PRACTICA N° 1 ESTERILIZACIÓN, MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRAS Y

AISLAMIENTOS

Rivera Andrés Felipe 99070715801; Martínez Erlis Yadit 1045137129; Suarez Angie

Natalia 1019086781; Barrera Lilian Yenifer 1094243483; Sandoval Isney Valeria

97081608931

Departamento De Microbiología, Facultad De Ciencias Básicas, Universidad De Pamplona

(Km 1 Vía Bucaramanga, Pamplona, Norte De Santander)

RESUMEN

El objetivo de esta práctica fue aplicar los métodos utilizados para la esterilización de

medios de cultivo, materiales, y accesorios utilizados en el laboratorio, preparar medios de

cultivo siguiendo los lineamientos básicos de asepsia y estableciendo el papel de cada

componente del medio en el cubrimiento de las diferentes necesidades nutricionales de

los microorganismos y aplicar y distinguir las técnicas y métodos de siembra en

microbiología. Para la esterilización se usó papel kraff enrollando las pipetas y cubriendo

totalmente las cajas de petri en conjunto, se introdujeron en un horno a 180°c, luego de la

esterilización se hicieron los cálculos necesarios para la preparación de medios de cultivo

(Agar, caldo) teniendo en cuenta el volumen necesario para la preparación (20ml cajas,

10ml tubos), teniendo los medios de cultivo preparados se hizo siembra por agotamiento,

masiva, punción en caja, por estría en tubo inclinado, picadura de tubo y siembra mixta en

tubo, se usó E. coli, E. coli + Salmonella, Pseudonoma spp, se obtuvieron colonias

separadas, grandes cantidades de células y se observo el crecimiento en los tubos solo

por los lugares donde pasó el asa, el tubos líquidos se mostro un cambio de translucido a

turbio, prueba positiva de crecimiento de microorganismos.

INTRODUCCION

Para trabajar en un laboratorio de

microbiología se requieren técnicas

específicas y diferentes a las que se

utilizan en otras disciplinas. Es

imprescindible trabajar en condiciones

asépticas: el material e instrumental que

se va a utilizar, así como los medios de

cultivo, deben ser sometidos a algún

procedimiento de esterilización,

eliminándose de ellos cualquier posible

organismo. Tienen importantísima

aplicación los procedimientos, técnicas y

productos que suprimen o disminuyen la

vitalidad de los microorganismos

patógenos. No existe un procedimiento

de esterilización y desinfección aplicable

a todos los casos. El método de

esterilización será seleccionado para

cada caso teniendo en cuenta la

naturaleza física del objeto y la

naturaleza biológica del contaminante.

Como rara vez se conoce la población de

microorganismos sobre un objeto que

debe ser tratado, debemos presuponer

que se encuentran presentes las formas

microbianas más resistentes: las

endosporas. El método de esterilización

a emplearse debe ser previamente

valorado. Actualmente existen valores

tabulados de tiempo de exposición,

temperatura y concentración de

principios activos para los métodos de

esterilización más usados que nos

permiten elegir el más adecuado para

cada caso. En la elección debe tenerse

en cuenta también el uso posterior que le

será dado (o no) al objeto a esterilizar.

CALOR HÚMEDO: la desnaturalización

y coagulación se facilita en presencia de

agua pues se rompen los puentes de

hidrógeno entre los grupos C = O----HN

que constituye la estructura secundaria y

se agrega (también mediante puente de

hidrógeno) una molécula de agua a cada

extremo de esas uniones rotas.

CALOR SECO: Deshidrata las bacterias,

virus, etc. y facilita la coagulación o

desnaturalización de las proteínas.

RADIACIONES: Luz ultravioleta:

solamente para aire o para superficie o

capas muy delgadas de líquidos pues no

penetra. Se usa para consultorios, salas,

laboratorios, cámaras, quirófanos. No

atraviesan el vidrio. (1)

MEDIOS DE CULTIVO: Los

microorganismos en general pueden vivir

y multiplicarse sobre substratos nutritivos

preparados en el laboratorio,

denominados medios de cultivo. Los

Medios de Cultivo son preparados

estériles que contienen sustancias

necesarias para el desarrollo de los

microorganismos.

Todos los microorganismos requieren

agua, carbono, nitrógeno, hidrógeno,

calcio, fósforo y hierro como elementos

vitales. Los microorganismos exigentes

requieren además factores de

crecimiento como aminoácidos,

vitaminas, purinas y otras sustancias que

no son capaces de sintetizar.

CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE

CULTIVO

1. Contener sustancias nutritivas

necesarias para el desarrollo de los

microorganismos (tales como

aminoácidos, carbohidratos,

polialcoholes, vitaminas, minerales).

2. Tener un pH que permita un desarrollo

óptimo, por lo general las bacterias

patógenos necesitan un pH neutro o

ligeramente alcalino (7.0 – 7.4), en

cambio las levaduras y hongos requieren

un pH ácido (5.0).

3. Estar previamente esterilizados o

preparados en condiciones asépticas.

4. Estar protegidos de la contaminación

ambiental por tapones de algodón cardé,

tapones de goma, tapas metálicas o

roscas

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE

CULTIVO

1. Medios Líquidos: se utilizan

preferentemente para favorecer el

desarrollo bacteriano de células

estresadas. En determinadas ocasiones

no se pueden sustituir por los medios

sólidos, por ejemplo en la síntesis de

exotoxinas, pigmentos, enzimas, etc. -

Ejemplo: Agua peptonada, Caldo común,

Caldo Cerebro Corazón, Caldo

Saboureaud, etc.

2. Medios Sólidos: se utilizan para

obtener bacterias aisladas por la

formación de colonias sobre la superficie

del medio de cultivo y para el estudio de

la morfología de las colonias, lo que no

permiten los medios líquidos. Se

diferencian porque tienen una sustancia

de sostén, que puede ser agar-agar. -

Ejemplo: Agar Común, Agar SS, Agar

Cerebro Corazón, Agar Saboureaud, etc.

3. Medios Semisólidos: se utilizan para

estudiar la motilidad de las bacterias.

Tienen un menor porcentaje de Agar, por

lo que no solidifican totalmente a la

temperatura ambiente. - Ejemplo: Agar

MIO, Agar SIM. (2)

SIEMBRAS: Sembrar o inocular es

introducir artificialmente una porción de

muestra (inóculo) en un medio adecuado,

con el fin de iniciar un cultivo microbiano,

para su desarrollo y multiplicación. Una

vez sembrado, el medio de cultivo se

incuba a una temperatura adecuada para

el crecimiento.

Siembra por agotamiento: Con éste

procedimiento se puede conseguir una

buena separación de las colonias y

aislarlas fácilmente. Para ello se funde el

medio de cultivo, se vuelca en caja de

Petri y se deja solidificar. Con el asa

previamente esterilizada se toma

material de un cultivo heterogéneo y se

descarga sobre la superficie del medio

formando estrías.

Siembra por punción: Con un asa

bacteriológica se toma el material que se

quiere sembrar y se lo introduce en el

tubo, con medio semisólido. Introducir la

aguja hasta el fondo, formando un canal

de punción, trayecto por el cual la

retiraremos luego.

Siembra por estrías en superficie: Se

siembra el material en la superficie del

Agar inclinado en un tubo de ensayo, allí

se extiende por toda la superficie con el

asa bacteriológica, previamente esteriliza

da ycargada con el material a sembrar, h

aciendo estrías no muy amplias, pero

tampoco muy estrechas. Se inicia por la

partemás profunda de la superficie inclin

ada y se termina la estría en la parte más

cerca de la boca del tubo.

Siembra masiva: con un asa estéril

introduciéndola en el tubo que contiene

la muestra a sembrar, luego frote toda la

superficie del Agar. Le evaluación del

crecimiento en las placas de Agar se

hace a través de la observación de

colonias agrupadas en grandes

cantidades.

Siembra mixta en tubo: Se realiza en

forma combinada en picadura hasta el

fondo del tubo deslizando el asa por la

superficie marcando estrías.

Siembra en medio liquido en tubo: se

toma el inoculo y se lleva al fondo del

tubo realizando movimientos circulares

en todo el tubo para esparcir el

microorganismo. (3)

MATERIALES Y METODOS

En la práctica de esterilización se uso

dos fiolas (pequeña, grande) 6 pipetas, 6

cajas de petri, a las fiolas se les elaboro

un tapón con algodón, gasa, y papel

aluminio enrollando esto con cinta de

enmascarar en el pico de la fiola, las

cajas de petri se envolvieron en conjunto

con papel kraff usando la cinta de

enmascarar, esto se llevo a calor

húmedo en el horno a 180°c por unas

horas. También se realizaron cálculos

para el uso de hipoclorito y sus distintas

aplicaciones con la esta fórmula:

V1C2=V2C2

Para la preparación de medios de cultivo

se realizaron los cálculos respectivos

teniendo en cuenta la información de los

medios, usando el autoclave para la

sedimentación y homogenización, esta

se uso por unas horas. Luego se sirvió

en las cajas de petri esperando unos

minutos para que se enfriara y así poder

sembrar en ellos.

Se hizo siembra por agotamiento y

siembra masiva usando el asa redonda,

se hizo siembra por punción con asa

bacteriológica, se hizo siembra en Agar

inclinado en tubo, siembra mixta, siembra

por picadura de tubo y siembra en medio

liquido, todas estas siembras se

elaboraron con el uso del mechero,

esterilizando el asa al rojo vivo,

flameando la boca del tubo antes y

después de tomar el inoculo, las cepas

que se usaron para cada siembra fueron

tres tubos cada uno contenido

individualmente con E. coli, E.

coli+Salmonella y Pseudonomas.

Cada estudiante hizo una siembra por

agotamiento y una siembra masiva a

partir del tubo E. coli.

Se hizo una siembra por grupo sobre

Agar (centrimide) realizando luna y

estrellas a partir del tubo Pseudonomas

spp.

Se inoculo el nombre a partir del tubo E.

coli, sobre Agar (EMB)

Se realizo una siembra por agotamiento

sobre Agar (Rambach) a partir del tubo

E. coli+Salmonella.

Se inoculo E. coli en un tubo con caldo

nutritivo,

Se hizo punción de E. coli en un tubo de

Agar nutritivo recto.

Se hizo siembra mixta de E. Coli en un

tubo de Agar inclinado.

Se hizo punción con E. coli en un tubo

semisólido.

Se inoculo E. coli en un tubo con caldo

tioglicolato.

Se hizo siembra de hongos en caja

(OGY) y caja (SABOURAUD), haciendo

picadura con asa bacteriológica llevando

el inoculo desde un pan hacia la caja de

petri, con punción profunda.

RESULTADOS Y ANALISIS

SIEMBRAS Y AISLAMIENTOS

AGAR NUTRITIVO

En la siembra masiva se obtuvieron

colonias de células aisladas, y en la

siembra masiva se logro obtener grandes

cantidades de células.

ANÁLISIS:

Estas siembras fueron posibles ya que

fueron ellas en medios de cultivo (Agar

Nutritivo) y este medio se usa para todo

tipo de bacterias ya que permanece

sólido incluso a relativamente altas

temperaturas. Además, el crecimiento

bacteriano en este Agar lo hace en la

superficie, por lo que se distinguen mejor

las colonias pequeñas.

SIEMBRA MASIVA S. AISLAMIENTO

AGAR EMB

En esta siembra se obtuvo lo que se

queria ya que el microorganismo tenia

que crecer solo por donde el asa pasara

y asi fue dando como resultado un color

negro platinado.

ANÁLISIS:

Este crecimiento se dio ya queeste

medio es utilizado para el aislamiento

selectivo de bacilos Gram negativos de

rápido desarrollo y escasas exigencias

nutricionales como el E. coli

demostrandolo en el resultado de sus

colonias, verdosas con brillo metalico y

centro negro azulado.

AGAR RAMBACH

En esta siembra se dieron colonias

naranjas y azules como se queria lograr,

se lograron obtener colonias aisltadas.

ANÁLISIS:

Esta siembra obtuvo colonias de

diferente color ya que se usó E.

coli+Salmonella y este tipo de medio de

cultivo es cromogénico lo que dice que

su funcion es detectar y aislar

Salmonella spp, siendo asi las colonias

oscuras el E. coli y las claras la

Salmonella.

AGAR CENTRIMIDE

En la siembra en el agar centrimide de

lograron observar las figuras hechas,

usando la lampara de luz azul dando

como resultado un pasa de luz

fluorescente.

ANÁLISIS:

este crecimiento selectivo se dio ya que

este medio de cultivo aporta al desarrollo

de Pseudomonas y estimula la formación

de pigmentos. Es éste un medio hay

peptona de gelatina que aporta los

nutrientes para el desarrollo microbiano.

el cloruro de magnesio y el sulfato de

potasio promueven la formación de

piocianina, pioverdina, piomelanina y

fluoresceína, por eso es que esta

siembra es fluorescente.

TUBOS SOLIDOS, SEMISOLIDOS Y

LIQUIDOS.

S. AGOTAMIENTO

FIGURA LUNA Y ESTRELLAS

En los tubos en los cuales se hizo la

siembra de E. coli, se pudo observar un

excelente resultado, se vio el cambio de

los tubos translucidos a turbios y el

crecimiento de microorganismos por

donde se paso el asa en los tubos con

AN.

ANÁLISIS:

- En los tubos de caldo glicolato se

dieron estos tipos de crecimiento

ya que este medio recomendado

para usar en ensayos de control

de esterilidad, también se usa por

su capacidad de favorecer el

desarrollo de una gran variedad

de microorganismos aerobios y

anaerobios.

- (Agar Nutritivo) y este medio se

usa para todo tipo de bacterias ya

que permanece sólido incluso a

relativamente altas temperaturas.

Además, el crecimiento

bacteriano en este Agar lo hace

en la superficie, por lo que se

distinguen mejor

las colonias pequeñas.

CONCLUSIONES

se ejecutaron siembras en caja

de petri masivas y por

agotamiento, obteniendose

buenos resultados ya que estos

medios de cultivo son completos

en su medio constitutivo y aporta

los nutrientes necesarios de

cualquier bacteria.

Se lograron siembras en tubos

por las tecnicas de picadura,

estría y mixta. Donde se

observaron creciemientos pero

tambien algunas inconsistencias

por aspectos fisicos abversos

como la humedad o vapor de los

tubos que impidieron la

perfeccion.

Se aplicaron y distinguieron las

diferente tecnicas y metodos de

siembra empleados en

microbiologia.

Algunas de las siembras por

agotamiento no se obtuvieron

colonias aisladas ya que interfirio,

el vapo y agua de las cajas y

algunas contaminaciones por falta

de uso de las tecnicas

adecuadas, como el trabajo cerca

al mechero y el manejo correcto

de las cajas de petri.

BIBLIOGRAFÍA

(1)https://es.wikipedia.org/wiki

/Esterilizaci%C3%B3n_(micro

biolog%C3%ADa)

(esterilización) citado

19/09/2015

(2)https://libroslaboratorio.files

.wordpress.com/2012/09/medi

os-de-cultivo-en-un-

laboratorio-de-

microbiologc3ada.pdf

(medios de cultivo) citado

19/09/2015

(3)https://conalepfelixtovar.wo

rdpress.com/2012/09/26/tecni

cas-y-metodos-de-

aislamiento-y-seleccion-de-

microorganismos/ (siembras

y aislamientos) citado

19/09/2015