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Microscopia
Tamaño celularLas células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son
de pequeño tamaño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los
microscopios para su visualización. Por lo general el poder resolutivo del ojo
humano es de 0.2mm (200 µm), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo
humano es de dos líneas separadas 1mm de distancia; si hay dos líneas a 200 µm
de distancia, veremos una sola línea. Los microscopios se utilizan para mejorar la
resolución.
Tamaño celularLa invención del microscopio en el siglo XVII posibilitó la serie de descubrimientos
posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio óptico
simple, examinó un corte de corteza, encontró que esta estaba compuesta por una
masa de diminutas cámaras, que llamó “células”, en realidad sólo vio las paredes
celulares, ya que este tejido está muerto a la madurez y las células ya no tienen
contenido. Mas tarde, Hooke y algunos de sus contemporáneos observaron
células vivas.
Microscopio óptico
El tipo de microscopio más utilizado es
el microscopio óptico, que se sirve de
la luz visible para crear una imagen
aumentada del objeto. El microscopio
óptico más simple es la lente convexa
doble con una distancia focal corta.
Estas lentes pueden aumentar un
objeto hasta 15 veces. Por lo general
se utilizan microscopios
compuestos, que disponen de varias
lentes con las que se consiguen
aumentos mayores. Algunos
microscopios ópticos pueden aumentar
un objeto por encima de las 2.000
veces.
Microscopio óptico
El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y
el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo
está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del
objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de
forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se
mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen
real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales
de los dos sistemas de lentes.
El equipamiento adicional de un
microscopio consta de un armazón con
un soporte que sostiene el material
examinado y de un mecanismo que
permite acercar y alejar el tubo para
enfocar la muestra. Los especímenes o
muestras que se examinan con un
microscopio son transparentes y se
observan con una luz que los atraviesa, y
se suelen colocar sobre un rectángulo
fino de vidrio. El soporte tiene un orificio
por el que pasa la luz. Bajo el soporte se
encuentra un espejo que refleja la luz
para que atraviese el espécimen. El
microscopio puede contar con una fuente
de luz eléctrica que dirige la luz a través
de la muestra.Los Microscopios
Ópticos actuales tiene
un poder resolutivo de
0,2 µm, unas mil veces
la del ojo humano.
Sistema Mecánico
1. Pie
2. Vastgo o columna
3. Tornillos de ajuste
macrométrico
4. Micrométrico
5. Tubo
6. Platina
7. Subplatina
Sistema Óptico
1. De Observación Ocular
2. Objetivo
3. De iluminación
condensador
4. Espejo
5. Fuente de luz
Sistema mecánicoEste sistema sostiene al sistema óptico y aloja los
elementos necesarios para la iluminación y
enfoque del preparado.
Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato.
Columna: soporta la platina, tubo y tornillos de
ajuste macro y micrométrico.
Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del
tubo o la platina en sentido vertical, lo que
permite el enfoque.
Pie y Tornillo de ajuste
Tubo: en su extremo superior se
halla el ocular, y en el inferior el
objetivo. Se trata de un cilindro
metálico cuyo interior se
encuentra pintado de negro, lo
que evita la reflexión de la luz.
Normalmente tiene una longitud
de 170 mm.
Platina: es una plataforma
horizontal sobre la cual se
coloca y sujeta el preparado a
observar, tiene un orificio
central que permite el paso de
la luz y un vernier que posibilita
la relocalización de los detalles
de interés.
Subplatina: sostiene al
condensador y se ubica por
debajo de la platina.
SISTEMA ÓPTICOSe compone de un sistema óptico de observación y un sistema óptico de
iluminación; el primero consta de:
Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy
cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se
denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos a seco (no hay
ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u
objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una
sustancia cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio).
CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS:
ESCALA DE REPRODUCCIÓN: relación lineal que existe entre el tamaño
del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc.
PODER DEFINIDOR: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de
contornos nítidos.
LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la menor distancia que debe existir entre dos
objetos para que puedan visualizarse por separado.
CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS:
PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de mostrar la
imagen en sus detalles más finos. Está en relación inversa
con el límite de resolución.
PODER DE PENETRACIÓN: es la propiedad de permitir la
observación simultánea de varios planos del preparado. Es
inversamente proporcional a la escala de reproducción o
aumento.
DISTANCIA FRONTAL: es la distancia de la lente frontal al
preparado colocado en la platina, cuando está enfocado.
Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del
objetivo.
AUMENTO TOTAL: Debemos notar que el ocular también
tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen
que observamos es el producto entre el aumento del objetivo
y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya
escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un
aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 =
400.
Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una
lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior
lente colectora.
El sistema óptico de iluminación consta de:
Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se
encuentra en la platina. Debajo de él se encuentra el diafragma iris que
regula la cantidad de luz que llega al condensador.
Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte
inferior del aparato, en caso de no poseerla debe ubicarse
una fuente de luz externa (lámpara incandescente común)
aproximadamente a 30 cm. del espejo.
1. Imagen.
Se debe tomar en consideración que la imagen de un microscopio óptico se
encuentra siempre “cabeza abajo” y si se mueve la preparación hacia un lado
se observa que se desplaza en sentido opuesto, estas características se
encuentran siempre presentes en un microscopio óptico y debemos
acostumbrarnos hasta encontrarlo normal.
Consideraciones
2. Enfoque.
El enfoque de una preparación debe iniciarse
siempre con el objetivo de menor aumento (lupa o
10X) ya que estos quedan siempre mas alejados de
la platina; se debe subir la preparación con el tornillo
micrométrico hasta el tope siempre mirando por un
lado del microscopio para evitar que choque el
objetivo con la preparación, después mirando a
través del ocular se empieza a bajar lentamente la
platina hasta localizar el foco, es decir donde la
preparación se observa nítidamente.
La mayor parte de los microscopios actuales están
pre focalizados, lo que indica que al quedar en
foco la lupa, los demás objetivos quedaran
también enfocados, y solo se requiere de un
pequeño ajuste del tornillo micrométrico para ver
nítidamente la imagen.
Consideraciones
3. Empleo del objetivo de inmersión en
aceite (x100).
Se deben utilizar preparaciones teñidas
completamente secas. Para esto se pone
una pequeña gota de aceite de inmersión
sobre la porción que se va a
examinar. Preferentemente se deben utilizar
aceites sintéticos que no se secan, en vez de
aceite de madera de cedro que se seca
rápidamente.
Consideraciones
4. Determinación de la posición de los
objetos observados.
El círculo luminoso que se observa a
través del ocular se denomina campo
microscópico y los objetos que se
observan en el se pueden localizar en
relación con las manecillas del reloj.
5. Inversión de las imágenes.
Las imágenes son invertidas por los
lentes. De esta manera los objetos que
aparecen en el fondo del campo
microscópico se encuentran realmente
en la parte mas alta y los objetos que se
encuentran en el lado izquierdo del
campo microscópico se encuentran
realmente en el lado derecho.
Consideraciones
6. Preparación de la muestra.
Ya que los microorganismos son transparentes es
difícil distinguirlos con este tipo de microscopía y es
por lo que se suelen teñir.
7. Observación microscópica
Para observar una muestra al microscopio óptico
podemos recurrirá a:
- Preparación húmeda. Se realiza colocando una
gota de la suspensión de microorganismos entre un
porta y un cubreobjetos. Se observa directamente.
- Preparación fijada. Se coloca una suspensión
homogénea de microorganismos en una gota de
agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o
agentes químicos) y después se tiñen mediante
diferentes técnicas. Estas preparaciones se
observan sin cubreobjetos y habitualmente, con
objetivos de inmersión
Consideraciones
Son técnicas que permiten observar
microorganismos en función de la capacidad de los
mismos para retener (o no) determinadas
sustancias colorantes, lo que depende de la carga
de la célula y del colorante.
Tinciones
Estos colorantes pueden ser de distintos
tipos:
-Catiónicos. Son sustancias que tienen
carga positiva. Penetran en el interior de las
células y las tiñen. Ejemplos: Azul de
metileno, Cristal violeta, Safranina.
- Aniónicos. Con carga negativa. No
penetran en el interior celular, de modo que
no tiñen las células, sino el entorno. En este
caso se habla de tinción negativa. Ejemplos:
Eosina, Nigrosina.
-Liposolubles. Se mezclan con los lípidos
celulares y los tiñen.
Ejemplo: Negro sudán.
Tinciones
TincionesPor otro lado las tinciones pueden
realizarse siguiendo distintos métodos.
- Simples. Utilizan un solo colorante. Se
basan en el hecho de que las células
tienen una composición química diferente
a la de su entorno, de modo que ambos
se comportan de forma diferente frente a
un colorante. El colorante tiñe las células
(Azul de metileno, Safranina) o no
(Nigrosina).
Tinciones
- Diferenciales. Se basan en el hecho
de que distintos tipos de células
tienen distinta composición química, y
por lo tanto reaccionan de forma
diferente frente a una tinción, lo que
permite clasificar los
microorganismos en diferentes
grupos, según su capacidad de
tinción. En este apartado están dos
tinciones de importancia taxonómica
y médica: la tinción de Gram y la de
ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-
Neelsen). Estas tinciones utilizan más
de un colorante.
Tinciones
- Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas
estructuras celulares tienen distinta composición
química, de modo que se tiñen selectivamente con
ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de
paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos.
Pueden utilizarse uno o más colorantes.
Existen distintas variantes de observación en microscopía óptica
Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera
Microscopía en contraste de
fase: se usa principalmente
para aumentar el contraste
entre las partes claras y
oscuras de las células sin
colorear. Es ideal para
especímenes delgados, o
células aisladas. El microscopio
de fase ilumina el espécimen
con un cono hueco de
luz, como en el microscopio en
campo oscuro.
Sin embargo en el microscopio de
fase el cono de luz es más
estrecho y entra en el campo de
visión del objetivo, que contiene un
dispositivo en forma de anillo que
reduce la intensidad de la luz y
provoca un cambio de fase de un
cuarto de la longitud de onda. Este
tipo de iluminación provoca
variaciones minúsculas en el
índice de refracción de un
espécimen
transparente, haciéndolo visible.
Este tipo de microscopio es muy
útil a la hora de examinar tejidos
vivos, por lo que se utiliza con
frecuencia en biología y medicina
Aplicaciones
Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de
fases, estriba en que permite observar las células en acción y estudiar
los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migración
celular. Puesto que muchos movimientos son demasiado lentos para ser
observados a tiempo real, normalmente resulta útil hacer películas o
vídeos por el sistema de aceleración de movimiento
(microcinematografía).
AplicacionesEsta técnica microscópica se usa para medir índice de refracción y
concentración de sólidos de las estructuras celulares utilizando un
método de refractometría por inmersión, así se sumergen las células en
una solución isotónica cuyo índice de refracción puede variarse.
Esta refractometría se ha empleado para ser medidos en procesos como
la división celular y el desarrollo de esporas fúngicas. Igualmente es útil
para determinar masa seca y espesor de las estructuras celulares.
Microscopía de fluorescenciaConsta de una fuente de luz (lámpara de mercurio o halógena) la cual debe emitir la mayor
cantidad de luz ultravioleta , el microscopio y un sistema de filtros, tiene por objeto permitir el
paso de ondas de luz con longitud en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado
exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
FuncionamientoLa luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que
solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es
reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las
moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una
longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte
pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz
residual con la frecuencia de la radiación de excitación.
El Microscopio confocal:
Es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas:
- Un diafragma de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado
Pinhole de Excitación, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos
superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y
resolución de la imagen; y
-Un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del
fotodetector, denominado Pinhole de Emisión
El Microscopio electrónico:
La potencia amplificadora de un
microscopio óptico está limitada por la
longitud de onda de la luz visible. El
microscopio electrónico utiliza electrones
para iluminar un objeto. Dado que los
electrones tienen una longitud de onda
mucho menor que la de la luz pueden
mostrar estructuras mucho más
pequeñas. La longitud de onda más corta
de la luz visible es de alrededor de 4.000
ángstroms (1 ángstrom es 0,0000000001
metros). La longitud de onda de los
electrones que se utilizan en los
microscopios electrónicos es de
alrededor de 0,5 ángstroms.
Todos los microscopios electrónicos
cuentan con varios elementos
básicos. Disponen de un cañón de
electrones que emite los electrones
que chocan contra el
espécimen, creando una imagen
aumentada. Se utilizan lentes
magnéticas para crear campos que
dirigen y enfocan el haz de
electrones, ya que las lentes
convencionales utilizadas en los
microscopios ópticos no funcionan
con los electrones.
El sistema de vacío es una parte
relevante del microscopio electrónico.
Los electrones pueden ser desviados
por las moléculas del aire, de forma
que tiene que hacerse un vacío casi
total en el interior de un microscopio
de estas características.
Por último, todos los
microscopios electrónicos
cuentan con un sistema
que registra o muestra la
imagen que producen los
electrones.
Hay dos tipos básicos de
microscopios electrónicos:
el microscopio
electrónico de
transmisión (Transmission
Electron Microscope, TEM)
y el microscopio
electrónico de barrido
(Scanning Electron
Microscope, SEM).
Microscopio electrónico de transmisión (MET): permite la observación
de muestra en cortes ultrafinos. Un MET dirige el haz de electrones hacia
el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o
son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen
aumentada del espécimen. Para utilizar un MET debe cortarse la muestra
en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Se coloca
una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para
registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de
transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
Un microscopio electrónico de barrido crea una imagen ampliada de la superficie
de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un
MEB, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El
MEB explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el MET, que
examina una gran parte de la muestra cada vez.
Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy
concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de
electrones por la pantalla de una televisión. Los electrones del haz pueden
dispersarse de la muestra o provocar la aparición de electrones secundarios.
Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un
dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído
de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión.
Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el
dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que
el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de
la misma en el monitor. Los microscopios electrónicos de barrido
pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este tipo de
microscopio es muy útil porque, al contrario que los MET o los
microscopios ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas
de la superficie del objeto.
1. Lo primero es conseguir una buena fuente de iluminación. Si la mismaestá incorporada al microscopio, enfocamos con el objetivo de menoraumento, cerramos el diafragma de campo y movemos el condensadorhacia arriba y hacia abajo hasta que el contorno del diafragma se veanítido. El diafragma se centra con los tornillos que lo sujetan a lasubplatina. Luego se quita el ocular y se verifica que la luz estécentrada. A medida que se abre el diafragma su contorno desaparecedel campo observado. Si la fuente de luz es externa, se quita elocular, se coloca el objetivo de menor aumento, y se mueve el espejohasta centrar la luz. Recordemos que si tenemos condensadordebemos usar la cara plana del espejo.
2. Volvemos a colocar el ocular y, siempre con el objetivo de menoraumento, colocamos el preparado sobre la platina. Utilizando el tornillode ajuste macrométrico enfocamos lo más claramente posible.
USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE
CAMPO CLARO ILUMINACIÓN KELLER
3. El condensador debe estar en la posición más alta y eldiafragma abierto. Esto si el preparado está coloreado,sino el diafragma debe estar cerrado.
4. Con el tornillo micrométrico se logra el enfoque fino según nuestra visión.
5. Modificamos la apertura del diafragma hasta obtener la cantidad
de luz deseada.
6. Luego de estudiado el preparado con este objetivo, podemos
pasar gradualmente a objetivos de mayor aumento, corrigiendo la
apertura del diafragma para cada uno de ellos.
USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE
CAMPO CLARO ILUMINACIÓN KELLER
7. En caso de utilizar el objetivo de inmersión, se coloca una pequeña
gota de aceite sintético sobre el preparado y luego se enfoca con sumo
cuidado, recordando que este objetivo es el de menor distancia frontal y
corremos el riesgo de estropear el preparado y la lente frontal. Al finalizar
el uso de este objetivo se deben retirar los restos de aceite con un papel
de carilina o una gasa embebida en xilol o solvente especial para
limpieza de lentes, nunca se debe dejar sucio el objetivo.
8. Cuando se termina de utilizar el microscopio se lo debe dejar de la
siguiente manera:
- fuente de luz apagada
- condensador al tope
- diafragma abierto
- platina alta
- objetivo de menor aumento en posición
- todas las lentes limpias.
USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE
CAMPO CLARO ILUMINACIÓN KELLER
