Métodos de Caracterización de Biomateriales

Gustavo A. Abraham y Teresita R. Cuadrado

Instituto de Investigaciones en Ciencia y Tecnología de Materiales (INTEMA) (UNMdP-CONICET), J. B. Justo 4302, B7608FDQ Mar del Plata, Argentina.

Resumen

Las propiedades en masa y superficie de los biomateriales utilizados en la fabricación de las partes constitutivas de un dispositivo biomédico, implante o sistema de diagnóstico definen la biocompatibilidad de los mismos, el comportamiento biomecánico y las prestaciones deseadas a corto y largo plazo. Los fenómenos de interacción que se desencadenan en el momento de poner en contacto al biomaterial con el medio biológico, los cuales son precursores de eventos posteriores, están determinados por la estructura y composición de la superficie a escala molecular (nanometro: milolonésima parte de un metro).

La herramienta ideal para caracterizar la superficie de un biomaterial debería permitir la observación de la muestra en contacto con un medio que se asemeje a las condiciones impuestas por la aplicación específica registrando los procesos moleculares que ocurren en la intercara en tiempo real. El espesor de la zona que debemos considerar superficie o interfase depende del tipo de propiedades a que nos estamos refiriendo. Esta puede ser simplemente una capa atómica o puede extenderse a decenas o cientos de capas. La mayoría de las aplicaciones en que están comprometidas superficies (lubricación, corrosión, interacción biológica, etc.) requieren una comprensión de las propiedades de superficies reales las cuales aunque parezcan limpias a simple vista presentan impurezas, moléculas o residuos resultado de los contactos previos con otros elementos (aire, vapores, fluidos biológicos, etc).

En este capítulo se presentan y describen los métodos más usados en la caracterización de biomateriales, las herramietnas disponibles para el análisis cualitativo y cuantitativo de los mismos así como para la determinación de sus propiedades en masa y superficie. Quedan excluídos aquellos métodos destinados a la evaluación de propiedades mecánicas dado que este tema en particular se trata en un capítulo aparte.

Introducción

Los biomateriales, tanto naturales como sintéticos, poseen características en masa y superficie que definen su biocompatib ilidad y bioestabilidad, las cuales deben conocerce a los efectos de predecir el comportamiento del dispositivo durante el periodo de aplicación clínica. Entre los parámetros evaluados podemos mencionar temperaturas de transición vítrea, puntos de fusión, capacidad calorífica, cristalinidad, coeficiente de dilatación, cinética de reacción, composición química, pureza, cantidad e identidad de aditivos, estabilidad y degradabilidad en presencia de diferentes medios, porosidad, rugosidad, hidrofilicidad, etc.

Las diferentes técnicas disponibles (cromatografía, difracción de rayos X, espectroscopía infrarroja, microscopía electrónica de barrido, microscopía de sonda de barrido, análisis térmico diferencial, etc.) plantean requerimientos específicos en cuanto a cantidad de muestra, geometrías de probetas particulares o procesos de acondicionamientos previos de los materiales a ensayar más o menos laboriosos. Algunas de las técnicas son de naturaleza “destructiva” o otras “no destructiva”, proporcionan información cualitativa o cuantitativa, absoluta o complementaria, brindando resultados de mayor o menor resolución o sensibilidad. Por lo tanto, los métodos apropiados a utilizar en cada caso deberán seleccionarse teniendo en cuenta el

objetivo del ensayo y el destino de la información obtenida (por ejemplo: escala de investigación, control y análisis de calidad, desarrollo de dispositivos o producción industrial).

Determinación de estructuras

La energía asociada con la radiación electromagnética en el rango infrarrojo (justo por encima de la longitud de onda del visible, aproximadamente entre 4000 y 600 cm-1) es suficiente para provocar la excitación de vibraciones de los enlaces químicos. La Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier, FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) y Raman involucran el uso de esta radiación para caracterizar los enlaces químicos, por lo que ambas técnicas se consideran siempre en conjunto, aunque son significativamente diferentes. La vibración de una estructura determinada se analiza en términos de los grados de libertad que dicha estructura posee. Mientras en un experimento de FTIR se emplea una lámpara de mercurio u otra fuente de amplio espectro, en Raman se emplea una fuente láser. El experimento Raman involucra un corrimiento en la longitud de onda del haz monocromático que incide sobre la muestra. Esos pequeños cambios se deben a la emisión resultante de los choques inelásticos de los electrones excitados. Ambas técnicas proporcionan una información muy valiosa de la estructura química y la zona debajo de 1500 cm-1 se denomina “huella digital” dado que permite la identificación de sustancias en forma unívoca.

Figura 1: Absorbancia en infrarrojo de algunos grupos funcionales comunes.

La técnica de Difracción de Rayos X, XRD (X-ray diffraction) proporciona información

sobre la estructura química y cristalina de un material. Los rayos X son radiación electromagnética de longitud de onda de aproximadamente 1 Å (10-10 m), que es del orden de la distancia interatómica (ent re los rayos gamma y los ultravioleta). Cada sólido cristalino posee un patrón característico de difracción que puede emplearse, como en FTIR, para su identificación. Dado que los polímeros son amorfos o semicristalinos, a través de este método se puede determinar el grado de cristalinidad de los mismos. En la Figura 2 se muestra claramente la formación de estructuras cristalinas en microsferas de poli(ácido láctico) (PLA, poliéster biodegradable) originalmente amorfas a medida que avanza el tiempo de degradación hidrolítica “in vitro”. Estos tipo materiales poliméricos son muy usados en la preparación de sistemas de liberación controlada de drogas, suturas, tornillos y barrras de osteosíntesis en el área de cirugía maxilofacial, etc. Esta técnica resulta de gran utilidad en la elucidación de la composición, pureza y estructura cristalina de los materiales metálicos y biocerámicos. De esta manera se puede obtener valiosa información de por ejemplo, α-alúmina para uso en implantes (cuya pureza debe ser mayor a 99.5% de óxido de aluminio), estabilidad de zirconias, estructura y parámetros de red de hidroxiapatita, fosfatos de calcio, carbón pirolítico o aleaciones metálicas de interés en implantes como aceros inoxidables, aleaciones CoCr, titanio y sus aleaciones, etc.

Figura 2: Patrones de difracción de rayos X de microesferas de poli(ácido láctico) (PLA) a

diferentes tiempos de degradación

La Cromatografía Gaseosa, GC (Gas chromatography), es una técnica que permite separar compuestos orgánicos volátiles. Un cromatógrafo de gases consiste en una fase móvil que fluye, un inyector, una columna de separación que contiene una fase estacionaria y un detector. Los compuestos orgánicos se separan debido a la existencia de una partición entre ambas fases. Un ejemplo de aplicación lo constituye la determinación del contenido de metacrilato de metilo residual en muestras de cementos óseos acrílicos. La polimerización del MMA in situ en la cavidad femoral progresa hasta la vitrificación del PMMA, después de la cual el coeficiente de difusión del monómero disminuye, permaneciendo en la matriz polimérica sin reaccionar. El contenido de monómero residual afecta a las propiedades mecánicas y puede originar eventos biológicos adversos durante la aplicación clínica tales como hipotensión o citotoxicidad. Otras técnicas cromatográficas incluyen la Cromatografía en Capa Fina (TLC), la Cromatografía Líquida de alta Prestación (HPLC), entre otras.

Por último, entre los métodos para determinar la estructura química, microestructura y estereoregularidad de polímeros o tacticidad, composición y secuencias copoliméricas, relaciones de reactividad de monómeros y otras características se encuentra la espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear, NMR (Nuclear magnetic resonance spectroscopy), ya sea en solución como en estado sólido. La NMR involucra cambios en el estado de espín del núcleo de un átomo. Los núcleos más comunes estudiados mediante NMR con 1H, 13C, 19F, 15N y 29Si. La NMR de protón y carbono (1H NMR y 13C NMR) constituye una herramienta de suma importancia en la síntesis y caracterización de biomateriales poliméricos. El requisito de solubilidad en alguno de los disolventes deuterados disponibles (comúnmente DCCl3, DMSO-d6, D2O, CD3-CO-CD3, CF3COOD) es fundamental para efectuar el análisis mediante esta técnica en solución. En la Figura 3 se muestra un ejemplo de un espectro obtenido mediante 1H NMR de poli(ε-caprolactona) (PCL), poliéster biodegradable sintético empleado en numerosas aplicaciones, y la asignación de las señales correspondientes a los protones de la unidad repetitiva. En el caso de oligómeros o polímeros lineales de bajo peso molecular, la relación de absorciones de los grupos finales y de las unidades repetitivas permite la determinación del peso molecular. Asimismo en el caso de polímeros ramificados, es posible determinar el grado de ramificación. También se muestran los espectros de quitina y quitosano, polisacáridos biodegradables altamente biocompatibles.

a) b) Figura 3: Espectros de resonancia magnética nuclear de protón a) PCL, poliéster biodegradable usado en el campo de liberación controlada de fármacos e ingeniería de tejidos. b) comparación

de espectros de los polisacáridos quitina y quitosano. Determinación de pesos moleculares

La Cromatografía de Permeación de Geles, GPC (Gel permeation chromatography),

también llamada cromatografía por exclusión de tamaños (Size exclusion chromatography, SEC), permite la determinación pesos moleculares y distribución de pesos moleculares de polímeros. El equipo de GPC consta de una zona de bombeo, zona de inyección, conjunto de columnas empacadas con un relleno de partículas porosas, un detector y un registrador. Por todo el sistema circula permanentemente un solvente a velocidad constante. La muestra disuelta en el solvente es inyectada al sistema y fluye a través de varias columnas en serie que se mantienen a temperatura constante.

Las moléculas más pequeñas tienen mayor facilidad de acceso a los poros del relleno y difunden dentro y fuera de los mismos siguiendo un camino tortuoso a medida que avanzan en la columna. Las moléculas más grandes no pueden penetrar en los poros y atraviesan las columnas en forma más rápida. De esta manera se logra la separación de las moléculas en función del volúmen hidrodinámico de las mismas, saliendo las moléculas más grandes a tiempos de elusión menores. Los detectores más usados son el índice de refracción, que mide la diferencia en el índice de refracción entre el disolvente puro y la solución que sale de las columnas, y el detector ultravioleta, que mide la absorbancia de grupos cromóforos. Los pesos moleculares obtenidos son relativos a los patrones empleados en la calibración, normalmente poliestireno, poli(óxido de etileno) o poli(metacrilato de metilo). La Figura 4 muestra una curva típica obtenida por esta técnica con la distribución de pesos moleculares de una muestra polimérica. Para Mw, peso molecular promedio en peso, se utilizó el símbolo del cuadrado vacío y para la polidispersidad (Mw/Mn) el cuadrado relleno, Mn es el peso molecular promedio en número.

Figura 4: Cromatograma típico de GPC mostrando los pesos moleculares promedio. A la

derecha se observa la variación del peso molecular y polidispersidad de una espuma de PLLA con el tiempo de degradación en solución buffer pH = 7.4 y 37ºC.

Evaluación de las propiedades térmicas

El análisis térmico puede definirse como la medida de propiedades físicas y químicas de los materiales en función de la temperatura (las medidas más usuales son: entalpía, capacidad calorífica, masa y coeficiente de expansión térmica). La familia de métodos de análisis térmico disponible es bastante amplia. Las principales técnicas pueden agruparse como se muestra en la Tabla 1:

Tabla 1: Métodos de análisis térmico

Propiedad Técnica Acrónimo Masa Termogravimetría TGA

Detección de gases EGD Volátiles Análisis de gases EGA

Temperatura Análisis térmico diferencial DTA Calor o flujo de calor Calorimetría diferencial de

barrido DSC

Dimensiones Termodilatometría TD Análisis termomecánico TMA Propiedades Mecánicas Análisis dinámico-mecánico DMA, DMTA

Propiedades ópticas Termomicroscopía Otras

La primera clase de métodos termoanalíticos está asociada con la pérdida de masa y puede determinarse de dos maneras. La primera forma involucra el uso de una balanza o un sensor similar para seguir los cambios de masa (TGA). La segunda se basa en la detección y análisis de los gases de descomposición producidos (EGD y EGA). Ambas técnicas están muy relacionadas y son complementarias, como todos los métodos termoanalíticos.

El Análisis Térmico Diferencial (ATD) es una técnica en la cual la temperatura de la muestra es comparada con la de un material inerte de referencia a medida que avanza el programa de calentamiento o enfriamiento establecido. La temperatura de la muestra y la de la referencia deben ser iguales hasta la ocurrencia en la muestra de algún evento térmico, como fusión, cambio de estructura cristalina, descomposición, o transición vítrea; en cuyo caso la

temperatura de la misma se hace menor (si el cambio es endotérmico) o mayor (si es exotérmico) que la de la referencia. Cuando la muestra y la referencia están a la misma temperatura, la señal neta de los termopares es cero, pero cuando un evento térmico ocurre en la muestra, existir una diferencia de temperatura que es detectada por el voltaje neto de los termopares.

La Calorimetría Diferenc ial de Barrido, DSC (Differential scanning calorimetry) es una técnica muy similar al ATD, dado que también se utiliza una muestra y un material de referencia pero la celda tiene un diseño diferente (ver Figura 5). La muestra (de aproximadamente 10 mg) se coloca en recipientes (cápsulas herméticas o no) de aluminio u oro. Como referencia puede utilizarse simplemente una de las cápsulas vacías. La muestra y la referencia deben mantenerse a la misma temperatura durante el programa de calentamiento, determinándose el flujo de calor que se desarrolla entre ambas en función de la temperatura.

Figura 5: Esquema de la celda de un calorímetro DSC

El área de los picos es una medida de la energía requerida para mantener la referencia y la

muestra a igual temperatura. La constante de calibración que traduce el área de los picos a calorías es conocida y constante, siendo posible así un análisis cuantitativo. El intervalo de trabajo va desde –100ºC (nitrógeno líquido) hasta 600ºC. Mediante DSC se obtiene un termograma donde la ordenada representa la capacidad calorífica (Cp) y la abscisa la temperatura T a tiempo t, donde puede identificarse claramente toda transformación endo o exotérmica que sufre la muestra a medida que varía la temperatura (ver Figura 6). Dado que los picos determinados pueden ser el resultado de varios procesos simultáneos en muchos casos esta técnica requiere de la realización de otros estudios complementarios. Las aplicaciones incluyen el cálculo de Cp, efectos térmicos, pureza, temperatura de transición vítrea (Tg), temperatura de cristalización (Tc), temperatura de fusión (Tm), cinéticas de reacción, entalpías de fusión y cristalización, porcentaje de cristalinidad y diagramas de fase entre muchas otras.

Determinación de Tg: La temperatura de transición vítrea es una propiedad de la parte amorfa de un polímero y por lo tanto es un parámetro que caracteriza a estos materiales. Por debajo de ella la movilidad es limitada y no existe suficiente energía térmica para que los segmentos de cadena se muevan; el polímero se encuentra en un estado vítreo. A la Tg, se produce el movimiento cooperativo de segmentos de moléculas de 40 o 50 átomos de carbono y el material se define en estado gomoso. La Tg puede medirse de diferentes maneras, ya que el cambio en la morfología del polímero va acompañado de bruscos cambios en las propiedades como índice de refracción, capacidad calorífica, conductividad térmica, constante dieléctrica, módulos mecánicos, volumen específico, entre otras.

No todos los métodos brindan el mismo valor de Tg debido en parte a las diferentes constantes de tiempo de las celdas de medida. La Tg aumenta al aumentar la velocidad del programa térmico impuesto porque las cadenas de polímero no pueden responder instantáneamente a los cambios de temperatura. Muchas veces el elevado grado de cristalinidad de un polímero termoplástico o el alto número de puntos de entrecruzamiento de uno

termorrígido hace que esta transición no sea detectable por no ser suficiente la sensibilidad del método. Algunos materiales altamente entrecruzados o con fuerzas intermoleculares muy fuertes pueden alcanzar la degradación antes de la Tg.

Durante la transición vítrea se observa un cambio de pendiente de la curva Cp vs T debido justamente a la diferencia en la Cp entre los estados vítreo y gomoso. La fusión es una transición de primer orden, pues varía la función de estado entalpía (H). En la Tg varía la derivada de la entalpía con respecto al tiempo (dH/dt), es entonces una transición de segundo orden. Para determinar el valor de Tg se puede tomar el punto medio de la transición (punto de inflección de la curva) o bien prolongar los tramos rectos y tomar la intersección de éstos como la línea de base y definir Tg en base al valor de temperatura al inicio o al final de la transición.

Figura 6: Termograma de un polímero semicristalino obtenido por DSC.

La Termodilatometría (TD) está relacionada con los cambios dimensionales (longitud y

volumen) en función de la temperatura sin la aplicación de ninguna carga externa. El coeficiente de expansión se determina siguiendo la variación de longitud en una dirección en particular con respecto a la temperatura impuesta. En el capítulo de “Propiedades Mecánicas de Biomateriales” se hace referencia al análisis termomecánico de materiales. Caracterización de superficies de biomateriales

La Figura 7 presenta un esquema de los métodos que se disponen tanto para el análisis de superficies de biomateriales como del sistema formado por la superficie de un material y los elementos biológicos adsorbidos, adheridos o ligados a los mismos, luego de un determinado periodo de contacto. El primer enfoque tiene por objetivo la determinación de los parámetros, propiedades, composición superficial y topografía del material que forma parte de un dado dispositivo. El segundo enfoque es utilizado fudamentalmente en el campo de la ciencia de los biomateriales para estudiar la respuesta biológica (biocompartibilidad, hemocompatibilidad, citotoxicidad, etc.) en presencia de estos sustratos caracterizados analizando los elementos biológicos en superficie, buscando correlaciones e identificando las propiedades significativas del material que permitan predecir el comportamiento de los dispositivos “in vivo”.

Preparación de muestras de biomateriales para el análisis de propiedades superficiales: La muestra debe ser semejante a la que va a ser sometida a un implante o ensayo biológico. De esta manera debe tenerse especial cuidado en la etapa de preparación de las mismas evitando alteraciones de la superficie mediante depósito o adsorción de elementos, generación de huellas de corte, etc. Si la muestra es envasada para transporte o almacenamiento previo al análisis superficial, debe analizarse la posibilidad de contaminación superficial. Por ejemplo: el papel blanco o marrón de sobres puede transferir iones metálicos a la superficie de la muestra, algunos plásticos empleados en envases han sido fabricados con aceites de silicona u otros aditivos que

pueden también transferirse a la muestra. Por este motivo el material de envase debe reunir ciertos requisitos de pureza y calidad de fábrica.

Figura 7: Métodos disponibles para la caracterización superficial de biomateriales

Análisis de muestras: Todos los métodos empleados para analizar superficies pueden potencialmente introducir alteraciones. Para construir una “imagen completa” de la superficie y extraer conclusiones definitivas acerca de la naturaleza de la misma deben emplearse un conjunto de métodos de análisis que aportan información complementaria y coherente (Tabla 2). En la Figura 8 se compara la sensibilidad de las diferentes técnicas en relación con la profundidad de las capas superficiales de material que asequible con cada una.

Se detallarán a continuación algunas de las técnicas relevantes para la caracterización de superficies de biomateriales y evaluación de los fenómenos de interacción de las mismas con el medio biológico.

Métodos Espectroscópicos

a) Métodos de espectroscopía vibracional: La espectroscopía vibracional, en particular la espectroscopía infrarroja (FTIR) brinda información acerca de la estructura molecular. El espectro infrarrojo se origina por la absorción de radiación de frecuencia que está en resonancia con una transición vibracional determinada. La Reflectancia Total Interna Atenuada (ATR-FTIR) es la aplicación de este método espectroscópico a la observación de superficies acoplado con el fenómeno físico de reflección total interna (reflección y refracción de radiación

electromagnética en la interfase de dos medios de diferente índice de refracción) para restringir el volúmen de análisis a la región superficial de la muestra. El haz infrarrojo es reflejado en la cara interna de un prisma transparente y con alta reflectancia, mientras que la superficie a ser examinada es colocada en perfecto contacto con la cara del prisma en el que ocurre la reflexión.

Tabla 2: Características y capacidades de algunos métodos comunes para el análisis de

superficies de biomateriales

Método Principio Profundidad analizada

Resolución espacial

Sensibilidad analítica

Ángulos de contacto La energía superficial se estima a partir del mojado de líquidos sobre superficies

3 – 20 Å 1 mm [1] Baja o alta dependiendo de la comp.química

Espectroscopía electrónica para análisis químicos (ESCA o XPS)

Los rayos X producen la emisión de electrones de energía característica

10 – 250 Å 8 –150 µm 0.1 % (atómica)

Espectroscopía electrónica Auger [2]

Un haz de electrones enfocados sobre la superficie produce la emisión de electrones Auger

50 – 100 Å 100 Å 0.1 % (atómica)

Espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)

Un bombardeo de iones lleva a la emisión de iones secundarios desde la superficie

10 Å a 1 µm [3] 500 Å Muy alta

Esp. infrarroja por reflexión total atenuada (ATR-FTIR)

La radiación infrarroja es absorbida por vibraciones moleculares excitadas

1 – 5 µm 10 µm 1 mol %

Microscopía de efecto túnel (STM) [4]

Medida de la corriente túnel cuántica entre una sonda metálica y una superficie conductora

5 Å 1 Å Átomos individuales

Espectroscopía electrónica de barrido (SEM, ESEM)

Se mide y visualiza espacialmente la emisión de electrones secundarios causada por un haz de electrones enfocado hacia la superficie

5 Å 40 Å (usualmente)

Alta, no cuantitativa

[1] El tamaño de una gota pequeña es 1 mm. Sin embargo la resolución espacial de la línea interfacial en el borde de la gota es aproximadamente 0.1 µm. [2] La espectroscopía electrónica Auger daña la superficie de materiales orgánicos y se emplea usualmente para materiales inorgánicos. [3] SIMS estático aproxi madamente 10 Å; SIMS dinámico hasta 1 µm. [4] Para materiales aislantes se emplea microscopía de fuerza atómica (AFM), que tiene una resolución espacial cercana a la del STM.

El desarrollo de esta técnica permite la aplicación de la espectroscopía infrarroja al estudio

de superficies poliméricas ópticamente planas, pulidas y suficientemente flexibles como para permitir ser presionados en contacto con la cara del prisma. La profundidad de penetración del haz es de 1 a 5 µm, por lo que proporciona información de una región importante próxima a la superficie. Se puede obtener información acerca de la estructura molecular del material, de interacciones inter e intra moleculares, cristalinidad, conformación y orientación de moléculas (ejemplo: proteínas), etc. Asimismo pueden observarse superficies poliméricas inmersas en agua u otro líquido, en estos experimentos se sustrae posteriormente la señal correspondiente a la fase líquida. Otros métodos IR como reflectancia difusa y reflexión externa mejoran notablemente la capacidad de la espectroscopía vibracional para estudiar superficies.

Figura 8: Comparación de la sensibilidad de algunas técnicas analíticas

b) Espectroscopía Electrónica para Análisis Químico, ESCA (Electron spectroscopy for chemical analysis), también llamada Espectroscopía Fotoelectrónica de Rayos X, XPS (X-ray photoelectron spectroscopy) es utilizada para determinar la composición elemental de superficies sólidas. El principio de ESCA se basa en la emisión de electrones desde el material en respuesta a la irradiación de la superficie con un haz monocromático de rayos X. La energía cinética de los fotoelectrones emitidos es única para los diferentes elementos y sensible al estado químico de los átomos. Dado que los electrones emitidos tienen poca capacidad de penetración de solo aquellos emitidos desde 100 Å o menos de profundidad del material pueden escapar de la superficie y ser detectados. El espectro ESCA, típicamente de 1.000 eV de ancho, permite identificar y cuantificar el porcentaje de átomos de los elementos presentes desde Li hasta U, excepto H y He con una sensibilidad del orden de 0,1 % átomos. Los espectros de alta resolución (ancho: 20 eV) detecta corrimientos asociados al entorno químico de los elementos existentes así como detalles acerca de estructuras aromáticas o insaturadas. Entre otras ventajas se puede mencionar que no es necesaria una preparación especial de la muestra, pueden estudiarse superficies hidratadas (congeladas), con un daño mínimo a la muestra y existe una teoría sólida para interpretar la información obtenida. Por ejemplo, en la Tabla 3 se muestra la composición de distintos poliuretanos segmentados con diferentes modificadores de extremo de cadena (SME) empleados en la fabricación de dispositivos en el área cardiovascular. Las cadenas macromoleculares (Mw del orden de 190.000) son modificadas en sus extremos para mejorar la biocompatibilidad o la bioestabilidad de estos materiales en base a la estrategia del enriquecimiento superficial de los mismos con determinados grupos funcionales ligados covalentemente a la estructura.

Tabla 3: Análisis por ESCA de una serie de poliuretanos con modificadores de superficie

Composición atómica (%) Material SME C O N Si F

Biomera - 80,7 16,6 2,7 - - Biospanb - 79,3 17,1 3,5 - - Biospan-Db Hidrocarbono 77,6 20,5 1,9 - - Biospan-Sb Silicona 54,0 23,0 0,9 22,0 - Biospan-Fb Fluorocarbono 76,9 18,2 1,7 - 3,1 a Ethicon Corp.; b The Polymer Techonology Group, Inc. c) Espectroscopía electrónica Auger, AES (Auger electron spectroscopy), ha sido usada para investigar morfología superficial, realizar análisis elemental y establecer perfiles de

composición en profundidad. Un haz focalizado de electrones se usa para exitar los electrones Auger de la superficie, los cuales son luego detectados y analizados. No se requiere preparación especial de la muestra y la adquisición de datos es rápida (unos pocos minutos) y reproducible. Este método no puede aplicarse a muestras orgánicas dado que las mismas son alteradas química y morfológicamente por el haz de electrones. Por lo tanto AES es de uso limitado para la caracterización de sustratos poliméricos o biológicos. d) Espectrometría de Masas de Iones Secundarios, SIMS (Secondary ion mass spectroscopy). Puede utilizarse para el análisis de superficies orgánicas e inorgánicas identificando todos los elementos así como iones atómicos y moleculares y fragmentos de masa alta presente a concentraciones muy bajas. Las superficies son bombardeadas con un haz de iones o átomos focalizados y la energía del haz incidente (aproximadamente 5-25 keV) es transferida a la superficie del material produciendo una emisión de partículas secundarias algunas de las cuales están ionizadas. Estas últimas son separadas en función de la relación masa/carga eléctrica donde las especies positivas y negativas son detectadas por separado. De esta forma se obtiene un espectro de masas de una capa superficial de 10Å. Al igual que ESCA requiere de una instrumentación compleja y cámara de alto vacío. Sin embargo, SIMS proporciona una información única y complementaria a la obtenida por ESCA. La distinción entre SIMS estático y dinámico se basa en la dosis de iones acelerados bombardeados hacia la superficie. SIMS estático o de bajo flujo produce un daño mínimo en la muestra y los fragmentos emitidos son característicos de la estructura molecular de la superficie. Dado que una superficie típica presenta 1013-1015 átomos por cm2 el haz utiliza una dosis del orden de 1013 iones/cm2. La técnica de alto flujo, SIMS dinámico, produce ablación rápida de la superficie durante el análisis y puede utilizarse para conocer cambios en la composición elemental a medida que se avanza en profundidad. El método SIMS de temperatura programada ofrece información de energías de adsorción y ayuda a distinguir fenómenos de adsorción física o química.

Métodos Termodinámicos

e) Métodos de Ángulo de Contacto (Contact angle): la medida del ángulo que forma la tangente del perfil de una gota de líquido sobre una superficie sólida, considerando que la gota se encuentra en reposo y equilibrio con dicho sólido, brinda información de la energía superficial del sustrato. El ángulo de contacto a menudo se toma como parámetro indicativo de la humectabilidad o mojabilidad (wettability) de la superficie de un materia l, y correlaciona frecuentemente con los fenómenos de interacción que ocurren con el medio biológico. El balance de fuerzas entre la tensión superficial líquido-vapor (γlv)de una gota de líquido y la tensión interfacial entre el sustrato sólido y la gota (γsl) puesta de manifiesto a través del ángulo de contacto (θ) de la gota con la superficie puede usarse para caracterizar la energía de la superficie γsv. Estas tensiones se relacionan mediante la siguiente ecuación: γsv = γsl + γlv.cos θ El ángulo de contacto para superficies inmóviles es sensible a 3-10 Å de la superficie. Experimentalmente se han desarrollado diferentes métodos para evaluar el ángulo θ (Figura 9). El método de burbuja de aire en agua es útil para estudiar interfases hidratadas y el método de Wilhelmy incrementa la reproducibilidad y exactitud de las determinaciones. En modo dinámico se puede evaluar la histéresis comparando ángulos obtenidos en avance y retroceso, la cual se observa en presencia de superficies rugosas, de química heterogénea o en sustratos reorientables con moléculas móviles en superficie. En resúmen, a los efectos de obtener valores reproducibles de θ se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: la medida es sensible al operador; la rugosidad y heterogeneidad de la superficie influencia los resultados; los líquidos usados se contaminan fácilmente reduciendo γlv, dado que los polímeros en muchos casos poseen gran

movilidad de las moléculas de la superficie; los líquidos utilizados pueden reorientar la estructura; los líquidos utilizados pueden disolver la superficie del material o al ser absorbidos provocar el hinchamiento del mismo; las geometrías de las muestras para una correcta medición son limitadas; el tamaño de la gota así como el tiempo en el que se efectúa la lectura pueden afectar los resultados.

Figura 9: Métodos para medir ángulo de contacto: a) gota en avance y retoroceso (aumento y

disminución de tamaño de gota); b) estabilidad de gota; c) método de Zisman para medir tensión superficial crítica; d) ascenso capilar; e) método Wilhelmy; f) burbuja de aire.

Métodos Microscópicos e) Visualización de superficies: La Microscopía Electrónica de Barrido, SEM (scanning electron microscopy) ofrece imágenes de gran resolución y profundidad de campo con una calidad tridimensional. El tipo de haz de electrones usado determina la resolución que será mayor cuanto mayor es el voltaje de aceleración utilizado. En la Figura 10 se aprecian las diferentes zonas que podemos diferenciar en el volumen de interacción del haz con el material bajo análisis y desde las cuales surgen los electrones o rayos X que se utilizan para generar la imagen. Los electrones secundarios son sensibles a cambios en la morfología superficial. Los electrones de fondo en cambio dan cuenta de la composición del material. Como proveen contraste de número atómico las áreas del material con mayor número atómico serán brillantes. El equipo SEM convencional opera bajo vacío y usa filamentos de tungsteno o hexaboruro de lantanio, LaB6. Los principales requerimientos de la muestra son: ser compatible con operación bajo vacío y conductor eléctrico. Si la muestra no soporta el vacío se puede hacer un secado de la misma por el método de CO2 en estado de punto crítico o se puede observar a baja temperatura. Las muestras no conductoras se recubren con una capa de carbón u oro.

Figura 10: Volumen de interacción y profundidad de escape relativo de la radiación empleada

para análisis SEM

El desarrollo posterior de SEM de bajo voltaje, LVSEM , amplió las posibilidades de estudio de la química superficial y topografía de materiales no conductores, mientras que la técnica ESEM (o SEM ambiental, environmental SEM), permite la aplicación de SEM a muestras sin recubrimientos metálicos y efectuar estudios de muestras en sumergidas en medio líquido. El ESEM utiliza un detector de electrones secundarios pudiendo obtenerse imágenes de muestras húmedas en atmósfera gaseosa o de vapor de agua hasta 20 Torr de presión sin ninguna preparación previa. También se puede observar el material en condiciones dinámicas siguiendo un programa térmico.

Figura 11: Imagen obtenida por ESEM de una gota de agua fijada entre fibras hidrofílicas El microscopio de bajo voltaje, LVSEM, usa filamentos de tugnsteno y toma la señal de electrones de fondo para generar la imágen pudiendo caracterizar muestras húmedas a 2-3 Torr. Los rayos X son señales importantes que proveen información sobre la composición química de la muestra midiendo la energía generada por la acción del haz. Esta técnica se denomina Espectroscopía de Energía Dispersiva, EDS (Energy dispersive X-ray spectroscopy). Dado que la altura de cada pico está relacionada con el porcentaje de ese componente en el material es posible llevar a cabo un análisis cuantitativo. Las aplicaciones de SEM/EDS en el campo de la medicina incluyen: análisis de fallas, comparación de materiales, evaluación de procesos de tratamiento superficial, caracterización de defectos, control de calidad de recubrimientos, etc.

En 1982 se avanzó mucho con la invención del Microscopio de Efecto Túnel, STM (Scanning tunneling microscopy) que ofrecía la imagen tridimensional directa de una superficie conductora con “resolución atómica” bajo una variedad amplia de medios. La importancia del desarrollo del STM es comparable a la invención del microscopio electrónico en 1930 dado que este usa un principio completamente diferente al del microscopio electrónico y al del óptico para obtener las imágenes de la superficie. El microscopio óptico no puede resolver estructuras atómicas porque la longitud de onda promedio de la luz visible es unas 200 veces mayor que el diámetro de un átomo (3 Å).Usando luz de color verde (longitud de onda aproximada de 0,5 µ) el microscopio óptico solo puede resolver datos próximos si entre ellos media al menos una distancia de 0,25 µ. Si bien el SEM tiene alto poder de resolución, los electrones de alta energía del haz penetran profundamente en la materia y solo pueden resolver algo de la estructura superficial. La aparición del STM despertó el interés generalizado de los científicos y constituyó el primer paso para el desarrollo posterior de numerosas técnicas que se conocen como Microscopía de Sonda de Barrido, SPM (Scanning probe microscopy). Estos instrumentos permiten estudiar las características de los cuerpos en detalle inasequible (escala atómica o molecular) para los microscopios ordinarios examinándolos a muy corta distancia con una sonda cuyo espesor puede ser de un solo átomo.

Figura 12: Imagen de resolución atómica de una capa de cristal de α-RuCl3 (3.7 nm de barrido)

En el STM los controles piezoeléctricos aproximan la punta a una distancia de 1 a 2 nm de la superficie de una muestra conductora, cercanía en que las nubes electrónicas del átomo del extremo de la sonda y del átomo más próximo de la muestra se solapan. Cuando se aplica un pequeño voltaje a la sonda los electrones atraviesan ese intervalo (efecto túnel) y dan lugar a la aparición de una minúscula corriente. La intensidad de esta corriente es extraordinariamente sensible al valor de la distancia de separación. Un mecanismo detecta estas variaciones de corriente y ajusta el voltaje al piezoeléctrico que es el encargado de reubicar la sonda en sentido vertical, siguiendo la topografía de la muestra, a los efectos de estabilizar la corriente. Un voltaje de 0,1 V produce un movimiento de 1 Å (10-10 m). Las variaciones en el voltaje aplicado al control piezoeléctrico se traducen en una imagen de relieve de la superficie del material al obligar a la punta a barrer un conjunto de líneas paralelas entre sí. Además de mostrar la topografía atómica de la superficie el STM revela la composición atómica porque la corriente túnel depende de la distancia y de la estructura electrónica de la superficie. La resolución lateral del microscopio está limitada por lo afilado que sea la punta lográndose valores de 6 a 12 Å. Para llegar a resolución lateral de 2 Å la aguja de tugnsteno debería contar con un solo átomo en la punta. El afilado de las puntas se efectúa mediante el bombardeo con un haz de iones de alta energía. Este microscopio es muy útil por su capacidad de suministrar un método directo y no destructivo de visualización de muestras biológicas. Por ejemplo; por este método se confirmó que la cabeza del virus conocido como φ29 mide

400x300x200 Å y se ha establecido la estructura de conección entre la cabeza y la cola del mismo llamada collar, que desempeña un papel significativo en el proceso de infección.

Figura 13: Esquema de un microscopio de efecto túnel (STM)

Pero entre las herramientas que han contribuido significativamente al desarrollo de la ciencia de biomateriales se destaca el Microscopio de Fuerza Atómica, AFM (Atomic force microscopy). La imagen se obtiene a partir del registro de la deflexión de una punta metálica debido a la repulsión de la nube electrónica entre el átomo en la punta de la sonda y los átomos de la superficie. De esta manera, este método puede generar una imagen de la topografía de materiales no conductores y componentes biológicos (células, tejidos, proteínas,etc.) y brindar información acerca de la topografía, elasticidad, fricción, adhesión, densidad de cargas, estructura y heterogeneidad química superficial. La resolución a escala atómica puede lograrse en un medio líquido o gaseoso tanto como en vacío. Esto es muy importante para el análisis de sistemas biológicos en medios fisiológicos reproducibles y para el estudio de fenómenos de cristalización, disolución o corrosión de materiales en varios solventes en tiempo real. Las muestras no requieren de procesos previos de recubrimiento , teñido, etc. como en el caso de SEM porque el contraste no depende del número atómico. Las imágenes de SPM no producen daño a las muestras por radiación tales como se observa en el caso de análisis SEM de polímeros, los cuales sufren entrecruzamiento o corte de cadenas. Además esta técnica permite manipular las superficies para crear estructuras moviendo átomo por átomo. La desventaja más importante es la baja velocidad de generación de la imágen (30 segundos a 1 hora). La estructura de AFM consiste de tres componentes esenciales (Figura 14): 1) Un actuador piezoeléctrico para mover la muestra en relación con la sonda a los efectos de mantener la fuerza constante. Los cerámicos piezoelectricos cambian de tamaño a una escala ínfima cuando varía el potencial eléctrico al que se somete. 2) Un transductor de fuerza, brazo de palanca con un sistema de medición de la magnitud de la deflección mediante un diodo laser. Las dimensiones típicas del brazo son 100 µm de longitud, 30 µm de ancho y 3 µm de espesor. 3) Una sonda o punta de prueba (0,5 µm) fabricada usualmente de silicio o nitruro de silicio ubicada en el extremo del brazo. La composición, geometría, química, elasticidad y topografía de la punta influenciará la medida en cada modo operacional. La magnitud de la fuerza depende de la genometría de la sonda, y es típicamente del orden de 100 nN, las cuales pueden producir daño en muestras blandas. Las fuerzas que se detectan tienen una sensibilidad del orden del picometro

(1 pN = 10-12N). En el modo de contacto la fricción puede generar una imagen distorcionada de la topografía y dañar la superficie de la muestra o afectar la estructura de las macromoléculas observadas. La Figura 15a muestra dos imágenes de una misma muestra de silicio epitaxial (100) obtenidas mediante AFM modo contacto donde se ha ampliando el campo de observación del segundo barrido. La primera imágen permite distinguir terrazas atómicas separadas por escalones de 0,15 nm de alto (un átomo). La presencia de zonas de topografía claramente diferenciables, en la segunda observación, dan cuenta daño producido por el recorrido previo de la sonda. El modo oscilante o “tapping” (Figura 16) elimina el problema de la fuerza friccional contactando la superficie en fo rma intermitente y oscilando con suficiente amplitud para evitar que la punta quede atrapada por la capa de contaminantes condensados alrededor de la sonda. La superficie de los materiales inorgánicos se contaminan más rápido que los poliméricos debido a su mayor energía superficial.

Figura 14: Esquema de un microscopio de fuerza atómica (AFM)

La resolución espacial depende de la geometría de la muestra. Se pueden obtener imágenes con resolución atómica a partir de muestras planas en aire o sumergidas en agua o etanol. Con muestras biológicas la resolución está determinada por la relación entre el tamaño de la punta y el objeto y por las fuerzas aplicables admisibles. La formación de imágenes de muestras sumergidas en líquidos permite reducir las fuerzas entre muestra y punta y si se usan medios salinos las moléculas presentan estructuras más cercanas a las que ocurren en los procesos celulares. Las primeras observaciones biológicas se centraron en ADN para lo cual la molécula se depositaba sobre superficies planas (a escala atómica) de mica (Figura 15b). Para que la sonda no desplazara las moléculas durante el barrido se realizaban tratamientos a la superficie de la mica para cambiar el signo de las cargas y aumentar su densidad superficial a los efectos de reforzar el enlace electrostático con el ADN (molécula polar). La resolución alta que brinda el AFM se contrapone con el escaso contenido de los datos que se pueden extraer, los cuales son fundamentalmente de naturaleza mecánica y física. Para ampliar las posibilidades de estos equipos se han desarrollado nuevos modos de análisis. La modificación química y bioquímica de las sondas ha posibilitado mediciones que tienen en cuenta la naturaleza química de los sustratos. De esta forma se han obtenido mapas de composición de materiales nanométricamente heterogéneos, han medido fuerzas de interacción de moléculas únicas entre biopolímeros y diferenciado zonas específicas de membranas celulares. La capacidad de medida de fuerzas de interacción entre el material de la sonda y la

muestra incluye repulsión estérica, electrostática, magnética, Van der Waals, puentes hidrógeno y fuerzas de adhesión moleculares localizadas.

a) b)

Figura 15: a) Silicio epitaxial (100), imagen AFM en modo contacto, primer barrido, 1 µm (izquierda); segundo barrido, 2 µm (derecha). b) Dos moléculas de ADN lineales superpuestas

(imagen SPM sobre mica con 155 nm de barrido).

Figura 16: Comparación de los distintos modos de barrido en AFM. a) y b) Distorsiones potenciales del modo de contacto. c) modo “tapping”.

La Figura 17 muestra las curvas típicas de fuerza obtenidas con la modalidad de “contacto mecánico” y de “molécula única”. El primer caso se emplea para medir propiedades superficiales importantes de naturaleza química, tales como por ejemplo, energía superficial, potencial cero y punto isoeléctrico. El segundo ensayo es muy utilizado en estudios de adhesión de moléculas sobre sustratos específicos, de interacción ligando-receptor, antígeno-anticuerpo y ADN-ADN, así como también el efecto de varios analitos tienen sobre la relación entre los pares antes mencionados. Por ejemplo se ha determinado una fuerza de 160 ± 20 pN para separar un complejo de una proteína avidina cuando se une con una molécula de vitamina B12 (biotina) mediante la técnica de recubrimiento de la sonda con avidina. Al lograr la adquisición de imágenes en 10 a 200 s se pueden observar procesos dinámicos rápidos tales como la formación de complejos moleculares (Ejemplo: ADN-polimerasa/ADN) o fenómenos más lentos como la división celular. Otra propiedad que se logra con la modificación química de la punta es la habilidad de extraer moléculas específicas de matrices heterogéneas. Se han removido proteínas de membranas celulares y secuencias de ADN de un cromosoma. La extracción del gen deseado fue verificado por la técnica de biología molecular. Si sumado al estiramiento estático de la molécula se le aplica una oscilación se puede determinar la mecánica compleja de la molécula (componentes elásticos y viscosos) para lo cual se debe registrar la frecuencia y la fase de la medición.

Las moléculas poliméricas o biológicas pueden sufrir distorsión o daño por la interacción con la sonda cuando se trabaja en modo contacto. Esto inconveniente ha sido superado al desarrollarse el modo alternativo oscilante o “tapping” donde se aplican fuerzas de menor magnitud. El brazo oscila cercano a la frecuencia de resonancia (10-100 KHz) con una maplitud de la sonda de decenas de nm, la cual se mantiene constante mediante el reposicionamiento de la muestra mediante la acción del piezoeléctrico. Dado que tapping es un modo dinámico se puede extraer información de la relación de fase entre la fuerza que mueve el brazo y la respuesta del mismo cuando contacta la muestra. El corrimiento de fase permite diferenciar entre regiones de diferentes propiedades químicas o mecánicas.

Figura 17: Curvas fuerza-distancia en los modos (A) contacto mecánico y (B) molécula única.

Muchos estudios se han focalizado en la determinación de interacciones entre células o células y componentes de la matriz extracelular. El conocimiento de estas interacciones es esencial en el área de inmunología e ingeniería de tejidos. f) Resonancia de plasmón (Surface plasmon resonance, SPR): La SPR es una técnica óptica que está ganando un amplio reconocimiento como una herramienta de valor para investigar las interacciones biológicas en superficies de biomateria les. Esta técnica ofrece un análisis en tiempo real de eventos superficiales dinámicos y puede de esta manera definir las velocidades de absorción y desorción de elementos en superficie y analizar diversos fenómenos de interacción. En conjunto, los métodos de microscopía de sonda de barrido, ATR-FTIR, elipsometría, y SPR permiten un estudio dinámico de eventos superficiales: mientras SPM permite visualizar cambios superficiales (absorción de proteínas, erosión, etc.). La ATR-FTIR con muchas limitaciones es capaz de estudiar cambios conformacionales, y la elipsometría espectral permite determinar espesores e índices de refracción de capas absorbidas. La resonancia de plasmón, puede dar rápidamente información de la velocidad y extensión de una adsorción, determinar propiedades dieléctricas, cinéticas de asociación/disociación, constantes de afinidad para una interacción ligando/ligado, etc. Lecturas sugeridas - Ratner B.D., Hoffman A.S., Schoen F.J. y Lemons J.E. Biomaterials Science: An Introduction to Materials in

Medicine. Academic Press, San Diego, CA, 1996. - Turi, EA. Thermal Characterization of Polymeric Materials. Academic Press, San Diego, CA, 1997. - Merrett, K., Cornelius, R.M., McClung, W.G., Unsworth, L.D., Sheardown, H. Surface analysis methods for

characterizing polymeric biomaterials. J. Biomater. Sci. Polym. Edn. 13 (6) 593-621 (2002). - Hirschmugl, C.J. Frontiers in infrared spectroscopy at surfaces and interfaces. Surf. Sci. 500, 577-604 (2002). - Barbosa, M.A., Campilho, A. Imaging Techniques in Biomaterials. Elsevier Science, B.V. Amsterdam (1994).