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MÉTODOS HISTOLÓGICOS
GISELA GARCÍA CRESPO.Profª Titular
Facultad de Ciencias Veterinarias
Histo
Creado por Ysrael VillamarínDibujo: Jan Acevedo
• Los métodos o técnicas histológicas se puede definir como: la serie de procedimientos especiales a los que se somete el material que se va a estudiar bajo el microscopio (Histológicamente)
MÉTODOS HISTOLÓGICOS
METODOS HISTOLÓGICOS• DIRECTOS( En
vivo)• INDIRECTOS
(Postmorten)• COLORACIÓN
MÉTODOS DIRECTOS
• ESTUDIO DONDE SE EMPLEAN PROCEDIMINETOS QUE NO AFECTAN LA BIOLOGÍA CELULAR, O PERMITEN OBSERVAR LOS CAMBIOS QUE SUFRE ANTE DETERMINADOS PROCEDIMIENTOS.
METODOS INDIRECTOS
• PROCEDIMIENTOS QUE REQUIEREN MAYOR TIEMPO PARA PODERLOS EJECUTAR, A VECES REQUIEREN DE UNA FIJACIÓN PREVIA.
• SON PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTMORTEN.
Entre estos procedimientos contamos...
METODOS HISTOLÓGICOS
• CULTIVOS CELULARESSe cultivan células fuera del
organismo que les dio origen.Requiere un medio apropiado:
aséptico (sin agentes nocivos), temperatura, pH, humedad, nutrientes, etc.
Ej: HeLa, linfocitos, etc.
CULTIVOS CELULARES
CULTIVOS CELULARES
CULTIVOS CELULARES
METODOS HISTOLÓGICOS
• AUTORRADIOGRAFIA:Técnica por la cual un objeto radiactivo produce una imagen de sí mismo sobre una película fotográfica. La imagen se denomina autorradiografía
Autorradiografía
METODOS HISTOLÓGICOS• CENTRIFUGACIÓN -
ULTRACENTRIFUGACIÓNSe obtienen células o componentes
subcelulares específicos de acuerdo a su gradiente de sedimentación Ej.: glóbulos rojos, glóbulos blancos; mitocondrias, retículo endoplasmático, etc.
METODOS HISTOLÓGICOS
• INJERTOS O TRANSPLANTES
– Homo-injertos: se realizan en la
misma especie• Auto-transplantes ( el mismo individuo)• Alo-injertos (diferentes individuos)
– Isotransplante
Homotransplante
Alotransplante
METODOS HISTOLÓGICOS
– Hetero-injertos o xeno-injertos: se
efectúan entre especies diferentes
Xenotransplante o heterotransplante
Xenotransplante o heterotransplante
METODOS HISTOLÓGICOS
• Disociación
• Escisiones
• Iluminación especial
METODOS HISTOLÓGICOS• Disociación
• Escisiones
METODOS HISTOLÓGICOS
• Maceracion
es
• Inyecciones
METODOS HISTOLÓGICOS
• Reconstrucciones
METODOS HISTOLÓGICOS
• Fotografías• Videos• Dibujos
METODOS HISTOLÓGICOS
• DIRECTOS• INDIRECTOS• COLORACIÓN
METODO DE COLORACIÓN
• SE BUSCA CONTRASTAR COMPONENTES CELULARES O EXTRACELULARES A TRAVÉS DE SUSTANCIAS CROMÓGENAS.
TEORÍAS DE LA COLORACIÓN
FÍSICAQUÍMICAFÍSICO-QUÍMICA
CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES
CLASIFICACIÓN POR SU ORIGEN
• NATURALES• ARTIFICIALES
CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES
CLASIFICACIÓN POR SU ORIGEN
• NATURALES
COLORANTES
NATURALESVEGETALES
• hematoxilina, azafrán, orceína.
COLORANTES
ANIMALES• carmín
(cochinilla)
COLORANTES
ARTIFICIALESPIGMENTOS
• rojo rutenio, verde brillante, azul de Prusia.
• Derivados de la anilina
• (destilación de la hulla)
Colorantes. Clasificación química
• Colorantes Básicos
• Colorantes Ácidos
• Colorantes Neutros
...
Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra• Fijación• Repicado• Inclusión de la muestra• Corte al micrótomo• Coloración• Montaje
Fases o procesos:
Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra– Identificación
• Especie• Raza• Número• Etc.
Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra– Tamaño
Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra– Tamaño: 0,5 a 1
cm
FIJACIÓN
PRINCIPIO DE LA FIJACIÓNCARACTERÍSTICAS DE UN BUEN FIJADOR
FIJACIÓNFormol al 10 %
Inmersión o perfusión
Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra– Identificación
Repicar la muestra
Procesamiento Histológico
• TOMA DE LA MUESTRA (0,5-1 CM)• FIJACIÓN: 40-60 VECES EL VOLUMEN• LAVADO EN AGUA CORRIENTE
¿cómo cortar tan delgado?
¿ 5 micrómetros?
¡¡¡ parafina !!! ... Pero y el agua?
¡¡¡ No son miscibles!!!
Procesamiento Histológico
• DESHIDRATACIÓN EN ALCOHOLES CRECIENTES (50º- 100º)
• ACLARAMIENTO EN XILOL• INCLUSIÓN EN PARAFINA
• CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES
Inclusión en parafina
• Procesamiento de la muestra– Lavado– Deshidratación– Aclaramiento
(xilol)– Inclusión en
parafina
Inclusión
• Confección del bloque– Identificación
Inclusión
• Confección del bloque
Corte al microtomo
• 5 micrómetros– Deslizamiento– Rotación
• 5 micrómetros– Deslizamiento– Rotación
MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO
Procesamiento Histológico
Microtomos de deslizamiento
Corte al microtomo
• 5 micrómetros– Microtomos de rotación
Procesamiento Histológico
• Recolección de los cortes– Pescado (baño
María)
Procesamiento Histológico
• Recolección de los cortes• Desparafinación
– Estufa– Xilol
¿ y el agua ? ...
• Hidratación(alcoholes decrecientes)
• Coloración
COLORACIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA
COLORACIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA
• Coloración– Desparafinación (xilol)– Hidratación– Coloración Hematoxilina– Coloración Eosina
HEMATOXILINA & EOSINARESUMEN:• CORTE AL MICROTOMO• RECOLECCIÓN (BAÑO DE MARÍA)• DESPARAFINACIÓN (XILOL)• HIDRATACIÓN ALCOHOLES DECRECIENTES
(100º A-AGUA)• COLORACION HEMATOXILINA( núcleo-
ácidos)
HEMATOXILINA & EOSINA
• LAVADO AGUA CORRIENTE• COLORACIÓN EOSINA• LAVADO CON AGUA• DESHIDRATACIÓN• ACLARAMIENTO• MONTAJE
Tipos de coloración ( acorde color producido )
Tipos de coloración ( acorde color producido )
• Ortocromática
• METACROMÁTICA
• Impregnación
Tipos de coloración ( acorde color producido )
• Retrógrada
• Progresiva
• VITAL (in vivo, in vitro)
• Histoquímica
MÉTODOS HISTOQUÍMICOS
Para carbohidratos: PAS, PAS-D
Lípidos.: SUDÁN, ACEITE ROJO
Ácidos nucléicos: FEULGEN
Pigmentos y minerales: VON KOSSA (Ca.)
EnzimaS : FOSFATASA (alcalina , ácida), ESTERASAS
MÉTODOS HISTOQUÍMICOS
COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS TEJIDOS
MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOSENZIMAS (P-AP), FLUORESCENCIA
OTRAS COLORACIONES
• PARA TEJIDO CONJUNTIVO• FIBRAS RETICULARES• IMPREGNACIONES ARGÉNTICAS Y
ÁUREAS• CELULAS CROMAFINES• HONGOS• BACTERIAS
Coloración H & E
COLORACIÓN H & E
HISTOQUÍMICA: Azul Alciano
HISTOQUÍMICA: PAS
COLORACIONES ESPECIALES: TRICRÓMICAS
COLORACIÓN FIBRAS ELÁSTICAS
FIBRAS ELÁSTICAS
IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA
METACROMASIA: AZUL DE TOLUIDINA
TRICRÓMICA
CME “DR. HUMBERTO FERNÁNDEZ MORÁN”
PANTALLA FLUORESCENTE
RESULTADO
Transmisión Barrido
GRACIAS POR SU ATENCIÓN