La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica

con la cual se logran excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología,

materiales, geología, etc.).

Ofrece indudables ventajas con respecto a la microscopía óptica tradicional (mayor nitidez y contraste en las imágenes, mejor resolución vertical y horizontal, etc.) y, principalmente, permite el estudio tridimensional de una muestra a través de la obtención de "secciones ópticas". Posibilita la localización e identificación de componentes celulares específicos con la particularidad de que al no ser una técnica destructiva, permite una observación in vivo. Además, con ella se pueden detectar in situ moléculas conjugadas con un fluorocromo excitable y estudiar procesos biológicos en tiempo real.

El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz procedente de los

planos fuera de foco.

Descripción del equipo

Microscopio Láser Confocal espectral (CLSM) Leica modelo TCS SP2 equipado con tres líneas de láser. Cuenta con un microscopio invertido DM IRE2 para campo claro en luz transmitida y fluorescencia en luz incidente con componentes ópticos para contraste interferencial de Nomarski (DIC).

La parte del microscopio de fluorescencia convencional posee

tres filtros de fluorescencia:

I3 (excitación azul; emisión

verde) N2.1 (excitación verde;

emisión naranja-rojo)

A (excitación UV; emisión azul)

Módulo confocal

El módulo confocal espectral SP2 es un módulo con sistema de detección espectral altamente sensible en el rango de 400 a 850 nm. Tiene tres canales

de detección para luz reflejada o fluorescencia. El sistema incluye tres fuentes de láser: rojo (HeNe 633 nm), verde (HeNe 543 nm) y azul (Ar 458 nm, 476

nm, 488 nm y 514 nm).

El microscopio tiene dos objetivos:

HC PL APO CS 20x 0.7 (seco) HCX PL APO 63x 1.2 (inmersión en agua)

La platina es motorizada de alta precisión y alta velocidad (variable) para

controlar el eje Z.

Adquisición y visualización

Panel de control con 7 potenciómetros digitales para el ajuste de los parámetros de exploración en directo.

Estación de trabajo:

Software para el control de la exploración, adquisición de series

multidimensionales (x, y, z, t), visualización, procesado bidimensional y cuantificación de las imágenes.

Software para el análisis de colocalizaciones 2D y 3D.

Software para FRET.

La técnica FRET (Transferencia de Energía por Resonancia Fluorescente) es una técnica importante para investigar una gran variedad de fenómenos biológicos que implican la proximidad entre dos moléculas y que permite caracterizar con enorme precisión la distancia entre 2 moléculas.

El mecanismo se basa en la presencia de 2 moléculas fluorescentes: un donante y un aceptor. La molécula “donante “puede ser excitada a una longitud de onda especifica y a su vez , provocar la excitación de la molécula “aceptora “que a su vez emitirá en una fluorescencia detectable.

Representación esquemática de la transferencia de energía de resonancia entre el donante D y el aceptor A tras la excitación de la molécula donante, donde D y A son fluoróforos.

Software para FRAP.

El método de Recuperación de Fluorescencia Tras Fotoquemado (FRAP) es una técnica para la observación del movimiento intracelular mediante quemado de la fluorescencia de una zona o molécula de interés. Un área específica de la muestra se quema mediante la acción del láser confocal , la pérdida y recuperación de fluorescencia es utilizada entonces para determinar como se recupera esta fluorescencia que se relaciona con la difusión y/o desplazamiento de la molécula “fotoquemada”

Los servicios que este microscopio brinda a la comunidad incluyen:

Adquisición de imágenes de muestras

de origen animal, vegetal o mineral a

través de la identificación y

localización de componentes

celulares o moleculares específicos.

Registro de imágenes Dic o de

Nomarski (contraste de interferencia).

Análisis de colocalizaciones

intracelulares 2D.

Estudios de actividad intracelular (pH

e iones) en el tiempo.

Posibilidad de obtener imágenes a

diferentes longitudes de onda (λ) y

perpendiculares al plano xy (plano

xz).

Software para FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) y FRAP

(Fluorescence Recovery After Photobleaching).

Observación de la morfología o

de los defectos en sólidos como

componentes microelectrónicos,

polímeros, resinas, minerales,

cerámicas, metales, etc.

Análisis de imágenes (realces,

medidas de intensidades y

morfométricas).

Imagen DIC o de Nomarsky (contraste interferencial) de cristales de dextrinas mezcladas con una droga que permite identificar diferentes formas y tamaños. A la derecha se representa un gráfico 3D de la imagen 2 D de la izquierda.

Cloroplastos (en verde) y pared celular (en rojo) en células de tejido fotosintético.

Cultivos celulares

neurogliales ( neuronas

fotorreceptoras sobre células

gliales de sostén). Imagen que

muestra la localización de tres

moléculas en forma

simultánea ( en verde, en rojo

y en azul)

Autofluorescencia de estructuras de un

tardígrado (uno de los seres vivos más

resistentes del planeta). Se puede

observar con claridad la zona

mandibular y el aparato digestivo.