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Universidad San Pablo-CEU

Facultad de Farmacia

Departamento de Química y Bioquímica

Centro de Metabolómica y Bioanálisis

METABOLÓMICA E INTEGRACIÓN MULTIÓMICA

EN ORGANISMOS UNICELULARES

HACIA LA COMPRESIÓN DE SISTEMAS BIOLÓGICOS

Tesis Doctoral

David Rojo Blanco

Madrid 2014

iii

A mis padres David y Aurora

A mi abuela Aurora

Y, especialmente, a mi abuelo Vicente

iv

v

Agradecimientos

Es preceptivo, y además hacerlo en primer lugar, dar las gracias a mi directora de

tesis Coral Barbas, quien, en 2010, me dio la oportunidad de continuar mis estudios al

aceptar mi solicitud para realizar una tesis doctoral en su grupo de investigación. Con ello

se abrió una nueva etapa en mi vida, la cual precisamente con estas líneas está

comenzando a cerrarse. Sin embargo, a este respecto, sería injusto solo mostrar mi

gratitud hacia ella en el campo científico o profesional pues lo que me ha permitido es

mucho más. Por todo ello, ¡muchas gracias!

En segundo lugar quisiera mencionar a Manuel Ferrer, con quien no solamente he

tenido el placer de participar en diversos proyectos sino con el que además he mantenido

la mejor de las relaciones. Casualidades de la vida, gracias a estas colaboraciones puede

aunar uno de mis intereses infantiles, el mundo de los microbios, con mis primeros pasos

en la investigación profesional. ¡Gracias!

Seguidamente he de destacar el soporte y apoyo de todos los miembros del

personal docente adscrito al CEMBIO: Javier Rupérez, Antonia García, María Paz Martínez,

María Paz Lorenzo, María Ángeles López, Fernanda Rey-Stolle y Santiago Angulo. Su labor

ha sido fundamental y sin ella esta tesis no hubiera sido posible.

Por otro lado, sería inexcusable la omisión en estas líneas de una mención a mis

compañeros del CEMBIO, tanto de los presentes como de los pasados, así como de todas

las personas que han colaborado de un modo u otro en las diversas publicaciones en las

cuales he sido coautor.

Además, y de un modo especial, quiero dar las gracias a mis amigos: Joanna y

Michał, quienes me comenzaron a mostrar la belleza de Polonia y con quienes di mis

primeros pasos en la metabolómica; Emily, an original English rose; Vanesa, de la que

siempre apreciaré su sinceridad, y Laura y Maria, le mie care amiche italiane con quienes

he compartido momentos fantásticos que nunca voy a olvidar. Asimismo, no puedo dejar

de lado a los paulinos Ángel, Joaquín y Allan con los que he vivido, en conjunto, los

sabores y sin sabores de casi diez años de mi vida, a Ursicino, quien me ayudó en la fase

vi

final de la maquetación del texto, ni tampoco a D. Leopoldo, a quien agradezco de corazón

su afecto y cercanía. Y por supuesto a Beata.

Asimismo, es de justicia dedicar unas líneas a las dos instituciones de las que he

formado parte desde mi llegada a Madrid. Primero a la Universidad San Pablo-CEU, donde

cursé mi licenciatura en Farmacia y a la que he seguido vinculado hasta el día de hoy, y, de

manera especialmente sentida, al Colegio Mayor de San Pablo, mi casa en Madrid, donde

tan feliz he sido durante nueve años.

Y, por último, pues tal y como se recoge en el Evangelio los últimos serán los

primeros (Mt 19, 30; Mt 20, 16; Mc 10, 31 y Lc 13, 30), gracias de corazón a mi familia, a

mis padres, David y Aurora, y a mis abuelos, quienes me lo han dado todo en esta vida.

Índice

Índice

3

Índice

página

Dedicatoria iii

Agradecimientos v

I - Introducción 5

I.1 - La vida, su origen y evolución 7

I.2 - Taxonomía, breve historia y situación actual 8

I.3 - La célula: procariotas y eucariotas 10

I.4 - Metabolómica: aspectos generales y metodología experimental 13

I.4.a - Diseño experimental 16

I.4.b - Selección y almacenamiento de la muestra. Extracción

de los metabolitos 16

I.5 - Herramientas analíticas en metabolómica 18

I.5.a - Técnicas analíticas 18

I.5.b - Tratamiento de datos 20

II - Objetivo y estructura de la tesis 25

III - La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido 29

III.1 - Introducción 31

III.2 - Materiales y Métodos 33

III.2.a - Betaína 34

III.2.b - Acetato 36

III.3 - Resultados 37

III.4 - Discusión 41

III.5 - Conclusiones 43

IV - Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación

multiómica 45

IV.1 - Introducción 47

IV.2 - Materiales y Métodos 48

IV.3 - Resultados 51

Metabolómica e integración multiómica en organismos unicelulares Hacia la compresión de sistemas biológicos

4

IV.4 - Discusión 54

IV.5 - Conclusiones 57

V - Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum,

un enfoque multiplataforma 59

V.1 - Introducción 61

V.2 - Materiales y Métodos 65

V.3 - Resultados 70

V.4 - Discusión 73

V.5 - Conclusiones 75

VI - Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo

y el mar Rojo, hacia la integración multiómica 77

VI.1 - Introducción 79

VI.2 - Materiales y Métodos 83

VI.3 - Resultados 85

VI.4 - Discusión 89

VI.5 - Conclusiones 93

VII - Conclusiones 95

VIII - Bibliografía 99

IX - Anexo 121

X - Índice de figuras y tablas 129

X.1 - Figuras 131

X.2 - Tablas 135

XI - Índice de abreviaturas 137

I Introducción

Introducción

7

I - Introducción

I.1 - La vida, su origen y evolución

Mucho se ha escrito y reflexionado sobre el origen de la vida. Actualmente, la

hipótesis más aceptada fija la antigüedad de nuestro planeta en unos 4600 millones de

años, datándose los primeros fósiles de células procariotas -los estromatolitos- en hace

unos 3800-3500 millones de años. Fue Alexander Oparin quien en 1924 propuso el modelo

más atrayente para explicar el origen de la vida. Según este, la alta temperatura de la

Tierra primitiva junto con la acción de los rayos ultravioleta y las descargas eléctricas

habrían provocado las reacciones químicas entre los átomos de carbono, hidrógeno y

oxígeno necesarias para dar origen a distintos compuestos orgánicos simples. De este

modo habrían surgido los primeros aminoácidos que, por efecto del calor, se combinarían

mediante enlaces peptídicos produciendo así las primeras proteínas. Disueltas en agua

formarían los primeros coloides y de ellos se originarían los protobiontes, glóbulos

estables compuestos de proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. La formación de

proteínas con actividad catalítica junto con la envoltura de estas gotículas en membranas

de naturaleza lipoproteica fueron los últimos pasos necesarios para la aparición de las

primeras formas de vida rudimentarias. En base a estas concepciones fue John B. S.

Haldane quien acuñó la conocida expresión de “sopa prebiótica” para hacer referencia al

estado de los primitivos océanos de la Tierra, ricos en principios inmediatos. En 1953

Stanley L. Miller demostró experimentalmente la viabilidad de esta hipótesis1; pero, sea

cual fuere su origen, lo que parece concluyente es que la vida procariota surgió poco

después del enfriamiento terrestre y muy probablemente su metabolismo era anaerobio2.

Las cianobacterias y la fotosíntesis productora de oxígeno habrían aparecido bastante más

tarde, hace unos 3000-2500 millones de años.

Asimismo parece probable que las células eucariotas se originasen a partir de las

procariotas hace unos 1400 millones de años pero no se sabe con exactitud cómo tuvo

lugar este proceso; para su explicación se han propuesto dos hipótesis. La primera

especula con la posibilidad de que núcleos, mitocondrias y cloroplastos se hubieran


8

originado a partir de invaginaciones de la membrana plasmática, apareciendo así

estructuras internas con doble membrana y material genético capaces de sufrir un

desarrollo y una especialización funcional. Por otro lado está la hipótesis endosimbiótica

de Lynn Margulis3, más popular que la anterior. De acuerdo con esta, el primer

acontecimiento que tuvo lugar habría sido la formación de un núcleo en la célula

proeucariota, muy probablemente por fusión de antiguas bacterias y arqueas.

Posiblemente una célula huésped bacteriana Gran negativa, que había perdido su pared

celular, incorporó en su interior una arquea formando así una asociación endosimbiótica

(de ahí el nombre de la hipótesis). Posteriormente la arquea habría perdido su pared y

membrana plasmática mientras la bacteria huésped desarrollaba pliegues interiores en su

propia membrana. Con el tiempo el genoma del huésped se habría transferido a la arquea

original, formándose así el núcleo y el retículo endoplasmático. Este sería el eucariota

ancestral con metabolismo fermentador que habría establecido nuevas asociaciones

simbióticas con bacterias fotosintéticas, apareciendo de este modo los cloroplastos. Por

su parte, las mitocondrias habrían surgido de otra relación endosimbiótica entre la

eucariota primitiva y bacterias con respiración aerobia. El principal apoyo de la hipótesis

endosimbiótica está precisamente en el descubrimiento de este tipo de relaciones tras

encontrarse una cianobacteria que habita en el protista biflagelado Cyanophora paradoxa.

Con todo, la secuencia exacta de los acontecimientos sigue sin conocerse.

I.2 - Taxonomía, breve historia y situación actual

Uno de los aspectos más desconcertantes y a la vez más fascinantes del mundo

microbiano es su gran diversidad, de ahí la dificultad para su clasificación sistemática. De

ello se ocupa la taxonomía (del gr. taxis, ordenación y nomos, ley), cuya actividad se dirige

tanto a la identificación de los organismo como a su nomenclatura y clasificación en

taxones -según su grado de semejanza-.

La especie constituye el grupo taxonómico básico. Para los organismos

microbianos esta puede ser definida como una colección de cepas que comparten

numerosas propiedades estables y que difieren de forma significativa de otros grupos. Es

Introducción

9

evidente la gran subjetividad a la que esto da cabida y por tanto la siguiente definición

propuesta consideraría miembros de una misma especie a aquellos individuos que

comparten al menos un 70 % de similitud en G+C en base a experimentos de hibridación

de DNA, lo que objetivaría la clasificación.

Por encima de la especie y en este orden se situarían los siguientes taxones:

género, familia, orden, clase, phylum y reino. Clásicamente se ha tendido a considerar

como canónico el sistema de cinco reinos propuesto por Robert Whittaker4 en 1969,

distinguiéndose entre: Monera, Protista, Fungi, Animalia y Plantae. Posteriormente, los

trabajos5 de Carl Woese y sus colaboradores sobre las secuencias de rRNA de células

procariotas les han llevado a proponer un árbol filogenético dividido en tres ramas (figura

1): Bacteria (diacil diésteres de glicerol como lípidos de membrana y rRNA bacteriano),

Archaea (diéter de diglicerol o tetraéter de diglicerol como lípidos de membrana y rRNA

arqueano) y Eucarya (acil diésteres de glicerol como lípidos de membrana y rRNA

eucariótico). Estos tres grupos se denominan dominios y se ubicarían por encima del

concepto tradicional de reino.

Figura 1. Árbol filogenético universal propuesto por Olsen y Woese basado en la

secuenciación de rRNA 16S6.


10

Toda esta información se articula según el sistema binomial propuesto ya en el s.

XVIII por el botánico sueco Carl von Linné en su obra Systema Naturae. Tras múltiples

revisiones y un gran esfuerzo compilador se publicaron en 1980 en el International Journal

of Systematic Bacteriology las listas aprobadas de nombres bacterianos, en donde

asimismo aparecen periódicamente los nuevos nombres válidos. Además el Bergey’s

Manual of Systematic Bacteriology contiene las descripciones de las especies procariotas

actualmente identificadas.

I.3 - La célula: procariotas y eucariotas

Tal y como hemos podido ya apuntar, existen dos grandes clases de células: las

procariotas (del gr. pro, ante y karyon, nuez o núcleo) y las eucariotas (del gr. eu,

verdadero y karyon, nuez o núcleo). A continuación desarrollaremos un breve resumen de

sus principales características.

Bajo el término procariota se engloba a los dominios de Bacteria y Archaea.

Morfológicamente la mayoría se presentan en forma de cocos o bacilos. Los primeros son

células casi esféricas que pueden existir tanto de forma individual como agrupados. Los

diplococos se forman cuando los cocos se dividen y permanecen juntos para constituir

pares; si se dividen repetidamente en un mismo plano formando largas cadenas se

denominan estreptococos y, si por el contrario lo hacen aleatoriamente generando

racimos irregulares, estos se llaman estafilococos. Finalmente cabe la posibilidad de que

constituyan paquetes cuadrados: las tétradas. Por su parte, los bacilos presentan forma de

bastoncillo, pudiendo variar considerablemente sus proporciones en longitud y diámetro.

Un caso particular lo constituyen los vibrios, de forma curvada y con aspecto de coma.

Menos comunes que las anteriores son las organizaciones en hifas, que pueden

ramificarse para formar una red llamada micelio. Las formas helicoidales pueden ser

espirilos, si son rígidos, o espiroquetas, si son flexibles. Además están los pedúnculos.

Finalmente hay algunas procariotas pleomórficas, que, como su nombre indica, presentan

una forma variable. En lo que respecta al tamaño la variabilidad entre las especies es

Introducción

11

inmensa, desde los escasos 0.3 µm del género Mycoplasma a los generosos 600 µm de la

Epulopiscium fishelsoni.

A nivel organizativo este tipo de célula contiene numerosas estructuras, a saber:

membrana plasmática, vacuolas, ribosomas, cuerpos de inclusión, nucleoide, espacio

periplásmico, pared celular, cápsula, fimbriae y flagelos. Además cuando las condiciones

ambientales son adversas pueden formar esporas. Casi siempre las procariotas presentan

una pared celular separada de la membrana plasmática por el espacio periplásmico y en

ningún caso sus orgánulos internos están rodeados por una membrana, lo que implica que

el material genético se localiza en una región discreta llamada nucleoide. Tal y como se

expondrá en el correspondiente cuadro comparativo, en general, la célula procariota es

mucho más sencilla que la eucariota.

En el dominio Eucarya son organismos unicelulares las algas, los hongos y los

protozoos. Su diferencia más obvia con el tipo celular anterior radica en la presencia de

membranas internas así como la mayor complejidad y grado de especialización funcional

de algunos de sus orgánulos (en particular en lo que atañe a la respiración celular y la

fotosíntesis). Orgánulos eucariotas son: la membrana plasmática, los microtúbulos, el

retículo endoplasmático, los ribosomas, el aparato de Golgi, los lisosomas, las

mitocondrias, los cloroplastos, la pared celular, los cilios, los flagelos, las vacuolas y, por

supuesto, el núcleo.

No consideramos de mayor interés para esta introducción una descripción

detallada de cada uno de los orgánulos celulares así como de su función. Sin embargo,

antes de concluir este epígrafe se impone un cuadro resumen (tabla 1) en el que se

comparen con rigor las diferencias entre los dos tipos de células.


12

Tabla 1. Comparación entre células procariotas y eucariotas2.

Propiedad Procariotas Eucariotas

Organización del material genético

Núcleo verdadero rodeado por membrana

Ausente Presente

Complejos de DNA con histonas

No Sí

Número de cromosomas Uno Más de uno Intrones en los genes Raro Común Nucleolo Ausente Presente Desarrollo de mitosis No Sí

Recombinación genética Parcial, transferencia unidireccional del DNA

Meiosis y fusión de gametos

Mitocondrias Ausentes Presentes Cloroplastos Ausentes Presentes Membrana plasmática con esteroles

Normalmente, no* Sí

Flagelos De tamaño submicroscópico, compuestos de una fibra

De tamaño microscópico, rodeados de membrana, normalmente con 20 microtúbulos dispuestos según el modelo 9 + 2

Retículo endoplasmático Ausente Presente Aparato de Golgi Ausente Presente Pared celular Normalmente, compuesta

químicamente por peptidoglicano**

Químicamente más sencilla y carece de peptidoglicano

Diferencias en orgánulos más sencillos

Ribosomas 70S 80S, excepto en mitocondrias y cloroplastos

Lisosomas y peroxisomas

Ausentes Presentes

Microtúbulos Ausentes o raros Presentes Citoesqueleto Ausente Presente

Diferenciación Rudimentaria Tejidos y órganos

*Sólo los micoplasmas y los metanotrofos contienen esteroles, no pudiendo sintetizarlos

los primeros por lo que han de adquirir sus precursores del medio. Además muchos

procariotas contienen hopanoides.

**Los micoplasmas y las Archaea no contienen peptidoglicano.

Introducción

13

Para la presente tesis doctoral se han abordado distintos trabajos realizados todos

ellos con microrganismos unicelulares, tanto procariotas como eucariotas, abarcándose

en conjunto los tres dominios taxonómicos. En los correspondientes capítulos se ampliará

la información concerniente a cada uno de los seres que han sido objeto de estudio.

I.4 - Metabolómica: aspectos generales y metodología experimental

La metabol[n]ómica, disciplina ómica encargada del estudio del metaboloma, fue

definida por Jeremy K. Nicholson como “the quantitative measurement of the dynamic

multiparametric metabolic response of living systems to pathophysiological stimuli or

genetic modification”7, si bien el primero en usar dicho concepto fue Stephen G. Oliver8.

Desde estos trabajos iniciales publicados a finales de la década de los noventa

hasta la actualidad, la metabolómica ha vivido una franca expansión (figuras 2 y 3). La

aplicación de este enfoque holístico a un cada vez mayor número de campos ha implicado

que para el análisis metabolómico se desarrollen diferentes estrategias según cual sea el

caso de estudio. Siguiendo la opinión de Alberto Valdés9 y Warwick B. Dunn10

distinguiríamos cuatro situaciones:

Análisis dirigido: aquel en el que se analiza uno o un grupo muy reducido de

compuestos preseleccionados en el diseño del estudio.

Análisis del perfil metabólico: aquel que analiza un grupo de compuestos con

propiedades fisicoquímicas similares o que participan en una determinada ruta

metabólica.

Análisis de la huella metabólica (del ingl. metabolic fingerprinting): consiste en la

obtención global de las señales correspondientes a los metabolitos presentes en la

muestra, pudiéndose establecer diferencias y/o similitudes entre los individuos a

través de un análisis conjunto y multivariante de estas señales11.

Análisis metabonómico: propiamente fue el definido por Nicholson7, este trata de

medir la respuesta metabólica dinámica de sistemas biológicos vivos ante

estímulos fisiológicos o modificaciones genéticas.


14

Aunque inicialmente la metabolómica y la metabonómica representaron distintos

enfoques para el estudio de los metabolitos, hoy en día no existe una distinción clara

entre ambas. De hecho, la Sociedad Metabolómica establece que el término

metabolómica engloba al de metabonómica, así como a las definiciones anteriores. En

esta línea de simplificación conceptual se ha optado por mantener para esta tesis solo la

distinción básica entre análisis dirigido (englobando los dos primeros casos) y

fingerprintring (agrupando a los dos últimos).

Figura 2. Número de artículos por año en los que se citan las palabras clave metabolomics

(azul) o metabonomics (rojo) en su título, según el buscador Web of Knowledge a fecha de

5 de mayo de 2014.

Figura 3. Crecimiento de la importancia relativa de la metabol[n]ómica frente a otras

disciplinas ómicas durante la pasada década según el buscador Web of Knowledge. En

verde, porcentaje de artículos que contienen en su título las palabras clave metabolomics

o metabonomics; en gris aquellos en los que figuran los términos genomics,

transcriptomics o proteomics.

Introducción

15

Por otro lado, ha de destacarse que las dificultades del análisis metabolómico son

reseñables, siendo principalmente debidas a la gran complejidad del metaboloma. Este

abarca una amplísima colección de metabolitos, los cuales varían tanto en propiedades

fisicoquímicas como en abundancias y rangos de concentración12.

Por todo ello, para la obtención de información biológica relevante -y así llevar a

cabo con éxito un estudio metabolómico (figura 4)-, se impone una adecuada metodología

experimental, debiendo incluir: un buen diseño experimental; una adecuada selección y

almacenamiento de la muestra; una correcta extracción de los metabolitos; una técnica

analítica acertada y un correcto tratamiento de datos. A continuación nos ocuparemos de

los tres primeros puntos, reservando los dos últimos para el siguiente epígrafe.

Figura 4. Esquema resumen del flujo de trabajo seguido en un estudio metabolómico.


16

I.4.a - Diseño experimental

En primer lugar resulta prioritario disponer de un correcto modelo experimental,

adecuado para responder a las cuestiones que plantee el tema en estudio. Algunos de los

puntos a tener en cuenta son: el tipo de muestra, la existencia de controles, el número de

réplicas por grupo… Todo ello debe estar convenientemente descrito. Además, son

fundamentales una correcta recogida y almacenamiento de la muestra junto con una

metodología que asegure su óptimo estado hasta su llegada al laboratorio.

Asimismo, según se focalice el trabajo en una lista concreta de metabolitos o en

una búsqueda de los mismos tan amplia como sea posible -es decir, según se opte por una

aproximación dirigida o una fingerprinting- así habrá de ser la elección de la técnica de

extracción, la metodología de análisis y el sistema de detección.

Todo ello debe complementarse con el ineludible punto de una búsqueda

bibliográfica previa.

I.4.b - Selección y almacenamiento de la muestra. Extracción de los metabolitos

Las muestras biológicas más habituales en los estudios metabolómicos son la

sangre (suero o plasma), la orina, los tejidos y las células. Este último ha sido el caso que

ha ocupado a los trabajos desarrollados en la presente tesis doctoral.

En general, el tratamiento de la muestra está directamente relacionado con las

características de la matriz, el tipo de analito que se desea extraer y la técnica de

determinación que se pretende aplicar. Si se trata de un análisis dirigido, se buscará

concentrar los metabolitos preseleccionados, optándose en este caso por etapas de

extracción muy selectivas. Si por el contrario el estudio es global, se buscará maximizar la

capacidad de detección de los metabolitos, tratando de obtenerse la fracción más

representativa del metaboloma.

Para el análisis del metabolismo celular es particularmente importante su

interrupción mediante la inhibición de las enzimas endógenas. Esta etapa debe llevarse a

cabo sin inducir variaciones en la concentración de los metabolitos. Las estrategias más

habituales se basan en cambios bruscos de pH13 14, el empleo de metanol, la mezcla de

Introducción

17

disolventes en frío15 16 17 o el cambio de temperatura inducido con nitrógeno líquido (-196

°C). Un posible inconveniente a señalar sería el potencial daño que se le infringiría a la

membrana celular, dando lugar a una pérdida de metabolitos, posibilidad que no se puede

obviar cuando se opta por el metanol o el nitrógeno líquido.

A continuación sería necesaria la realización de un procedimiento que permita

romper la célula para así liberar su metaboloma. Esto se suele realizar mediante métodos

mecánicos, como las sondas de ultrasonidos o la agitación de la muestra en presencia de

pequeños gránulos, o mediante ciclos de congelación/descongelación que favorezcan la

lisis. Seguidamente pueden ser interesantes etapas de centrifugación o evaporación, con

el fin de purificar o concentrar la muestra, además de para así poder elegir la fase líquida

más adecuada para la técnica de análisis. Asimismo, en algún momento del protocolo, ha

de realizarse la desproteinización, las opciones más empleadas para la desnaturalización

de las proteínas son los cambios bruscos de pH o el uso de disolventes orgánicos como el

metanol o el acetonitrilo18.

Por otro lado, en el caso de que la técnica analítica de elección fuera cromatografía

de gases ha de tenerse en cuenta que los analitos han de ser volátiles y térmicamente

estables. Para favorecer la primera propiedad se puede llevar a cabo una sililación. De esta

manera, los grupos funcionales con hidrógenos activos (por ejemplo: -OH, -NH, -COOH o -

SH) reaccionan con N-metil-N-trimetilsilitrifluoroacetamida (MSTFA) o con N,O-bis-

trimetilsilitrifluoroacetamida (BSTFA) produciendo derivados trimetilsilados. Gracias a

esto, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos, ácidos orgánicos o esteroles son susceptibles

de ser analizados por cromatografía de gases. Una etapa previa de metoximación

protegería los grupos funcionales cetona al evitar la tautomería ceto-enólica.

En general, y salvo que el protocolo manejado indicase lo contrario, las muestras

deben ser almacenadas a -80 °C y mantenidas a bajas temperaturas (aproximadamente 4

°C) durante su proceso de preparación a fin de evitar cualquier alteración en los

metabolitos.


18

I.5 - Herramientas analíticas en metabolómica

I.5.a - Técnicas analíticas

Hoy en día resulta evidente que no existe una herramienta analítica perfecta en

todas sus prestaciones para satisfacer las múltiples necesidades generadas en el campo de

la metabolómica, máxime en lo que atañe al análisis de la función celular en su nivel

molecular19.

En este sentido, la espectrometría de masas (mass spectrometry, MS) es la técnica

analítica más difundida dada su rapidez, sensibilidad y selectividad, tanto a nivel

cualitativo como cuantitativo10. Esta se basa en la formación y detección de iones,

previamente separados en función de su relación masa/carga (m/z). Dada la gran

complejidad de las muestras que son objeto de estudio, generalmente se tiende a su

acoplamiento con una técnica de separación como la cromatografía de gases (gas

chromatography, GC), de líquidos (liquid chromatography, LC) o la electroforesis capilar

(capilar electrophoresis, CE).

GC-MS: ideal para metabolitos volátiles y térmicamente estables, su gran

inconveniente suele ser la necesidad de tediosas etapas de derivatización. El

análisis requiere de pequeños volúmenes (típicamente alrededor de 1 µL),

pudiéndose optar entre una inyección split o splitless. Las columnas capilares

puede ser de varios tipos: de paredes impregnadas (usada en la presente tesis), de

soporte impregnado, de capa porosa, rellenas o de sílice fundida. Las fases

estacionarias más comunes son la DB-5 o la DB-5010 (respectivamente, polisiloxano

con un 5 % de fenilos / 95 % de metilos y polisiloxano con un 50 % de cada uno de

ellos). Dado que no se obtiene una perfecta separación analítica, la complejidad

del cromatograma es notoria y por tanto se requieren programas informáticos

para su deconvolución. La identificación de los metabolitos es posible gracias a la

gran reproducibilidad que ofrece la técnica tanto en tiempos de retención

(retention time, RT) como en perfiles de fragmentación, lo que permite su

comparación con bibliotecas ya existentes (por ejemplo las creadas por O. Fiehn o

Introducción

19

el National Institute of Standards and Technology: NIST). Las fuentes de ionización

más comunes son el impacto electrónico (fuerte) y la ionización química (suave).

LC-MS: típicamente usa para su acoplamiento una fuente de ionización por

electrospray (que permite un análisis tanto en polaridad positiva como en

negativa) o, en menor medida, una ionización química a presión atmosférica20. Son

factores limitantes para el electrospray la concentración salina de la fase móvil así

como los pH extremos, aspecto que también puede afectar a la integridad de la

fase estacionaria de la columna. Aquí la preparación de la muestra es más simple

que en GC-MS, sin embargo no es posible la identificación de los metabolitos por

comparación directa con una biblioteca comercial. En este caso ésta se realiza en

base a la masa exacta o mediante el análisis de los espectros de fragmentación de

MS/MS. La prestación de masa exacta no es una característica común de todos los

analizadores, en los casos que nos ocuparán esta ha sido obtenida mediante el uso

de un analizador de tiempo de vuelo (time of flight, TOF). Asimismo, análogamente

a lo que ocurre en GC-MS, aquí las columnas analíticas tampoco consiguen una

separación perfecta de los analitos, lo implica el uso de programas informáticos de

deconvolución. En lo que respecta a sus fases estacionarias, la más usada es la fase

inversa C8 o C1810, aunque, para una cobertura metabólica completa, se requerirían

fases estacionarias tipo HILIC21.

CE-MS: en este caso los compuestos se separan atendiendo a su relación m/z y no

en base a su interacción con una fase estacionaria. Ideal para metabólitos iónicos y

polares, típicamente usa el electrospray como fuente de ionización. Son

características de la CE la elevada velocidad de separación -cuando se emplean

altos voltajes y capilares cortos-, la alta eficacia, el pequeño volumen de inyección,

el consumo mínimo de reactivos y la gran versatilidad en cuanto a modos de

operación. Su gran desventaja sería la poca reproducibilidad en cuanto a tiempos

de migración (migration time, MT). Al igual que en las anteriores, aquí también es

necesaria la deconvolución.


20

Aunque la presente tesis se focalice en MS no podemos despreciar otras

herramientas como la resonancia magnética nuclear (RMN) o la detección ultravioleta

(UV). Esta última podría ser suficiente en el caso de un análisis dirigido en el que solo se

precisase cuantificar ciertos metabolitos de interés. Los mejores detectores UV son los

diode array, estos proporcionan un espectro de todas las longitudes de onda, lo que

permite seleccionar más fácilmente aquella en la que el o los analitos de interés sean más

visibles, evitándose así el inconveniente de repetir el análisis.

La descripción detallada de cada uno de los métodos de análisis así como de los

equipos empleados se hará en el correspondiente apartado de materiales y métodos de

cada uno de los capítulos.

I.5.b - Tratamiento de datos

El volumen de datos generado una vez completado el análisis y hecha la

deconvolución (y el alineado, si procede) es ingente. Estos se expresan en forma de

matriz, constituida esta por dos vectores: columnas -cada uno de los casos de estudio: las

muestras- y filas -las entidades-. Sin embargo, el manejo de esta información cruda no es

ni eficaz ni posible y por ende se estima pertinente apuntar que tres son los pasos a dar en

esta materia. Primeramente se requiere de una depuración, eliminándose ruido y señales

indeseadas, esto es el filtrado. Seguidamente se aplicarán los test estadísticos pertinentes.

Finalmente se procederá a la identificación de los biomarcadores.

Filtrado: el primer punto a garantizar es la reproducibilidad instrumental. En todo

acoplamiento cromatografía/electroforesis-MS las muestras inyectadas

interaccionan tanto con la parte separativa como con la espectrométrica pudiendo

ocasionar una variación, bien en la intensidad, bien en el tiempo de detección de

cada señal. Precisamente por esta razón se requiere del análisis periódico de

controles de calidad (quality control, QC) a lo largo de toda la secuencia de

análisis22. Idealmente, estos se prepararían a partir de la mezcla de una misma

parte alícuota tomada de cada una de las muestras.

Introducción

21

Definimos una entidad metabólica como el pico al cual se le asocian un

índice de retención (retention index, RI) y un espectro de masas -GC- o un RT/MT y

un espectro de masas -LC y CE-. Cualquier entidad que no cumpla los criterios de

filtrado descritos a continuación deberá ser descartada22.

Los motivos exactos por los que preparar QCs son tres22: para equilibrar el

sistema separativo antes de la inyección de las muestras “reales”, para calcular la

precisión instrumental -entendida como criterio de filtrado- y para la corrección de

la señal -solo si las muestras se hubieran analizado en secuencias diferentes-. En el

caso de los biomarcadores el criterio de filtrado de la Food and Drug

Administration (FDA)23 es el de descartar toda entidad cuyo coeficiente de

variación (CV) en los QCs supere el 30 %. Asimismo, es recomendable ignorar todas

aquellas entidades que no estén presentes en al menos el 50 % de los QCs,

siempre y cuando estos se hayan preparado a partir de un pool de las muestras a

analizar.

Estadística: inicialmente han de considerarse dos problemas24: el tratamiento de

los missing values y la detección de outliers. Los primeros pueden definirse como

celdas vacías de la matriz en las cuales, por el motivo que fuere, las respectivas

entidades no han sido detectadas. La solución más estricta sería la de descartar la

fila entera, sin embargo esto redundaría en la pérdida de información

potencialmente interesante. Se plantean pues algunas alternativas tales como

reemplazar los missing values por la media de toda la fila o bien por la media de

sus vecinos más próximos. En cuanto al segundo punto, definimos outlier como

aquella muestra cuyos valores no son concordantes con los de la inmensa mayoría

de los de su clase. Además de la re-inspección visual del correspondiente

electroferograma o cromatograma una buena manera para su detección es la de

comparar su ratio media/mediana con el de las otras muestras.

El último paso previo en la preparación de los datos sería el de su potencial

transformación o normalización24. Las opciones más comunes son: Z-score

(desviación de cada punto respecto de la media dividida por la desviación


22

estándar), división por la media o mediana y transformación logarítmica

(recomendada si se desea una distribución gaussiana, condición requerida por

multitud de test).

Hechas estas consideraciones previas ha de exponerse que, según se

considere a cada una de las variables individualmente o en relación con las demás,

se distinguen dos grandes grupos de test: los univariantes y los multivariantes.

El test estadístico univariante por excelencia es el t-test. Un t-test de dos

colas se usa típicamente para contrastar una hipótesis mediante la diferencia

significativa de medias, asumiendo una misma distribución de varianzas en ambos

grupos. Se considera que una variable es significativa -y por tanto responsable de

la separación de los grupos- cuando su p valor es igual o inferior a 0.05. Este mismo

procedimiento puede usarse para comparar más de dos clases, en cuyo caso el test

aplicado será un one-way analysis of variance (ANOVA). Este se basa en la

construcción de un nuevo conjunto de variables mediante combinación lineal de

las originales de tal modo que maximicen la diferencia de la media respecto de la

varianza. Una idea similar es la usada por el two-ways ANOVA, si bien aquí se

incluye el contraste simultáneo de dos hipótesis. En esta línea, el test más

sofisticado sería aquel que no solo contrasta varios grupos simultáneamente sino

también más de dos hipótesis, este es el multivariate analysis of variance

(MANOVA). Análogo al t-test pero para distribuciones no normales de datos o

cuando el número de observaciones es demasiado pequeño para asegurarlo es el

test de Mann-Whitney U.

Sin embargo, dado el amplio número de variables a considerar en el

experimento metabolómico se recomienda su estudio como un todo, pues cada

una de ellas no tendría mayor sentido de manera aislada. Esto implicaría métodos

estadísticos multivariantes, los cuales pueden dividirse en dos grandes conjuntos25:

métodos de análisis de factores (factor analysis methods) y métodos de

clasificación (classification methods).

Introducción

23

El análisis de componentes principales (principal components analysis, PCA)

es un caso particular de análisis de factores basado en el cálculo de una “nueva”

“variable de variables” (en otros textos directamente denominada componente

principal) a partir de una matriz de correlaciones, típicamente en metabolómica

una matriz de covarianzas, de tal manera que dicha nueva variable explique la

máxima dispersión existente entre los individuos. Otro método de análisis de

factores es el análisis discriminante (discriminant analysis, DA) cuyo propósito es

descubrir las variables responsables de la diferencia entre grupos.

En este punto se impone la introducción de dos nuevos conceptos: los de

análisis supervisado y no supervisado. El primero asume, con independencia del

test utilizado, la introducción de clases que agrupen a las muestras, cosa que se

ignoraría en el segundo. En este sentido el método partial least squares (PLS) se

basa en un análisis doble de componentes principales al buscar qué variables

maximizan la separación de covarianzas entre los grupos previamente definidos.

Por su parte, los métodos de clasificación son aquellos que consideran solo

uno de los vectores de la matriz -filas o columnas- y no ambos a la vez, como hacen

los anteriores. Este conjunto de métodos agrupa a los vectores elegidos en función

de un criterio de “distancia” permitiendo así la matematización de su diferencia.

Nuevamente aquí encontramos métodos supervisados y no supervisados,

respectivamente K-means methods e hierarchical methods (también conocidos

como hierarchical component analysis: HCA). Los primeros clasificarán los vectores

en función del número predefinido de clases mientras que los segundos

comenzarán agrupando a los dos más próximos y continuando así hasta completar

todo el dendrograma.

Obviamente, el conjunto de test estadísticos finalmente aplicados

dependerán del caso de estudio en cuestión pero, fueran cuales fuesen ambos,

nunca ha de olvidarse que, tal y como expresó Jean Paul Benzécri26, un modelo

debe derivarse de los datos, [y] no al contrario.


24

Identificación de biomarcadores: tal y como ya hemos apuntado, la potencial

asignación de un nombre a cada una de las entidades se realiza mediante

procedimientos distintos según se trate de GC o de LC / CE. En la medida en la que

el metaboloma de todos los organismos aún no haya sido completamente

caracterizado la información que nos ofrecen las bibliotecas no siempre resulta

satisfactoria, aspecto que se acentúa en el mundo microbiano. Esta es una de las

grandes limitaciones a la hora de estudiar nuevos organismos o rutas metabólicas

que aún no han sido descritas, caso que ha lugar en alguno de los capítulos de esta

tesis.

El resultado final de todo ello habrá de ser una interpretación coherente de los

resultados, ubicando cada metabolito en su correspondiente ruta bioquímica. Los

distintos test estadísticos que hayan sido aplicados garantizarán la veracidad de las

conclusiones, las cuales siempre deberían servir para dar respuesta a la pregunta inicial

que incoó el análisis… amén de poder suscitar otras nuevas.

NOTA: Dada la amplitud de los temas tratados y, hasta cierto punto, la disparidad de los

mismos se ha decidido que en la presente tesis la revisión bibliográfica específica se

realizará en la introducción correspondiente a cada uno de los capítulos.

II Objetivo y estructura

de la tesis

Objetivo y estructura de la tesis

27

II - Objetivo y estructura de la tesis

El objetivo de la presente tesis doctoral ha sido la exploración, desde distintas

aproximaciones, de las diversas posibilidades de la metabolómica al servicio del estudio de

varios organismos unicelulares.

En el primer capítulo se ha abordado un caso de análisis dirigido en el cual se ha

buscado la detección y estimación del contenido tanto de betaína como de acetato, todo

ello dentro del marco planteado para el estudio de la vida microbiana de la fosa marina

Medee.

El capítulo dos es un trabajo enfocado desde la óptica del fingerprinting. En él nos

ocuparemos del estudio del efecto del tratamiento antibiótico sobre la microbiota

intestinal.

En los capítulos tres y cuatro se mostrarán dos ejemplos del potencial de la

combinación de ambas perspectivas cuando, tras un análisis por fingerprinting, se realice

una búsqueda dirigida de ciertos biomarcadores. En esta línea, en el capítulo tres, se ha

ahondado en las causas de la resistencia de Leishmania spp. al tratamiento con

antimoniales así como en su mecanismo de acción para, a continuación, monitorizar el

flujo de 13C y así contrastar la hipótesis planteada sobre su origen metabólico. Finalmente,

en el capítulo cuatro, se han estudiado las diferencias en el metabolismo microbiano de

distintas zonas contaminadas del mar Mediterráneo y del mar Rojo para, en un segundo

paso, cuantificar relativamente los compuestos implicados en dicho proceso.


28

III La vida microbiana en la fosa Medee,

un caso de análisis dirigido

La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido

31

III - La vida microbiana en la fosa Medee, un caso de análisis dirigido

III.1 - Introducción

Hoy en día los ambientes hipersalinos son todavía relativamente comunes en

nuestro planeta, si bien lo fueron aún más en el remoto pasado geológico cuando, por

ejemplo, todo el norte de Europa estaba cubierto por una gran extensión de agua salada

satura -el mar de Zechstein27-, cuya retirada parece haber estado implicada en la extinción

masiva del Pérmico-Triásico28 29, acontecida hace 252 millones de años.

El último gran episodio de crisis salina de nuestra Historia Geológica tuvo lugar en

el Messiniense (subdivisión del Mioceno comprendida entre los 7.2 y los 5.3 millones de

años), momento en el cual el Mediterráneo quedó aislado del océano Atlántico. Como

consecuencia de la ruptura del balance hídrico entre ambos se produjo la progresiva

desecación del Mediterráneo30, apareciendo en su fondo enormes depósitos residuales de

agua hipersalina. La estabilidad actual de estas formaciones viene marcada por un

compromiso entre la topografía de la zona, su conveniente protección frente a las

corrientes marinas y una permanente reposición de sal aportada por la disolución de los

depósitos circundantes31. Algunos ejemplos de estos ambientes son las fosas Bannock,

Tyro, Discovery, L’Atalante y Urania32 33 31. Las tres últimas se ubican en la llamada “región

de las fosas anóxicas”, área vecina a la dorsal mediterránea en la cual todavía se espera

encontrar más de estas formaciones34. Confirmando esta idea han aparecido

recientemente Thetis y Medee35 36 37 38 (figura 5).


32

Figura 5. Mapa de la “región de las fosas anóxicas”. En rojo, las fosas hipersalinas

mencionadas.

Como consecuencia de la mayor densidad de este agua saturada en sal estas fosas

están separadas del resto de la masa marina por una fina pero muy estable capa que

dificulta los intercambios químicos entre las dos zonas, particularmente de oxígeno34. Este

relativo aislamiento convierte a estos ambientes en los lugares ideales para el estudio de

los ciclos biogeoquímicos que pudieron tener lugar durante los primeros momentos de la

vida, cuando convivieron las primitivas comunidades de organismos quimiolitótrofos con

los ya por entonces veteranos heterótrofos.

La energía para el mantenimiento de esta biomasa procede del juego de

reacciones de oxidorreducción que tienen lugar en el límite superior de la capa de agua

hipersalina, donde la oxidación aeróbica de metales, grupos HS- y grupos sulfurados (que

difundirían en estado reducido desde el fondo) constituye un proceso marcadamente

exergónico39 40 41 42 43. Según la relativa capacidad de los quimiolitótrofos para usar el

oxígeno u otros aceptores de electrones distinguimos dos grandes grupos: las Alpha-

Epsilonproteobacteria y las Gamma-Epsilonproteobacteria, que respectivamente fijan el

CO2 vía ciclo de Calvin-Benson-Bassham o mediante la reducción de ácidos tricarboxílicos.


33

Precisamente por ello estos organismos son uno de los principales productores de materia

orgánica de novo de las oscuras profundidades marinas43, sustentando así al resto de la

comunidad microbiana formada por multitud de organismo halófitos, la mayoría de ellos

solo encontrados en estas fosas mediterráneas. Con todo, el análisis de cómo ha lugar la

metanogénesis en estos ambientes está todavía dando sus primeros pasos44.

El propósito de este capítulo, inserto en el contexto de un trabajo mucho mayor,

ha sido el de contribuir mediante un análisis dirigido de betaína y acetato a la exploración

de las condiciones medioambientales de la citada fosa Medee. En esta línea, se ha

estudiado la abundancia, importancia ecológica e interacción trófica de los principales

procariotas de la solución salina saturada a fin de poder relacionar la síntesis de novo de

materia orgánica con el resto de su actividad metabólica.

III.2 - Materiales y Métodos

Las muestras de la fosa Medee se recogieron a bordo del RV Urania a lo largo de

cinco campañas oceanográficas realizadas entre los años 2008 y 2012. El muestreo se llevó

a cabo con botellas Niskin de 12 litros fijadas a una escarapela provista de sensores SBE-

911 y CTD (Sea-Bird Electronics, Belleve, WA, USA). Las profundidades de toma de

muestra fueron aproximadamente de los 2800 m a los 3100 m, recolectándose tanto agua

hipersalina como sedimentos, ambos almacenados a -80 °C.

El tratamiento de las primeras comenzó al mezclarse 50 mL de estas con 150 mL de

metanol frío (-80 °C, calidad LC), manteniéndose este preparado en frío durante 60

minutos a fin de precipitar las sales. Posteriormente se centrifugaron a 19.3 x 103 g y 4 °C

durante 10 minutos. Una vez retirado el sobrenadante este se almacenó a -80 °C.

Tanto la toma de muestra como la extracción metabólica fue planificada y llevada

a cabo por el equipo del Dr. Michail M. Yakimov, miembro del Institute for Coastal Marine

Environment (Messina, Italia).


34

III.2.a - Betaína

El análisis mediante LC-MS comenzó con la preparación de la muestra. Para ello

300 µL del extracto metanólico anteriormente citado fueron centrifugados a 16 x 103 g y 4

°C durante 15 minutos a fin de precipitar cualquier impureza sólida. Acto seguido los

sobrenadantes se transfirieron a los viales quedando de este modo listos para su análisis.

El perfil metabólico fue obtenido mediante un cromatógrafo de líquidos formado

por un desgasificador en línea, una bomba binaria y un autoinyector (1290 infinity,

Agilent). Las muestras se mantuvieron a 4 °C durante todo el análisis, el volumen de

inyección fue de 0.5 µL y la columna elegida fue una de fase inversa (Zorbax Extend C18 50

x 2.1 mm, 3 μm; Agilent) cuya temperatura de trabajo ascendió a 60 °C. Por su parte el

flujo empleado fue de 0.6 mL/min, siendo la fase móvil agua con 0.1 % de ácido fórmico

(A) y acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico (B). El gradiente comenzó con un 5 % de B (0-

1 minutos), luego elevándose hasta un 80 % (1-7 min) y seguidamente hasta el 100 % (7-

11.5 minutos). Tras retornar a las condiciones iniciales de 5 % de B (11.5-12 minutos) estas

se mantuvieron durante 3 minutos a fin de re-equilibrar la columna. La duración total de

cada análisis fue de 15 minutos.

Los espectros de masas se midieron en inyecciones independientes para la

polaridad positiva y negativa usando un equipo cuya fuente de ionización es el

electrospray y cuyo analizar es un QTOF (Agilent 6550 iFunnel). En polaridad positiva se

realizó un barrido de 50 a 1000 m/z y el voltaje del capilar se fijó en 3000 V, tomándose un

espectro de masas por segundo. La temperatura del gas fue de 250 °C, el flujo del gas de

secado de 12 L/min y la presión del nebulizador de 52 psi. Por su parte, los parámetros del

espectrómetro de masas fueron: diferencia de potencial del fragmentador 175 V, del

skimmer 65 V y del octopolo 750 V. En modo negativo el rango de medida fue de 50 a

1100 m/z y la diferencia de potencial del fragmentador 250 V; el resto de parámetros se

mantuvieron en los mismos valores.

A fin de permitir una constante corrección de la m/z detectada por el equipo se

han inyectado dos masas de referencia. En modo positivo estas fueron: 121.0509


35

([C5H4N4+H]+) y 922.0098 ([C18H18O6N3P3F24+H]+) y en modo negativo: 112.9855 ([C2O2F3-

H]-) y 1033.9881 ([C18H18O6N3P3F24+TFA-H]-).

El análisis dirigido comenzó con la búsqueda de betaína, la cual se llevó a cabo

reutilizando los datos obtenidos mediante este método general de LC-MS que, sin ser la

técnica de elección para este compuesto, sí es una herramienta adecuada para un

enfoque de fingerprinting, que era la aproximación inicial. A tenor de su estructura

molecular (figura 6) se calculó su masa monoisotópica (118.0863) (MS Fragmentor

software, 12.01, ACD/Labs), encontrándose la m/z 118.0866 (error 2.5 ppm) en las

muestras correspondientes a las profundidades de 2932 m, 2941 m y 2963 m. En aras de

realizar una estimación de su posible concentración se prepararon dos estándares

(concentraciones 10 μM y 1 μM), analizándose dos réplicas de cada uno bajo las mismas

condiciones que las muestras. Calculando la correspondiente recta de regresión (r=0.999)

(figura 7) e interpolando las áreas obtenidas se determinó la concentración del analito.

CH3

CH3

CH3

N+

OH

O

Figura 6. Estructura molecular de la betaína.

Figura 7. Recta de regresión calculada a partir de los estándares de betaína.

y = 722320x + 164874R² = 0.9997

-2.E+06

0.E+00

2.E+06

4.E+06

6.E+06

8.E+06

1.E+07

-5 0 5 10 15

Ab

un

dan

cia

(U.A

.)

Concentración del patrón de betaína (µM)


36

III.2.b - Acetato

El otro metabolito interesante para este estudio fue el ácido acético.

Consecuentemente se procedió a su determinación mediante un equipo de electroforesis

capilar zonal (Beckman P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System) en base a un

método previamente desarrollado45. Dicho instrumento consta de un detector UV

(fijándose la longitud de onda a 200 nm), un autoinyector y un capilar de poliacrilamida,

este último de 37 cm de longitud y 75 µm de diámetro. Durante el análisis las muestras se

mantuvieron a temperatura ambiente, inyectándose durante 5 s por diferencia de presión

y aplicándose una diferencia de potencial de 10 kV. El tampón electroforético de elección

fue una mezcla de H2O:MeOH (9:1, ácido fosfórico 0.2 M en el agua) cuyo pH se ajustó a 6.

Las muestras a inyectar se diluyeron 1:1 con agua miliQ, detectándose una posible

presencia de ácido acético sólo en uno de los casos. Para su confirmación se procedió a

reanalizar dicha muestra, previa adición del estándar, siendo la concentración final de este

2 mM y 20 mM (figura 8 A). Esta misma idea se utilizó para descartar la presencia de ácido

acético en las otras dos muestras (figura 8 B y C).

Para la estimación de la concentración del analito se analizaron dos patrones de

ácido acético de concentraciones 4 mM y 40 mM cuyos datos de absorbancia fueron

utilizados para interpolar.


37

Figura 8. Fragmento de los electroferogramas correspondiente a la determinación de

ácido acético. En el eje de abscisas se expresa el tiempo en minutos y en el de ordenadas

la absorbancia en U.A. A) muestra con ácido acético. B y C) muestras sin ácido acético.

Asimismo se representan los electroferogramas correspondientes a los estándares de

ácido acético 4 mM y 40 mM.

III.3 - Resultados

A lo largo de las cinco campañas oceanográficas anteriormente mencionadas se

monitorizaron distintos parámetros a fin de caracterizar el entorno de la fosa en estudio.

Aproximadamente a una profundidad de unos 2877 - 2880 m se detectó un ligero salto en

la concentración de oxígeno, la salinidad y la temperatura. En este punto la salinidad

comenzó a incrementar sus valores (de 38.7 a 39.0 mM), al igual que la temperatura, si

bien el oxígeno adoptó una tendencia de disminución (de 212 ± 17 a 133 ± 12 μmol/L).

Esto permitió establecer la interfaz entre el agua marina normal y la hipersalina entorno a

una profundidad de unos 2910 m (figura 9). A fin de completar esta primera aproximación

se añadieron a las citadas mediciones otras en referencia a las concentraciones de varios

compuestos inorgánicos (tabla 2).


38

Figura 9. Relación entre la salinidad, la temperatura y la concentración de oxígeno

respecto de la profundidad en la fosa Medee. Las barras indican el error estándar respecto

de la media para tres réplicas.

Tabla 2. Composición química del agua hipersalina de la fosa Medee medida en muestras

previamente concentradas diez veces mediante evaporación. Concentraciones expresadas

en mM salvo explícita mención de otra unidad.

Profundidad (m)

Parámetros 2940 2975 3010 3102

Densidad (kg/L) 1.19 1.21 1.22 1.22 Temperatura (°C) 14.45 14.73 15.32 15.44

Salinidad 304 314 325 345 Na+ 4.022 4.110 4.165 4.178 Cl- 4.684 4.833 4.830 5.259

Mg2+ 603 630 773 788 K+ 331 363 462 471

Ca2+ 2.4 2.6 3.0 2.8 SO4

2- 140.4 146.0 166.9 201.0 HS- 0.67 0.93 0.97 1.64 Br- 49.0 53.3 62.6 65.3

H3BO3 1.9 2.0 2.2 2.3 NH4

+ 2.31 2.27 2.45 2.35 Li (µM) 149 160 166 163


39

En cuanto al número total de células procariotas se observó su aumento

significativo en la interfaz (8.6-26.4 x 104 células/mL) respecto de las capas

inmediatamente superiores (1.6-1.9 x 104 células/mL) para, acto seguido, comenzar una

disminución gradual conforme aumenta la profundidad (figura 10).

Figura 10. Relación entre la población microbiana y la profundidad en la fosa Medee. Las

barras indican el error estándar respecto de la media para tres réplicas. DAPI: 4’,6-

diamidino-2-fenilindol, reactivo de tinción fluorescente usado en microscopía para la

realización de recuentos celulares. EUB: Eubacteria. ARCH: Archaea. GM1: Grupo Marino 1

de Thaumarchaeota. EURY: Euryarchaeota.

El siguiente paso consistió en la determinación de las principales especies

microbianas de Medee. Para ello se recurrió a la amplificación mediante PCR (Polymerase

Chain Reaction) y transcripción inversa de rRNA 16S partiendo de varias muestras de RNA

recogidas a profundidades determinadas (figura 11), trabajo realizado por el equipo del

Dr. Michail M. Yakimov, miembro del Institute for Coastal Marine Environment (Messina,

Italia).


40

Figura 11. Panorámica de la población procariota de la fosa Medee. Su estratificación y

abundancia relativa se agrupan por árboles filogenéticos en relación a la profundidad

(RAxML program).

El primero de los puntos significativos a mencionar aquí es la presencia de los

grupos de Alphaproteobacteria y Gammaproteobacteria, dominantes en el área de

transición y en la parte superior de la interfaz y típicos de las zonas oceánicas con poca

concentración de oxígeno. Con relación a los mismos se ha demostrado su capacidad para

fijar CO2 mediante una reacción acoplada a otra de oxidación de compuestos azufrados46

47. Por otro lado, destacamos la ausencia de Epsilonproteobacteria así como de ATP citrato

liasa, enzima clave del reductor ciclo de los ácidos tricarboxílicos que realizan algunos

organismos quimiolitótrofos como el anteriormente citado.

En cuanto a los microbios del agua hipersalina aquí los grupos mayoritarios son

MSBL1 (87 % de las arqueas) (Mediterranean Sea Brine Lakes 1) y KB1 (72 % de las

bacterias) (Kebrit Deep Bacteria 1); ambos constituyen potenciales nuevas divisiones de

procariotas que, al carecer de un miembro cultivable, se han referido en base al nombre

genérico del lugar donde se han identificado. En esta línea, resultan especialmente


41

significativas algunas de las contribuciones realizadas en la dirección de una posible

metanogénesis por parte de los organismos del grupo MSBL143 48 49. Puesto que se ha

confirmado a partir de los datos de rRNA 16S la presencia de metil coenzima M reductasa

en el agua hipersalina de Medee sería posible apuntar a que esta fuese la responsable de

tal actividad.

Siguiendo la línea de un típico experimento metabolómico de análisis dirigido y

dado que los sustratos para la metanogénesis en los ambientes hipersalinos son

conocidos, se procedió a monitorizar la presencia de los metabolitos de interés

confirmándose la existencia de betaína y acetato (tabla 3).

Tabla 3. Concentración estimada de betaína y acetato en las muestras de agua hipersalina

analizadas.

Profundidad (m)

2932 2941 2963

Betaína (μM) 0.07 0.19 0.13 Acetato (mM) No detectado No detectado 0.54

III.4 - Discusión

Los factores principales que condicionan que vida microbiana es posible en los

ambientes hipersalinos son la energía disponible (generada mediante reacciones de óxido-

reducción) y el mantenimiento del equilibrio osmótico del citoplasma48. La osmolaridad

puede regularse de un modo relativamente sencillo mediante diversas estrategias como la

biosíntesis de determinados compuestos o la acumulación de iones monovalentes48 50. La

variable más limitante es la producción energética pues en estos ambientes la ausencia de

luz y de oxígeno impide altos rendimientos exergónicos. Por tanto, solo unas pocas

especies de anaerobios son capaces de soportar estas duras condiciones27 48 50,

habiéndose demostrado recientemente su interconexión simbiótica al constituir una

comunidad capaz de explotar en su conjunto este hostil nicho ecológico51 52.

La estabilidad de esta red trófica se basa en la reducción de betaína, compuesto

típicamente usado en el mantenimiento de la presión osmótica (tal y como se ha

observado en Acetohalobium arabaticum y Methanohalobium evestigatum53). Asimismo


42

se ha demostrado la capacidad de A. arabaticum para degradar betaína mediante su

reducción, usando el hidrógeno como donador de electrones (reacción de Stickland),

cualidad también encontrada en otros miembros del orden Halanaerobiales54. La ausencia

de ATP citrato liasa y de Epsilonproteobacteria descarta otras vías reductoras. Son

productos de la citada reacción de reducción el acetato y la trimetilamina, posible sustrato

para la metanogénesis. La confirmación de la presencia de estos metabolitos indica la

existencia de actividad metanogénica en Medee, aun cuando sus concentraciones son

notoriamente bajas. Asimismo este hecho se avala por la existencia de metil coenzima M

reductasa.

En base a las similitudes encontradas entre Medee y otros ambientes de

características similares53 se puede plantear la hipótesis de la existencia una degradación

reductora de betaína tras la que, aprovechándose uno de sus productos -la trimetilamina-

se llevaría a cabo la metanogénesis. Esta síntesis de novo de materia orgánica se

fundamenta en dos evidencias: la existencia de betaína solo en las capas superiores de

Medee frente su casi total ausencia en las más profundas, donde sería totalmente

consumida y la acumulación de uno de los productos de esta degradación -el acetato- en

la zona más honda, no pudiendo ser otra su procedencia dada la imposibilidad de usar

mono o dimetilamina para su síntesis48 53.

Por otro lado, el análisis detallado de los miembros de la comunidad microbiana

reveló la presencia de al menos seis linajes de procariotas, dominando los ya citados KB1 y

MSBL1. La relación del grupo KB1 con los ambientes de degradación de la betaína y la de

MSBL1 con la de la metanogénesis daría muestra de la complementación de las distintas

ramas filogenéticas, constituyéndose así una red trófica para el aprovechamiento de los

recursos (figura 12).


43

Figura 12. Modelo de síntesis de novo de materia orgánica a partir de la reducción de

betaína y posterior metanogénesis, muestra de la cooperación trófica entre KB1 y MSBL1.

III.5 - Conclusiones

Las evidencias anteriormente citadas han servido para plantear un modelo

hipotético que explique cómo ha lugar la vida bajo las extremas condiciones existentes en

ambientes como el de la fosa mediterránea Medee. Siendo este un ecosistema

estratificado por la concentración salina, la mayor parte de su biomasa se concentra en las

capas superiores próximas a la interfaz donde la disponibilidad de betaína permite su

reducción por las arqueas del grupo KB1, a posteriori suministradoras de trimetilamina

para la biosíntesis de metano realizada por las bacterias MSBL1. El análisis dirigido de

estos metabolitos ha servido para demostrar el potencial de la metabolómica como

herramienta complementaria aplicada al estudio de complejos ecosistemas para cuya

completa descripción se requiere de una aproximación holística multidisciplinar.


44

IV Microbiota intestinal y

tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica

Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica

47

IV - Microbiota intestinal y tratamiento antibiótico, una aproximación multiómica

IV.1 - Introducción

El intestino grueso es sin duda alguna uno de los lugares más desconocidos en lo

que atañe a los procesos de la nutrición humana. A lo largo de su tracto habita una

amplísima población microbiana íntimamente involucrada en la fisiología y la nutrición de

los individuos, esta es la que conocemos bajo el nombre microbiota. En esta línea, este

complejo ecosistema puede asimilarse para su estudio al modelo de un biorreactor

anaeróbico en el cual un amplio catálogo de genes bacterianos complementan nuestras

capacidades de digestión, detoxificación, producción de compuestos bioactivos o

asimilación de determinados nutrientes55 56 57 58 59. Los estudios más recientes parecen

demostrar que cada individuo tiene una microbiota única y más o menos estable,

dominada en un 90 % por los fila Bacteroidetes y Firmicutes junto con otros menos

abundantes como Actinobacteria, Proteobacteria y Verrucomicrobia60. Por otro lado,

parece bastante evidente la capacidad perturbadora del tratamiento antibiótico sobre

estas poblaciones61 62 63, siendo esta aún más digna de consideración dada la emergencia

de resistencias y los importantes problemas de salud pública que esto supone, máxime

tras demostrarse que algunas de estas especies pueden sobrevivir en el intestino humano

durante años61 64 65 66.

Obviamente, ante un tratamiento antibiótico es toda la microbiota la que se ve

afectada y no solo el patógeno contra el que va dirigido. En los últimos años se ha

comenzado a evaluar el efecto de estas terapias sobre la población microbiana del

intestino, primeramente mediante el estudio del rRNA 16S61 64 65 67 68 69 70. Sin embargo, la

gran diversidad de estos organismos complica terriblemente la interpretación de los

resultados. Asimismo, esta investigación se ve limitada por la elección mayoritaria de un

enfoque genómico, que es estático, lo que deja fuera del campo de estudio elementos

dinámicos tales como la expresión de proteínas y metabolitos71.

En lo que respecta al campo específicamente metabolómico cabe mencionar que

ya se ha tratado de monitorizar mediante RMN alguno de los cambios que acontecen en el


48

intestino de los ratones frente a antibióticos de amplio espectro72, pero, hasta donde nos

consta, nunca se ha aplicado esta metodología a un caso humano.

Este capítulo constituye la parte metabolómica del primer trabajo llevado a cabo

para el estudio del tratamiento antibiótico y sus repercusiones sobre la microbiota

intestinal, abordado este desde una perspectiva holística -esto es: genómica, proteómica y

metabolómica-. Gracias a esta aproximación multiómica ha sido posible la construcción de

una auténtica instantánea de la estructura de la población microbiana y de su situación en

el ecosistema intestinal, así como una mejor intelección de las relaciones de esta con la

fisiología humana.

IV.2 - Materiales y Métodos

Las muestras seleccionadas fueron materia fecal fresca procedente de un individuo

que no había estado bajo tratamiento antibiótico durante los últimos tres meses. Dicho

paciente (varón de 68 años) ingresó en el Departamento de Medicina Interna del Hospital

Universitario de Kiel por la infección de su marcapasos y sin presentar en su cuadro clínico

ningún signo de desorden intestinal. El tratamiento antibiótico se inició por vía

intravenosa con la administración de ampicilina/sulbactam (2 x 750 mg/dosis) y cefazolin

(3 x 2 g/dosis). Tras esto se mantuvo el cefazolin (3 x 2 g/dosis) durante 14 días, momento

en el que se le retiró la vía y se dio por finalizada la terapia. Las muestras se recogieron

por triplicado en los siguientes momentos: antes del inicio del tratamiento (día 0), en los

días 3, 6, 11, y 14 de la administración de antibióticos y en el día 40, es decir, 26 días

después del término de la posología. Todas ellas fueron inmediatamente congeladas y

almacenadas a -80 °C.

A partir de las mismas se procedió a la extracción de DNA y RNA; a la secuenciación

de rDNA 16S y rRNA 16S; a la purificación, ampliación y secuenciación de mRNA; al estudio

metagenómico y metatranscriptómico; a la extracción, separación e identificación de las

proteínas y, finalmente, al estudio metabolómico por fingerprintring.

Para este último, de 0.4 a 2 g de cada una de las muestras fueron resuspendidos en

una solución de tampón fosfato salino (phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4) y


49

centrifugadas a 1000 g y 4 °C durante 2 minutos a fin de separar los restos fecales

(infranadante) de la fracción celular. Acto seguido el sobrenadante se centrifugó a 13000 g

durante 5 minutos, obteniéndose así los correspondientes pellets de la microbiota

intestinal.

La extracción de los metabolitos se realizó mediante la adicción de 1.2 mL de

metanol frío (-80 °C, calidad LC) a los pellets seguida de su agitación y reposo durante una

hora a -80 °C. Concluido este periodo, las muestras fueron nuevamente agitadas y

sonicadas durante 30 s en nitrógeno líquido para después volver nuevamente a reposar

durante una hora a -80 °C. Este protocolo se repitió cinco veces para, una vez concluido,

precipitarse los restos indeseados mediante centrifugación a 16000 rpm y 4 °C durante 10

minutos. El extracto metanólico obtenido fue almacenado a -80 °C hasta su llegada al

laboratorio de metabolómica.

A fin de precipitar cualquier impureza sólida que se pudiera haber formado

durante este tiempo, dicho extracto metanólico se centrifugó nuevamente a 13000 g y 4

°C durante 20 minutos. A partir del sobrenadante generado se prepararon los QCs

mediante la mezcla de una parte alícuota tomada de cada una de las muestras,

transfiriéndose el resto a los correspondientes viales para su análisis.

El perfil metabólico fue obtenido mediante un cromatógrafo de líquidos formado

por un desgasificador en línea, dos bombas binarias y un autoinyector (1200 series,

Agilent). La columna elegida fue una de fase inversa (Discovery HS C18, 150 x 2.1 mm, 3

µm, Supelco) protegida mediante la correspondiente precolumna (Discovery HS C18, 20 x

2.1 mm, 3 µm, Supelco), ambas mantenidas a 40 °C durante todo el tiempo de análisis. Por

su parte, el flujo de trabajo fue de 0.6 mL/min, usándose como fase móvil agua con 0.1 %

de ácido fórmico (A) y acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico (B). El gradiente comenzó

con un incremento de B del 25 % al 95 % en 35 minutos, volviendo a las condiciones

iniciales durante el siguiente minuto y manteniéndose estas durante 9 más a fin de re-

equilibrar el sistema. La duración total de cada inyección fue de 45 minutos. Asimismo, ha

de mencionarse que las muestras se analizaron según una secuencia aleatoria,

colocándose entre medias varios QCs a fin de asegurar la precisión instrumental. El


50

volumen de inyección fue de 10 µL, manteniéndose los viales a 4 °C durante todo el

análisis.

Los espectros de masas se midieron en polaridad positiva usando un equipo cuya

fuente de ionización es el electrospray y cuyo analizar es un QTOF (Agilent 6520). El

barrido de masas fue de 50 a 1000 m/z y el voltaje del capilar se fijó en 3000 V,

tomándose 0.77 espectros de masas por segundo. La temperatura del gas fue de 330 °C, el

flujo del gas de secado de 10.5 L/min y la presión del nebulizador de 52 psi. Por su parte,

los parámetros del espectrómetro de masas fueron: diferencia de potencial del

fragmentador 175 V, del skimmer 65 V y del octopolo 750 V.

A fin de permitir una constante corrección de la m/z detectada por el equipo se

inyectaron dos masas de referencia, a saber: 121.0509 ([C5H4N4+H]+) y 922.0098

([C18H18O6N3P3F24+H]+).

Los archivos resultantes se procesaron mediante el algoritmo de deconvolución

MFE, herramienta incluida en el programa informático Mass Hunter Qualitative Analysis

(B.04.00, Agilent). Acto seguido se alinearon todos los cromatogramas (muestras y QCs)

mediante el programa informático MassProfiler Professional (B.02.01, Agilent) para así

proceder con su análisis multivariante mediante el uso de SIMCAP+ (12.0.1.0, Umetrics).

Gracias a este se generó un modelo de PLS-DA, incluyendo en el mismo todas las variables

y la predicción para los QCs (figura 13 A). Como consecuencia se descartó la muestra “día

3”. En un segundo paso se realinearon los cromatogramas correspondientes a las

muestras “día 0”, “día 6”, “día 11”, “día 14” y “día 40”, filtrándose sus variables a fin de

seleccionar aquellas con un mínimo de 100 % de presencia en al menos uno de los cinco

grupos. Seguidamente se procedió a la realización de un t-test comparando los pares “día

0” vs “día 6”, “día 6” vs “día 11”, “día 11” vs “día 14” y “día 14” vs “día 40”

seleccionándose las variables cuyo p valor fuese menor o igual de 0.01. Con ellas se

construyó el correspondiente modelo de PLS-DA (figura 13 B) además de representarse

mediante un HCA (figura 14). En último término la lista de m/z generada tras el t-test se

contrastó con la base de datos de libre acceso METLIN, identificándose 49 m/z de interés

(±1 ppm) luego proyectados mediante un PLS-DA (figura 13 C).


51

IV.3 - Resultados

El agrupamiento de los QCs tras su predicción (figura 13 A) así como los altos

valores de R2 y Q2 demuestran tanto la fortaleza del modelo como la validez biológica de

la separación existente entre los grupos de muestras, la cual mantiene la misma tendencia

tras los filtrados (figura 13 B y C). Consecuentemente se distinguen tres conjuntos: “días 0,

11 y 14”; “día 6” y “día 40”. Esta situación se contrastó con un HCA (figura 14) el cual vino

a corroborar la proximidad de las situaciones metabólicas de los “días 0, 11 y 14” y su

diferencia respecto de “día 6” y “día 40”.

Figura 13. Proyecciones PLS-DA. A) Todo el conjunto de datos (8600 entidades) con

predicción de los QCs. 7 componentes principales. R2=0.989. Q2=0.670. B) Variables

estadísticamente significativas tras el t-test (382 entidades). 4 componentes principales.

R2=0.978. Q2=0.928. C) Variables estadísticamente significativas identificadas en METLIN

(49 entidades). 4 componentes principales. R2=0.968. Q2=0.915.


52

Figura 14. HCA de las variables estadísticamente significativas tras el t-test (382

entidades). Las m/z más abundantes se representan en rojo, las menos abundantes en

azul.

Esta misma tendencia se observó en los datos de metranscriptómica y proteómica

(figura 15).

Figura 15. A) Metatranscriptómica. Agrupamiento de las muestras en función del tipo y

abundancia de los genes expresados, la distancia entre las mismas se calculó mediante la

función Bray-Curtis. B) Proteómica. Agrupamiento de las muestras en función del tipo y

abundancia de las proteínas expresadas, la distancia entre las mismas se calculó mediante

la correlación de Pearson.


53

Centrándonos en los datos de metabolómica, lo primero a reseñar es que de las

382 variables significativas 29 son comunes a todas las muestras. Asimismo, la muestra

“día 40” es la que contiene un mayor número de entidades, 280, seguida de “día 6” con

234, “día 14” con 185, “día 11” con 121 y “día 0” con 139.

De acuerdo con las identificaciones putativas de METLIN (tabla 4, anexo) se

pueden establecer cinco grupos de metabolitos (figura 16). En base a los mismos destaca

el aumento de los ácidos orgánicos de cadena larga y de los péptidos los “días 6 y 40”,

estos incluyen: dos esfingolípidos, seis ácidos grasos insaturados, dos amidas, un ácido

lipofosfatídico y un tripéptido. Por su parte, los glicero(liso)fosfolípidos están aumentados

los “días 11 y 14” y disminuidos tras el fin del tratamiento antibiótico. Finalmente, ha de

ser mencionado el significativo aumento en el “día 40” de algunos compuestos tales como

varios derivados de colesterol, precursores de vitamina D, ácidos biliares, prostaglandinas

y esteroles.

Figura 16. Representación esquemática de la abundancia de los distintos grupos de

metabolitos bacterianos a lo largo de la secuencia de muestreo. Grupo 1: ácidos grasos

(18), esfingolípido (1), glicerolípidos (2), glicerofosfolípido-LPA (1), esterol-alcaloide (1).

Grupo 2: ácido graso con aldehídos y alcoholes (1), esfingolípido (1), carnitinas (2), ácido

graso con etanolamida (1). Grupo 3: ácido graso con etanolamida (1), esteroles-derivados

de vitamina D3/ácidos biliares (4), derivados de prostaglandinas (2), ácido graso

insaturado (1). Grupo 4: esfingolípido (1), esterol-derivado de vitamina D3/ácido biliar (1).

Grupo 5: esterol-corticoide (1). Entre paréntesis se indica el número de metabolitos de

cada clase.


54

IV.4 - Discusión

La evaluación de las repercusiones del tratamiento antibiótico sobre el ambiente

del intestino humano requiere inicialmente de la mención de los dos factores principales

que modulan los cambios en la microbiota: primeramente, la selección de las especies

resistentes y su posterior remisión tras el cese de la presión antibiótica, y en segundo

lugar, la velocidad con la que acontecen los fenómenos en el nivel objeto de estudio,

factor muy significativo al tratarse de una aproximación multiómica.

En el presente capítulo se ha demostrado que el mayor cambio se produce en la

transición entre los días 11 y 14, tras alcanzarse un pico de mínima diversidad microbiana

el día 11. Todo ello vendría precedido de una reducción de los organismos Gram-negativos

(día 6) y una posible colonización de su nicho ecológico por parte de los microbios propios

de la parte superior del tracto intestinal, tales como los Bacteroidetes, que naturalmente

son resistentes a los betalactámicos (día 11). Tras esto comenzaría a recuperarse el

número y tipo de Gram-positivas propias del tramo distal del intestino, cosa que ya se ha

apuntado en varios estudios previos basados en rDNA 16S65 68 69.

Estas oscilaciones poblacionales muestran su correlato en la biodiversidad y

riqueza de los metabolitos y proteínas determinados en cada uno de los tiempos de

muestreo. Uno de los primeros elementos a considerar es la disminución de la expresión

proteica, si bien particularmente las proteínas implicadas en la glicolisis, la

descarboxilación del piruvato, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, el metabolismo del

glutamato, la incorporación de hierro y la hidrólisis del GTP experimentan un sutil

aumento tras el inicio de la administración antibiótica (día 6) a fin de permitir a las

bacterias mayores posibilidades de supervivencia ante una situación de estrés y de falta

de nutrientes. No obstante, hacia el final del tratamiento todas ellas estarían disminuidas

significativamente.

Por otro lado, en cuanto a la expresión génica, se ha detectado una disminución

general de la actividad de los elementos móviles extracromosomales asociados a la

regulación de las secuencias palindrómicas espaciadoras, que en conjunto constituyen un

primitivo tipo bacteriano de inmunidad adaptativa73, pues dichas secuencias protegen a


55

las células de la invasión de DNA exógeno (vía virus o plásmido)74. Por ende, bajo la

presión antibiótica, la microbiota intestinal sería más susceptible de adquirir nuevas

secuencias de DNA, incrementándose así la posibilidad de obtener genes por transferencia

horizontal, a la postre responsables del desarrollo de resistencias.

Desde la perspectiva metabólica el primer hecho que resultó llamativo fue la

disminución de varios grupos de compuestos esperados en base a la estructura de la

población microbiana. En esencia, esto sugiere una alteración de la relación establecida

entre las enzimas pancreático/hepáticas y las microbianas, lo que es congruente con la

situación anteriormente citada que ha lugar con las proteínas. En conjunto esto apuntaría

hacia una disminución de la actividad de ciertas vías metabólicas claves, lo cual se ha

tratado de modelizar esquemáticamente en la figura 17.

Aparentemente, la excreción biliar de los antibióticos es la que dispara toda la

cascada de acontecimientos bioquímicos. Inicialmente las bacterias responderían al

tratamiento aumentado tanto la actividad de sus sistemas de defensa, tales como la

expresión de betalactamasas y péptidos transportadores, como la síntesis de

glicerofosfolípidos, a fin de luchar contra una situación de falta de nutrientes. En este

contexto disminuirían la producción de polisacáridos y lipopolisacáridos. Por otro lado, los

genes relacionados con la síntesis de la cubierta celular y la degradación del

peptidoglicano aumentarían su expresión, manteniéndose elevada hasta el final del

tratamiento. Asimismo, la parte bacteriana del metabolismo de los ácidos biliares, las

hormonas y el colesterol, se ve atenuada, lo que posiblemente afecta a la circulación

enterohepática y a la síntesis lipídica, si bien, tras el fin del tratamiento, se retornaría a los

niveles previos al inicio del mismo. Una situación análoga ocurre con las vitaminas cuya

síntesis o asimilación depende de la microbiota (típicamente la B12). Por lo que respecta a

las rutas metabólicas directamente implicadas en la nutrición de los procariotas (glicólisis,

ciclo de los ácidos tricarboxílicos, metabolismo del glutamato, incorporación de hierro…)

estas presentan una inducción hasta un máximo de actividad que ha lugar el día 6, a partir

del cual se atenúan paulatinamente. Esto se traduciría en una significativa disminución en

la circulación enterohepática de los compuestos en cuyo proceso de asimilación


56

intervienen las bacterias tales como el hierro, algunos azúcares o ciertos aminoácidos

ramificados. Finalmente, en lo que respecta stricto sensu a la estructura de la población

bacteriana se puede constatar una progresiva oscilación que iría desde una predominancia

inicial de los Bacteroidaceae hasta una situación final de dominio de los Burkholderiaceae.

Figura 17. Esquema interpretativo de las variaciones de la microbiota y la actividad

metabólica en el intestino humano frente a un tratamiento antibiótico. Las líneas

continuas indican relaciones, las discontinuas aumentos o disminuciones de las sustancias

consignadas en los respectivos recuadros.


57

IV.5 - Conclusiones

El presente capítulo constituye una evidencia empírica pionera sobre la posibilidad

de la integración de distintos datos ómicos aplicados al estudio de una situación biológica

concreta: la evolución de la microbiota y de sus relaciones con el individuo hospedador

durante un tratamiento antibiótico con betalactámicos. El modelo construido viene a

apuntar en la dirección de la producción de profundas alteraciones en ambos factores

durante la administración de los fármacos, para, una vez concluida la pauta posológica,

retornarse a una situación más o menos similar a la de partida. Con todo, a pesar de lo

atrayente de estas conclusiones, estas deben ser matizadas antes de su generalización

pues han sido obtenidas a partir de datos procedentes de un único paciente.


58

V Efecto y resistencia de los

fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum,

un enfoque multiplataforma

Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un enfoque multiplataforma

61

V - Efecto y resistencia de los fármacos antimoniales sobre Leishmania infantum, un

enfoque multiplataforma

V.1 - Introducción

La leishmaniasis es una de las enfermedades parasitarias más ampliamente

difundida a nivel mundial, cuya incidencia aumenta en los países en vías de desarrollo.

Actualmente se considera que unos 350 millones de personas viven bajo unas condiciones

de serio riesgo de contagio, contabilizándose unos 2 millones de casos nuevos por año75.

La transmisión del parásito entre los mamíferos -hospedadores vertebrados- se

debe a la picadura de las hembras de la subfamilia Phlebotominae -hospedadores

invertebrados-, las cuales necesitan la sangre de los primeros para la maduración de su

progenie. Esto introduce algunas formas promastigote en el torrente sanguíneo,

comenzando de este modo el ciclo de vida de Leishmania spp. (figura 18). Fagocitados por

las células del sistema inmune, rápidamente los promastigotes se transforman en

amastigotes en el interior de los fagolisosomas, multiplicándose en medio de este

ambiente hostil hasta matar al macrófago. Esto liberaría a la circulación sanguínea una

importante carga de amastigotes, los cuales serán ingeridos por las Phlebotominae tras

una nueva picadura. El ciclo se cerraría con la vuelta a la forma promastigote, cosa que ha

lugar en el intestino medio del hospedador invertebrado.


62

Figura 18. Esquema del ciclo de vida de Leishmania spp. según el Laboratory Identification

of Parasites of Public Health Concern del Centers for Disease Control and Prevention76.

Las manifestaciones clínicas de la enfermedad sirven para su clasificación en tres

grupos según produzca una lesión exterior localizada (cutánea), afecte a las mucosas

(mucocutánea) o dañe los órganos internos (visceral). Hoy en día los principales focos de

leishmaniasis visceral se localizan en Sudán e India, mientras que en Afganistán, Siria y

Brasil prima la manifestación cutánea77. En esta última se incluyen algunas variantes

particulares tales como la mucocutánea, la cutánea difusa, la recidivante y la dérmica

post-kala-azar. Ahora bien, si la leishmaniasis cutánea tiende espontáneamente a su

curación (aunque pueda evolucionar a alguna de las formas antes mencionadas según la

especie de Leishmania que la haya producido y el estado del sistema inmune)78, la visceral

es mucho más agresiva y puede causar la muerte si no se recibe tratamiento. Esta última

mayoritariamente la produce el complejo Leishmania (L.) donovani - Leishmania (L.)

infantum, si bien la malnutrición y la depresión del sistema inmune (fundamentalmente

por una coinfección con VIH) también predisponen a su desarrollo75.


63

Lamentablemente, los tratamientos actuales están limitados tanto en número

como en eficacia. Los primeros en introducirse fueron los antimoniales pentavalentes (Sb

(V)), usados ya en Brasil en 1912 contra la leishmaniasis cutánea y mucocutánea y en Italia

en 1915 contra la visceral79 80. En las últimas décadas se han desarrollado algunos nuevos

fármacos contra la leishmaniasis visceral tales como la anfotericina B o la miltefosina, si

bien los antimoniales siguen siendo el tratamiento más frecuente. Tras su uso durante

más de sesenta años ha sido en los últimos treinta cuando la aparición de resistencias a Sb

(V) ha comenzado a ser un verdadero problema clínico. Esto viene a ilustrarse con el alto

porcentaje de fracasos terapéuticos registrado en India en pacientes previamente no

tratados, que según los datos más actuales se elevaría hasta un 65 %81. Todo ello apunta

hacia un mal uso generalizado de los antimoniales que, en última instancia, sería la razón

principal de esta emergencia de resistencias82.

Aunque su mecanismo de acción ya ha sido estudiado, los resultados todavía no

son concluyentes. Las investigaciones iniciales sugerían que el Sb (V) inhibe la síntesis

macromolecular en los amastigostes83, probablemente mediante la alteración del

metabolismo energético al perturbar la glicólisis y la β-oxidación de los ácidos grasos84.

Trabajos posteriores pusieron de manifiesto la inducción de la apoptosis celular en

amastigotes tratados con Sb (III) al detectarse cierta fragmentación de su DNA y la

externalización de fosfatidilserina en la superficie de su membrana celular85 86.

Finalmente, se ha demostrado que, in vitro, el Sb (III) actúa como inhibidor competitivo de

la tripanotiona reductasa87, cosa que apuntaría a que el metabolismo del glutatión y del

tripanotión también estaría involucrado en la medida en la que juega un papel central en

la regulación del estrés oxidativo. Esta última hipótesis ha ganado popularidad desde que

se ha demostrado una relación directa entre el Sb (III) y la perturbación del equilibrio

redox del parásito88.

Una situación análoga se presenta en lo referente al mecanismo de resistencia,

tradicionalmente interpretado como un balance entre la entrada, salida y secuestro de la

molécula activa89. En esta línea, en los miembros de la familia Tripanosomatidae no puede

obviarse el papel central que juegan el tripanotión y el glutatión, tioles claves en sus


64

procesos de detoxificación de metales pesados90. En primer lugar, los niveles de estos se

relacionan con los de las enzimas implicadas en la síntesis de glutatión (glutamilcisteina

sintasa y gsh 1) y poliaminas (ornitina decarboxilasa), moléculas que a la postre son las

precursoras del tripanotión90 91 92 93 94 95. Otra posibilidad a tener en cuenta es la

conjugación directa del metal con un tiol, proceso catalizado por la glutatión-S-

transferasa96. En este sentido, los niveles de esta última97 así como los de la tripanotión-S-

transferasa96 se han visto alterados en los casos de resistencia a antimonio. Por otro lado,

la cantidad de este en la célula también puede controlarse actuando sobre su entrada o

salida, proceso que, para los metaloides trivalentes, se ha visto mediado por

acuagliceroporinas98. Asimismo, la conjugación tiol-Sb es posible gracias a su secuestro en

una vacuola intracelular mediante la proteína A, un transportador de la familia ABC99.

Finalmente, la resistencia a Sb también puede relacionarse con el citoesqueleto,

estructura fundamentalmente formada por dímeros de α-/β-tubulina. En la medida en la

que su síntesis se ve afectada por metaloides100 101 102 103 104 105 como el As y en cuanto a

que ya se han registrado casos de resistencia cruzada de este con Sb, no resulta

descabellado pensar en una interrelación de ambos a nivel del citoesqueleto. Con todo,

para una perfecta compresión de la resistencia también ha de tenerse en cuenta el papel

activo que juega el hospedador, factor ampliamente explicado por Haldar et al.78

Siendo esta la situación, la metabolómica, en su enfoque de fingerprinting,

constituye una herramienta atractiva para enfrentarse a este problema. En esta línea,

para conseguir una cobertura del metaboloma tan completa como sea posible es

fundamental la combinación de varias plataformas de análisis106, máxime si la materia a

abordar es tan compleja como ciertamente lo es el funcionamiento celular a nivel

molecular19. Además, en la medida en la que no se dispone de ningún biomarcador de

resistencia a ninguno de los fármacos actualmente en uso contra Leishmania spp. es

particularmente urgente su identificación, hasta el punto de constituir una de las

prioridades de la Organización Mundial de la Salud107. Consecuentemente, en los últimos

años la leishmaniasis ha sido ampliamente estudiada108 109 110 111, incluso en lo referente al

mecanismo de acción del Sb78 89 112 113. En esta línea, el presente capítulo afronta esta


65

cuestión mediante el uso de tres plataformas de análisis (LC-MS/MS, CE-MS y GC-MS) a fin

de ahondar tanto en el conocimiento del mecanismo de acción como en el de la

resistencia a Sb (III) en L. (L.) infantum. El experimento se completa con una estrategia

novedosa para el rastreo de 13C, usada a fin de identificar la ruta sintética de los

biomarcadores previamente caracterizados.

V.2 - Materiales y Métodos

Los promastigotes de las cepas de L. (L.) infantum M/CAN/ES/96/BCN150 fueron

suministrados por el Dr. F. J. Carrión de la Facultad de Veterinaria de la Universidad

Complutense de Madrid. Estos se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con un

10 % de suero fetal bovino inactivado por calentamiento a 26 °C. Las cepas resistentes se

obtuvieron mediante el cultivo de la parental bajo concentraciones crecientes de tartrato

potásico de Sb (III) hasta que los parásitos pudieron soportar 180 µM. El cultivo masivo

comenzó con un inóculo de 4.105 promastigotes/mL que, una vez hubo alcanzado la fase

exponencial y una concentración de 8.106 promastigotes/mL, fue transferido al mismo

volumen de medio fresco e incubado -o no- en presencia de tartrato potásico de Sb (III)

120 µM durante 12 horas (la concentración inhibitoria de éste para esta cepa es de

20.9 µM). Tras su recolección, los parásitos se lavaron con medio Hank a 4 °C e

inmediatamente después se congelaron con N2 líquido, manteniéndose a -80 °C hasta su

llegada al laboratorio de metabolómica. La preparación del experimento con 13C siguió

exactamente los mismos pasos, si bien el cultivo de los parásitos se hizo en medio RPMI-

1640 cuya arginina había sido sustituida completamente por L-arginina marcada con 13C

en todas sus posiciones.

De este modo, el diseño experimental contempló la existencia de tres grupos de L.

(L.) infantum, a saber: cepas sensibles tratadas (ST), cepas sensibles no tratadas (SNT) y

cepas resistentes (R), contando con cuatro réplicas de cada una de ellas.

En LC-MS cada pellet de 4.107 promastigotes se resuspendió y lisó mediante la

adición de 200 µL de MeOH/H2O (4:1) y posterior agitado con TissueLyser LT (Qiagen,

Germany) con 2 bolas de cristal de 2 mm durante 5 minutos a 50 Hz. Seguidamente, las


66

impurezas se eliminaron mediante centrifugación (15700 g, 4 °C, 20 minutos) y posterior

filtrado del sobrenadante a través de un filtro de nilón de 0.22 µm. De este modo quedó la

solución lista para su análisis.

En esta plataforma, el perfil metabólico fue obtenido mediante un cromatógrafo

de líquidos formado por un desgasificador en línea, dos bombas binarias y un autoinyector

(1200 series, Agilent). La columna elegida fue una de fase inversa (Discovery HS C18, 150 x

2.1 mm, 3 µm, Supelco) protegida mediante la correspondiente precolumna (Discovery HS

C18, 20 x 2.1 mm, 3 µm, Supelco), ambas mantenidas a 40 °C durante todo el tiempo de

análisis. Por su parte, el flujo de trabajo fue de 0.6 mL/min, usándose como fase móvil

agua con 0.1 % de ácido fórmico (A) y acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico (B). El

gradiente comenzó con un incremento de B del 25 % al 95 % en 35 minutos,

manteniéndose así durante 5 minutos y volviendo a las condiciones iniciales durante el

siguiente minuto, mantenidas estas durante 9 más a fin de re-equilibrar el sistema. La

duración total de cada inyección fue de 50 minutos. Asimismo, ha de mencionarse que las

muestras se analizaron según una secuencia aleatoria, colocándose tanto al inicio como a

intervalos regulares varios QCs a fin de asegurar la precisión instrumental. El volumen de

inyección fue de 15 µL, manteniéndose los viales a 4 °C durante todo el análisis. Los

espectros de masas se midieron en polaridad positiva usando un equipo cuya fuente de

ionización es el electrospray y cuyo analizar es un QTOF (Agilent 6520). El barrido de

masas fue de 50 a 1000 m/z y el voltaje del capilar se fijó en 3000 V, tomándose 1.95

espectros de masas por segundo. La temperatura del gas fue de 330 °C, el flujo del gas de

secado de 10.5 L/min y la presión del nebulizador de 52 psi. Por su parte, los parámetros

del espectrómetro de masas fueron: diferencia de potencial del fragmentador 175 V, del

skimmer 65 V y del octopolo 750 V. A fin de permitir una constante corrección de la m/z

detectada por el equipo se inyectaron dos masas de referencia, a saber: 121.0509

([C5H4N4+H]+) y 922.0098 ([C18H18O6N3P3F24+H]+).

En CE-MS cada pellet de 4.107 promastigotes se resuspendió y lisó mediante la

adición de 200 µL de MeOH/H2O (4:1) y posterior agitado con TissueLyser LT (Qiagen,

Germany) con 2 bolas de cristal de 2 mm durante 5 minutos a 50 Hz. Seguidamente las


67

impurezas se eliminaron mediante centrifugación (15700 g, 4 °C, 20 minutos).

Posteriormente, 150 µL del sobrenadante se transfirieron y evaporaron a 35 °C en un vial

con inserto mediante SpeedVac SPD121P (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

Finalmente el precipitado se resuspendió en 150 µL de H2O MilliQ, centrifugándose

nuevamente con las condiciones antes descritas y transfiriéndose el sobrenadante a un

nuevo vial, quedando así listo para su análisis.

En esta plataforma, el perfil metabólico fue obtenido con un equipo de

electroforesis capilar (7100 Agilent) acoplado a un espectrómetro de masas TOF (6224

Agilent). La separación se llevó a cabo en polaridad normal en un capilar de sílice fundida

de 100 cm de longitud y 50 µm de diámetro. El tampón de separación se preparó a partir

de una solución 0.8 M de ácido fórmico en MeOH/H2O (10 %), manteniéndose a 20 °C

durante todo el análisis. A lo largo del mismo y antes de cada nueva inyección se procedió

a lavar el capilar con el citado tampón durante 5 minutos. Asimismo, el equipo contaba

con líquido auxiliar (0.6 µL/min), mezcla de MeOH/H2O (50 %) con 0.1 mM de ácido

fórmico y dos masas de referencia, a saber: 121.0509 ([C5H4N4+H]+) y 922.0098

([C18H18O6N3P3F24+H]+), las cuales permitir una corrección constante de la m/z detectada.

Las muestras fueron inyectadas hidrodinámicamente mediante la aplicación de una

presión de 50 mBar durante 50 s, seguida de un stacking de tampón introducido mediante

la aplicación de 100 mBar durante 10 s. El voltaje de separación fue 30 kV con una presión

interna de 25 mBar, siendo el tiempo total de cada análisis 30 minutos. Por su parte, los

parámetros del espectrómetro de masas fueron previamente optimizados114 mediante el

estudio de la relación señal/ruido para la m/z 175.1179. Estos fueron: fragmentador 100

V, skimmer 65 V, octopolo 750 V, presión del nebulizador 20 psi y, respectivamente,

temperatura y flujo del gas de secado 200 °C y 12.0 L/min. El voltaje del capilar se fijó en

3500 V, adquiriéndose los datos en modo positivo en un barrido de masas de 80 a 1000

m/z y midiéndose 1.02 espectros/s. Asimismo, ha de mencionarse que las muestras se

analizaron según una secuencia aleatoria, colocándose tanto al inicio como a intervalos

regulares entre ellas varios QCs.


68

En GC-MS cada pellet de 4.107 promastigotes se resuspendió y lisó mediante la

adición de 350 µL de MeOH/Cl3CH/H2O (3:1:1) y posterior agitado con TissueLyser LT

(Qiagen, Germany) con 2 bolas de cristal de 2 mm durante 5 minutos a 50 Hz.

Seguidamente las impurezas se eliminaron mediante centrifugación (15700 g, 4 °C, 20

minutos). Posteriormente, 200 µL del sobrenadante se transfirieron y evaporaron a 35 °C

en un vial con inserto mediante SpeedVac SPD121P (Thermo Fisher Scientific, Waltham,

MA). Para la metoximación se adicionaron 10 µL de hidrocloruro de o-metoximamina en

piridina (15 mg/mL), incubándose las muestras durante 16 horas en oscuridad. Después se

añadieron otros 10 µL de BSTFA con un 1 % de trimetilclorosiloxano, incubándose las

muestras durante 1 hora a 70 °C para su sililación. Finalmente se adicionaron 100 µL de

heptano con C18:0 metilester (100 ppm), compuesto usado como patrón interno.

Siguiendo exactamente el mismo procedimiento se prepararon dos blancos, analizados

estos al inicio y al final de la secuencia. Asimismo, ha de mencionarse que las muestras se

analizaron según una secuencia aleatoria, colocándose tanto al inicio como a intervalos

regulares entre ellas varios QCs.

En esta plataforma, el perfil metabólico fue obtenido mediante un cromatógrafo

de gases (Agilent Technologies 7890A) acoplado a un autoinyector (Agilent Technologies

7693) y un cuadrupolo (Agilent Technologies 5975). La columna elegida fue una DB5-MS

de 30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y 0.25 µm de recubrimiento interno,

formado este por una película de dimetilpolisiloxano (95 %) y difenilpolisiloxano (5 %).

Esta se protegió con una precolumna de 10 m (Agilent 122-5532G), inyectándose 2 µL de

muestra derivatizada. El flujo del gas portador (He) se fijó en 1 mL/min y la temperatura

del inyector en 250 °C. La relación de split fue 1:10, usándose un liner con lana de vidrio

desactivada (Restek 20782). El gradiente de la temperatura comenzó a 60 °C, mantenidos

durante un minuto, e incrementándose a partir de aquí hasta los 325 °C a razón de 10

°C/min. Finalmente se refrescó el sistema durante 10 minutos a fin de acondicionarlo para

la siguiente inyección. El tiempo total de análisis fue de 37.5 minutos. La línea de

transferencia del detector, el filamento de la fuente y la temperatura del cuadrupolo se

fijaron respectivamente en 290 °C, 230 °C y 150 °C. Por su parte, la fuente de ionización de


69

impacto electrónico trabajó a -70 eV, midiéndose en polaridad positiva con un rango de

barrido de 50 a 600 m/z y detectando 2 espectros por segundo.

Tras el trabajo de laboratorio, este inmenso volumen de datos recolectados se

trató de dos maneras distintas, de una para LC-MS y CE-MS y de otra para GC-MS. En LC y

CE los archivos resultantes se procesaron mediante el algoritmo de deconvolución MFE,

herramienta incluida en el programa informático Mass Hunter Qualitative Analysis

(B.04.00, Agilent). Acto seguido se alinearon de manera independiente para cada técnica

todos los cromatogramas mediante el programa informático MassProfiler Professional

(B.02.01, Agilent). Las m/z se filtraron en base a su presencia en las muestras de los

distintos grupos (QCs, ST, SNT y R), fijándose como criterio para todas las técnicas un 50 %

de presencia en los QCs además de un 75 % de presencia mínima de cada m/z en cada

grupo (ST, SNT y R). Procediéndose a la comparación por parejas (ST vs SNT para investigar

el efecto del tratamiento y R vs SNT para indagar sobre las causas de la resistencia), las

diferencias significativas se evaluaron mediante un test estadístico univariante (Mann-

Whitney U, p valor ≤ 0.05). Esta lista de masas se contrastó con la base de datos de libre

acceso METLIN. Para aquellos compuestos que resultaron ser más interesantes se

procedió a la confirmación de su identificación con LC-MS/MS, para esto se repitió el

análisis en las mismas condiciones pero fragmentándose los iones seleccionados mediante

disociación por colisión inducida. Así se generaron sus espectros de MS/MS. Comparando

estos con los de las estructuras propuestas fue posible concluir a cuál de ellas se

correspondían. La información para esto se obtuvo a partir de tres fuentes: METLIN, los

patrones comerciales (en el caso de estar disponibles) y el programa informático MS

Fragmentor (12.01, ACD/Labs).

En lo que respecta a GC-MS el tratamiento de datos comenzó con la identificación

de los metabolitos. Esta, junto con la deconvolución, se realizó mediante el programa

informático AMDIS115 (versión 2.69), el cual compara los espectros y los índices de

retención o tiempos de elución de los datos experimentales con los de la biblioteca de

Fiehn116. La fiabilidad de este procedimiento viene garantizada por la reproducibilidad de

los patrones de fragmentación en una fuente de impacto electrónico así como por el


70

reajuste de la elución de los distintos compuestos en base al RT del patrón interno, que en

la biblioteca de Fiehn es de 19.663 minutos. El filtrado fue análogo al descrito

anteriormente.

Finalmente se procedió al análisis de las muestras cultivadas con 13C mediante LC-

MS y CE-MS, siguiéndose las mismas condiciones metodológicas ya descritas para ambas

técnicas. Para la determinación de la presencia o ausencia de la marca de 13C se

compararon las cepas control y las tratadas con L-arginina marcada, identificándose el

correspondiente pico [M+nº13C+H]+ en el espectro de masas de alguna de aquellas

entidades que resultaron ser estadísticamente significativas (Mann-Whitney U, p valor ≤

0.05).

V.3 - Resultados

En aras de demostrar la calidad del modelo biológico y el rigor analítico del

experimento se procedió a la construcción de tres modelos de PCA mediante el programa

SIMCAP+ (12.0.1.0, Umetrics) (figura 19). En base a la separación observada entre los

grupos, así como por el agrupamiento de los QCs, se confirmó la validez de los resultados

en ambos aspectos.

Figura 19. Modelos de PCA construidos con los features filtrados al 50 % de presencia en

los QCs. A) LC-MS: 2 componentes, R2=0.620, Q2=-0.029. B) CE-MS: 2 componentes,

R2=0.872, Q2=0.694. C) GC-MS: 2 componentes, R2=0.515, Q2=0.235.


71

Con idéntico propósito y llegando a las mismas conclusiones se confeccionaron los

modelos de PCA para los análisis de 13C (figura 20). Esto supone de facto una validación

biológica de los resultados obtenidos tras el primer experimento.

Figura 20. Modelos de PCA construidos con los features filtrados al 50 % de presencia en

los QCs (muestras control y 13C). A) LC-MS: 3 componentes, R2=0.428, Q2=0.107. B) CE-MS:

2 componentes, R2=0.577, Q2=0.424.

La tabla 5 resume el número de m/z que superaron cada una de las etapas de

filtrado descritas en el apartado anterior. De aquellas que resultaron ser estadísticamente

significativas sus identificaciones, naturaleza bioquímica y porcentajes de cambio (para

cada comparación ST vs SNT y/o R vs SNT) se recogen en la tabla 6 (anexo),

complementada con la tabla 7 (anexo) donde se han consignado los fragmentos usados

para la identificación por LC-MS/MS. La lista de los metabolitos marcados con 13C estaría

reflejada en la tabla 8 (anexo). Por su parte, en la figura 21 se presenta un gráfico con el

número de compuestos identificados por técnica. Ya en este punto se hace evidente lo útil

que resulta un análisis multiplataforma pues solo 10 de los 61 compuestos (16 %) son

comunes a dos técnicas y ninguno de ellos se detectó en las tres. Esto significa que el 84 %

restante es exclusivo de una técnica, repartido más o menos equitativamente entre las

tres plataformas al identificarse un 35 % en CE-MS, un 26 % en GC-MS y un 23 % en LC-

MS/MS.


72

Tabla 5. Número de compuestos tras el alineamiento, el filtrado y la estadística para cada

una de las comparaciones (ST vs SNT y R vs SNT) y técnicas de análisis.

LC-MS CE-MS GC-MS

ST vs. SNT

R vs. SNT

ST vs. SNT

R vs. SNT

ST vs. SNT

R vs. SNT

Número de m/z

Tras el alineamiento

7299 7299 1072 1072 89 89

Tras el filtrado 1197 1074 79 157 36 40

Tras la estadística 283 278 32 97 23 24

Identificadas 14 31 26

Figura 21. Número de compuestos identificados por técnica de análisis.

En esta línea, la figura 22 representa la clasificación de los compuestos

identificados por técnica en base a su naturaleza bioquímica. En general, la categoría más

abundante es la de los aminoácidos, péptidos y conjugados, con al menos un 22 %. A ella

le siguen la de los ácidos orgánicos y las aminas. No obstante, las diferencias por técnica

son importantes. En CE-MS los aminoácidos, péptidos y conjugados son el grupo más

destacado con un 67 %, tras este sitúan las purinas y pirimidinas con un 13 % y los ácidos

orgánicos con un 10 %. Por su parte, en GC-MS, tras los aminoácidos (42 %), el colectivo

más significativo es el de los carbohidratos con un 27 % y luego el de las purinas y

pirimidinas con un 12 %... y lo que es más, tanto carbohidratos como esteroles y prenoles

no se han detectado en ninguna otra plataforma. En lo que atañe a LC-MS/MS el grupo

dominante es el de los ácidos grasos con un 36 %, seguido del de los aminoácidos con un

22 % y los esfingolípidos y bases esfingoideas con un 21 %. Asimismo tanto los ácidos

grasos como los esfingolípidos y los glicerofosfolípidos son exclusiva de esta técnica.


73

Figura 22. Porcentaje de compuestos identificados por técnica clasificados en función de

su naturaleza bioquímica. Los colores indican el grupo biológico, referenciado este en la

tabla contigua.

V.4 - Discusión

Generalmente se ha venido aceptando que los antimoniales pentavalentes

necesitan reducirse a su forma trivalente para tener actividad antileishmania77. No

obstante, tanto el lugar donde esto ocurre (macrófago o amastigote) como el mecanismo

que media el proceso (enzimático o no enzimático) son fuente de controversia. Por

ejemplo, algunos estudios117 118 119 120 sugieren que los amastigotes axénicos son sensibles

al Sb (V) mientras que no lo son los promastigotes, lo que apuntaría a que la reducción se

produce en esta etapa del ciclo de vida del parásito. Sin embargo, la situación opuesta

también ha sido objeto de publicación121. Asimismo ha de tenerse en cuenta que tanto el

glutatión como el tripanotión pueden reducir Sb (V) de manera no enzimática bajo

condiciones ácidas122 123 124 125 126, si bien también es posible que esto acontezca por una

vía enzimática mediada por una reductasa tiol dependiente -relacionada con la glutatión

S-transferasa-127 o por un homólogo de la arsenato reductasa128. Precisamente para evitar

esta polémica se decidió usar directamente antimonio trivalente sobre promastigotes de

L. (L.) infantum.

Tal y como se ha expresado en la introducción, es bien sabido que los fármacos

antimoniales alteran el equilibrio redox de Leishmania spp. al interferir en su capacidad

para producir antioxidantes derivados del tripanotión. Sin embargo, las últimas

investigaciones han demostrado que esto es más complejo de lo que se pensaba en la

medida en la que se ha constatado una significativa reacción del sistema inmune del

hospedador al gluconato sódico de antimonio, capaz de activar tanto la inmunidad

Aminas

Ácidos grasos

Ácidos orgánicos

Aminoácidos, péptidos y conjugados

Carbohidratos

Cetonas y aldehidos

Esfingolípidos y bases esfingoideas

Esteroles

Glicerofosfolípidos

Purinas/pirimidinas y conjugados


74

innata129 como la adaptativa130. En cuanto al primer tipo de inmunidad, se ha visto como

el gluconato sódico de antimonio induce la generación de radicales libres en las células

sanguíneas periféricas de ratones infectados con L. infantum131 así como la producción de

NO en leishmaniasis canina132. En lo que atañe a la inmunidad celular ha de mencionarse

que el gluconato sódico de antimonio induce la proliferación de los linfocitos T,

concretamente los Th1133 134 y los T citotóxicos135, si bien no actúa sobre los linfocitos B, lo

que podría constituir una buena explicación de la pobre respuesta registrada al

tratamiento con antimoniales en pacientes coinfectados con Leishmania spp. y VIH.

Tal y como se observa en los resultados (tabla 6, anexo), tanto la arginina como sus

subproductos ornitina, putrescina y tripanotión disulfuro están disminuidos en los

parásitos tratados. Por otro lado, tanto la arginina como el tripanotión disulfuro, la

putrescina y la ornitina están incrementados en las cepas resistentes. A este respecto

algunos estudios han sugerido que la disponibilidad de arginina es uno de los factores

limitantes para la supervivencia del parásito136 137. Esto se entiende en tanto que la

arginina puede usarse para la producción de citrulina y ornitina y esta a su vez para

sintetizar putrescina y espermidina. Esta última se usa junto con el glutatión para formar

glutationil-espermidina y tripanotión, el principal antioxidante del parásito138.

Si un primer pensamiento nos induciría a afirmar que el tratamiento con

antimoniales estaría actuando vía aumento de la producción de NO, compuesto que

mataría al parásito, esto debe matizarse, pues conforme avanza la terapia y decrece el

número de parásitos, también lo hace la producción de NO, hecho que parece apuntar a

que la principal acción del antimonio se ejercería de manera directa sobre el metabolismo

del parásito139 y no sobre el del hospedador. En este sentido los resultados confirman uno

de los mecanismos propuestos para explicar la actuación del Sb (III) vía perturbación de la

síntesis de tripanotión disulfuro. Asimismo apuntan hacia una novedosa explicación del

fenómeno de la resistencia, que estaría causada por un aumento permanente de los

niveles de arginina y sus subproductos (figura 23). El rol central del metabolismo de este

aminoácido queda confirmado por la marcación con 13C de la ruta de las poliaminas (tabla

8, anexo).


75

Figura 23. Representación esquemática de las principales alteraciones del metabolismo.

Verde: metabolito aumentado. Rojo: metabolito disminuido. Subrayado: detectado con

13C. Flecha continua: relación bioquímica directa. Flecha discontinua: relación bioquímica

mediada por dos o más enzimas. A) ST vs SNT. B) R vs SNT.

V.5 - Conclusiones

Los resultados recogidos en este capítulo demuestran la necesidad de un enfoque

multiplataforma para lograr una cobertura del metaboloma tan completa como sea

posible, detectándose un tipo u otro de compuestos según la técnica utilizada. Asimismo,

se evidencia el potencial explicativo de la metabolómica en cuanto a herramienta

bioanalítica per se, capaz de generar un modelo explicativo en respuesta a las preguntas


76

sobre el mecanismo de acción del Sb y la generación de resistencias por Leishmania (L.)

infantum.

VI Contaminación,

biodegradación y actividad microbiana en el

Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración

multiómica

Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar Rojo, hacia la integración multiómica

79

VI - Contaminación, biodegradación y actividad microbiana en el Mediterráneo y el mar

Rojo, hacia la integración multiómica

VI.1 - Introducción

El mar Mediterráneo es una de las áreas geográficas más amenazadas por el alto

riesgo de contaminación que sufren sus aguas, debida tanto al gran número de

conducciones residuales y vertidos industriales como al intenso tráfico marítimo. Sirva

como ejemplo que, solo este último, se estima en unos 55 millones de toneladas métricas

de crudo por año140 141, lo que supone el 20 % de la producción mundial, cantidad

increíble si se tiene en cuenta que el Mediterráneo apenas representa el 1 % de la

superficie marítima planetaria. A tenor de estas cifras no resulta sorprende que, por

ejemplo en el año 2000, hubiera unas 600 mil toneladas métricas de vertidos de crudo142

143. En esta línea, diversos estudios han demostrado que un alto número de ensenadas,

puertos y estuarios están contaminados144, incluyendo una cifra considerable de

productos metabolizados que son incluso más dañinos que los de partida145, lo que

ocasiona indeseables sinergias y aumenta así la toxicidad total146. Por si fuera poco, todo

esto se ve agravado por el perfil geográfico del Mediterráneo y su carácter de cuenca

semi-cerrada, motivo por el cual estas especies químicas se ven atrapadas y tienden a

acumularse.

Por todo ello resulta crucial tanto una mejor comprensión del destino y

recuperación de estas áreas147 como del impacto de estos vertidos sobre nuestra cadena

alimentaria148, además de poder conocerse que poblaciones microbianas pueden vivir en

tales ambientes. En este sentido, la distribución de las especies bacterianas debe resultar

de especial interés dada la gran diversidad de sedimentos, salinidades, oreografías, climas,

tipos de nutrientes y posibles asociaciones entre los distintos consorcios de procariotas149

150, lo que no es sino muestra de la flexibilidad y adaptabilidad de sus metabolismos151. Las

especies microbianas que más contribuyen a la degradación de crudo pertenecen al grupo

de las Gammaproteobacteria (particularmente a los géneros Alcanivorax, Marinobacter,

Oleispira, Thalassolitus, Oleiphilus, Cyclocasticus y Neptunomonas) y de las


80

Alphaproteobacterias (en especial el orden Rhodobacterales), siendo mucho menos

frecuentes los Firmicutes (concretamente los del género Planomicrobium). En su conjunto,

este es el elenco dominante en estos ecosistemas contaminados, si bien, cada organismo

tiene sus preferencias. Por ejemplo, los géneros Cycloclasticus y Neptunomonas son

especialista en la degradación de hidrocarburos policíclicos aromásticos146, por su parte

Oleispira antárctica152 y Thalassolitus oleivorans153 optan por las aguas frías, mientras que

Oleiphilus messinensis y Alcanivorax borkumensis154 se decantan por las de temperatura

más moderada.

La situación, per se, dista de ser sencilla, para complicarse aún más al deberse

tener en cuenta las influencias de la concentración de crudo en el agua155 156 157 158, su

propia diversidad química158 y su interacción con los diversos procesos geoquímicos

locales158. En conclusión, tanto la diversidad microbiana como su carga genética se ven

profundamente afectadas por los vertidos de petróleo148 156 159 160 161, fenómeno que, tras

los estudios de los derrames de crudo que se produjeron en la plataforma Deepwater

Horizon en 2010 en el Golfo de México, se ha determinado que aproximadamente tarda

un mes en manifestarse162.

Sin embargo, y a pesar de todo lo que se ha investigado, hasta la fecha no se han

combinado técnicas de secuenciación génica con modelos computacionales para estudiar

la estructura de las poblaciones de procariotas y sus rutas metabólicas de biodegradación

de tóxicos en lugares contaminados por petróleo. Asimismo, muchas secuencias génicas

de las que disponemos no han podido ser vinculadas con una especie en concreto. En este

sentido este trabajo es el siguiente paso lógico, estudiar la composición de la comunidad

bacteriana y su actividad combinando datos genómicos y metabolómicos, en los cuales

aquí nos centraremos especialmente. Todo ello se ha desarrollado gracias a la financiación

y colaboración de tres proyectos a nivel comunitario, a saber, MAGICPAH163, ULIXES164 y

KILLSPILL165. Bajo este marco, los objetivos planteados por la Unión Europea fueron tres:

determinar la influencia de las contaminaciones crónicas de petróleo en la diversidad

microbiana, estudiar la capacidad metabólica de las comunidades de procariotas


81

establecidas en tales áreas y, en base a esto, intentar desarrollar nuevos biométodos para

su descontaminación.

En esta línea y enlazando con lo referido en primer lugar, el mar Mediterráneo es

un área de particular interés y todavía no muy estudiada por la comunidad internacional a

este nivel. Para tales propósitos se recogieron muestras de sedimentos de ocho lugares

(figura 24) contaminados por crudo y diseminados a lo largo y ancho de sus costas,

procedentes de ubicaciones tan dispares como Marruecos, Túnez, Egipto, Grecia e Italia

(del golfo de Génova y de las aguas de Mesina y Siracusa). La lista se completó con una

muestra del puerto de Aqaba (Jordania) en el mar Rojo.

Figura 24. Localización geográfica y nomenclatura adoptada para cada una de las muestras

procedentes de los correspondientes emplazamientos contaminados.

Cada uno de estos emplazamientos resulta interesante por diversos motivos. El

Max (ELMAX) se localiza al oeste de la ciudad de Alejandría, siendo éste el punto más

contaminado de las costas egipcias al exceder ampliamente el límite legal en las

concentraciones de metales pesados, hidrocarburos aromáticos y otros derivados del


82

petróleo. En el extremo occidental, la ensenada Mar Chica (MCh) es una de las mayores

bahías de todo el Mediterráneo en la cual se recogen todos los vertidos de la ciudad

marroquí de Nador. Por su parte, la ensenada de Bizerta (BIZ) se localiza en las aguas de

Túnez y está contaminada tanto por la urbanización costera como por la refinería STIR.

Más al este, el golfo de Aqaba (AQ), de territorialidad jordana, da cobijo a una de las

mayores terminales petroleras del mundo con unos 20 ó 30 millones de toneladas

métricas anuales de tránsito, lugar en el que los vertidos accidentales por las operaciones

de carga y descarga son relativamente frecuentes. Por otro lado, el puerto de Priolo (PRI)

Gargallo, próximo a las aguas de la localidad siciliana de Siracusa, se caracteriza por una

densa concentración de industrias pesadas que conllevan un intenso tráfico marítimo,

relacionado tanto con la exportación de su producción como con su abastecimiento de

hidrocarburos. También en Sicilia, pero al norte, se ubica el puerto de Mesina (MES) el

cual sufre de una contaminación crónica de petróleo y sus derivados debida a la baja

renovación hidrodinámica de sus aguas. Por su parte, en el golfo de Génova se hundió en

1991 el petrolero MT Haven (HAV). Finalmente, Elefsina (ELF), bahía próxima a Atenas,

presenta altos grados de contaminación debidos a los vertidos de la refinería ELPE.

Al margen de estas consideraciones geográficas, las expectativas europeas se

concretaron en cuatro puntos, objetivos de un trabajo más amplio que el aquí consignado.

En primer lugar, caracterizar el ambiente geoquímico de las zonas contaminadas. En

segundo término, determinar que microbios ocupan dichos nichos ecológicos.

Seguidamente, averiguar si los cambios en la población microbiana de las distintas zonas

se asocian a sus capacidades biodegradativas y/o a las especies químicas del ambiente.

Finalmente, acometer una caracterización metabólica detallada de los mecanismos de

biodegradación propuestos en base a una reconstrucción computacional elaborada a

partir de datos de secuenciación génica. Para esto último se han dado tres pasos:

secuenciar el DNA total, relacionar estos datos con secuencias génicas conocidas y

contenidas en las base de datos de KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) e

integrar esta información con los resultados de un análisis metabólico dirigido de las

especies químicas más relevantes.


83

VI.2 - Materiales y Métodos

La toma de muestra se llevó a cabo entre abril de 2011 y septiembre de 2013 en

los ocho lugares ya referidos (figura 24). Para ello se recogieron entre 10 y 1200 g de

sedimento marino, a continuación almacenados en frío. A partir de estas muestras se

acometieron las correspondientes medidas de los parámetros geoquímicos de interés y se

realizaron los tratamientos pertinentes a fin de prepararlas para su análisis genómico y

metabolómico. Todo este proceso, así como la planificación experimental del proyecto,

corrió a cargo del Dr. Michail M. Yakimov, miembro del Institute for Coastal Marine

Environment (Messina, Italia), del Dr. Daniele Daffonchio, catedrático de la Università

degli studi di Milano (Italia) y del Dr. Manuel Ferrer, miembro del Instituto de Catálisis del

Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, España). Tanto los cultivos

microbianos, como los datos de genómica y la reconstrucción informática de las rutas

metabólicas que se recogen en el presente capítulo es fruto del trabajo de sus equipos así

como de su coordinación.

El tratamiento de las muestras para su análisis metabolómico de fingerprinting

partió de 5 g de sedimento, mezclados con 10 mL de MeOH frío (-80 °C). Estos fueron

sonicados durante 2 minutos, procedimiento que se repitió cuatro veces mediando entre

cada una de las mismas lapsos de 2 minutos. Durante todo este tiempo las muestras se

mantuvieron refrigeradas. A continuación se procedió a retirar el sobrenadante, luego

centrifugado a 10000 g y 4 °C durante 30 minutos. Precipitadas todas las impurezas

sólidas, el extracto de interés se almacenó a -80 °C hasta su llegada al laboratorio de

metabolómica, donde no recibió más tratamiento que su purificación a través de un filtro

de nilón de 0.2 µm de tamaño de poro. Dada la limitación en la cantidad de sedimento de

partida solo PRI, HAV, MES y AQ fueron objeto de fingerprinting, analizándose tres

réplicas de cada una obtenidas de las división del extracto metanólico inicial. Los

correspondientes QCs se prepararon mediante la mezcla de una parte alícuota tomada de

cada una de las muestras. El perfil metabólico fue obtenido mediante LC-MS, cuyo

método, columna y equipo se corresponden con los ya descritos en el capítulo I de la

presente tesis. Los archivos resultantes se procesaron mediante el algoritmo de


84

deconvolución MFE, herramienta incluida en el programa informático Mass Hunter

Qualitative Analysis (B.05.00, Agilent). Acto seguido se alinearon todos los cromatogramas

(muestras y QCs) mediante el programa informático MassProfiler Professional (B.02.01,

Agilent), procediéndose a su filtrado en base a la selección de aquellas variables presentes

en al menos el 50 % de los QCs y en el 100 % de las muestras de cada grupo. De este modo

en LC-MS (+) el número de variables se redujo de 114050 a 3390 y en LC-MS (-) de 54358 a

1485. Seguidamente se llevó a cabo un análisis multivariante de los datos filtrados

mediante el uso de SIMCAP+ (12.0.1.0, Umetrics) (figura 26 A). Asimismo se realizó un

HCA previa normalización de los datos mediante la división de sus abundancias

individuales por la desviación estándar de cada variable (figura 26 B), procedimiento

llevado a cabo gracias a la página web de libre acceso MetaboAnalyst 2.0166.

Por otro lado, el análisis metabolómico dirigido comenzó con la preparación de

nuevas muestras. Para tal fin se suplementó un medio mínimo ONR7a con una mezcla de

los siguientes sustratos al 0.1 % de concentración final. Estos fueron: naftaleno,

tetradecano, ácido benzoico, ácido 4-clorobenzoico, ácido 3-nitrobenzoico, ácido 4-

hidroxibenzoico, ácido ftálico, ácido isoftálico, ácido tereftálico, antraceno, 2,3-

dihidroxibifenilo, ácido 4-hidroxifenilpirúvico, ácido 3,4-fenoxibenzoico, carbazol, fenol,

2,4,6-trihidroxitolueno y ácido gálico, todos ellos del proveedor Fluka-Aldrich-Sigma

Chemical Co. (St. Louise, MO, USA). Una vez conseguida esta preparación, 300 mL de esta

mezcla fueron añadidos a 100 mL de sedimento marino de cada uno de los lugares de

muestreo, los cuales previamente habían sido convenientemente mezclados con 10 mL de

petróleo árabe esterilizado por filtración. Estos 100 mL de sedimento contaban

aproximadamente con una densidad celular de 2.0 x 105 células/g. Finalmente se

añadieron NH4Cl y Na2HPO4 hasta alcanzar una concentración de 5 mM y 0.5 mM

respectivamente. Estos cultivos se mantuvieron en agitación constante a 250 rpm,

controlándose tanto su temperatura como su concentración de O2 a fin de reproducir las

condiciones medioambientales (tabla 9). Los tiempos de incubación hasta la toma de

muestra fueron de 1 día (R0) , 2 semanas (R2) y 3 semanas (R3), contándose por tanto con

una batería de 24 muestras a analizar. Para su recolección se centrifugó el cultivo a 13000


85

g durante 5 minutos, añadiéndose posteriormente 1.2 mL de MeOH frío sobre la fracción

celular, a partir de lo cual se siguió el procedimiento ya descrito en el capítulo II de la

presente tesis y objeto de la citada publicación71. Asimismo y a fin de determinar la

presencia o ausencia de los citados metabolitos junto a la de sus productos de

degradación (catecol, clorocatecol, ácido salicílico, ácido mucónico, ácido gentísico, ácido

protocatecuico, ácido homogentísico, ácido mirístico, tolueno y ácido

homoprotocatecuico) se prepararon las correspondientes patrones (proveedor Fluka-

Aldrich-Sigma Chemical Co., St. Louise, MO, USA) en MeOH a una concentración

aproximada de 100 ppm, analizándose estos en una secuencia separada de la de las

muestras. A nivel experimental tanto patrones como muestras se analizaron por LC-MS

(método, columna y equipo especificados en el capítulo I) y GC-MS (método, columna y

equipo especificados en el capítulo III). Aun cuando se trató de un análisis dirigido se

prepararon QCs a fin de garantizar la estabilización inicial del sistema cromatográfico. La

correspondiente identificación y caracterización de los picos cromatográficos de los

estándares se basó tanto en su espectro como en su tiempo de retención, a partir de los

cuales se confeccionaron dos bibliotecas, una para cada una de las plataformas de análisis.

Mediante los programas informáticos ChemStation (G1701EA E.02.00493, Agilent) en GC-

MS y Mass Hunter Qualitative Analysis (B.05.00, Agilent) en LC-MS y en base a estas

bibliotecas se realizó en las muestras la identificación e integración de los picos

correspondientes a los compuestos de interés (tabla 10).

VI.3 - Resultados

La caracterización de los distintos ambientes geoquímicos (tabla 9) constituyó el

primer paso para determinar si es su diversidad la que induce un crecimiento de

comunidades microbianas distintas o si por el contrario los responsables son los

contaminantes.


86

Tabla 9. Características fisicoquímicas principales de los sedimentos investigados. (-): no

determinado.

AQ BIZ ELF ELMAX HAV MCh MES PRI

Masa muestra (g) 50 50 50 50 1200 10 1200 1200

Temperatura (°C) 27 - 13 20 15 21 23 19

Conductividad (mS/cm) 89 13 57 77 49 54 70 49

pH 8.30 7.76 7.50 7.59 8.05 8.62 7.37 6.85

Profundidad (m) 18 - 16 9 78 32 1 6

Densidad microbiana (células/g) 3.4 x 105 2.6 x 105 2.3 x 105 3.0 x 105 1.9 x 106 2.6 x 105 2.2 x 105 4.0 x 105

[Petróleo total] (ppm) 2400 1120 500 1822 Alquitrán 5100 1000 4000

[Ca2+] (mg/L) 126 - - - 420 87 420 420

[Cl-] (mg/L) 20000 20000 20000 20000 20000 20000 20000 20000

[O2] (mg/L) 20.0 - 6.0 18.0 6.0-6.5 22.0 1.0-2.2 0.0

El siguiente paso lógico fue el procesamiento de la información procedente de la

secuenciación génica, obtenida esta mediante amplificación por PCR de rRNA 16S, a fin de

determinar la variedad taxonómica en las muestras de sedimentos contaminados. La

correlación de estos datos con las unidades taxonómicas operacionales queda reflejada en

la figura 25 A, donde se dan noticia de los distintos phyla microbianos presentes. Su

interrelación se estableció mediante el correspondiente modelo de PCA (figura 25 B).

Figura 25. Resultados de la secuenciación de rRNA 16S. A) Diversidad y abundancia

relativa de los distintos phyla microbianos. B) PCA.

Esta batería de resultados, luego usados para la reconstrucción computacional de

las rutas de degradación, se complementó con los datos metabolómicos (figura 26 y tabla

10). El agrupamiento de las muestras observado en los modelos de PCA (figura 26 A)


87

demuestra que la dispersión entre estas es debida a una diferencia biológica real y no al

azar, lo que asimismo refuerza la validez de la metodología de análisis. Por otra parte, la

relación entre las muestras en base a su huella metabólica se expone en el HCA (figura 26

B). La tabla 10 recoge las abundancias de los distintos metabolitos cuya biodegradación

fue predicha por el modelo computacional.

Figura 26. A) Modelos de PCA construidos con los datos filtrados. A1) LC-MS (-): 2

componentes principales, R2=0.338, Q2=0.013. A2) LC-MS (+): 2 componentes principales,

R2=0.491, Q2=0.210. B) HCA construido con los datos filtrados y normalizados. B1) LC-MS (-

). B2) LC-MS (+).


88

Tabla 10. Abundancias relativas de los distintos compuestos cuyo metabolismo fue predicho computacionalmente. N.D.: no detectado. Metabolito Fórmula

Técnica analítica

Masa monoisotópica

Ion principal

Ion cualificador

RT patrones

(min) AQ R1 AQ R2 AQ R3 BIZ R1 BIZ R2 BIZ R3 ELF R1 ELF R2 ELF R3

ELMAX R1

ELMAX R2

ELMAX R3

HAV R1

HAV R2

HAV R3

MCh R1

MCh R2

MCh R3

MES R1

MES R2

MES R3

PRI R1 PRI R2 PRI R3

2,3-dihidroxibifenilo C12H10O2 GC-MS 186.0681 330 212 16.9 8862 74787 55052 5641 165527 117000 9518 103999 106625 7745 202856 168988 8305 191023 238394 6406 140359 156961 9356 56319 56033 8041 344736 289554

2,4,6-trihidroxitolueno

C7H8O3 GC-MS 140.0473 341 253 15.3 176 264 69 70 57 74 334 57 64 75 175 64 121 102 59 60 63 135 388 84 195 57 77 158

Ácido 3,4-fenoxibenzoico

C13H10O3 GC-MS 214.0630 271 227 18.0 23274 547560 517007 22639 260227 251671 24118 571067 508540 22543 549540 576060 21740 509050 480614 20279 254960 249900 22962 87005 84240 27034 77950 71447

Ácido 3-nitrobenzoico

C7H5NO4 GC-MS 167.0219 224 178 14.4 4700 7776 8487 4060 78839 75111 4930 47830 42410 4903 45388 46095 3959 86875 82738 4295 65027 64505 4394 26025 25941 5195 83944 75850

Ácido 4-clorobenzoico

C7H5ClO2 GC-MS 155.9978 213 169 11.8 13983 65242 38631 5672 124621 102480 8515 16117 17827 6429 119830 88384 9801 228563 317203 5866 216731 489522 10230 145635 168756 7019 254822 178336

Ácido 4-hidroxibenzoico

C7H6O3 GC-MS 138.0317 267 193 14.5 26448 45953 46369 26513 483165 465397 27771 285352 259072 22772 279783 280859 25978 551171 521734 24109 395442 405647 27480 157391 145657 33203 516449 491910

Ácido 4-hidroxifenilpirúvico

C9H8O4 GC-MS 180.0423 338 277 17.5 1707 2343 2000 1794 13973 17624 2326 36402 29844 2348 21157 24666 1761 52056 36792 2038 18725 18210 2087 17856 7566 1627 30778 26887

Ácido benzoico C7H6O2 GC-MS 122.0368 179 135 9.6 23902 114339 47362 8627 100108 67699 9893 99118 126325 8169 125513 66258 22978 171913 249503 6145 152077 147238 21695 63417 82273 8495 447107 233860

Ácido ftálico C8H6O4 GC-MS 166.0266 295 221 15.2 14793 76770 70839 12883 284322 285619 15070 78214 84850 13431 77711 77529 15876 271743 245441 12666 300780 296548 14856 297451 274646 17503 245779 245717

Ácido gálico C7H6O5 GC-MS 170.0215 281 458 18.0 162 1310 273 319 425 396 610 598 611 555 840 523 355 503 334 282 682 602 363 276 412 199 496 633

Ácido gentísico C7H6O4 GC-MS 154.0266 355 223 16.1 205 1175135 1115646 279 773058 729340 305 769203 680102 120 741399 744763 300 213 65 216 754751 731086 66 979088 974244 469 124270 54961

Ácido homogentísico C8H8O4 GC-MS 168.0423 384 341 16.8 0 725215 717387 0 407526 385442 0 210646 200056 0 311342 324319 0 76429 78153 0 385378 390315 0 374922 376933 0 79216 76891

Ácido homoprotocatecuico

C8H8O4 GC-MS 168.0423 267 179 16.7 154 93827 92428 62 51506 50852 69 26522 26982 83 38112 44068 72 63690 62998 68 51364 50861 90 50274 49847 76 64751 62367

Ácido isoftálico C8H6O4 GC-MS 166.0266 279 103 16.0 6187 21371 20130 6233 130990 127135 7628 129076 115155 6643 56084 57070 7080 118810 108083 6330 133503 121757 6861 118009 118709 8041 110311 109213

Ácido mirístico C14H28O2 GC-MS 228.2089 285 117 17.0 1734 986624 938952 2065 597912 603556 2109 722878 673676 2138 575668 578089 2743 338900 113887 2286 580996 554256 2717 799450 804206 3014 419719 401038

Ácido mucónico C6H6O4 GC-MS 142.0266 271 227 14.4 0 65 10425 0 1256 1613 0 722 737 0 726 1014 0 1427 1350 0 833 1272 0 425 196 0 1846 1353

Ácido protocatecuico C7H6O4 GC-MS 154.0266 311 281 16.6 590 431043 419393 279 118309 114848 281 237657 214052 182 411610 427341 246 3491 7106 153 320401 317765 269 462813 472842 670 84384 37769

Ácido salicílico C7H6O3 GC-MS 138.0317 267 135 13.0 114 774815 519869 1759 411517 261805 154 396511 405143 88 386143 283689 110 378607 490665 1110 412476 377854 129 433339 462997 113 6622 3473

Ácido tereftálico C8H6O4 GC-MS 166.0266 221 103 16.3 7728 52451 50647 5452 50334 49118 7596 55080 48302 6841 59099 59769 7340 51974 123129 7030 69294 462066 7661 29995 31570 12804 43766 43127

Antraceno C14H10 GC-MS 178.0783 178 152 16.6 1221 3783 2752 1128 1397 2100 1089 58906 55314 985 8431 5301 1221 39827 78322 1026 3517 13263 70 12946 10185 1903 35218 31234

Carbazol C12H9N GC-MS 167.0735 166/167 140/139 18.4/17.1 280 7022 5960 592 27479 20481 586 92952 106032 380 14044 17508 222 56407 99294 528 27633 49883 413 85560 94440 681 48967 79026

Catecol C6H6O2 GC-MS 110.0368 254 239 10.5 57 531445 282517 655 335313 176719 980 397974 452708 697 384088 216036 611 433624 377058 491 492913 433979 653 292499 358364 1052 492238 358121

Clorocatecol C6H5ClO2 GC-MS 143.9978 288 185 12.7 0 91010 55919 0 22755 15015 58 88311 97264 0 29431 21041 66 100244 122273 0 74 0 0 34601 35326 0 130702 101142

Fenol C6H6O GC-MS 94.0419 151 166 6.8 1709 13272 3452 1212 4749 3968 1177 13594 22914 1307 22047 7222 1269 82722 113455 1403 9362 14336 1531 5010 6702 1430 33806 14352

Naftaleno C10H8 LC-MS

(+) 128.0626

4.8 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 2063 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.

Tetradecano C14H30 GC-MS / LC-MS

(±) 198.2348

N.D.

Tolueno C7H8 GC-MS / LC-MS

(±) 92.0626

N.D.


89

VI.4 - Discusión

La caracterización geoquímica de los ambientes en estudio muestra su gran

diversidad (tabla 9). Por ejemplo, en lo que a la temperatura media respecta se observa

una marcada variación entre los relativamente fríos 13 °C de ELF y los 27 °C de AQ.

Análogamente ocurre con el pH, que oscila entre un valor ligeramente ácido de 6.85 en

PRI y otro básico de 8.62 en MCh. Por su parte, la saturación de oxígeno, parámetro crítico

para el crecimiento bacteriano, abarca cifras que van desde la anoxia en PRI o la

microaerobiosis en MES a datos de aguas bien oxigenadas como las de AQ. Asimismo, la

cantidad de petróleo oscila entre las 500 ppm de ELF y las 5100 de MCh. Sin embargo, el

número de células por gramo de muestra revela ciertas sorpresas dado que la anóxica PRI

tiene valores relativamente altos para carecer de O2, siendo el máximo absoluto el de HAV

y el mínimo el de MES. A tenor de esta situación se realizó un intento de análisis

multivariante sobre estas variables, cuya conclusión es la ausencia de diferencias

significativas entre las muestras en el nivel de sus características geoquímicas.

Por otro lado, los datos de la secuenciación génica de rRNA 16S muestran la

diversidad de las comunidades microbianas (figura 25 A). Su análisis de componentes

principales (figura 25 B) pone de manifiesto la existencia de dos grupos: HAV, PRI, BIZ y

ELF frente a AQ, MES, MCh y ELMAX. Esto sugiere que el parámetro geoquímico más

influyente es la temperatura, pues HAV, PRI, BIZ y ELF se sitúan en un rango de 13 a 19 °C,

frente a AQ, MES, MCh y ELMAX que están entre 20 y 27 °C. A su vez, la subdivisión dentro

de este grupo es nuevamente debida a la temperatura (ELMAX y MCh tienen 20-21 °C

frente a MES y AQ que están en los 23-27 °C). Esta distribución no se correlaciona con el

resto de parámetros geoquímicos, cosa particularmente llamativa en el caso de la

saturación de O2 pues MES y PRI, que son las dos muestras con una menor concentración

de este, no se agrupan en la figura 25 B. En relación a la figura 25 A queda de manifiesto

que el phylum más abundante en todas las muestras es el de Proteobacteria, del cual la

clase de Gammaproteobacteria es la predominante en AQ, HAV, PRI, MES y BIZ cuyos

géneros más insignes, a saber: Marinobacter, Pseudoalteromonas y Cyclocasticus, son bien

conocidos por su actividad biodegradativa167 168. Por su parte, en MCh el phylum


90

predominante es el de Bacteroidetes, cuya clase más importante es la de Flavobacteria. A

nivel medioambiental el grupo de los Bacteroidetes es importante en el ciclo marino del

carbono por su reconocida capacidad de degradar moléculas de alto peso molecular y

biopolímeros169. La presencia de los Bacteroidetes también es significativa en MES, en la

que sin embargo lo más llamativo es la existencia del candidato a división OD1, grupo

encontrado previamente en ambientes anóxicos y con altas concentraciones de sulfuro170.

No obstante, el estudio de las relaciones entre los miembros de las distintas comunidades

bacterianas debe tener en cuenta su abundancia relativa en cada una de las muestras. Así,

el criterio propuesto por Jed A. Fuhrman et alii171 apuesta por distinguir entre taxones

raros (menos del 1 %), frecuentes (1-10 %) y muy abundantes (más del 10 %). Incluyendo

esto y reanalizando los datos de la secuenciación (figura 27) se observa con total nitidez

que las diferencias entre las muestras son debidas a aquellos grupos presentes en menor

medida, correlacionándose los resultados de la figura 27 A (genéticos) con los de la 26

(metabólicos).

Figura 27. HCA en base a los datos de secuenciación de rRNA 16S cuya distancia se ha

estimado en base a la función de Pearson. A) Taxones raros. B) Taxones frecuentes. C)

Taxones muy abundantes.

Partiendo de estos datos de secuenciación se identificaron un total de 238449

genes potencialmente codificadores de proteínas, complementándose la información

proporcionada por el análisis del rRNA 16S con datos de secuenciación de DNA de cada


91

una de las poblaciones. Este análisis metagenómico se orientó hacia la caracterización de

las posibles rutas de degradación que están operando en cada una de las muestras, entre

las cuales también aquí se observa cierta diversidad siendo PRI la que menos genes

potencialmente codificadores presenta (5858) frente a BIZ, que es la que más (55601). Su

asignación funcional se realizó enfrentando estos datos con los de la base de datos de

KEGG. De acuerdo con esto y con la información sobre las funciones bioquímicas de cada

una de las enzimas potencialmente presentes se planteó una red hipotética de

catabolización para los distintos alcanos y compuestos aromáticos construida mediante un

algoritmo programado a fin de interrelacionar todas estas variables172. En total se predijo

el metabolismo de 42 sustratos y sus intermediarios, perteneciendo estos a diversos

grupos, a saber: alcanos, ácidos grasos e hidrocarburos policíclicos aromáticos (naftaleno,

carbazol, fenantreno y quinolinas) y sus intermediarios (ácido salicílico, catecol y ácido

gentísico), derivados del catecol (fenol, bifenol, benceno y ácido 2-clorobenzoico),

derivados del ácido protocatecuico (ácido ftálico, ácido 3-fenoxibenzoico y ácido 3-

nitrobenzoico) y derivados del ácido 4-hidroxifenilacético y sus intermediarios (ácido

homoprotocatecuico, ácido 4-hidroxifenilpirúvico, tolueno, ácido gálico, 2-aminofenol,

ácido 3-clorobenzoico). Es asimismo llamativo que la distribución enzimática predicha

(figura 28) presente un agrupamiento concordante con los datos genómicos (figura 27 A) y

metabolómicos (figura 26).

Figura 28. HCA de la distribución enzimática predicha en base a los datos de

secuenciación. La distancia entre los grupos se ha estimado en base a la función de

Pearson.


92

Sin embargo, los datos de secuenciación no necesariamente han de

correlacionarse con aquello que esté teniendo lugar en el sistema biológico en estudio y,

lo que es más, todavía se desconoce la función, e incluso la secuencia, de muchos genes.

Por ello la validación de este modelo teórico necesita apoyarse en los resultados

concretos de la metabolómica (tabla 10), que es la única disciplina ómica capaz de

proporcionar una instantánea de lo que está pasando. La figura 29 muestra el grado de

degradación de cada uno de los contaminantes así como la producción de los distintos

intermediarios tras tres semanas de incubación. Comparando los datos de abundancia de

la tabla 10 a tiempo R0 y R3 se puede estimar de manera concluyente en que porcentaje

se degrada cada uno de los tóxicos en cada muestra. De este modo se observa que AQ y

BIZ metabolizan todos los contaminantes, respectivamente en un grado del 99 al 41 % y

del 97 al 4 %. ELMAX no cataboliza fenol y carbazol, procesando los otros en un ratio del

98 al 29 %. Por su parte HAV no degrada ácido clorobenzoico, carbazol, fenol y antraceno,

siendo los porcentajes del resto del 98 al 4 %. MES no metaboliza antraceno ni carbazol,

degradando el resto del 99 al 47 %. PRI cataboliza los tóxicos del 88 al 30 % excepto el

ácido benzoico, el ácido clorobenzoico, el 2,3-dihidroxibifenilo y el carbazol. Finalmente,

MCh es capaz de degradar los sustratos de un 96 a un 55 % excepto el ácido

clorobenzoico, el ácido tereftálico y el carbazol.


93

Figura 29. A) En porcentaje, degradación de los contaminantes. 100 % significa no

degradación. B) Producción de las especias químicas intermedias. El máximo se representa

en rojo. En ambos casos no se han tenido en cuenta los datos de ELF cuyos valores están

fuera del rango de la escala.

VI.5 - Conclusiones

Los ambientes marinos contaminados y la actividad bioquímica que en ellos tiene

lugar constituyen un tema crucial, no solo en aras de una posible biosolución del

problema, sino por la comprensión per se de lo que allí está aconteciendo. Para ello se

requiere de un estudio ómico global, demostrándose en este capítulo como, lo que a nivel

teórico es esperable, se constata en la práctica. Así queda de manifiesto como a partir de

datos de secuenciación genética, que es el nivel de regulación más alto en la jerarquía

funcional, es posible predecir tanto la actividad enzimática como la metabólica,

reconstruyéndose de este modo las rutas biodegradativas de cada uno de los sistemas, las

cuales conscientemente se han dejado fuera de este capítulo tanto por su complejidad

como por no relacionarse directamente con el trabajo desarrollado para la presente tesis.

En esta línea, lo reseñable es el uso la metabolómica, tanto desde su óptica de

fingerprinting como desde la del análisis dirigido, para cubrir con ella la validación de los

resultados de dos etapas cruciales comprendidas en el marco de una investigación mucho

mayor y que aquí se ha intentado esbozar. De este modo se concluye como la


94

caracterización de cada uno de los ambientes no depende en primer término de las

características geoquímicas de los mismos, sino de las poblaciones microbianas que allí

habitan y, por ende, del conjunto de genes que les permiten llevar a cabo tal o cual

proceso bioquímico. Dado que la diferencia principal entre cada una de las muestras viene

marcada por el tipo de contaminación es lícito suponer que es este factor el determinante

en el condicionamiento de las especies bacterianas que allí habitan, las cuales en un

futuro quizá puedan ser usadas al servicio de nuestros intereses.

VII Conclusiones

Conclusiones

97

VII - Conclusiones

La presente tesis doctoral ha centrado sus esfuerzos en la exploración de las

capacidades analíticas de diversas técnicas al servicio de la metabolómica, tanto desde la

perspectiva del fingerprinting como de la del análisis dirigido. Así, a lo largo de cuatro

capítulos, ha sido posible contribuir, con un cierto éxito, a la explicación de aquello que

está pasando en los distintos sistemas biológicos estudiados, cuyo denominador común

han sido los organismos unicelulares. En tanto que, a nivel particular, ya han sido

expuestas diversas conclusiones individuales para cada uno de los epígrafes, nos

centraremos aquí en señalar los aspectos generales que se ubican por encima de las

anteriores.

En primer lugar ha de remarcarse la necesidad de la combinación de varias

plataformas analíticas si lo que se desea es una cobertura metabólica global, o al menos

tan amplia como sea posible. Cada analito rige un cierto tipo de técnica ideal para su

medición, de lo que son ejemplo los capítulos I y IV y, especialmente, el III, en el cual se

demuestra de manera rotunda la ventaja de contar con tres plataformas de análisis

complementarias tales como GC-MS, LC-MS y CE-MS.

En segundo término impera una mención expresa a la potencia explicativa del

análisis no dirigido. De ello son buena muestra los capítulos II y III, en los cuales el

fingerprinting ha contribuido satisfactoriamente a aumentar el conocimiento sobre dos

escenarios biológicos cuyo estudio no se había sesgado con ninguna hipótesis previa.

Y, finalmente, es ineludible una última alusión a las consecuencias derivadas del

paradigma que rige el dogma central de la biología molecular. Si el DNA está en la base de

aquello que es posible que ocurra, si el RNA muestra lo que parece estar ocurriendo y aun

cuando las proteínas, particularmente las enzimas, son las herramientas que lo posibilitan;

son únicamente los metabolitos los responsables de la situación final, antes y después, de

un sistema biológico, estableciendo relaciones de retroalimentación con el resto de

niveles de la jerarquía funcional. Por ello, un ser vivo es un todo integrado y es esta la

principal conclusión a la que se puede llegar tras recorrer los cuatro capítulos de la


98

presente tesis, en los que, en cuatro situaciones radicalmente distintas, ha sido posible

alcanzarse a atisbar la convergencia y concordancia de los resultados procedentes de las

tres principales disciplinas ómicas; siendo la metabolómica la validación empírica de las

conclusiones derivadas de las dos primeras.

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172. Guazzaroni, M. E.; Herbst, F. A.; Lores, I.; Tamames, J.; Peláez, A. I.; López-Cortés,

N.; Alcaide, M.; Del Pozo, M. V.; Vieites, J. M.; von Bergen, M.; Gallego, J. L.; Bargiela, R.;

López-López, A.; Pieper, D. H.; Rosselló-Móra, R.; Sánchez, J.; Seifert, J.; Ferrer, M.,

Metaproteogenomic insights beyond bacterial response to naphthalene exposure and bio-

stimulation. ISME J 2013, 7 (1), 122-36.


120

IX Anexo

Anexo

123

IX - Anexo

Tabla 4. Metabolitos microbianos identificados en grado de tentativa. Las abundancias se corresponden con la media aritmética

calculada a partir de las tres muestras recogidas en cada uno de los citados días. % hace referencia a la probabilidad de

correspondencia de cada una de las fórmulas moleculares con el perfil de distribución isotópica. En gris, compuestos de interés.

m/z RT Día 0 Día 6 Día 11 Día 14 Día 40 Fórmula % Tipo de metabolito Nombre

184.1462 23.20 20289 362828 3501 61896 256773 C11H20O2 99.6 Ácido graso (insaturado) Citronellyl formate / Dimethyl-nonenoic acid / Ethyl-methyl-octenoic acid / Hendecenoic acid / Nonenyl acetate / Undecanolactone / Undecenoic acid

184.1464 31.61 1 5401 1 1 22103 C11H20O2 55.0 Ácido graso (insaturado) Citronellyl formate / Dimethyl-nonenoic acid / Ethyl-methyl-octenoic acid / Hendecenoic acid / Nonenyl acetate / Undecanolactone / Undecenoic acid

200.1776 21.87 22290 39301 23294 28811 58374 C12H24O2 86.2 Ácido graso (saturado) Decyl acetate / Isolauric acid / Lauric acid / Methyl-undecanoic acid

210.1620 24.31 1 6516 1 1 27879 C13H22O2 80.9 Ácido graso (insaturado) Tridecadienoic acid / Tridecynoic acid

224.1777 24.31 1 4125 1 1 46480 C14H24O2 82.1 Ácido graso 3,4-tetradecadienoic acid / Alepric acid / Dodecadienyl acetate / Myristic

acid alkyne / Oxo-tetradecenal / Tetradecadienoic acid / Tetradecynoic acid

236.2138 18.63 1 29516 1 1 48648 C16H28O2 92.5 Ácido graso Hexadecadienal / Hexadecatrienol / Hexadecenynol / Hexadecynal

262.2294 26.27 1 4631 1 1 85210 C18H30O - Ácido graso Ladderane-hexanol / Octadecatrienal

262.2297 28.67 7005 33057 1 15204 276997 C18H30O - Ácido graso (hydroxypropanyl)-isolongifolene / (methoxyethyl)-isolongifolene /

Ladderane-hexanol / Octadecatrienal

262.2298 25.68 1 1 27467 1 143620 C18H30O 99.1 Ácido graso (hydroxypropanyl)-isolongifolene / (methoxyethyl)-isolongifolene /

Ladderane-hexanol / Octadecatrienal

264.2452 28.70 1 15738 5211 1 84131 C18H32O - Ácido graso (hydroxypropanyl)-isolongifolane / Octadecadienal / Octadecatrienol

264.2453 23.20 277000 2905113 28579 566782 2079951 C18H32O 99.5 Ácido graso (hydroxypropanyl)-isolongifolane / Octadecadienal / Octadecatrienol

266.2607 32.05 10797 11314 4565 14001 1 C18H34O 97.8 Ácido graso con aldehídos/alcoholes Octadecadienol / Octadecenal

268.2403 20.95 1 24350 1 11401 26852 C17H32O2 86.3 Ácido graso Cyclohexylundecanoic acid / Heptadecenoic acid / Heptadecylenic acid /

Hexadecenoic acid methyl ester / Methyl-hexadecenoic acid / Pentadecenyl acetate

280.2401 28.86 13954 52274 16722 1 844063 C18H32O2 75.3 Ácido graso (insaturado)

Chaulmoogric acid / Conjugated linoleic acid / Hexadecadienyl acetate / Hexadecynyl acetate / Linoelaidic acid / Linoleic acid / Malvalic acid /

Methyl-heptadecadienoic acid / Octadecadienoic acid / Octadecynoic acid / Stearolic acid / Trans-octadecadienoic acid


Cycloheptylundecanoic acid / Elaidic acid / Hexadecenyl acetate / Methylheptadecenoic acid / Octadecenoic acid / Octadecylenic acid / Oleic acid /

Palmitoleic acid ethyl ester / Petroselaidic acid / Petroselinic acid / Vaccenic acid

287.2825 13.52 1 46058 1 30733 5538 C17H37NO2 83.1 Esfingolípido C17 Sphinganine


(hexylfuranyl)-octanoic acid / Colneleic acid / Dihydro-oxo-phytoenoic acid / EpODE / Epoxy-octadecadienoic acid / HOTE / HOTrE / Hydroxylinolenic

acid / Hydroxy-octadecatrienoic acid / Hydroxy-octadecenynoic acid / Kamlolenic acid / Keto-octadecadienoic acid / Oxo-octadecadienoic

acid / Oxo-octadecynoic acid / OxoODE / Oxo-phytoenoic acid


Artemisic acid / Avenoleic acid / Densipolic acid / Dimorphecolic acid / EpOME / Epoxy-octadecenoic acid / HODE / Hydroxy-linoleic acid /

Hydroxy-octadecadienoic acid / Hydroxy-octadecynoic acid / Ketooctadecenoic acid / Methoxy-methyl-hexadecadienoic acid / Oxooctadecenoic

acid / Oxo-pentyl-cyclopentaneoctanoic acid / Vernolic acid

297.3030 18.65 1 1 1 17162 4078 C19H39NO - Ácido graso de etanolamida Palmitoyl N-Isopropylamide

298.2510 24.31 31755 741682 15881 65783 2080169 C18H34O3 96.2 Ácido graso Epoxy-octadecanoic acid / Epoxy-stearic acid / Hydroxy-octadecenoic acid


124

24 / Hydroxy-oleic acid / Keto-stearic acid / Methyl-oxo-heptadecanoic acid /

Oxo-octadecanoic acid / Ricinelaidic acid / Ricinoleic acid / Trimethyldodecadienoic acid

299.2825 14.73 330574 188524 73969 139384 3376 C18H37NO2 99.0 Esfingolípido Amino-octadecanoic acid / Aminooctadecenediol / Hydroxy-sphingosine /

Ketosphinganine / Palmitoyl ethanolamide / Sphingosine

299.2827 16.37 120874 102452 78053 593343 24627 C18H37NO2 98.2 Acilcarnitina Amino-octadecanoic acid / Aminooctadecenediol / Hydroxy-sphingosine /

Ketosphinganine / Palmitoyl ethanolamide / Sphingosine

300.1111 3.98 1 1 1 17697 1 C16H16N2O4 57.7 Ácido nitro-fenilpropilaminobenzoico Nitro-phenylpropylaminobenzoic acid

300.2663 23.20 86097 2214730 1 230241 1507505 C18H36O3 90.6 Ácido graso (saturado) Hydroxy-methyl-heptadecanoic acid / Hydroxy-octadecanoic acid /

Hydroxy-stearic acid

325.2979 26.40 51360 192919 115476 123459 9127 C20H39NO2 84.5 Ácido graso de etanolamida Oleoyl ethanolamide

343.3086 24.32 1 21210 1 1 58112 C20H41NO3 74.3 Esfingolípido Dihydroceramide C2

354.2768 26.25 1 1 1 1 430139 C21H38O4 - Glicerolípido/Prostaglandina/Ácido graso Ceriporic acid B / Linoleoyl glycerol / MG (0:0/18:2/0:0) / MG

(18:2/0:0/0:0) / PGF2 Alcohol methyl ether

354.2773 25.68 1 1 116225 1 564843 C21H38O4 98.2 Glicerolípido/Prostaglandina/Ácido graso Ceriporic acid B / Linoleoyl glycerol / MG (0:0/18:2/0:0) / MG

(18:2/0:0/0:0) / PGF2 Alcohol methyl ether

356.2925 28.65 1 1 4042 1 772119 C21H40O4 89.1 Glicerolípido Heneicosanedioic acid / MG (0:0/18:1/0:0) / MG (18:1/0:0/0:0)

358.2869 21.46 1687 35548 1 1 373172 C24H38O2 98.6 Esterol Bufanolide skeleton / Cholenoic acid / Hyrtial / Ladderane-dodecanoic acid

358.2873 19.51 1 1 1 1 61030 C24H38O2 - Esterol Bufanolide skeleton / Cholenoic acid / Hyrtial / Ladderane-dodecanoic acid

372.2666 23.93 1 1 1 1 17252 C24H36O3 - Esterol Cholacalcioic acid / Trinorvitamin D3 carboxylic acid /

Trinorcholecalciferol carboxylic acid / Hydroxycholadienoic acid / Oxocholenic acid / Oxocholenoic acid

372.2667 11.56 523082 322577 382758 173663 50527 C24H36O3 99.9 Esterol Cholacalcioic acid / Trinorvitamin D3 carboxylic acid /

Trinorcholecalciferol carboxylic acid / Hydroxycholadienoic acid / Oxocholenic acid / Oxocholenoic acid

393.1896 24.32 1 9517 1 1 54483 C19H27N3O6 60.1 Péptido Asp Ile Phe / Asp Leu Phe / Asp Phe Ile / Asp Phe Leu / Glu Phe Val / Glu

Val Phe / Ile Asp Phe / Leu Asp Phe / Phe Glu Val

394.2152 31.06 125587 230574 133616 153433 147468 C22H31FO5 52.8 Esterol Dihydrodexamethasone

394.2483 31.37 1 16953 1 1 67334 C19H39O6P 73.9 Glicerofosfolípido (plasmalógeno) LPA (P-16:0e/0:0)

397.1738 24.31 1 20273 1 1 51258 C19H27NO8 83.4 Glucurónido de ácido graso Diethylpropion (metabolite V-glucuronide)

397.3345 6.86 2258 3945 1 1 735546 C27H43NO 99.3 Esterol Solanidine / Verazine

399.3349 18.25 5541 45983 83227 96855 30422 C23H45NO4 82.8 Ácido graso de etanolamida Palmitoyl-carnitine

399.3499 7.58 1 1 1 1 29532 C27H45NO 98.8 Esterol Demissidine / Spirosolane skeleton

409.319 16.22 1 1 1 1 166856 C24H43NO4 98.9 Ácido graso (derivado de prostaglandina) Lumula / PGF2 diethyl amide

439.2701 18.00 17665 60176 61916 167517 42281 C20H42NO7P 91.3 Glicero(liso)fosfolípido LysoPE (0:0/15:0) / LysoPE (15:0/0:0) / PA (17:1/0:0) / PC (12:0/0:0)

444.3606 29.13 1 1 1 1 136523 C29H48O3 75.1 Esterol

Carboxy-methyl-cholestaenol / Dihydroxy-dihomo-epivitamin D3 / Dihydroxy-dihomo-epicholecalciferol / Dihydroxy-dihomovitamin D3 /

Dihydroxy-dihomocholecalciferol / Dihydroxy-dimethylvitamin D3 / Dihydroxy-dimethylcholecalciferol / Ethyl-dihydroxyvitamin D3 /

Ethyldihydroxycholecalciferol / Hydroxy-methyl-cholestene-carboxylic acid

453.2854 20.01 101857 253926 128077 594140 228176 C21H44NO7P 99.9 Glicero(liso)fosfolípido Glycerophospho-N-palmitoyl ethanolamine / LysoPE (0:0/16:0) / PE

(16:0/0:0)

495.3324 19.41 5972 1 74426 42252 1 C24H50NO7P 99.8 Glicero(liso)fosfolípido LysoPC (16:0) / PC (16:0/0:0)

495.3327 20.19 262254 109518 2658276 989897 30635 C24H50NO7P 99.8 Glicero(liso)fosfolípido LysoPC (16:0) / PC (16:0/0:0)

519.3323 18.64 2257 6027 19420 10683 1 C26H50NO7P 77.4 Glicero(liso)fosfolípido Linoleoylglycerophosphocholine / LysoPC (18:2)

521.3478 21.14 1 3442 46255 20110 1 C26H52NO7P 96.7 Glicero(liso)fosfolípido LysoPC (18:1) / PC (18:1/0:0) / PC (O-16:1/2:0)

640.5066 32.02 1 37727 64674 1 84188 C41H68O5 78.5 Glicerolípido

DG (16:0/22:6/0:0) / DG (16:1/22:5/0:0) / DG (18:1/20:5/0:0) / DG (18:2/20:4/0:0) / DG (18:3/20:3/0:0) / DG (18:4/20:2/0:0) / DG (20:2/18:4/0:0) / DG (20:3/18:3/0:0) / DG (20:4/18:2/0:0) / DG

(20:5/18:1/0:0) / DG (22:5/16:1/0:0) / DG (22:6/16:0/0:0)

Anexo

125

Tabla 6. Compuestos estadísticamente significativos identificados en L. (L.) infantum. En GC-MS el error no está disponible al no

generar este equipo datos de masa exacta.

Nombre Masa

monoisotópica Fórmula

molecular Error (ppm)

ST vs SNT p valor R vs SNT p valor Técnica analítica

Naturaleza bioquímica

(4,8,10-d18:3)Sphingosine 295.2511 C18H33NO2 2 Disminuido < 0.05 LC-MS Esfingolípidos y bases esfingoideas

2-Oxo-5-methylthiopentanoic acid 162.0351 C6H10O3S 7 Disminuido < 0.01 Disminuido < 0.01 CE-MS Ácidos orgánicos

4-Hydroxy-proline / 5-amino-2-oxopentanoate 131.0582 C5H9NO3 0 Aumentado < 0.05 CE-MS

Aminoácidos, péptidos y conjugados Disminuido < 0.01 GC-MS

4-Oxoproline / L-1-Pyrroline-3-hydroxy-5-carboxylate / 1-Pyrroline-4-hydroxy-2-carboxylate

129.0426 C5H7NO3 1 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

2-Oxoarginine 173.0800 C6H11N3O3 0 Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.01 CE-MS Ácidos orgánicos

Adenosine 267.0968 C10H13N5O4 Aumentado < 0.05 Disminuido < 0.05 GC-MS Purinas/pirimidinas y conjugados

ADMA / SDMA 202.1430 C8H18N4O2 0 Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Alanine / Sarcosine 89.0477 C3H7NO2 6 Disminuido < 0.01 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Allantoic acid 176.0546 C4H8N4O4 10 Disminuido < 0.01 Disminuido < 0.01 LC-MS Ácidos orgánicos

Arginine 174.1117 C6H14N4O2 1 Disminuido < 0.05 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Asparagine /N-carbamoyl Sarcosine 132.0535 C4H8N2O3 5 Aumentado < 0.05 CE-MS


Aspartic acid 133.0375 C4H7NO4 Disminuido < 0.05 GC-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Aspartyl-leucine 246.1216 C10H18N2O5 15 Aumentado < 0.05 LC-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Bis(glutathionyl)spermine 780.3622 C30H56N10O10S2 13 Disminuido < 0.01 LC-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

C17 Sphinganine 287.2824 C17H37NO2 4 Aumentado < 0.05 LC-MS Esfingolípidos y bases esfingoideas

Cellobiose 342.1162 C12H22O11 Disminuido < 0.05 Aumentado < 0.05 GC-MS Carbohidratos

Choline 103.0997 C5H13NO 3 Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminas

Citrulline 175.0957 C6H13N3O3 0 Disminuido < 0.01 Disminuido < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Cystathionine 222.0674 C7H14N2O4S 2 Aumentado < 0.05 Aumentado < 0.01 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Ergosterol 396.3392 C28H44O Aumentado < 0.01 Disminuido < 0.05 GC-MS Esteroles

Glucose-6-phosphate 260.0297 C6H13O9P Disminuido < 0.05 Disminuido < 0.05 GC-MS Carbohidratos

Glutamate / Isoglutamate / 2- Oxo-4 hydroxy-5-aminovalerate / L4-Hidroxy Glutamate semialdehyde

147.0532 C5H9NO4 0 Disminuido < 0.01 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Glutamine 146.0691 C5H10N2O3 Disminuido < 0.05 Disminuido < 0.05 GC-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Glycerophosphocholine 257.1028 C8H20NO6P 1 Aumentado < 0.01 LC-MS Glicerofosfolípidos

Guanine 151.0494 C5H5N5O 0 Aumentado < 0.01 CE-MS Purinas/pirimidinas y conjugados

Histidine 155.0695 C6H9N3O2 0 Aumentado < 0.01 CE-MS

Aminoácidos, péptidos y conjugados Aumentado < 0.05 GC-MS

Hypoxanthine 136.0385 C5H4N4O 0 Disminuido < 0.05 CE-MS

Purinas/pirimidinas y conjugados Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.01 GC-MS

Imidazole lactate 156.0535 C6H8N2O3 0 Disminuido < 0.01 Aumentado < 0.01 CE-MS Ácidos orgánicos

Lauric acid 200.1776 C12H24O2 1 Aumentado < 0.05 LC-MS Ácidos grasos

Lauric Acid ethyl ester 228.2089 C14H28O2 1 Disminuido < 0.05 LC-MS Ácidos grasos

Leucine 131.0946 C6H13NO2 0 Disminuido < 0.05 Disminuido < 0.05 CE-MS



126

Leucyl-Alanine 202.1317 C9H18N2O3 0 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Linoleic acid 280.2402 C18H32O2 Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.01 GC-MS Ácidos grasos

Linolenic Acid 278.2246 C18H30O2 0 Aumentado < 0.05 Disminuido < 0.01 LC-MS Ácidos grasos

Lysine 146.1055 C6H14N2O3 0 Aumentado < 0.05 CE-MS

Aminoácidos, péptidos y conjugados Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.01 GC-MS

Malic acid 134.0215 C4H6O5 Disminuido < 0.05 Disminuido < 0.01 GC-MS Ácidos orgánicos

Methylhistidine 169.0851 C7H11N3O2 0 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Myo-inositol 180.0632 C6H12O6 Disminuido < 0.01 GC-MS Carbohidratos

Myristic acid 228.2089 C14H28O2 Disminuido < 0.05 Aumentado < 0.05 GC-MS Ácidos grasos

Myristic Acid ethyl ester 256.2402 C16H32O2 1 Aumentado < 0.05 LC-MS Ácidos grasos

N-Acetylaminobutanal/ Pipecolic acid 129.0790 C6H11NO2 0 Aumentado < 0.05 CE-MS Cetonas y aldehidos

N-Acetyl-lysine 188.1161 C8H16N2O3 1 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Norleucine 131.0946 C6H13NO2 19 Disminuido < 0.05 LC-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Ornithine 132.0899 C5H12N2O2 0 Disminuido <0.05 Aumentado < 0.05 CE-MS


Palmitic Acid ethyl ester 284.2715 C18H36O2 3 Aumentado < 0.01 LC-MS Ácidos grasos

Phosphocholine 183.0660 C5H14NO4P 2 Aumentado 0.011 Disminuido < 0.01 LC-MS Aminas

Phytosphingosine 317.2930 C18H39NO3 3 Aumentado 0.012 LC-MS Esfingolípidos y bases esfingoideas

Proline 115.0633 C5H9NO2 1 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Putrescine 88.1000 C4H12N2 6 Disminuido < 0.01 CE-MS

Aminas Aumentado < 0.01 GC-MS

Ribitol / Arabitol / Xylitol 152.0685 C5H12O5 Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.05 GC-MS Carbohidratos

Ribose / Lyxose 150.0528 C5H10O5 Disminuido < 0.05 Disminuido < 0.05 GC-MS Carbohidratos

Ribose-5-phosphate 228.0046 C5H9O8P Aumentado < 0.01 Aumentado < 0.01 GC-MS Carbohidratos

S-Adenosylhomocysteine 384.1216 C14H20N6O5S 0 Aumentado < 0.05 CE-MS Purinas/pirimidinas y conjugados

S-Adenosylmethionine 398.1372 C15H22N6O5S 2 Disminuido < 0.05 Aumentado < 0.05 CE-MS Purinas/pirimidinas y conjugados

Serine 105.0426 C3H7NO3 Disminuido < 0.01 Disminuido < 0.01 GC-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Sorbitol / Mannitol 182.0790 C6H14O6 Disminuido < 0.01 GC-MS Carbohidratos

Threonine 119.0582 C4H9NO3

Aumentado < 0.01 GC-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Threonine / Homoserine 0 Aumentado < 0.05 CE-MS

Trypanothione disulfide 721.2887 C27H47N9O10S2 0 Disminuido < 0.01 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Tyrosine 181.0739 C9H11NO3 0 Aumentado < 0.05 CE-MS

Aminoácidos, péptidos y conjugados Aumentado < 0.05 GC-MS

Valine / Betaine / 5-Aminopentanoate 117.0790 C5H11NO2 1 Disminuido < 0.01 Aumentado < 0.05 CE-MS Aminoácidos, péptidos y conjugados

Xanthine 152.0334 C5H4N4O2 Aumentado < 0.05 GC-MS Purinas/pirimidinas y conjugados

Anexo

127

Tabla 7. Compuestos identificados por LC-MS/MS y sus fragmentos característicos.

Nombre Masa monoisotópica Fórmula molecular Error (ppm) Fragmentos

(4,8,10-d18:3) sphingosine 295.2511 C18H33NO2 2 57.07, 81.07, 95.08, 121.10, 162.10, 204.11, 222.12, 279.23

Allantoic acid 176.0546 C4H8N4O4 10 43.06, 60.06, 70.06, 71.05, 116.07, 130.09, 134.08, 175.19, 176.10, 177.10

Aspartyl-leucine 246.1216 C10H18N2O5 15 70.03, 86.09, 132.10, 141.10, 155.11, 201.12, 247.13

Bis(glutathionyl)spermine 780.3622 C30H56N10O10S2 13 70.06, 72.08, 86.09, 104.10, 143.03, 158.96, 184.07, 522.75

C17 sphinganine 287.2824 C17H37NO2 4 69.07, 90.05, 121.10, 164.87, 194.98, 196.97, 227.19, 254.25, 272.25

Glycerophosphocholine 257.1028 C8H20NO6P 1 60.08, 86.09, 104.11, 104.18, 105.11, 124.99, 184.07, 258.11

Lauric acid 200.1776 C12H24O2 1 29.04, 41.04, 43.05, 55.05, 57.07, 69.07, 71.08, 89.06, 103.07, 117.09, 131.10, 151.86, 172.86, 183.85, 201.12

Lauric acid ethyl ester 228.2089 C14H28O2 1 43.05, 57.07, 71.09, 89.06, 103.07, 117.09, 229.22

Linolenic acid 278.2246 C18H30O2 0 55.06, 67.06, 81.07, 95.09, 109.10, 123.12, 137.13, 173.13, 279.23

Myristic acid ethyl ester 256.2402 C16H32O2 1 43.05, 57.07, 71.09, 89.06, 103.07, 117.09, 257.25

Norleucine 131.0946 C6H13NO2 19 30.03, 41.04, 42.04, 43.06, 44.05, 57.07, 69.07, 86.09, 130.16, 131.16, 132.09

Palmitic acid ethyl ester 284.2715 C18H36O2 3 41.04, 43.06, 55.06, 57.07, 69.07, 71.09, 85.10, 89.06, 95.09, 103.08, 117.09, 135.12, 149.13, 173.15, 201.19, 229.21

Phosphocholine 183.0660 C5H14NO4P 2 45.04, 60.08, 86.1, 98.98, 124.99, 184.07

Phytosphingosine 317.2930 C18H39NO3 3 41.04, 55.02, 71.05, 95.05, 113.06, 135.11, 171.10, 219.17, 252.26, 282.27, 300.28, 318.30

Tabla 8. Compuestos con presencia confirmada de 13C.

Nombre Masa monoisotópica con 13C Fórmula molecular Nº de 13C Técnica analítica

Arginina 180.1311 C6H14N4O2 6 CE-MS

Citrulina 181.1152 C6H13N3O3 6 CE-MS

Ornitina 137.1054 C5H12N2O2 5 CE-MS

Putrescina 92.1123 C4H12N2 4 CE-MS

Tripanotión disulfuro 725.3030 C27H47N9O10S2 4 CE-MS


128

X Índice de figuras y tablas

Índice de figuras y tablas

131

X - Índice de figuras y tablas

X.1 - Figuras

Figura 1. Árbol filogenético universal propuesto por Olsen y Woese

basado en la secuenciación de rRNA 16S. 9

Figura 2. Número de artículos por año en los que se citan las palabras

clave metabolomics (azul) o metabonomics (rojo) en su título, según el

buscador Web of Knowledge a fecha de 5 de mayo de 2014. 14

Figura 3. Crecimiento de la importancia relativa de la metabol[n]ómica

frente a otras disciplinas ómicas durante la pasada década según el

buscador Web of Knowledge. En verde, número de artículos que

contienen en su título las palabras clave metabolomics o metabonomics;

en gris aquellos en los que figuran los términos genomics, transcriptomics

o proteomics. 14

Figura 4. Esquema resumen del flujo de trabajo seguido en un estudio

metabolómico. 15

Figura 5. Mapa de la “región de las fosas anóxicas”. En rojo, las fosas

hipersalinas mencionadas. 32

Figura 6. Estructura molecular de la betaína. 32

Figura 7. Recta de regresión calculada a partir de los estándares de

betaína. 35

Figura 8. Fragmento de los electroferogramas correspondiente a la

determinación de ácido acético. En el eje de abscisas se expresa el

tiempo en minutos, en el de ordenadas la absorbancia en U.A. A) muestra

con ácido acético. B y C) muestras sin ácido acético. Asimismo se muestra

en todas ellas los electroferogramas correspondientes a los patrones de

ácido acético 4 mM y 40 mM. 37


132

Figura 9. Relación entre la salinidad, la temperatura y la concentración de

oxígeno respecto de la profundidad en la fosa Medee. Las barras indican

el error estándar respecto de la media para tres réplicas. 38

Figura 10. Relación entre la población microbiana y la profundidad en la

fosa Medee. Las barras indican el error estándar respecto de la media

para tres réplicas. DAPI: 4’,6-diamidino-2-fenilindol, reactivo de tinción

fluorescente usado en microscopía para la realización de recuentos

celulares. EUB: Eubacteria. ARCH: Archaea. GM1: Grupo Marino 1 de

Thaumarchaeota. EURY: Euryarchaeota. 39

Figura 11. Panorámica de la población procariota de la fosa Medee. Su

estratificación y abundancia relativa se agrupan por árboles filogenéticos

en relación a la profundidad (RAxML program). 40

Figura 12. Modelo de síntesis de novo de materia orgánica a partir de la

reducción de betaína y posterior metanogénesis, muestra de la

cooperación trófica entre KB1 y MSBL1. 43

Figura 13. Proyecciones PLS-DA. A) Todo el conjunto de datos (8600

features) con predicción de los QCs. 7 componentes principales.

R2=0.989. Q2=0.670. B) Variables estadísticamente significativas tras el t-

test (382 features). 4 componentes principales. R2=0.978. Q2=0.928. C)

Variables estadísticamente significativas identificadas en METLIN (49

features). 4 componentes principales. R2=0.968. Q2=0.915. 51

Figura 14. HCA de las variables estadísticamente significativas tras el t-

test (382 features). Las m/z más abundantes se representan en rojo, las

menos abundantes en azul. 52

Figura 15. A) Metatranscriptómica. Agrupamiento de las muestras en

función del tipo y abundancia de los genes expresados, la distancia entre

las mismas se calculó mediante la función Bray-Curtis. B) Proteómica.

Agrupamiento de las muestras en función del tipo y abundancia de las


133

proteínas expresadas, la distancia entre las mismas se calculó mediante la

correlación de Pearson. 52

Figura 16. Representación esquemática de la abundancia de los distintos

grupos de metabolitos bacterianos a lo largo de la secuencia de

muestreo. Grupo 1: ácidos grasos (18), esfingolípido (1), glicerolípidos (2),

glicerofosfolípido-LPA (1), esterol-alcaloide (1). Grupo 2: ácido graso con

aldehídos y alcoholes (1), esfingolípido (1), carnitinas (2), ácido graso con

etanolamida (1). Grupo 3: ácido graso con etanolamida (1), esteroles-

derivados de vitamina D3/ácidos biliares (4), derivados de

prostaglandinas (2), ácido graso insaturado (1). Grupo 4: esfingolípido (1),

esterol-derivado de vitamina D3/ácido biliar (1). Grupo 5: esterol-

corticoide (1). Entre paréntesis se indica el número de metabolitos de

cada clase. 53

Figura 17. Esquema interpretativo de las variaciones de la microbiota y la

actividad metabólica en el intestino humano frente a un tratamiento

antibiótico. Las líneas continuas indican relaciones, las discontinuas

aumentos o disminuciones de las sustancias consignadas en los

respectivos recuadros. 56

Figura 18. Esquema del ciclo de vida de Leishmania spp. según el

Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern del

Centers for Disease Control and Prevention. 62

Figura 19. Modelos de PCA construidos con los features filtrados al 50 %

de presencia en los QCs. A) LC-MS: 2 componentes, R2=0.620, Q2=-0.029.

B) CE-MS: 2 componentes, R2=0.872, Q2=0.694. C) GC-MS: 2

componentes, R2=0.515, Q2=0.235. 70

Figura 20. Modelos de PCA construidos con los features filtrados al 50 %

de presencia en los QCs (muestras control y 13C). A) LC-MS: 3

componentes, R2=0.428, Q2=0.107. B) CE-MS: 2 componentes, R2=0.577,

Q2=0.424. 71


134

Figura 21. Número de compuestos identificados por técnica de análisis. 72

Figura 22. Porcentaje de compuestos identificados por técnica

clasificados en función de su naturaleza bioquímica. Los colores indican el

grupo biológico, referenciado este en la tabla contigua. 73

Figura 23. Representación esquemática de las principales alteraciones del

metabolismo. Verde: metabolito Aumentado. Rojo: metabolito

Disminuido. Subrayado: detectado con 13C. Flecha continua: relación

bioquímica directa. Flecha discontinua: relación bioquímica mediada por

dos o más enzimas. A) ST vs SNT. B) R vs SNT. 75

Figura 24. Localización geográfica y nomenclatura adoptada para cada

una de las muestras procedentes de los correspondientes

emplazamientos contaminados. 81

Figura 25. Resultados de la secuenciación de rRNA 16S. A) Diversidad y

abundancia relativa de los distintos phyla microbianos. B) PCA. 86

Figura 26. A) Modelos de PCA construidos con los datos filtrados. A1) LC-

MS (-): 2 componentes principales, R2=0.338, Q2=0.013. A2) LC-MS (+): 2

componentes principales, R2=0.491, Q2=0.210. B) HCA construido con los

datos filtrados y normalizados. B1) LC-MS (-). B2) LC-MS (+). 87

Figura 27. HCA en base a los datos de secuenciación de rRNA 16S cuya

distancia se ha estimado en base a la función de Pearson. A) Taxones

raros. B) Taxones frecuentes. C) Taxones muy abundantes. 90

Figura 28. HCA de la distribución enzimática predicha en base a los datos

de secuenciación. La distancia entre los grupos se ha estimado en base a

la función de Pearson. 91

Figura 29. A) En porcentaje, degradación de los contaminantes. 100 %

significa no degradación. B) Producción de las especias químicas

intermedias. El máximo se representa en rojo. En ambos casos no se han

tenido en cuenta los datos de ELF cuyos valores están fuera del rango de

la escala. 93


135

X.2 - Tablas

Tabla 1. Comparación entre células procariotas y eucariotas. 12

Tabla 2. Composición química del agua hipersalina de la fosa Medee

medida en muestras previamente concentradas diez veces mediante

evaporación. Concentraciones expresadas en mM salvo explícita mención

de otra unidad. 38

Tabla 3. Concentración de betaína y acetato. 41

Tabla 4. Metabolitos microbianos identificados en grado de tentativa. Las

abundancias se corresponden con la media aritmética calculada a partir

de las tres muestras recogidas en cada uno de los citados días. % hace

referencia a la probabilidad de correspondencia de cada una de las

fórmulas moleculares con el perfil de distribución isotópica. En gris,

compuestos de interés. 123

Tabla 5. Número de compuestos tras el alineamiento, el filtrado y la

estadística para cada una de las comparaciones (ST vs SNT y R vs SNT) y

técnicas de análisis. 72

Tabla 6. Compuestos estadísticamente significativos identificados en L.

(L.) infantum. En GC-MS el error no está disponible al no generar este

equipo datos de masa exacta. 125

Tabla 7. Compuestos identificados por LC-MS/MS y sus fragmentos

característicos. 127

Tabla 8. Compuestos con presencia confirmada de 13C. 127

Tabla 9. Características fisicoquímicas principales de los sedimentos

investigados. (-): no determinado. 86

Tabla 10. Abundancias relativas de los distintos compuestos cuyo

metabolismo fue predicho computacionalmente. N.D.: no detectado. 88


136

XI Índice de abreviaturas

Índice de abreviaturas

139

XI - Índice de abreviaturas

AMDIS: Automated Mass spectral Deconvolution and Identification

ANOVA: one-way analysis of variance

AQ: Aqaba

ARCH: Archaea

BIZ: Bizerta

BSTFA: N,O-bis-trimetilsilitrifluoroacetamida

CE: electroforesis capilar (capilar electrophoresis)

CV: coeficiente de variación

DA: análisis discriminante (discriminant analysis)

DAPI: 4’,6-diamidino-2-fenilindol (4’,6-diamidino-2-phenylindole)

DNA: ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid)

ELF: Elefsina

ELMAX: El Max

EUB: Eubacteria

EURY: Euryarchaeota

FDA: Food and Drug Administration

GC: cromatografía de gases (gas chromatography)

GM1: Grupo Marino 1

HAV: MT Haven

HC2: Halophilic Cluster 2

HCA: hierarchical component analysis

IR: infrarrojo

JS1: Japan Sea 1

KB1: Kebrit Deep Bacteria 1

KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

LC: cromatografía de líquidos (liquid chromatography)

LPA: lisoglicerofosfato (lysoglycerophosphate)


140

m/z: relación masa/carga

MANOVA: multivariate analysis of variance

MBGA: Crenarchaea Marine Benthic Group A

MCh: Mar Chica

MES: Mesina

METLIN: Metabolite and Tandem MS Database

MFE: Molecular Feature Extraction

MGI: Thaumarchaea Marine Group I

MGII: Euryarchaea Marine Group II

MS: Espectrometría de masas (mass spectrometry)

MSBLx: Mediterranean Sea Brine Lakes x

MSTFA: N-metil-N-trimetilsilitrifluoroacetamida

MT: tiempo de migración (migration time)

NIST: National Institute of Standards and Technology

NO: óxido nítrico (nitric oxide)

OD1: OP11-derived 1

OP1 y 11: Obsidian Pool 1 y 11

OPLS: ortogonal projections to latent structures

p.e.: punto de ebullición

PBS: phosphate buffered saline

PCA: análisis de componentes principales (principal components analysis)

PCR: polymerase chain reaction

PLS: partial least squares

PRI: Priolo

Q2: coeficiente de capacidad predictiva

QC: control de calidad (quality control)

R: cepas resistentes

R0: 1 día, réplica a tiempo 0

R2: 2 semanas, réplica a tiempo 2 semanas

Índice de abreviaturas

141

R2: coeficiente de determinación

R3: 3 semanas, réplica a tiempo 3 semanas

RI: índice de retención (retention index)

RMN: resonancia magnética nuclear

RNA: ácido ribonucleico (ribonucleic acid)

RPMI: medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute

RT: tiempo de retención (retention time)

SA1 y 2: Shaban Deep Archaea 1 y 2

SNT: cepas sensibles no tratadas

ST: cepas sensibles tratadas

TFA: ácido trifluoroacético (trifluoroacetic acid)

TMEG: Terrestrial Miscellaneous Euryarchaeotal Group

TOF: tiempo de vuelo (time of flight)

UV: ultravioleta

VC2: Euryarchaea Hydrothermal Vent

VIH: virus de la inmunodeficiencia humana

WS3: Wurtsmith aquifer Sequences 3

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