METILACIN EN PROMOTOR DE NF-KB p-65 PROVOCA UN CAMBIO EN LA PROGRAMACIN FETAL Y SU RELACION EN LA DISFUNCIN ENDOTELIAL INDUCIDA POR HIPERGLICEMIA DE LA GESTANTE

LA METILACIN DE H3K4me1 ENRIQUECE PROMOTOR DE NF-KB p-65 EN LA PROGRAMACIN FETAL Y SU RELACIN EN LA DISFUNCIN ENDOTELIAL INDUCIDA POR HIPERGLICEMIA DE LA GESTANTE DE RATNAlumno: Alex Baeza

Profesor gua: Javier Urra

Santiago- Chile20151ResumenLa disfuncin endotelial es la prdida de la homeostasis vascular y funcin arterial normal, presentndose con frecuencia en individuos con diabetes mellitus debido a hiperglicemia crnica.

El efecto nocivo, producto de que la hiperglicemia crnica, sigue presentndose tras volver a un estado de normoglicemia.

Antecedentes previos han demostrado que la hiperglicemia crnica media cambios en la metilacin de histonas 3 lisina 4, y este activa al promotor del gen NF-KB p-65.

El objetivo del presente seminario de investigacin es estudiar si la hiperglicemia crnica durante la gestacin es capaz de inducir cambios en la metilacin de H3K4 y estimular a NF-KB de la progenie, utilizando modelo murinos en constante hiperglicemia. Modelo murino preado en constante hiperglicemiaParmetro metablico

-Glicemia, a las 4 y 8 semanas en ayunaExtraccin de aortasDescendencia wild type (WT)2 meses1 mes post-partoInmunoprecipitacin

Ac dirigidos a H3K4me1

Q-PCR para NF-KB p65 zona promotorRT-PCR para medir expresin de

NF-KB p65, VCAM-1 y MCP-1 IntroduccinEntre el periodo 2000-2012 la isquemia miocrdica se ha mantenido en primer lugar como causa de muerte en el mundo (WHO, 2014)

En chile en el ao 2010 estuvo como la 2da causa de muerte (MINSAL, 2010)

Se define como un desiquilibrio en la biodisponibilidad de sustancias activas de origen endotelial, que predisponen a la inflamacin, vasocontriccin e incremento de permeabilidad vascular, que facilitan el desarrollo de aterosclerosisEndotelioVasodilatadores de origen endotelial

Oxido ntricoPGI2 Heparan sulfatos

Vasocontrictores del endotelio

Factores quimioatrayentesMCP-1VCAM-1

Estmulos mecnicosInteraccin con protenas circulantesDisfuncin endotelialDisfuncin endotelialEndotelioVasodilatadores de origen endotelial

Oxido ntricoPGI2 Heparan sulfatos

Vasocontrictores del endotelio

Factores quimioatrayentesMCP-1VCAM-1

30), y que la prevalencia de obesidad aumenta a medida que avanza la edad (Minsal, 2013)Hiperglicemia durante la gestacin FisiolgicaMantenida Aporte > necesidad Diabetes gestacionalReversibleDiabetes mellitus tipo 2Riesgo de ECVFetoSusceptibilidad en la adultez de enfermedad crnicaFigura 2. DG provoca hiperglicemia intrauterina. El ROS generado puede inducir la expresin del gen inhibidor o activador, resultante en la remodelacin de la cromatina (modificacin epigentica) de genes en mltiples rganos, incluyendo el pncreas, rin, corazn y msculo. Programando a futuro hipertensin y disfuncin diastlica del miocardio, figura modificada de (Garcia-Vargas et al., 2012)

Macrosoma, hipertensin y sufrimiento fetal Hiperglicemia crnica

Figura 3.La exposicin previa de las clulas diana a la hiperglicemia, provoca cambios perjudiciales a largo plazo despus de haber alcanzado la normoglicemia

La hiperglicemia crnica genera cambios metablicos en la clula, activando vas pro-inflamatorias

Este legado se denomina memoria metablica

NF-KBNF-kappa B es un factor de transcripcin pleiotrpica que desempea un papel fundamental en la regulacin de mltiples funciones biolgicas, tales como la inflamacin, la inmunidad, la proliferacin celular y la apoptosis.

Estrs/AGEp50p65IKBIKBp65p50PPIKBFosforilacin por IkB kinasaUbiquitinacin de IkB PPUbUbUbp50p65IKBDegradacin de IkB por 26S proteosomap50p65p50p65DNAMCP-1VCAM-1Translocacin Papel de la epigenticaLos mecanismos descritos sugieren rutas por las que los factores ambientales como la hiperglicemia pueden inducir disfuncin endotelial.

La existencia de la denominada memoria metablica, en el que persisten los efectos de la hiperglicemia a pesar de la normoglicemia

Hiperglicemia crnicaMetilacin de lisina 4 en histonas 3Aumento de expresin de gen NF-KB p65Genera predisposicin a disfuncin endotelialNormoglicemiaDefinicin de epigenticaEl mecanismo central est involucrado en la regulacin del gen, denominndose mecanismo epigentico, ya que no altera la secuencia del ADN

Pueden transmitirse de una generacin celular a la siguiente (herencia mittica), o ser transmitidas de generacin en generacin (herencia meitica) 3 vasMetilacin del ADNAdicin grupo metilo en C5 citosina

Evita la unin de factores de transcripcin

Ocurre en citosinas de islas CpG

En el genoma se ubican cercanos al promotor.ARN no codificanteARN no codificanteARNs no codificantes (ncRNAs) implicados en la regulacin epigentica de la expresin gnica mediante el silenciamiento de genes o la degradacin del ARNm dianaModificacin de histonasMs de 100 modificaciones post-transduccionales en la cola de lisina de las histonas han sido estudiadas

Entre ellas acetilacin (activacin) y metilacin, que puede activar o reprimir.

Transcripcin inactivametiltransferasas de ADN (DNMTs)

Nucleosoma (DNA + histona)

2 copias de H2A, H2B, H3 y H4 (formando un octmero)

Linker DNA de 140 pb

Ms de 100 PTMs, acetilacin activa, metilacin activa o reprime en histonas H3 y H4

Metilacin del ADNModificacin de histonas

Figura 5.

Normoglicemia22

Figura 7.Presentacin del problema de investigacinCul es la relacin entre la hiperglicemia crnica durante la gestacin y los cambios en la metilacin en H3K4me1 y enriquecimiento del promotor del gen NF-KB de la progenie en modelo murinos en constante hiperglicemia?

HiptesisLa hiperglicemia crnica durante la diabetes gestacional confiere cambios proaterognicos en la expresin gnica, inducido por ROS que asigna modificaciones especficas de larga duracin relacionados a la metilacin de H3K4me1, enriqueciendo al promotor de NF-kB P65. Este cambio es permanente durante perodos posteriores de normoglicemia y puede presentarse en la progenie.

ObjetivosObjetivo general

Relacionar la hiperglicemia crnica durante la gestacin es capaz de inducir cambios en la metilacin de H3K4me1 y enriquecer el promotor del gen NF-kB p65 de la progenie, utilizando modelo murinos en constante hiperglicemia.

Objetivos especficos

Establecer rango de expresin de NF-KB por qPCR en madres al mes de haber parido y en las cras a los 2 meses (etapa adulta)

Correlacionar glicemia y expresin del gen NF-KB para corroborar el efecto metablico

Evaluar la presencia de disfuncin endotelial mediante la expresin de MCP-1, VCAM-1 y NF-KB

Material y mtodoModelo murino

Se realiz el experimento en ratones Akita hembras C57BL/6-Ins2Akita/J y su respectivo tipo salvaje C57Bl/6J (WT) como control

Los ratones Akita llevan una mutacin en el gen de insulina-2 (Ins2), el locus se encuentra en el cromosoma 7.

La mutacin se hereda de forma autosmica dominante, siendo los heterocigotos viables. Una transicin de G a A en el nucletido 1907 (G1907A) del exn 3 del alelo mutado.

Los ratones Akita desarrollan hiperglicemia a la 6 semanas (glicemia de 325 mg/dL)

Figura 8Genotipado mediante RFLPPCR con primers dirigidos a un segmento del exn 3 del gen INS2

Con primer oIMR1093 dirigido hacia adelante 5 TGC TGA TGC CCT GGC CTG CT 3 y oIMR1094 dirigido en reversa 5 TGG TCC CAC ATA TGC ACA TG 3.

Gel al 3% representativo de amplificacin de un segmento del exn 3, del gen Ins2. Carril 1 con marcador de peso molecular. Carril 2 blanco de agua. Carril 3 con fragmento de 280 pb correspondiente a un segmento del exn 3 del gen Ins2.RFLP

La sigla RFLP se refiere a (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Los polimorfismos de restriccin son secuencias que pueden ser cortadas por las enzimas de restriccin.

Se utiliza para la deteccin de mutaciones.

El RFLP realizado fue utilizando la enzima de restriccin Fusobacterium nucleatum 4H (Fnu4H) y el sitio de reconocimiento era 5'-G CNGC - 3 'y 3' CGNCG - 5 '.

Fnu4HSegmento del exn 3= 280 pbG1907G1907140 pb140 pb140 pb140 pbWT140 pb140 pb280 pbG1907AG1907Heterocigoto Akita/WTFigura 9. Gel representativo de la digestin con Fnu4H.

Carril 1 con marcador de peso molecular.

Carril 2,3 y 4 corresponde al producto digerido por la enzima Fnu4H, el fragmento pesa 280 pb, pero al reconocer un sitio de restriccin en los 2 alelos WT, hay producto digerido de 140 pb. Carril 4 y 5 con producto de digestin de 140 pb correspondiente al alelo WT, y fragmento de 280 pb correspondiente al alelo mutado G1907A, el cual pierde sitio de restriccin para la enzima Fnu4H. Figura sacada de (Grasemann et al., 2012).

Material y mtodoRatonesRatn Akita hembraRatn WT machoRaton WT hembraRatn WT machoDHG (descendencia hiperglicmica)DNG (descendencia normoglicemica)Ratones akitaRatones WTSe mantuvieron en una sala con ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y se les proporcion a ambos una dieta normal ms agua, para que no interviniese la dieta con la glicemiaModelo murino preado en constante hiperglicemiaParmetro metablico

-Glicemia, a las 4 y 8 semanas en ayunaExtraccin de aortasDescendencia wild type (WT)2 meses1 mes post-partoInmunoprecipitacin

Ac dirigidos a H3K4me1

Q-PCR para NF-KB p65 zona promotorRT-PCR para medir expresin de

NF-KB p65, VCAM-1 y MCP-1 RT-PCRAortas tratadas con homogenizadorAislamiento de RNA de aortas por mtodo trizolRelacin absorbancia 260/280 cercana a 2.0Sntesis de cDNA con random hexmerosQ-PCR con cebadores dirigidos a

NF-KB p65VCAM-1MCP-1Deteccin en tiempo real fluorescencia acumulada por sistema TaqMan

GenPrimer directoPrimer reversoNF-KB p655- gtgcagcctcttcgtcctc-3

5- gtgcactacagacgagccatt-3 VCAM-15-TGACAAGTCCCCATCGTTGA-35-ACCTCGCGACGGCATAATT-3MCP-15 cttcggagtttgggtttgcttgtc 35 agtctctgccgcccttctgtg 3GenPrimer directoPrimer reverso18s RNA5- GTAACCCGTTGAACCCCATT3

5- CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3 Realizar normalizacin con cebadores dirigidos al gen endgeno 18s RNAInmunoprecipitacin

InmunoprecipitacinAortas tratadas con homogenizadorTratamiento de clulas con formaldehdoSonicar, genera roptura del ADNInmunoprecipitacin

Anticuerpo anti-H3K4me1Complejos inmunes recogidos con esperma de salmn A agarosa .Elusin con tampnComplejos ADN-protena eluidos se incuban a 68c para revertir entrecruzamientoComplejos ADN-protena eluidos se incuban a 68c para revertir entrecruzamientoSobrenadante ADN-protena se purifica mediante extraccin fenol-cloroformoDNA purificado QPCR con cebadores dirigidos a gen NF-KB p65GenPrimer directoPrimer reversoNF-KB p655- gtgcagcctcttcgtcctc-3

5- gtgcactacagacgagccatt-3 Realizar normalizacin con cebadores dirigidos al gen endgeno 18s RNAGenPrimer directoPrimer reverso18s RNA5- GTAACCCGTTGAACCCCATT3

5- CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3