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13/10/2015
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Red Cyted Hortyfresco.
Métodos alternativos para la evaluación microbiológica de productos IV gama y otros alimentos: biosensores y sistemas
ópticos y de visión avanzados.
LPF-TAGRALIA. UPM
Belén Diezma Iglesias
Eva Cristina Correa Hernando
Red Cyted Hortyfresco.
Calidad de los productos
agroalimentarios
Calidad organoléptica
Calidad nutricional
Calidad microbiológica
e inocuidad
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Red Cyted Hortyfresco.
Calidad organoléptica
Apariencia externa (color, tamaño, no defectos)
SaborAromaTextura
Calidad nutricional Compuestos nutrientesCompuestos biofuncionales
Calidad microbiológica e inocuidad (riesgos crónicoso agudos que pueden hacer que elalimento sea nocivo para la saluddel consumidor)
Microorganismos patógenosResiduos químicosToxinasContaminaciones
Red Cyted Hortyfresco.
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Red Cyted Hortyfresco.
Red Cyted Hortyfresco.
¿Los biosensores como alternativa?
¿Hasta dónde podemos ver?
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Red Cyted Hortyfresco.
¿Los biosensores como alternativa?
SENSOR QUÍMICO según la International Union of Pure and AppliedChemistry (IUPAC):
“Elemento que transforma la información química de una muestra, que puedeabarcar desde la simple determinación de la concentración de uncompuesto hasta el análisis de una matriz compleja, en una señal analíticaútil”
“Normalmente está constituido por dos elementos conectados en serie:receptor (sistema de reconocimiento químico) y el transductor físico-químicode la señal”
BIOSENSOR subgrupo de sensores químicos que incorpora unelemento de detección biológica o biomimético
Red Cyted Hortyfresco.
Primer Biosensor(Canary on a cage)
Canary on a chip
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Red Cyted Hortyfresco.
The Kemberton Colliery Mines Rescue Brigade 'C' Team, photographedin front of the Rescue Station in 1914. The man on the left is carryinga canary in a cage to detect carbon monoxide after a fire or explosion- canaries were used simply because their yellow colour made themeasier to see in semidarkness underground - otherwise sparrows orany other darkness small birds, which were equally sensitive to theeffects of gas would have been just as effective!
During WWI the sappers tunnelling at the Western Front used canariesfor gas detection but they would trim the claws as it was discoveredthat a canary could die of gas and the effects of rigor meant that theywould grip their perch and not fall off. If this happened theminers/sappers might not notice the onset of gas. The men arewearing 'Proto' breathing sets, developed by Siebe Gorman & Cofrom the earlier 'Fleuss' apparatus.
(Madeley, Shropshire, England)
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Biosensor
Sistema llave-cerradura: encima/sustrato; anticuerpo/antígeno ; ADN/secuencia complementaria
Dispositivos muy específicos de alta selectividad para análisis en tiempo real en mezclas complejas
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Red Cyted Hortyfresco.
Principales áreas de interés en la industria alimentaria
Detección de residuos de plaguicidas
Control de calidad en envases de atmósfera modificada
Detección de toxinas y patógenos en frutas y verduras
Calidad nutricional
Red Cyted Hortyfresco.
El 44% de las muestras recogidas de frutas y verduras europeascontiene restos de productos fitosanitarios (AINIA, 2014)
El 71% de las aplicaciones descritas para los biosensoresenzimáticos son para la determinación de plaguicidas incluidos loscarbamatos y compuestos organofosforados
Detección de residuos de plaguicidas
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Red Cyted Hortyfresco.
Basados en la correlación entre la toxicidad de un pesticida y el descenso de actividad de un
biomarcador como la enzima Acetilcolinesterasa
Detección de residuos de pesticidas
Red Cyted Hortyfresco.
Detección de residuos de pesticidas
Carbamatos (Propoxur) en
cebollas y lechugas
Organofosforados en patata
Tecnología Límite de detección
Biosensor de fibra óptica 8 μg l-1
´Cambio visual de color en la superficie de un chip plástico de membrana
0.1-0.2 ppm para cambio de color
Organofosforados en manzana, zumo
naranja
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Detección de residuos de pesticidas
Carbamatos en muestras licuadas de manzana, col y
brócoli
Tecnología Límite de detección
Acetilcolinesterasa inmovilizada en una
estructura de nanotubos de
carbono y polianilina
Transductor amperométrico
1,4-0.95 μmol l-1
Red Cyted Hortyfresco.
detección de etanol y daños por baja
[O2] en envases de lechugas, brocoli,
coliflor, mínimamente procesadas
Contiene inmovilizada alcohol oxidasa, peroxidasa y un cromógeno.
Alcohol oxidasa cataliza la oxidación de etanol en acetaldehído y H2O2
en presencia de O2.
Peroxidasa descomponeH2O2, liberando O2 que oxida el cromógeno causando un cambio de color.
El grado de cambio de color depende de la concentración de etanol,
tiempo de exposición, y la temperatura
Tecnología Límite de detección
Sensor comercial basado en un
cromógeno y un sistema
bienzimático: alcohol oxidasa y
peroxidasa
10 μl l-1 de etanol en la fase gaseosa a 5ºC + t exposición
15 s
(ALCO-SCREEN, Chematics, North Webster, IN, Patent c4786596)
Control de calidad en envases de atmósfera modificada
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detección de alcoholes volátiles
en el espacio de cabeza de zumo de frutas y vegetales
Alcohol oxidasa cataliza la oxidación de etanol en acetaldehído, el H2O2 se oxida en
un electrodo de platino, generando una señal eléctrica proporcional a la
concentración del alcohol.
No distingue entre etanol y metanol
Tecnología Límite de detección
Biosensor enzimático
amperométrico: alcohol oxidasa
10 μl l-1 de etanol en la fase gaseosa a 5ºC + t exposición
15 s
Control de calidad en envases de atmósfera modificada
Red Cyted Hortyfresco.
Salmonella typhimurium en
superficie de tomates
Tecnología Límite de detección
Biosensor magnetoelástico: electro-bobina magnética para
generar campo magnético oscilante
La unión biosensor-bacteriófago disminuye la
frecuencia resonante
1,5·103 ufc/mm2
Detección de toxinas y patógenos en frutas y verduras
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Micotoxinas en maiz
Tecnología Límite de detección
´Biosensor de fluorescencia de fibra óptica
2 ng/ml de aflatoxina
Detección de toxinas y patógenos en frutas y verduras
Fumonisinas
Aflatoxinas
Anticuerpo embebido en la fibra
Fumonisina
Fumonisina+marcador fluorescente
Exposición competitiva
FibraExposición
Aflatoxinas (fluorescente)
Red Cyted Hortyfresco.
Calidad nutricional
Cuantificación de glucosa en
homogeneizados de frutas (manzana, pera, mango…)
Inmovilización de glucosa oxidasa sobre una membrana inerte fijada a un electrodo
de platino. La oxidación de glucosa produce H2O2 lo que incrementa la corriente
en el electrodo
Tecnología Límite de detección
Biosensor enzimático
amperométrico: glucosa oxidasa
5 mM
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Principales áreas de interés en la industria alimentaria
Detección de residuos de pesticidas
Control de calidad en envases de atmósfera modificada
Detección de toxinas y
patógenos
Propoxur en cebollas y lechugas
Organofosfatados en lechuga
detección de etanol y daños por baja
[O2] en envases de lechugas, brocoli,
coliflor, mínimamente procesadas
Bacterias patógenas en
vegetales
Micotoxinas en maiz
Red Cyted Hortyfresco.
Limitaciones en el uso de biosensores
• Vida útil corta de los recubrimientos biológicos
• Falta de sensibilidad en matrices reales complejas
• Alto coste de producción no producción en masa
• La mayor parte de los biosensores están diseñados para
medir en fase líquida (destructivos)
Muy pocos dispositivos comercialmente disponibles
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Red Cyted Hortyfresco.Silva et al., 2013
Red Cyted Hortyfresco.
¿Hasta dónde podemos ver?
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Red Cyted Hortyfresco.
Los sistemas de visión
Fuente: www.bestsorting.com
Red Cyted Hortyfresco.
Los sistemas de visión
Fuente: www.visysglobal.com
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Red Cyted Hortyfresco.
Clasificadores: sistemas de visión, características
Cámaras de 3 canales:
VIS: RGB
VIS e IR o UV
Láseres:
VIS
IR
UV
Fluorescencia
Reflectancia + Algoritmos: identificación defectos por color y materias extrañas por color, tamaño y/o forma
Inspección estructura: identificación materias extrañas y algunos defectos
Algunas experiencias: Cámaras VIS más efectivas para detección de defectos en lechuga iceberg, romana yrepollo Cámaras VIS/IR más efectivas para detección de defectos en espinaca baby,identificación de troncos de lechugas Láser más efectivos para identificación de insectos, piedras, ramitas, cartones… Láser fluorescencia para separación de coronas en zanahorias
Evaluación clorofila
Fuente: www.key.com
Red Cyted Hortyfresco.
La imagen “química” en el control de calidad de hortalizas IV gama
La tecnología y su potencial
Algunas experiencias
Resultados y posibilidades de futuro
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Red Cyted Hortyfresco.
Bacterias patógenas en
vegetales
Micotoxinas en maiz
Tecnología Límite de detección
Light scattering sensor basados en el diferente patrón de dispersión de la luz que producen las
colonias de distintos patógenos
1 única célula en 25g de muestra
´Biosensor de fluorescencia de fibra óptica
2 ng/mL de aflatoxina
Detección de toxinas y patógenos en frutas y verduras
Red Cyted Hortyfresco.
La tecnología y su potencial
Fuente: adaptado Riccioli et al., 2011
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Red Cyted Hortyfresco.
Red Cyted Hortyfresco.
La IH en alimentos
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Red Cyted Hortyfresco.
La IH para la identificación de microorganismos
Park et al., 2015
Distinción entre bacterias Gram-positiva y Gram- negativa a nivel microscópico
Red Cyted Hortyfresco.
La IH para la identificación de microorganismos
A nivel macroscópico IH-NIR (1000-2350 nm), diferenciación de bacterias e identificación de
patógenos; en placa con pocillos suspensiones salinas conteniendo losmicroorganismos: Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus,Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Salmonella entiritidis
Imágenes del plano correspondiente a a) la longitud de onda 1.685 nm (derecha), en la que se segrega B. cereus; b) la longitud de onda 1.940 nm, en la que se segrega E. coli y
S. spp
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La IH para la identificación de microorganismos
A nivel macroscópico IH-VIS (400-900 nm), distinción temprana entre colonias de
Campylobacter y no Campylobacter; en crecimiento en agar
Red Cyted Hortyfresco.
La IH para la detección e identificación de microorganismos en alimentos
IH-NIR (930-1630 nm); en producto avícolas
Estimación de microorganismos viables totales con un coeficiente decorrelación y un error cuadrático medio de 0,94 y 0,5 log10 ufc g−1
Predicción de población de enterobacterias, alcanzando errorescuadráticos medios de 0,45 log10 ufc g−1, con las determinacionescomprendidas en el rango de 2,75 a 5,43 log10 ufc g−1
A nivel macroscópico
Mapas de distribución de número de viables totales en filetes de pollo para diferentes
Imagen virtual de la estimación decontenido en enterobacterias encarne de pollo
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Red Cyted Hortyfresco.
La IH para la detección e identificación de microorganismos en frutas y hortalizas
IH-VIS (400-900 nm); en producto cítricos
Detección precoz de efectos causados por Penicillium sp. (90-98%de acierto)
A nivel macroscópico
Gómez-Sanchís et al., 2011
Red Cyted Hortyfresco.
La IH para la detección e identificación de microorganismos en frutas y hortalizas
IH-VIS (400-900 nm); en producto cítricos
Detección de contaminación con E. coli en hojas de espinacas
A nivel macroscópico
Siripatrawan et al., 2011
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Red Cyted Hortyfresco.
La IH para la detección e identificación de microorganismos en frutas y hortalizas
IH-VIS (400-900 nm); en producto cítricos
Detección de contaminación con Listeria innocua en hojas deespinacas
A nivel macroscópico
Red Cyted Hortyfresco.
Inoculación: inmersión en suspensiones con poblaciones iniciales de 5 ó 7unidades logarítmicas de ufc de una cepa no patógena de Listeria innocua (M5,M7); población Control sin inoculación.Días de medida: 0, 1, 3, 6 y 9 días después de inocular (almacenamiento a 8ºC)
Análisis multivariante de imagen: identificación de patrones espectrales a partirde los gráficos de dispersión de los componentes principales PC1 y PC2; cómputode los espectros medios de las tres clases de identificadas; asignación de lospíxeles anónimos a la clase de la que la separa la menor distancia SAM
Recuentos microbiológicos Adquisición imágenes hiperespectrales
Siembra en placa con medio de cultivos para mesófilos y
Listeria
Cámara con espectrógrafo HeadwallPhotonics HyperespecTM VNIR: 400 –
1000 nm.Resolución espectral: 3 nm; resolución
espacial: 260 µm
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Red Cyted Hortyfresco.
Día 0 Día 9
Control
Inoculación en suspensión con 107
ufc
30 35 40 45 50 55 60 65 70
M7
M5
Control-2
% de píxeles degradados y semidegradados4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8
M7
M5
Control-2
Recuento de microorganismos totales (log ufc/g)
Espectros representativos de tres niveles diferentes de degradación, a partir de los cuales se clasificantodos los píxeles de las imágenes adquiridas.
Imágenes con los porcentajes más altos (>50%) de píxeles semi-degradados y degradadoscorrespondieron a contenidos microbiológicos superiores a 5 unidades logarítmicas de ufc (valor clave en eldeterioro de un alimento perecedero).
No se ha distinguido entre muestras con cargas microbiológicas conformadas por distintas especies
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Red Cyted Hortyfresco.
La IH para la detección e identificación de microorganismos en frutas y hortalizas
IH-VIS (400-900 nm); en producto cítricos
Detección de contaminación con Pseudomonas tolaasi enchampiñones
A nivel macroscópico
Gaston et al., 2011
Red Cyted Hortyfresco.
Limitaciones en el uso de IH
• Adquisición de imágenes de la superficie completa del
producto, dificulta la presentación de la muestra en un sistema
en línea
• Limitada resolución en las aplicaciones macroscópicas (300
micras)
• Limitaciones en la especificidad: inconveniente en muestras en
las que cohabitan numerosas especies en concentraciones
elevadas
• Identificación de contaminaciones microbianas con cargas
superiores a superiores a 102 ufc/ml. Límites de detección
superior al que puede alcanzarse con los procedimientos
habituales
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Red Cyted Hortyfresco.
www.lpftag.upm.eswww.hortyfresco.cl
¡Gracias por su atención!
