se estimula por AMP y ADP y se inhibe por ATP y citrato. 19

Toda célula viva debe extraer de alguna manera energía libre de los nutrientes que obtiene del medio. Los mecanismos enzimáticos utilizados para extraer la energía libre de compuestos como la glucosa y para conservar una parte de ella en una forma biológicamente útil, como ATP, son muy parecidas en todas las células.

Algunas bacterias efectúan el proceso denominado respiración anaerobia; es decir, una respiración que ocurre en ausencia de oxígeno. En la fermentación, que también es anaerobia, se genera ATP mediante un proceso en el que utilizan compuestos orgánicos como

donadores y aceptores de electrones. Ciertos tipos de bacterias viven exclusivamente de la fermentación; otras recurren a ese proceso cuando se agota el oxígeno en su medio. La producción de alcohol a partir del azúcar es un ejemplo de fermentación. Cuando se agota el oxígeno, las levaduras convierten el piruvato en etanol. Ciertas bacterias y algunas células animales, principalmente las musculares, son capaces de obtener energía por la vía anaerobia (como en la fermentación) durante un tiempo, a través de la producción de lactato.

La ineficiencia del proceso anaerobio (fermentación) demanda el consumo de gran cantidad de combustible.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es capaz de metabolizar la glucosa hasta etanol en condiciones anaerobias y hasta bióxido de carbono en condiciones de aerobiosis.4,5,14,25


Figura 1.2 Ruta glucolítica.23


UNIVERSIDAD VERACRUZANALABORATORIO DE BIOQUÍMICA METABOLICA

PRÁCTICA No. 1

PIRUVATO: METABOLITO INTERMEDIARIO DE LA GLUCÓLISIS.

NOMBRE:__________________________________GRUPO:________FECHA:_________

TIEMPO DE PRÁCTICA: 2 Horas

OBJETIVO: Comprobar la producción de

piruvato y acetaldehído y etanol durante la fermentación de la glucosa.

PREGUNTAS PRELABORATORIO

1.-¿Qué es la glucólisis?

2.-¿Cuáles son los productos finales de la glucólisis en ausencia y presencia de oxígeno?

3.-¿Cuántos ATP son sintetizados en la glucólisis?

4.-¿En donde se lleva a cabo la glucólisis?

FUNDAMENTO

Según el organismo y sus condiciones de crecimiento, la vía de la glucólisis puede cumplir distintas funciones. En muchos microorganismos que viven en condiciones anaeróbicas (sin oxígeno), sirve como la principal vía productora de energía por catabolismo de carbohidratos, lo que da por resultado la formación de productos metabólicos finales específicos, como etanol, ácido láctico, glicerol y CO2.2

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIAL DE LABORATORIO:- Baño maría- 1 Pipeta Pasteur- 1 Pipeta de 2 mL - 2 Pipetas graduadas de 5 mL- 2 Pipetas graduadas de 10 mL- 1 Probeta de 250 mL- 5 Tubos de ensaye- 2 Tubos con tapón de rosca- 3 Vasos de precipitados de 250 mL- 1 Matraz Erlenmeyer de 300 mL, con tapón - 1 Agitador de vidrio- 1 Perilla- 1 Tubo rectangular- 1 Tubo de vidrio con una longitud de 30 a

35 cm- 1 Tripié- 1 Mechero- 1 Tela de asbesto

MATERIAL BIOLÓGICO:- Levadura de pan, 11 g

REACTIVOS:(Para su preparación véase la preparación de soluciones).- Suspensión de levadura 50 g/L en agua - Ácido tricloroacético al 1%- Solución acuosa de piperidina al 3%- Solución de nitroprusiato de sodio al 5% (preparar en el momento de usar)- Solución de glucosa al 10%- Hidróxido de sodio al 10%- 2,4-dinitrofenilhidrazina al 10%


- Carbonato de calcio al 10%, 100 mL- Sulfato de amonio (sólido)- Sulfito de sodio (sólido)- Solución de hidrocloruro de 2,4-dinitrofenilhidrazina (solución saturada en HCl 2 M)- Solución saturada de hidróxido de

calcio, 50 mL- Hidróxido de amonio concentrado- Benceno, 50 mL- Cloruro de calcio- Aceite parafínico

EQUIPO:- Balanza analítica o granataria- Centrifuga- Estufa a temperatura constante (30° C)

A) Formación de Piruvato a partir de Glucosa

MÉTODO I:1. Mida 5 ml de solución de levadura (50 g/L) en un tubo de ensaye, agregue 5 mL de solución de glucosa al 10% e incube durante 24 horas a 30° C2. Después de 24 horas tome 5 mL del caldo fermentado y añada 2 mL de solución de 2,4 dinitrofenilhidrazina al 10% y agite.3. Deje reaccionar 5 minutos y añada 5 mL de benceno.4. Agite durante 1 minuto y espere a que la emulsión se rompa y con una pipeta transfiera la fase bencénica a un tubo limpio.5. Añada 5 mL de carbonato de calcio al 10% y agite.6. La reacción entre el ácido pirúvico y la hidrazina debe dar un cambio de color.1

MÉTODO II:1. En dos tubos mida 5 mL de solución de glucosa al 10%, un tubo debe tener tapón de rosca y otro no, etiquete los tubos (A y B).2. A los dos tubos, agregue 5 mL de suspensión de levadura en agua. El tubo A

permanecerá para evitar la entrada de aire, el tubo B no se tapa. Coloque los tubos en un baño maría a 37° C durante una hora. 3. Añada a cada tubo 2 mL de la solución de ácido tricloroacético al 1%. Mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500 rpm.4. Separe el sobrenadante y utilícelo para la determinación de piruvato.

A-2) Determinación de Piruvato mediante Nitroprusiato de Sodio

1. En un tubo de ensaye agregue 2 mL del sobrenadante y hiérvalo.2. Agregue 1 g de sulfato de amonio sólido.3. Agregue dos gotas de solución de nitroprusiato de sodio al 5% (recién preparada).4. Mezcle vigorosamente y deje deslizar cuidadosamente por las paredes del tubo hidróxido de amonio concentrado hasta que se formen dos capas.5. Si hay piruvato, se forma un anillo verde o azul en la interfase de los dos líquidos. La formación de un anillo rosado transitorio en la interfase indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloración azul o verdosa característica de la reacción con piruvato.

A-3) Determinación de Piruvato con 2,4-Dinitrofenilhidrazina

1. Agregue 1 mL de solución saturada de 2,4-difenilhidrazina a 2 mL de sobrenadante.2. Mezcle fuertemente y coloque dos o tres gotas de mezcla en un tubo de ensaye.3. Agregue 1 mL de solución de hidróxido de sodio al 10% y diluya con agua hasta 5 mL.4. La presencia de un color rojo indica la presencia de piruvato.A-4) Formación de Acetaldehído a partir

de Glucosa

1. En dos tubos de ensaye, mida 5 mL de la solución de glucosa al 10% y agregue 5 mL de la suspensión de levadura en agua,

un tubo deberá ser con tapón de rosca y el otro no, etiquete los tubos (C y D).


2. Al tubo D añada 0.5 g de sulfito de sodio. Mezcle vigorosamente.3. Incube los tubos a 37° C durante una hora. El tubo C deberá permanecer cerrado. 4. Centrifugue y separe el sobrenadante.5. Mezcle 2 ml de sobrenadante con 0.5 ml de solución de nitroprusiato de sodio al 5% (recién preparada) y 2 mL de piperidina al 3%. Agite.6. Si hay acetaldehído presente, se observara una coloración azul. 22


HOJA DE RESULTADOS

NOMBRE:_______________________________GRUPO:__________FECHA:__________

1.- Anota el cambio de color observado al agregar el 2,4-dinitrofenilhidrazina al tubo, ¿resultó el color esperado?

2.-Completa la tabla con tus observaciones para los incisos A.

Tubos Color InterpretaciónNitroprusiato de sodio

AB

2,4-DinitrofenilhidrazinaAB

AcetaldehídoCD

3.- Escribe la reacción que se lleva a cabo para la producción del carbonato de calcio.4.-¿Qué sucedió en el tubo que contenía la solución saturada de hidróxido de calcio, generado en la fermentación alcohólica?

5.-Calcula la cantidad de glucosa convertida en etanol en el inciso B. Describe lo observado al comprobar la presencia de etanol. 6.- ¿Qué función tenía el cloruro de calcio en la reacción?

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES


CUESTIONARIO

1.- ¿Cuáles son los productos finales en el metabolismo de la glucosa en las siguientes células. En cada caso escribe la ecuación mostrando la reacción general.

a) En células con un metabolismo activo y con un abundante suministro de oxígeno.

b) En células del músculo después de una carrera enérgica.

c) En células de levadura bajo condiciones anaerobias.

2.- ¿Cuáles reacciones son los puntos de control en la glucólisis?3.- Es bien conocido entre los cazadores que la carne de animales que han estado corriendo antes de morir tiene un sabor agrio. Sugiere una razón para esta observación.4.- En la glucólisis la síntesis de ATP esta catalizada por:

a) Hexoquinasa.b) 6-fosfofructoquinasa.

c) Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa.d) Piruvato quinasa.e) Ninguna de las anteriores.

5.- La actividad de la 6-fosfofructoquinasa puede ser disminuida por los siguientes factores excepto por:

a) ATP en altas concentraciones.b) Citrato.c) AMPd) Bajo pHe) Disminución de la concentración de

fructosa 2,6-bifosfato.6.- Los altos niveles de glucosa 6-fosfato inhiben la glicólisis. Si la concentración de glucosa 6-fosfato disminuye, la actividad es restaurada. ¿Por qué?8.-¿Cuál es la enzima que cataliza la reacción para producir acetaldehído?9.- ¿Qué requiere dicha enzima?10.- ¿Cuál es la enzima que cataliza la conversión de acetaldehído a etanol?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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PRÁCTICA No. 2

FERMENTACIÓN DEL VINO

NOMBRE:__________________________________GRUPO:________FECHA:_________

TIEMPO DE PRÁCTICA: 2 Horas

OBJETIVO: Estudiar el efecto de la

concentración de sacarosa en la fermentación del vino.

PREGUNTAS PRELABORATORIO

1.- En una fermentación, ¿A una mayor concentración de glucosa esperaría encontrar una mayor concentración de etanol?

2.- ¿Qué factores de experimentación deben controlarse durante el proceso de fermentación alcohólica?

FUNDAMENTO

La fabricación del vino sigue siendo un arte más que una ciencia. Aunque las uvas son en gran medida las frutas más frecuentemente usadas para su elaboración, otras tales como los duraznos también se utilizan para hacer los vinos. El procedimiento para hacer vino de uva en casa es simple. El jugo de uva se inocula con un cultivo iniciador de levaduras compradas en un supermercado.

La fermentación primaria dura aproximadamente una semana; durante este tiempo la sacarosa originalmente presente en el jugo se convierte en etanol

y células de levadura, con el desarrollo de bióxido de carbono. El exceso de células de la levadura se quita del jugo junto con otros sedimentos, y se procede a una fermentación secundaria más lenta para desarrollar el sabor final.

La sacarosa puede ser agregada para alcanzar el contenido en alcohol deseado o modificar el sabor. El tipo de vino puede ser clasificado según su color. Otra clasificación se basa en el contenido de sacarosa, Tabla 1.1.

Tipo GravedadEspecifica

Contenido deSacarosa

(% p/p)Vino seco 1.085 – 1.100 21 – 25Vino medio dulce 1.120 – 1.140 29 –33Vino dulce 1.140 – 1.160 33 – 37

Tabla 1.1 Clasificación de vinos según el contenido de sacarosa.

Uso del Alcoholímetro

Un alcoholímetro es un dispositivo de flotación usado para medir la densidad de un líquido. Debido a que el líquido ejerce una fuerza de flotabilidad igual al peso del volumen desplazado por el alcoholímetro, el contador flotará más arriba en un líquido más denso que en un líquido más ligero, en general, una solución más densa tiene más sólidos disueltos. Un alcoholímetro convencional puede medir fácilmente la gravedad específica de un líquido con una exactitud de 0.001.


Muchas escalas están disponibles en un alcoholímetro. Uno típico empleado en la industria de las bebidas alcohólicas permite lecturas en la escala de Balling/Brix y la del potencial de alcohol (PA), así como la escala de gravedad específica. La escala de Balling, o Brix, cuya calibración está basada en los porcentajes en peso del azúcar en la solución; mientras que, la escala de PA es una indicación del porcentaje potencial (de volumen) de alcohol que puede ser producido con la fermentación básica en la conversión completa del azúcar originalmente presente en la solución.

Generalmente, el azúcar residual está presente y es a veces deseable para el sabor. Observe que por razones históricas, el contenido en alcohol está medido comúnmente en unidades de porcentaje de volumen o de prueba, mientras que el contenido del azúcar se expresa en porcentaje de peso. Ambas unidades se utilizan extensamente en la industria del vino.

La manera apropiada de usar un alcoholímetro es hacerlo girar suavemente en el jugo de uva, mosto, o el vino para el cual la gravedad específica debe ser medida. El torcer del alcoholímetro quita la mayoría de las burbujas de aire de su superficie que pueda invalidar la medida. Una probeta graduada se utiliza generalmente para este propósito. Se requiere de dos lecturas para estimar el contenido en alcohol en un vino fermentado. La primera lectura se toma al principio de la fermentación. La segunda lectura al final de la misma. Así, el contenido en alcohol actual es simplemente el valor final menos el valor inicial.

Debido a que la densidad de un líquido es una función de la temperatura, la tabla 1.2 da la corrección que uno debe agregar a las lecturas de la gravedad específica para obtener los valores

correspondientes en 15.5° C, la temperatura en la cual el contador está calibrado.

Temperatura(85.5° C)

Corrección (sp. g.)

1015.5 0.00021 +0.00125 +0.002

28.8 +0.00335 +0.005

40.5 +0.007

Tabla 1.2 Corrección de la temperatura a la lectura de la gravedad específica.

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIAL DE LABORATORIO:- 1Probeta graduada de 250 mL- Tubos de ensaye de 13 X 100- 1Matraz Erlenmeyer- 1Tapón de goma para el matraz- Tubo Tygon

MATERIAL BIOLÓGICO:- Levadura activa del vino seco - Cepas de Saccharomyces ellipsoideus

REACTIVOS:- Jugo de uva o de otra fruta- Sacarosa

EQUIPO:- Alcoholímetro (hidrómetro). - Balanza

MÉTODO:1. Prepare el cultivo iniciador de levadura

Mezcle 1 g del cultivo de levadura de vino seco en 100 mL de jugo de uva. Vea la Nota 1.

Deje la levadura crecer en un envase sin apretar a temperatura ambiente por 24 horas.

2. Fermentación primaria

Agregue bastante azúcar al jugo de uva para preparar los 4 substratos


como se muestra en la tabla 1.3, un litro por cada uno:

Sustrato Concentración de Sacarosa

extra adicionadaA 0.0 g/LB 100.0 g/LC 200.0 g/LD 300.0 g/L

Tabla 1.3 Concentración de sacarosa adicionada.

Mida la gravedad específica y el valor de PA para cada uno de los substratos iniciales con un alcoholímetro. Éste es el valor inicial de PA que será utilizado más adelante para estimar el contenido en alcohol.

Inocule cada botella con 20 mL del cultivo iniciador de levadura preparado en el paso previo. Vea la nota 2.

Tape la botella del jugo con un tapón de goma. Una pieza de tubo Tygon es extendida del tapón para proporcionar un respiradero para el bióxido de carbono desarrollado. El otro extremo del tubo se sumerge en agua en un pequeño tubo de prueba tapado para la botella. El agua previene la entrada del oxígeno, que altera el metabolismo de la levadura y estropea el vino. Al mismo tiempo, el bióxido de carbono puede escaparse de la botella.

Fermente a temperatura ambiente por una semana.

3. Fermentación secundaria Al termino de una semana, decante

el jugo de la botella para limpiar los envases temporales individuales.

Mida los valores de PA para cada uno de los sobrenadantes con un alcoholímetro. Estime el contenido en alcohol restando el valor final del PA del valor inicial del PA.

Deseche el sedimento y lave cada botella con agua.

Vierta el jugo nuevamente dentro de la botella limpia. Ponga detrás el ensamblaje limpio del tapón de goma y del tubo Tygon.

Fermente lentamente por otras 4-6 semanas.

Mida los valores del PA como antes cuando este listo para consumir.

4. Pruebe el vino. 5. Pruebe con otros jugos de fruta.NOTA 1. Las uvas frescas pueden ser machacadas para obtener el jugo. La mayoría de los lagares agregan el dióxido de sulfuro como gas o como sal sólida para prevenir el crecimiento de otras levaduras y bacterias que causen los desperdicios. El dióxido de sulfuro también es producido por Saccharomyces durante la fermentación. La fuente más simple del jugo es el estante del supermercado. Utilice “Todo Natural” la variedad sin preservativos o azúcar agregados. NOTA 2. La levadura del vino seco se agrega directamente al jugo de uva en un nivel de 1 g por 4 litros. Para mejores resultados, primero suspenda 1 g de la levadura del vino seco en 10 mI del agua caliente cerca de 35 °C. Entonces agregue el cultivo suspendido al jugo de uva.20


HOJA DE RESULTADOS

NOMBRE:________________________________GRUPO:__________FECHA:_________

1.- Anota en la tabla el contenido de alcohol que mediste.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1.-¿Qué es el efecto Pasteur? 2.- Comente sobre las maneras de mejorar el experimento.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Sustrato Contenido de alcohol en Fermentación primaria

Contenido de alcohol en Fermentación secundaria

A

B

C

D

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