Métodos de estudio enparasitología y micología

Métodos directos o parasitológicos

Son los que permiten visualizar directamente parásitos u hongos en un material patológico, o aislarlos del mismo.

Los parásitos y hongos pueden ser vistos estudiando el material “en fresco” o mediante coloraciones u otros artificios.

Métodos directos o parasitológicos

Los materiales pueden ser tratados previamente, para concentrar y/o mejorar la visualización de parásitos y hongos en ellos.

Ejemplos: -Coproparasitario (incluye “limpieza” de la suspensión de materias fecales y enriquecimiento por centrifugados)-Tratamiento de expectoraciones con soluciones cáusticas (reblandece el mucus y “aclara” las preparaciones)

Métodos parasitológicos I

Examen en fresco: el material se coloca sobre una lámina portaobjetos, montado en algún medio líquido o no, cubierto con una laminilla, para su observación al microscopio.

Los líquidos de montaje (solución salina fisiológica, hidróxido de sodio o potasio 10-20%, lactofenol-azul algodón, lugol, glicerina tamponada) facilitan la observación microscópica evitando distorsiones de la luz, reblandeciendo el material y/o aumentando el contraste de los objetos buscados

Métodos parasitológicos II

Frotis coloreados:

Coloraciones panópticas: May-Grunwald-Giemsa, Giemsa, otras coloraciones hematológicas

Coloraciones específicas: Ziehl-Neelsen, Kinyoun (ácido- alcohol resistencia)Gomori, Methenamino plata (pared de los hongos)Tinción Tricrómica (protozoarios entéricos, microsporidios)Hematoxilina férrica (membrana, núcleos y otros

componentes de protozoarios)

Cortes histológicos:Hematoxilina-eosinaPASGomori, Giemsa, Kinyoun para cortes

Método parasitológicos III

Técnicas inmunológicas directas:

IFD – Inmunofluorescencia directa

Microscopio de fluorescencia

Conjugado: anti-Ac y Fluoresceína

Ac específicos

Material patológico

YYYY

YYYY ٭٭٭٭

O O O

YYYY ٭٭٭٭YYYY

Parásitofluorescente+–

(sin parásitos) (con parásitos)

También son métodos parasitológicos los que permiten poner en evidencia componentes del parásito (antígenos u otras moléculas, ácidos nucleicos, etc.), mediante diversas técnicas.

Métodos parasitológicos IV

Técnicas moleculares:PCR – Polymerase Chain Reaction

4- Identificación del conjunto de secuencias reproducidas, mediante electroforesis y cromatografía

2- Reconocimiento de una secuencia específica mediante un “primer”

1- ADN parasitario

3- Multiplicación (amplificación) de la secuencia específica mediante polimerización en cadena

~~~~~~~~~~~~~

~~~~~~~~~

Métodos parasitológicos V

Técnicas para identificación de antígenos:Aglutinación de Látex

2- Suspensión de partículas de látex, adsorbidas (cubiertas) con Ac específicos

Aglutinación+

(Presencia de Ag)

Ag

Ag

Ag

Ag

Ag

Ag

1- Suero de paciente, con Ag o no

Ag Ag Ag

Ag Ag

No Aglutinación(Ausencia de Ag)

Métodos parasitológicos VI

Técnicas de aislamiento por cultivo:

Medios generales-Sirven para el aislamiento primario de una variedad de agentes

- Pueden ser modificados con el agregado o cambio de algun componente para darle mayor especificidad

ejemplos: •Sabouraud, para hongos•NNN, para protozoarios hemoflagelados

Medios selectivos

-Sirven para el aislamiento de un agente o grupo de agentes determinados

-Tienen una formulación muy bien definida

ejemplos:DTM, para dermatofitosLIT: para tripanosomas

Métodos parasitológicos VII

Técnicas de aislamiento por inoculaciónde animales de experimentación:

Excepcional (aunque es necesario frente a determinados agentes de dificil identificación o aislamiento por otros medios; ej: Toxoplasma gondii en líquido amniótico)

Exige seguir rigurosas normas de bioética, bioseguridad y calidad operacional

Métodos indirectosinmunológicos

Son los que permiten suponer la presencia de parásitos u hongos infectando el organismo, mediante el estudio de la respuesta del hospedero (producción de Ac específicos, reacciones de hipersensibilidad tardía, producción de linfoquinas, etc.)

Métodos inmunológicos I

Técnicas de precipitación en gel de agar:

DD: Doble difusión“Arcos de precipitación”

donde se forman y concentran los

complejos Ag-Ac

AgarVidrio

pocillo

Ag Suero

Métodos inmunológicos II

Técnicas de aglutinación :

-Aglutinación directa:Suspensiones de parásitos enteros son enfrentadas a sueros de pacientes. Los Ac (Y) presentes aglutinan los parásitos, formando acúmulos consistentes.

-Aglutinación de partículas(látex, betonita, carbón,etc.):Suspensiones de partículas inertes, con su superficie cubiertas de Ag parasitarios, son enfrentadas a sueros de pacientes. Los Ac presentes aglutinan estas partículas, formando acúmulos consistentes

Y

YY

Y Y

Y

Y

Y Y

Y Y

YY

Métodos inmunológicos III

Técnicas de aglutinación :

HAI - hemaglutinación indirecta

2- Suspensión de GR con su superficie cubierta de Ag parasitario

3a- Positivo: los GR aglutinan por la presencia de Ac en el suero. La malla de GR aglutinados impide la sedimentación de los mismos

3b- Negativo: los GR no aglutinan por la ausencia de Ac en el suero y sedimentan en el fondo del recipiente.

Ac Ac

Ac Ac Ac

(Los GR se comportan como partículas inertes y no participan de la reacción Ag-Ac)

1. Suero de paciente con Ac o no

Ac Ac Ac

Ac Ac

Métodos inmunológicos IV

Técnicas de marcado de la reacción Ag-Ac:

IFI – Inmunofluorescencia indirecta1- Parásito o corte del mismo, sobre lámina portaobjetos

2- suero de paciente con Ac o no

3. Conjugado anti-Ig (IgG, IgM, otras Ig) con fluoresceína

4a. Positivo: si en el suero hay Ac, el parásito se observa verde fluorescente

4b- Negativo: si en el suero no hay Ac, el parásito no fluoresce

Ac Ac

Las sustancias fluorescentes, cuando sen excitadas por una luz de longitud de onda corta, emiten luz de longitud de onda mayor.

Pueden ser utilizadas otras sustancias fluorescentes (rhodamina, auramina, etc.).

En la técnica de Inmunoperoxidasa, la fluoresceína es sustituída por un sustrato enzimático cromogénico que puede ser observado en el microscopio común.

AcAc Ac

Ac

AcAc

AcAcAcAc

Métodos inmunológicos V

Técnicas de marcado de la reacción Ag-Ac:

ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay(y otras técnicas inmunoenzimáticas)

AgAgAgAg

Ag

1. Ag parasitariosadheridos a una base inerte (plásticos) Ac Ac

Ac Ac

AgAg AgAg Ag

AgAgAgAgAg

AcAc

AcAcAc

2- Suero de paciente con Ac o no

3- conjugado anti-Ac con enzima y luego, sustrato cromogénico AgAg

AgAg

Ag

AgAg

AgAg

Ag AcAcAcAc Ac

ΦΦ

Φ

4a- Positivo: contenido coloreado

ΦΦΦΦ

NOTA: La producción de color puede ser observada a simple vista o con la ayuda de un fotocolorímetro

4- Negativo: contenido incoloro

Métodos inmunológicos VI

Técnicas de marcado de la reacción Ag-Ac:

Quimioluminiscenciafotómetro

AgAgAgAg

Ag

1. Ag parasitariosadheridos a una base inerte (plásticos)

AgAg

AgAg

Ag AcAcAcAc Ac

ΦΦ

ΦAc Ac

Ac Ac ΦΦΦΦ

4a- Positivo: contenido produce luminiscenciaAgAgAg

AgAgAc

AcAcAc

Ac

AgAg AgAg Ag

2- Suero de paciente con Ac o no

3- conjugado anti-Ac con enzima y luego, sustrato luminiscente AgAg

AgAg

Ag

NOTA: La producción de luminiscencia es observada con la ayuda de un fotómetro o luminómetro

4- Negativo: contenido opaco

Métodos inmunológicos VII

El desarrollo de las técnicas de marcado de la reacción Ag-Ac, donde los valores finales puede ser leídos e interpretados mediante la utilización de equipos electrónicos (colorímetros, fluorómetros, fotómetros, etc.), ha posibilitado la automatización de los procedimientos y el análisis computacional de los resultados.

Esto facilita la padronización y reproducibilidad de los procesos, mayor precisión en la lectura y registro de resultados y una mejor cuantificación y valoración de los mismos. La automatización de todo el procedimiento disminuye los errores y permite un mejor control de calidad.

Métodos inmunológicos VIII

Los resultados de los estudios serológicos pueden se cualitativos (positivos o negativos) o cuantitativos. Los resultados cuantitativos pueden ser expresados como:

Títulos: máxima dilución del suero problema que arroja un resultado positivo (Ej: 1/16; 1/128; 1/2048)

Unidades predeterminadas: cuando el valor obtenido como resultado es comparado a un patrón predeterminado de densidad óptica, fluorescencia , luminiscencia o concentración conocida de Ac específicos, que expresa el “punto de corte” de la técnica (cutoff o valor límite que diferencia positivos y negativos) (Ej: UI/ml; Index Value; MIU/ml; OD; etc.)

Métodos inmunológicos IX

Los títulos o valores límites de cada técnica, son determinados con base en el comportamiento de las mismas frente a grandes conjuntos de sueros que expresan positividad, negatividad o resultados dudosos en la reacción.

Dos grandes conceptos definen el comportamiento de las técnicas serológicas: Sensibilidad y Especificidad

Desde el punto de vista inmunológico o experimental, la sensibilidadexpresa la capacidad de la técnica para detectar las menores concentraciones posibles de los anticuerpos (o antígenos) buscados.

La especificidad expresa la capacidad de esa técnica para diferenciar los anticuerpos específicos (o antígenos) buscados de otros presentes en el material en estudio.

Métodos inmunológicos X

Respecto al comportamiento de las técnicas cuando son utilizadas en poblaciones humanas, la sensibilidad expresa la capacidad de la misma para diagnosticar casos positivos en el conjunto de personas estudiadas (expresión de índole cuantitativa).

La especificidad expresa, por su parte, la capacidad de determinar resultados verdaderos (expresión de ídole cualitativa).

El comportamiento de una técnica en una población determinada, está signada no sólo por la presencia del fenómeno investigado (presencia de determinado agente o de la enfermedad producida por el mismo) sino también por otros fenómenos biológicos que pueden interferir en el procedimiento y en la interpretación de los resultados:

Presencia de otros agentes que estimulan la formación de Ac específicos e inespecíficos que pueden interferir con la técnica en cuestión

Fenómeno investigado

Ac naturales, reaginas factor reumatoideo y otras moléculas de acción inespecífica

Métodos de estudio

Cuidados particulares en cada una de las etapas de un estudio paraclínico

Etapa preanalítica: registro de datos, recolección, preparación y conservación de la muestra...

Etapa analítica: manejo de la muestra, bioseguridad, calidad operacional, control de calidad interno y externo...

Etapa postanalítica: registro, interpretación y validación de los resultados, expresión de los resultados, expresión de los valores de referencia...