MODELACIÓN DEL CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS Y PATÓGENAS ASOCIADAS A

ALIMENTOS

CATALINA AGUILAR RIVERA

Trabajo de grado para optar el título de Magíster en Ciencias Biológicas con énfasis en Microbiología

Universidad de Los Andes

Facultad de Ciencias Biológicas Bogotá D.C.

2007

MODELACIÓN DEL CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS Y PATÓGENAS ASOCIADAS A

ALIMENTOS

CATALINA AGUILAR RIVERA

BERNADETTE KLOTZ CEBERIO

Director, Ph.D

MARÍA CONSUELO VANEGAS LÓPEZ

Co- Director, M.Sc

Universidad de Los Andes Facultad de Ciencias Biológicas

Bogotá D.C. 2007

DEDICATORIA Cada experiencia es un paso más hacia el éxito; es un sueño que no se hubiera hecho realidad

sin la presencia de Dios, el apoyo de mi familia y el de todas las personas que creyeron en mí.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de La Sabana por apoyar y f inanciar este proyecto y a su Facultad de

Ingenier ía por facilitarme los laboratorios. Al Laboratorio de Ecología Microbiana de Alimentos

de la Universidad de Los Andes y al Laboratorio de Investigación de la Facultad de Ingeniería

de la Universidad de La Sabana por la donación de las cepas.

A la Dra. Bernadette Klotz por su entrega incondicional y por ser un modelo a seguir. A la Dra.

Consuelo Vanegas por todos sus aportes y sugerencias. Al Dr. Francisco Zimmerman por sus

valiosas orientaciones. Al Ing. Francisco Garcés por su apoyo y colaboración. A Pilar Gómez

por su ayuda incalculable. A todos los auxiliares de laboratorio y al personal administrativo de

la Universidad de La Sabana por su eficiente gestión. Y a todas las personas que directa e

indirectamente hicieron parte de este proceso haciendo realidad este proyecto.

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 1

2. MARCO TEÓRICO 4 2.1. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE CRUDA 4 2.2 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS 6 2.2.1 Lactobacillus plantarum 8 2.2.2 Lactobacillus paracasei 8 2.2.3 FERMENTA CIÓN ÁCIDO LÁCTICA 9 2.3 Escherichia coli 11 2.4 Listeria monocytogenes 12 2.5 MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA 13 2.5.1 INTRODUCCIÓN A LOS MODELOS PREDICTIVOS 16 2.5.2 TIPOS DE MODELOS 20 2.5.3 DESARROLLO DE MODELOS 20 2.5.4 MODELOS PRIMARIOS DE CRECIMIENTO 26 2.5.5 AJUSTE Y SELECCIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS 29 2.5.6 VALIDA CIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS 29 3. JUSTIFICACIÓN 31 4. OBJETIVOS 33 4.1 OBJETIVO GENERAL 33 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 33

5. MATERIALES Y MÉTODOS 34 5.1 FASES EXPERIMENTALES 34 5.2 METODOLOGÍA 35 5.2.1 SELECCIÓN DE BAL PARA EL ESTABLECIMIENTO DE LOS CULTIVOS MIXTOS CON PA TÓGENOS ASOCIA DOS A ALIMENTOS: Escherichia coli y L. monocytogenes 35 5.2.2 MEDIOS DE CULTIVO 37 5.2.3 MANTENIMIENTO DE LAS CEPA S 38 5.2.4 MÉTODOS ESTADÍSTICOS 38 5.2.5 RECUENTO DE BACTERIAS 39 5.2.6 DESA RROLLO DE CULTIVOS SINCRONIZADOS 42 5.2.7 GENERA CIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO INDIVIDUAL EN MEDIO ESTÁ NDAR 47 5.2.8 GENERA CIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO/INA CTIVACIÓN BACTERIA NAS MIXTAS EN MEDIO ESTÁ NDA R 49 5.2.9 DESA RROLLO DE MODELOS PRIMA RIOS 49 5.2.10 MODELOS PRIMA RIOS SELECCIONA DOS 49 5.2.10.1 Ecuación de Gompertz modif icada 49 5.2.10.2 Ecuación de Baranyi 50 5.2.11 EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO Y LA BONDA D DE AJUSTE DE LOS MODELOS PRIMA RIOS 50 5.2.11.1 Error cuadrado medio 50 5.2.11.2 Error estándar 51 5.2.11.3 Análisis de residuos 51 5.2.11.4 Coeficiente de determinación 51 5.2.11.5 Análisis de los parámetros cinéticos estimados 51 5.2.12 VALIDACIÓN DE LOS MODELOS PREDICTIVOS 51 5.2.12.1 MÉTODO GRÁFICO 52 5.2.12.2 MÉTODO MATEMÁ TICO 52

5.2.12.2.1 Factores de exactitud y bias 52 5.2.12.2.2 Porcentaje de Discrepancia y porcentaje de Sesgo o Bias 52 5.2.12.2.3 Prueba del Ji cuadrado 53 5.2.13 GENERA CIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EXTENDIDAS Y SU MODELACIÓN PRELIMINA R 53 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 54 6.1 GENERA CIÓN Y MODELA DO DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIA NO EN CULTIVO INDIV IDUAL EN CALDO MRS 54 6.1.1 OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO INDIVIDUAL 54 6.1.2 SELECCIÓN Y EVALUACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS 54 6.1.3 DESA RROLLO DE LOS MODELOS PRIMA RIOS 58 6.2 GENERA CIÓN Y MODELA DO DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIA NO EN CULTIVO MIXTO EN CALDO MRS 61 6.2.1 OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO 61 6.2.2 DESA RROLLO DE LOS MODELOS PRIMA RIOS 63 6.3 DETERMINACIÓN DEL PÉRFIL DE pH DURA NTE EL CRECIMIENTO EN CULTIVO INDIVIDUAL Y MIXTO DE LAS CEPAS BA CTERIA NAS 69

6.4 VALIDACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS 72

6.4.1 GENERA CIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO INDIVIDUAL EN LECHE ENTERA UHT. 72 6.4.2 GENERA CIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO MIXTO EN LECHE ENTERA UHT. 74 6.4.3 VALIDA CIÓN DE LOS MODELOS DE CRECIMIENTO PREDICTIVOS DESARROLLADOS EN MRS. 77 6.4.3.1 Validación del modelo de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. 78 6.4.3.2 Validación del modelo de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. 82 6.4.3.3 Validación del modelo de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. 86

6.4.3.4 Validación del modelo de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. 87 6.5 MODELACIÓN PRELIMINAR DE CURVAS EXTENSAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO 93 6.5.1 CULTIVOS MIXTOS EN CALDO MRS 93 6.5.1.1 Generación de curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en MRS 93 6.5.1.2 Determinación del perf il de pH durante el crecimiento en cultivo mixto de las cepas bacterianas en MRS 95 6.5.1.3 Modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas en cult ivo mixto en MRS 97 6.5.2 GENERA CIÓN DE CURVAS EXTENSAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO EN LECHE ENTERA UHT 103 6.5.2.1 Obtención de las curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT 103 6.5.2.2 Determinación del perf il de pH durante el crecimiento en cultivo mixto de las cepas bacterianas en leche entera UHT 105 6.5.2.3 Modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas en cult ivo mixto en leche entera UHT 105 6.6 DISCUSIÓN FINAL 112 6.6.1 ANÁLISIS COMPA RATIVO DEL COMPORTA MIENTO DE LOS PA RÁMETROS CINÉTICOS ENTRE LOS MODELOS EN MRS Y EN LECHE ENTERA UHT PARA CULTIVOS INDIVIDUALES Y MIXTOS 112 6.6.2 EVALUACIÓN DE LOS PA RÁMETROS CINÉTICOS ENTRE CULTIVOS INDIV IDUALES Y CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE LOS MODELOS DESARROLADOS EN MRS 115 6.6.2.1 Tasas de crecimiento 116 6.6.2.2 Fase Lag 118 6.6.2.3 Máxima concentración bacteriana alcanzada 119 6.6.3 EVALUACIÓN DE LOS PA RÁMETROS CINÉTICOS ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE LOS MODELOS DESARROLADOS EN LECHE ENTERA UHT 122 6.6.3.1 Tasas de crecimiento 122

6.6.3.2 Fase Lag 124 6.6.3.3 Máxima concentración bacteriana alcanzada 126 6.6.4 ANÁLISIS COMPA RATIVO DEL pH ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS EN CALDO MRS Y EN LECHE ENTERA UHT A 37°C 129 6.6.5 A PROXIMA CIÓN AL MECA NISMO INHIBITORIO DE LAS BAL FRENTE A LAS PA TÓGENAS ESTUDIADAS 131 CONCLUSIONES 140 RECOMENDACIONES 142 REFERENCIAS 143 ANEXOS 152

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Características de algunos microorganismos y grupos de microorganismos relacionados con leche y derivados lácteos. 5 Tabla 2. Productos fermentados artesanalmente con BAL. 9 Tabla 3 Diferenciación de los principales géneros de BAL. 10 Tabla 4. Sincronización de cultivos para la generación de curvas de crecimiento con una extensión de 34 horas y 18 puntos de muestreo. 42 Tabla 5. Puntos de muestreo en cultivos sincronizados a 13 horas de desfase. 47 Tabla 6. Bondad de ajuste de los modelos predictivos para curvas de crecimiento en cultivo individual. 56 Tabla 7. Evaluación de la bondad de ajuste de los modelos predictivos. 57 Tabla 8. Bondad de ajuste del Modelo de Baranyi para curvas de crecimiento en cult ivo individual. 59 Tabla 9. Comparación del Modelo de Baranyi para el crecimiento en cult ivo mixto de L. plantarum y E. coli, L. plantarum y L. monocytogenes, L. paracasei y E. coli, y L. paracasei y L. monocytogenes. 64 Tabla 10. Parámetros cinéticos predichos por el modelo de Baranyi generado en MRS a 37°C para curvas de crecimiento en cult ivo individual y mixto. 78 Tabla 11. Validación del Modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de crecimiento de L. plantarum en cult ivo individual y mixto. 79 Tabla 12. Validación del Modelo en leche UHT a 37°C para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo mixto e individual. 83 Tabla 13. Validación del Modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de Crecimiento de E. coli en cultivo mixto e individual. 86 Tabla 14. Validación del Modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de Crecimiento de L. monocytogenes en cult ivo mixto e individual. 90 Tabla 15. Análisis de regresión para los tres modelos polinomiales ajustados a los cultivos mixtos en caldo MRS a 37°C. 98 Tabla 16. Análisis de regresión para los tres modelos polinomiales ajustados a los cultivos mixtos en leche UHT a 37°C. 107

Tabla 17. Comparación de parámetros cinéticos y pH obtenidos en caldo MRS versus los obtenidos en leche entera UHT. 112 Tabla 18. Coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cult ivos mixtos en caldo MRS a 37°C. 116 Tabla 19. Coeficientes entre las fases lag de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultivos mixtos en caldo MRS a 37°C. 118 Tabla 20. Coeficientes entre las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultivos mixtos en caldo MRS a 37°C. 120 Tabla 21. Coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cult ivos mixtos en leche entera UHT a 37°C. 123 Tabla 22. Coeficientes entre las fases lag de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultivos mixtos en leche entera UHT a 37°C. 125 Tabla 23. Coeficientes entre las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultivos mixtos en leche entera UHT a 37°C. 126 Tabla 24. Evaluación del crecimiento de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS con diferentes valores de pH a 37°C por 24 horas. 132 Tabla 25. Verif icación de BLIS a partir de sobrenadantes de cult ivos mixtos de las BAL y las cepas patógenas estudiadas en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C por 24 horas. 135 Tabla 26. Resultados de verif icación de la producción de BLIS en MRS a 37°C 156 Tabla 27. Resultados de verif icación de la producción de BLIS en leche Entera UHT a 37°C 157 Tabla 28. Validación estadística del método modif icado de recuento en placa (siembra en cuartos en placa de petri estándar). 160 Tabla 29. Estandarización de inóculos para la sincronización de cultivos paralelos. 163 Tabla 30 Resultado de los recuentos en placa para la validación estadística de las curvas de crecimiento bacteriano a partir de cultivos sincronizados. 165

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Formación de lactato por bacterias homofermentativas. 10 Figura 2. Fermentación de glucosa por bacterias heterofermentativas. 11 Figura 3. Curva de crecimiento típica para una población bacteriana en un sistema cerrado. 18 Figura 4. Modelo primario de crecimiento e identif icación de los parámetros más relevantes. 21 Figura 5. Modelo secundario de superficie de respuesta. 22 Figura 6. Interfase Pathogen Modelling Program. 23 Figura 7. Interfase Grow th Predictor. 23 Figura 8. Interfase ComBase Predictor. 24 Figura 9. Interfase Perfringens Predictor. 24 Figura 10. Criterios de búsqueda y resultados del ComBase Internet brow ser 25 Figura 11. Representación matemática de algunos modelos de crecimiento primarios. 26 Figura 12. Representación gráfica de algunos modelos de crecimiento primario. 27 Figura 13. Diagrama de f lujo del ensayo de verif icación de la producción de BLIS (Bacteriocin-Like Inhibitory Substances) en BAL. 36 Figura 14. Diagrama de f lujo del ensayo de validación del método modif icado de recuento en placa (siembra en cuartos de placa). 41 Figura 15. Diagrama de f lujo del procedimiento 1 para la estandarización de inóculos. 44 Figura 16. Diagrama de f lujo del procedimiento 2 para la estandarización de inóculos. 45 Figura 17. Diagrama de f lujo del procedimiento 3 para la estandarización de inóculos. 46 Figura 18. Curvas de crecimiento en cultivo individual. 55

Figura 19. Ajuste a las curvas de crecimiento individual en caldo MRS a 37°C por el Modelo de Baranyi. 58 Figura 20. Curvas de crecimiento en cultivo mixto en caldo MRS a 37°C. 62 Figura 21. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento en cult ivo mixto de L. plantarum en caldo MRS a 37°C. 63 Figura 22. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento en cult ivo mixto de L. paracasei en caldo MRS a 37°C. 64 Figura 23. Curvas de crecimiento en cultivo mixto normalizadas en caldo MRS a 37°C. 68 Figura 24. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo individual y mixto en caldo MRS a 37°C. 70 Figura 25. Curvas de crecimiento en cultivo individual en leche entera UHT a 37°C. 73 Figura 26. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo individual generadas en leche entera UHT a 37°C. 74 Figura 27. Curvas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT a 37°C. 75 Figura 28. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT a 37°C. 77 Figura 29. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. 80 Figura 30. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. 81 Figura 31. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. 84 Figura 32. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. 85 Figura 33. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. 88 Figura 34. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. 89

Figura 35. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. 91 Figura 36. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. 92 Figura 37. Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en caldo MRS a 37°C. 94 Figura 38. Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en caldo MRS a 37°C con el comportamiento del pH. 96 Figura 39. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. plantarum durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. 99 Figura 40. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. paracasei durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. 100 Figura 41. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de E. coli durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. 101 Figura 42. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. monocytogenes durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. 102 Figura 43. Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT a 37°C. 104 Figura 44. Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto en leche entera UHT a 37°C con el comportamiento del pH. 106 Figura 45. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. plantarum durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. 108 Figura 46. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de L. paracasei durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. 109 Figura 47. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultivos mixtos de E. coli durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. 110 Figura 48. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cult ivos mixtos de L. monocytogenes durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. 111

Figura 49. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C. 114 Figura 50. Modelos de crecimiento para cult ivos mixtos de L. plantarum y L. paracasei en asocio con L. monocytogenes en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C. 114 Figura 51. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales y mixtos de cepas patógenas en caldo MRS a 37°C. 121 Figura 52. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales y mixtos de BAL en caldo MRS a 37°C. 122 Figura 53. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales y mixtos de cepas patógenas en leche entera UHT 37°C. 128 Figura 54. Modelos de crecimiento para cult ivos individuales y mixtos de BAL en leche entera UHT a 37°C. 128 Figura 55. Comportamiento del pH en cult ivos individuales y mixtos de las BAL en caldo MRS y leche entera UHT a 37°C. 129 Figura 56. Comportamiento del pH en cult ivos individuales y mixtos de las bacterias patógenas en caldo MRS y leche entera UHT a 37°C. 130 Figura 57. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las BAL en cultivos individuales y mixtos en caldo MRS a 37°C por 34 horas. 133 Figura 58. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las cepas patógenas en cultivos individuales y mixtos en caldo MRS a 37°C por 34 horas. 134 Figura 59. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las BAL en cultivos individuales y mixtos en leche entera UHT a 37°C por 34 horas. 138 Figura 60. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las cepas patógenas en cult ivos individuales y mixtos en leche entera UHT a 37°C por 34 horas. 139 Figura 61. Fotografía de los resultados de verif icación de la producción de BLIS. 154 Figura 62. Fotografías del método modif icado de recuento en placa (siembra en cuartos en placa de petri estándar). 160 Figura 63. Relación entre el recuento celular y la densidad óptica (OD540) de cultivos de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en MRS a 37°C. 164

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1. COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 151

ANEXO 2. COMPOSICIÓN FISICOQUÍMICA DE LA LECHE ENTERA UHT 153

ANEXO 3. ESTA NDARIZACIÓN DE MÉTODOS - EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE BLIS 154

ANEXO 4. ESTA NDARIZACIÓN DE MÉTODOS - VALIDACIÓN ESTA DÍSTICA DEL MÉTODO MODIFICA DO DE RECUENTO EN PLACA 159

ANEXO 5. ESTA NDARIZACIÓN DE MÉTODOS - VALIDACIÓN DE CULTIVOS SINCRONIZADOS 162

ANEXO 6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO MODIFICA DO DE RECUENTO EN PLA CA 167

ANEXO 7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA ESTA NDA RIZACIÓN DE INÓCULOS 168

ANEXO 8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VALIDACIÓN DE CULTIVOS SINCRONIZADOS 169

ANEXO 9. COMPARA CIÓN ESTADÍSTICA DE LA BONDAD DE AJUSTE DEL MODELO DE GOMPERTZ MODIFICA DO VERSUS LA DEL MODELO DE BA RANYI 170

ANEXO 10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE TASAS DE CRECIMIENTO 171

ANEXO 11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE FASES LAG 173

ANEXO 12. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA CONCENTRA CIÓN INICIAL 175

ANEXO 13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA MÁXIMA CONCENTRACIÓN ALCANZADA 176

ANEXO 14. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL pH 177

ANEXO 15. VALIDACIÓN ESTADÍSTICA EN LECHE ENTERA UHT DEL MODELO GENERA DO EN CALDO MRS 178

ANEXO 16. VALIDACIÓN ESTADÍSTICA DE LA ECUACIÓN POLINOMIAL DE TERCER GRADO PA RA MODELACIÓN 179

1

1. INTRODUCCIÓN

La creciente globalización del comercio de alimentos y los cambios tanto en el estilo de vida

como en la alimentación de la población mundial, que conllevan a variaciones en la preparación

y en el procesamiento de los alimentos, han obligado a la agroindustria y a las autoridades en

general, a asumir posiciones más rigurosas frente a la industria alimentaria, pr iorizando en el control de calidad, y la seguridad e inocuidad de los alimentos. Según la Organización Mundial

de la Salud (OMS), la frecuencia de enfermedades por consumo de alimentos mal procesados o

contaminados podr ía ser entre 300 y 350 veces mayor a lo que los informes indican y se

considera que los alimentos son la mayor fuente de exposición a riesgos por presencia de

agentes patógenos en países desarrollados y en vía de desarrollo (FAO, 2006).

La OMS reporta 400 millones de casos de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) por

año, con una incidencia signif icativamente mayor en países en desarrollo, siendo la falta de

educación, el mal estado nutricional de un alto porcentaje de sus habitantes (72%), sus

características culturales y las pobres condiciones higiénicas la causa de una mayor presencia

de ETAs en estos países. Sin embargo, las estadísticas de países industrializados muestran

que un 10% de sus pobladores puede padecer anualmente de una ETA, representando

actualmente un grave problema sanitario, económico y hasta político en muchos casos (NHI,

2005).

Aunque el conocimiento científ ico sobre los microorganismos patógenos asociados a alimentos

ha crecido marcadamente en los últ imos 16 años (McEntire, 2004), todav ía se requiere de

muchos estudios que permitan conocer el comportamiento de estos microorganismos dentro de

las operaciones de producción, procesamiento, distribución y almacenamiento de los alimentos

para poder generar estrategias de intervención y garantizar así su inocuidad.

Colombia no es ajena al panorama mundial y tanto Listeria monocytogenes como Escherichia

coli son actualmente un serio problema de salud pública que compete tanto a las autoridades

sanitarias como al sector agroindustrial de nuestro país. Estos dos patógenos ubicuos se han

2

aislado de leche cruda y pasteurizada, derivados lácteos, carnes crudas y procesadas,

vegetales y frutas (SIVIGILA, 2004).

Numerosos autores han propuesto el uso de f lora competitiva para garantizar la inocuidad de

alimentos como extrapolación de la condición observada en productos fermentados

artesanalmente (Gombas, 1989; Holzapfel et al., 1995; Schillinger et al., 1991, Savadogo et al.,

2004).

La interacción de microorganismos benéficos como las bacterias ácido lácticas (BAL), que

hacen parte normal de la microbiota de muchas matrices alimentarias o que son utilizadas como

cultivos iniciadores en productos fermentados y que además poseen propiedades antagónicas

con otras bacterias, pueden ser consideradas como excelente alternativa para inhibir el

crecimiento de patógenos a nivel industrial dentro del contexto de biopreservación o

bioconservación. Sus mecanismos de acción son la acidif icación del medio por producción de

ácido láctico, la producción otras sustancias inhibidoras como ácido acético, peróxido de

hidrógeno, bacteriocinas, acetaldehídos y dióxido de carbono, entre otras (Madigan et al.,1999).

Se reconoce que derivados lácteos fermentados artesanalmente garantizan su inocuidad por la

presencia de BAL. En Colombia, el Suero Costeño de alto consumo en la Costa Atlántica,

representa un ejemplo de interacción y competit ividad entre bacterias patógenas asociadas a la

leche y las BAL. Este derivado lácteo que se produce pr incipalmente a nivel artesanal, sin

buenas prácticas de manufactura, goza del aprecio de los consumidores por los beneficios que

aporta a su salud y nutrición (Rodr íguez, 1988).

Son varias las referencias que existen a nivel de inhibición de patógenos por BAL o sus

productos a través de experimentos reto. Por ejemplo, Kalalou et al. (2004) establecieron que

las BAL extendieron la vida útil de carne de camello picada a 22ºC. Lactobacillus acidophilus

inhibió el crecimiento de E. coli O157:H7 y Staphylococcus aureus en medio de cult ivo estándar

(Reilly y Gilliland, 1996). Murry et al. (2004) reportaron la inhibición en el crecimiento de E. coli,

Salmonella spp. y Clostridium spp. por la presencia de Lactobacillus plantarum y Lactobacillus

salivarius. Sin embargo, son pocos los artículos existentes que estudian la dinámica de

poblaciones y la modelación de las interacciones en cultivos mixtos. Breidt y Fleming (1998)

modelaron el crecimiento competit ivo de L. monocytogenes y Lactococcus lactis en caldo de

vegetales. Leroy y De Vuyst (1999, 2003, 2004 y 2005) y Foegeding et al. (1992) modelaron la

interacción y reportaron la inhibición de crecimiento entre un cult ivo iniciador productor de

3

bacteriocinas en salchichón y su efecto sobre Listeria innocua y L. monocytogenes

respectivamente.

Pero no solo la bioconservación es tendencia mundial como alternativa al uso de compuestos

químicos para garantizar la seguridad e inocuidad de los alimentos. Especialmente en la última

década ha incursionado fuertemente la microbiología predictiva, que comprende el estudio

cuantitativo del comportamiento microbiano en alimentos y utiliza modelos matemáticos para

describirlo. Actualmente la microbiología predictiva, unida al Análisis de Riesgos y Puntos Cr íticos de Control (HACCP) y a la Evaluación Cuantitativa de Riesgo Microbiano (ECRM), hace

parte de este enfoque proactivo para asegurar la inocuidad alimentaria.

Del conjunto de modelos predictivos existentes, son muy pocos los que se enfocan en describir

el crecimiento simultáneo de cepas bacterianas en cultivos mixtos. Por lo tanto, la obtención de

más datos cuantitativos y el desarrollo de los modelos matemáticos que se proponen en este

trabajo, permit irán predecir el comportamiento microbiano en una matriz alimentaria (que para

este caso será leche entera UHT). De esta manera se podrá establecer el t ipo de interacción

entre BAL, reconocidas por sus propiedades biocontroladoras, y bacterias patógenas de origen

alimentario, reconociendo también, que los modelos predictivos, inicialmente empíricos, podrán

evolucionar hacia modelos explicativos en la medida que se identif iquen los factores que

determinen la predominancia de las bacterias biocontroladoras sobre las patógenas (Baranyi,

2004).

4

2. MARCO TEÓRICO

2.1. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE CRUDA

La leche por su pH, su actividad de agua y sus propiedades nutricionales constituye un alimento

completo para la dieta humana y al mismo tiempo permite el crecimiento de gran variedad de

microorganismos. La leche de vaca contiene agua (87%), grasa (3.9%), proteína (3.3%), lactosa

(4.5%) y minerales (0.9%) y es por lo tanto un excelente sustrato para bacterias y hongos (FAO,

2006). Asociados a este sustrato se encuentran microorganismos beneficiosos, como grupos

definidos de BAL y algunos hongos, que son útiles por su capacidad de generar derivados

lácteos con nuevas características organolépticas y f isicoquímicas. Sin embargo, existen

bacterias psicrótrofas y otras de tipo coliforme, que pueden deteriorar la calidad de la leche,

alterando su presentación y su contenido nutr icional. Adicionalmente, algunos microorganismos

pueden ser agentes causales de enfermedades en los consumidores como lo son E. coli,

Salmonella spp., Yersinia enterolitica, L. monocytogenes, S. aureus, Campylobacter jejuni,

Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis entre otros (Pelczar, 1999).

Teóricamente la leche deber ía salir estéril de la ubre, pero generalmente contiene de 100 a

10.000 bacterias/mL en buenas condiciones de operación. Estas bacterias pueden seguir

multiplicándose en la leche si no se aplican adecuadas prácticas de almacenamiento y

conservación (FAO, 2006). Las bacterias patógenas contaminan la leche por dos vías

principales: la vía externa (factores ambientales) y la v ía mamaria, en la que las bacterias se

adhieren a la piel de la ubre, ingresan por el canal del pezón o llegan a la leche directamente

por el torrente sanguíneo. Estas bacterias son: S. aureus, Streptococcus spp., coliformes como

E. coli y Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa, Clostridium spp., Bacillus spp. Por vía

descendente o hematógena lo hacen bacterias asociadas a enfermedades sistémicas del

animal (Salmonella spp., Brucella spp., Mycobacterium tuberculosis), las cuales tienen la

propiedad de movilizarse en la sangre y a través de los capilares mamar ios infectan la ubre

(Pelczar, 1999). En la Tabla 1 se presentan las principales características de los

microorganismos más relevantes asociados con mayor frecuencia en lácteos.

5

Tabla 1. Características de algunos microorganismos y grupos de microorganismos relacionados con leche y derivados lácteos.

Nombre Fuente Crecimiento

en leche cruda

Patogenicidad Alteración

Bacillus cereus Alimentación, estiércol, suelo, polvo ++ Intoxicación

alimentaria

Coagulación dulce, nata en

leche pasteurizada

Bacillus cereus y B. stearothermophilus

Alimentación, estiércol, suelo, polvo

++ Probablemente no Alteración de la leche esterilizada

Campylobacter jejuni Estiércol, agua + Desórdenes intestinales

No

Clostridium botulinum Suelo, agua contaminada - Botulismo No

Coliformes Heces, utensilios de ordeño, agua contaminada ++

Mastitis, desórdenes intestinales

Alteración de la leche y el queso

Corynebacterium bovis Canal del pezón + No No

Corynebacterium pyogenes

Interior de la ubre, moscas + Mastitis Casi nunca

Lactobacillus spp. Utensilios de ordeño, leche en cántaras, sala de ordeño

++ No Acidif icación de la leche

Lactococcus lactis Utensilios de ordeño, leche en cántaras, sala de ordeño

++ No Acidif icación de la leche

Listeria monocyotgenes Suelo, alimentación + Listeriosis No

Microbacterium lacticum Utensilios de ordeño + No

Crece en productos

pasteurizados

Micrococcus spp. Canal del pezón, piel, sala de ordeño, utensilios de

ordeño + Probablemente no

Crece en productos

pasteurizados

Mohos Polvo, superficies sucias, alimentación +/- Algunos producen

toxinas Alteraciones en

queso, mantequilla

Mycobacterium tuberculosis

Enfermedad de la vaca o del ordeñador - Mastitis,

tuberculosis No

Psicrótrofos (Pseudomonas)

Utensilios de ordeño, leche ref rigerada, agua

contaminada ++ Ocasionalmente

Hidrolizan las proteínas y la

grasa de la leche ref rigerada

Salmonella, Shigella Estiércol, agua contaminada +

Desordenes intestinales,

mastitis No

Staphylococcus aureus

Canal del pezón, interior de la ubre, piel, ordeñador

enf ermo ++

Intoxicación alimentaria,

mastitis, úlceras Casi nunca

Staphylococcus epidermidis

Canal del pezón, piel, sala de ordeño

++ Probablemente no Casi nunca

Streptococcus agalactiae, , S.

pyogenes, S. uberis

Interior de la ubre, sala de ordeño ++ Mastitis Acidif icación

Vibrio cholerae Agua contaminada, ordeñador enfermo

- Cólera No

Virus Vaca, humanos, sala de ordeño

- Muchos si lo son No

Levaduras Polvo, utensilios de ordeño +/- No Alteran el queso, mantequilla, leche

condensada Fuente: Beerens, H., Luquet, F.M. 1990. Guía práctica para el análisis microbiológico de la leche y los productos lácteos. Acribia, Zaragoza.

6

La leche también puede ser contaminada post-ordeño a través del medio externo (aire, agua,

suelo y estiércol, utensilios, equipos, manipuladores, tanques de almacenamiento y transporte)

con patógenos y/o f lora deter iorativa siendo las bacterias más comunes: Micrococcus spp.,

Streptomyces spp., Pseudomonas spp., Alcaligenes spp., Flavobacterium spp.,

Chromabacterium spp., Bacillus spp., Clostridium spp., E. coli, L. monocytogenes, S. aureus,

Streptococcus spp. (Ekici et al., 2004).

2.2 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS Las BAL son generalmente Gram positivas, aerobias facultativas, que requieren de aminoácidos

específ icos, vitaminas del complejo B y de otros factores de crecimiento para un adecuado

desarrollo en medios de cultivo estándar. No utilizan hidratos de carbono complejos y en su

mayor ía no presentan reducción de nitratos ni producción de catalasa (Boone, 2001).

Según el criterio taxonómico y f ilogenético existen reportados 12 géneros de BAL: Lactobacillus,

Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Vagococcus,

Aerococcus, Alloicoccus, Tetragenococcus, Carnobacterium y Weisella. Los géneros

Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus y Leuconostoc se utilizan generalmente como

cultivos lácticos iniciadores y el género Enterococcus puede encontrarse en algunos cultivos

iniciadores mixtos por su capacidad para desarrollar aromas, sabor y textura en productos

lácteos (Fox et al., 2000).

Las BAL presentes en diversos sustratos naturales como Lactococcus spp., Lactobacillus spp.,

Leuconostoc spp., Streptococcus spp. y Pediococcus spp., han sido utilizadas desde principios

de la civilización como un método empírico para la conservación de alimentos (Boone, 2001).

Las BAL conocidas como GRAS (“generally regarded as safe”) (NHI, 2005), comunes en la

fermentación de productos de origen animal y vegetal, inhiben el crecimiento de otras bacterias,

entre ellas importantes patógenos asociados a alimentos, sin generar resistencias múltiples

como ocurre con los antibióticos tradicionales. Este mecanismo antagónico por parte de las

BAL, se debe a la producción de una serie de metabolitos, como ácido láctico y acético,

peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, etanol, entre otros, que interf ieren con el metabolismo y el

desarrollo de las bacterias, favoreciendo de esta manera la conservación de los alimentos

(Rabel, 2003). Un ejemplo de esta interacción lo constituyen los productos tradicionales

fermentados, como el Suero Costeño, que aunque son producidos casi siempre bajo pobres

condiciones higiénicas, por la presencia de las BAL garantizan su inocuidad (Rodr íguez, 1988).

7

Debido a sus características fermentativas y antagónicas, las BAL han adquirido recientemente

un fuerte interés por parte de la industria alimentaria, para su aplicación en procesos de

biopreservación, como cultivos biocontroladores de f lora deteriorativa y patógena. Estas

condiciones, además de incrementar la vida comercial y la seguridad microbiológica de los

alimentos, traen beneficios para la salud, por sus propiedades probióticas, ampliamente

reconocidas (Rabel, 2003).

En general las BAL son más resistentes a medios ácidos que la mayoría de las bacterias, creando para sí un entorno favorable en distintas matrices. Por eso, en presencia de BAL la

producción de ácidos orgánicos y de bacteriocinas, así como pH bajos pueden afectar el

crecimiento de otros microorganismos en cultivos mixtos. Las propiedades inhibitorias de los

ácidos orgánicos, como el ácido láctico, están asociadas a las formas protonadas que no están

cargadas eléctricamente y pueden atravesar biomembranas y por tanto, la inhibición resultante

puede deberse a acidif icación del citoplasma y/o acumulación de aniones ácidos dentro de la

célula (Zalán, 2005).

Las bacteriocinas son péptidos de síntesis ribosomal que se caracterizan por tener

generalmente un espectro de inhibición reducido y no generar respuesta de resistencia

microbiana; éstas en comparación con los antibióticos no se utilizan en el tratamiento de

enfermedades (Montville y Chen, 1998). Según Garneu et al. (2002), las bacteriocinas se

clasif ican en cuatro clases: las de la clase I o lantibióticos, contienen aminoácidos poco

comunes como lantionina, b-metil-lantionina y dihidroalanina, que se forman debido a

modif icaciones posteriores al proceso de la traducción. La formación de aminoácidos no

comunes se explica por la deshidratación de los aminoácidos serina y treonina, con la posterior

adición de los átomos de azufre de la cisteína, a los dobles enlaces de los

deshidroaminoácidos. Un ejemplo bien conocido de estas bacteriocinas es la nisina.

La clase II o no lantibióticos de las bacteriocinas, está constituida por pequeños péptidos (<10

kDa) estables al calor, con actividad inhibitoria comprobada contra L. monocytogenes. Dentro

de esta clase, las bacteriocinas más estudiadas son: pediocina, sakacina, mesentericina y

lactacina (Cheng y Hoover, 2003a). La clase III está conformada por péptidos grandes, mayores

a 30 kDa, los cuales, por ser termolábiles, son de poco interés a nivel industrial. Dentro de este

grupo se encuentran principalmente las helveticinas J y V. Existe otro grupo de bacteriocinas

agrupadas en la clase IV, que aunque es poco estudiado, se sabe que se encuentra constituido

por proteínas mixtas asociadas a lípidos o a carbohidratos (Garneu et al., 2002).

8

Se sugiere que las clases I y II de las bacteriocinas son las más efectivas contra patógenos en

alimentos y comparten mecanismos de acción semejantes. Al parecer, los péptidos se unen a la

membrana citoplasmática a través de uniones electrostáticas con los fosfolípidos cargados

negativamente, luego se insertan a la membrana con una reorientación que depende del

potencial de membrana, el cual esta influenciado por el pH y la composición fosfolipídica.

Los monómeros de bacteriocina forman agregados proteicos que resultan en la formación del

poro con la consecuente salida de iones (principalmente potasio y magnesio), pérdida de la fuerza motriz de protones (FMP) , salida de A TP y aminoácidos. La fuerza motriz de protones

juega un papel central en la síntesis de ATP, en el transporte activo y el movimiento bacteriano,

por lo tanto, se inhibe la s íntesis de macromoléculas y la producción de energía dando como

resultado la muerte celular (Cheng y Hoover, 2003b).

2.2.1 Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum es un bacilo alargado, Gram positivo, que presenta bordes

redondeados y generalmente se agrupa en pares o en cadenas cortas. Crece en agar MRS

(Anexo 1) formando colonias redondas, lisas, color crema, con una temperatura óptima de

crecimiento entre 30 y 42ºC y un rango de pH para desarrollo entre 4 y 7. Ha sido aislado de

diferentes ambientes incluyendo suelos, ensilados, productos de consumo diario como lácteos,

vegetales frescos y especias, y también del tracto gastrointestinal de algunos animales (Boone,

2001). Esta bacteria presenta un catabolismo homofermentativo (ver numeral 2.2.3) y muchas

de sus cepas son productoras de bacteriocinas (plantaricinas, lactolinas y pediocinas) con

actividad inhibitoria reconocida frente a L. monocytogenes (Loessner et al., 2003).

En caldo MRS (Anexo 1), L. plantarum crece de forma exponencial por alrededor de 8 horas y

antes de entrar a la fase estacionaria presenta una fase de desaceleración de dos horas

aproximadamente. Hacia la mitad de la fase logar ítmica ocurre la principal acumulación de

ácido láctico y después de 24 horas de cultivo, con una OD570 (densidad óptica) cercana a dos

se puede establecer que esta acumulación es de 1.2% (Vamanu et al., 2005).

2.2.2 Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei es un bacilo alargado Gram positivo, de bordes cuadrados con

tendencia a agruparse en cadenas, que presenta una morfología macroscópica (en agar MRS)

9

muy similar a la de L. plantarum aunque con colonias más transparentes. Su temperatura

óptima de crecimiento se encuentra entre 25 y 37°C, con rangos de pH entre 3.5 y 6.0, siendo

los productos lácteos su principal fuente de aislamiento (Boone, 2001). También hace parte de

las BAL homofermentativas y sus propiedades probióticas son ampliamente reconocidas porque

tiene la capacidad de degradar oligofructosa e inulina de cadena larga, favoreciendo así la

función intestinal (Mackras et al., 2005). Sin embargo, sus propiedades antagónicas han sido

poco estudiadas, pero se han reportado sus efectos inhibitorios frente a cepas de E. coli en

quesos manufacturados artesanalmente (Caridi, 2002).

2.2.3 FERM ENTACIÓN ÁCIDO LÁCTICA

Las BAL obtienen su energía a partir de la fermentación de azúcares y de compuestos

relacionados fermentables, por lo que su crecimiento se limita generalmente a hábitats ricos en

azúcares; y como su capacidad biosintética es reducida, requieren de medios de cultivo

complejos con factores de crecimiento espec íf icos para su óptimo desarrollo (Boone, 2001).

Especialmente en países subdesarrollados son muchos los productos fermentados

artesanalmente por BAL, las cuales son las responsables de su sabor, estabilidad e inocuidad

microbiológica. La Tabla 2 presenta algunos ejemplos de productos artesanales producidos con

BAL alrededor del mundo.

Tabla 2. Productos fermentados artesanalmente con BAL.

Región Productos lácteos Cereales y v egetales fermentados

Carnes fermentadas

Países de occidente Yogurt, queso Sauerkraut, pepinil los, olivas, masa ácidas, encurtidos Salami, jamones

Países del medio oriente

Tofú Encurtidos

Korea Kimchi Russia Kefir

Egipto Laban rayab, laban zeer Kishk

Nigeria Gari África del Sur Magou

Tailandia Nham Filipinas Balao balao México Pulque Pozol, colonche

Colombia Suero Costeño

Fuente: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) 1998. Revista del Departamento de Agricultura, Bioseguridad, Nutrición y Protección del Consumidor

10

Dentro de las BAL se diferencian dos grupos: el grupo de bacterias homofermentativas que sólo

producen ácido láctico y el grupo de las heterofermentativas que además de ácido láctico

producen otros compuestos, principalmente etanol y dióxido de carbono (Tabla 3). Los géneros

homofermentativos (Figura 1) producen más de 85% de ácido láctico a partir de glucosa (1.8

moles de ácido láctico por mol de glucosa) y los géneros heterofermentativos (Figura 2) solo

alrededor de 50% (1 mol de ácido láctico por mol de glucosa) (Eck, 1990; Stanley, 1998). Las

diferencias observadas en los productos de fermentación están determinadas por la presencia o

ausencia de la enzima aldolasa (enzima clave en la glucólisis), siendo las heterofermentativas las que carecen de aldolasa y su patrón de fermentación está marcado por la fosfocetolasa.

Tabla 3. Diferenciación de los principales géneros de BAL.

Género Forma celular y organización Fermentación Streptococcus spp. Cocos en cadena Homof ermentativ a

Leuconostoc spp. Cocos en cadena Heterof ermentativ a

Pediococcus spp. Cocos en tétradas Homof ermentativ a

Lactobacillus spp. Bacilos normalmente en cadena Homof ermentativ a Heterof ermentativ a

Enterococcus spp. Cocos en cadena Homof ermentativ a

Lactococcus spp. Cocos en cadena Homof ermentativ a

Fuente: Madigan et al., 1999. Brock Biología de los microorganismos. Octava edición rev isada. Prentice Hall Iberia. Madrid.

Figura 1. Formación de lactato por bacterias homofermentativas. La ruta metabólica usada es idéntica a la glucólisis. El producto final es el lactato el cual es excretado por las células al ambiente. Fuente: Paustian, T. 2000. Metabolism and Fermentation. University of Wisconsin - Madison http://dwb.unl.edu.

11

Figura 2. Fermentación de glucosa por bacterias heterofermentativas. En esta ruta metabólica no es util izada la vía de la glucólisis. Sólo un ATP es generado por glucosa fermentada. Fuente: Paustian, T. 2000. Metabolism and Fermentation. Univ ersity of Wisconsin - Madison http://dwb.unl.edu.

2.3 Escherichia coli

Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, f lagelado, no esporulado, oxidasa negativo y

anaerobio facultativo, cuyo rango óptimo de temperatura es de 22 a 37ºC (Boone, 2001).

Presenta una marcada tolerancia a ambientes adversos incluyendo pH ácidos y bajas

concentraciones de humedad. Se ha demostrado también que puede sobrevivir a los procesos

de fermentación, secado y almacenamiento a 4°C en salchichas fermentadas con pH menor de

4.5 por más de dos meses (Glass et al., 1992).

Normalmente E. coli hace parte de la microflora del tracto intestinal de humanos y animales de

sangre caliente, por lo que la mayoría de las cepas son consideradas inocuas. Sin embargo,

algunas patogénicas son responsables de causar enfermedades diarreicas que pueden ser

autolimitantes o pueden conllevar a serias complicaciones. En la actualidad se reconocen cinco

variedades enteropatógenas de E. coli: cepas enterotoxigénicas (ECET), enteroinvasivas

(ECEI), enteropatógenas clásicas (ECEP) , enterohemorrágicas (ECEH) y enteroagregativas

12

(ECEAgg). Dos de estas categorías reciben una atención especial por parte de la Organización

Mundial de la Salud (OMS): ECET ya que per se o asociada a rotavirus, ocasiona el 80% de los

casos de enfermedad diarreica aguda (EDA) a nivel mundial (Escartin, 2000).

En algunas regiones del mundo la EDA constituye la tercera parte de los ingresos en los

hospitales. Esta situación resulta más dramática en los países en vías de desarrollo, donde esta

enfermedad constituye la principal causa de mortalidad (Riverón, 1992). ECEH constituye la

otra categoría priorizada, en este caso, debido a su potencial letalidad, al estar asociada a cuadros clínicos de mayor riesgo para la salud humana como son la colitis hemorrágica y el

síndrome urémico hemolít ico (Boyce et al., 1995; Barreto et al., 1998; 1999; Nataro y Kaper,

1998). Por otro lado, ECEH está considerado dentro de los agentes zoonóticos cuya presencia

se ha incrementado en este siglo (Martínez, 1999).

La supervivencia de E. coli en medios no entéricos es muy limitada por lo que su presencia en

alimentos listos para el consumo se relaciona directamente con mala manipulación a lo largo de

la cadena de producción o con contaminación reciente. Por esta razón se utiliza como indicador

de contaminación fecal de los productos (Escartin, 2000).

2.4 Listeria monocytogenes Las listerias son bacilos f lagelados, Gram positivos que tienen un metabolismo aeróbico y

anaerobio facultativo, produciendo ácido láctico a partir de la fermentación de glucosa. Son

oxidasa negativos, producen ß-D-galactosidasa, no reducen nitratos y no hidrolizan caseina.

Son catalasa posit ivos pero pueden dar reacciones negativas cuando crecen en medios de

cultivo con concentraciones bajas de carne o de extracto de levadura (Boone, 2001).

El género Listeria esta distribuido ampliamente en la naturaleza: t ierra, barros, agua, aguas

residuales, ensilados, vegetales, carnes crudas, heces de animales y personas sanas. La

temperatura óptima para su crecimiento está entre 30 y 37ºC aunque pueden crecer a

temperaturas entre 0.4 y 45ºC, sobreviviendo a condiciones de congelación. Las listerias crecen

mejor a pH neutros y por lo general mueren a pH inferiores a 4.6. Sin embargo, su capacidad

para crecer en pH bajos, está influenciada por el tipo de acidulante, donde los ácidos orgánicos

son más los más inhibidores debido a su naturaleza lipofílica (Escartin, 2000).

13

Listeria monocytogenes es un patógeno emergente causante de la listeriosis y cuya transmisión

se da principalmente a través de alimentos contaminados. Tiene la particularidad de crecer en

diferentes ambientes y está ampliamente distribuido en la naturaleza por lo que se considera

ubicuo (Chae, 2000). Es capaz invadir células de mamíferos y propagarse a nivel intracelular

causando serias complicaciones que van desde abortos, desarrollo de meningoencefalitis y

hasta la muerte. Cualquier individuo está expuesto a este tipo de infecciones, pero en especial

las personas altamente susceptibles (mujeres embarazadas, recién nacidos, adultos mayores e

inmunosuprimidos), son las que presentan cuadros de mayor severidad (NIH, 2005).

Cerca de 75 millones de casos reportados por ETAs resultan en 32.5000 hospitalizaciones y

sólo en Estados Unidos se han reportado aproximadamente 5.000 muertes al año por este tipo

de infecciones (NIH, 2005). Se ha estimado un total de 2.500 casos de listeriosis por año,

siendo esta enfermedad la de mayor mortalidad dentro del grupo de las ETAs. En los casos

reportados de listeriosis, el 90% requiere de hospitalización, el 20% resulta en muerte y entre el

10 y el 30% de los sobrevivientes presentan enfermedad residual con afecciones neurológicas

(Escartin, 2000).

Listeria monocytogenes es un bacilo Gram posit ivo, móvil y de distribución universal en la

naturaleza. Una de las pr incipales características de L. monocytogenes es la capacidad de

adaptación y supervivencia en superficies de contacto con los alimentos, convirtiéndose en un

foco silencioso de contaminación (Tompkin, 2005). También puede sobrevivir a procesos de

congelación, a altas concentraciones de sal y en algunos casos al calor, siendo los alimentos

listos para el consumo y los manufacturados sin altos estándares de calidad los más

susceptibles a su contaminación (Cutter y Henning 2003).

2.5 MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA

La industria moderna de alimentos está siendo sometida a grandes cambios debido a la

demanda de los consumidores por adquirir alimentos inocuos, sanos, nutrit ivos, naturales y

mínimamente procesados. Estos requerimientos por parte de los consumidores exigen un

mayor conocimiento del comportamiento de los microorganismos en los diferentes sistemas

alimentarios y hacen que sean necesarias estrategias rápidas y proactivas para evaluar el riesgo microbiológico y poder producir alimentos microbiológicamente seguros (Schillinger,

1996).

14

La microbiología predictiva comprende el estudio cuantitativo del comportamiento microbiano en

alimentos. En función de los factores determinantes (intr ínsecos, extrínsecos, implícitos o de

elaboración y tratamiento) describe el crecimiento o inhibición de microorganismos en

alimentos. Este conocimiento objetivo y cuantitativo de la respuesta microbiana permite

entonces predecir el comportamiento de los microorganismos durante las operaciones de

procesado, distribución y almacenamiento mediante modelos matemáticos con base en

parámetros físico-químicos relevantes. La microbiología predictiva constituye, por lo tanto, un

enfoque interdisciplinario en el que se conjugan la microbiología, la matemática, la estadística, la tecnología de alimentos y de sistemas con el objeto de describir por medio de ecuaciones

matemáticas la respuesta de los microorganismos frente a combinaciones de condiciones

ambientales definidas y controladas (Cayré et al., 2004).

La microbiología predictiva de gran progreso, fortalecimiento y expansión en las últ imas

décadas es utilizada como soporte en sistemas de seguridad alimentaria como son HACCP y

ECRM dentro de los términos del objetivo de seguridad del alimento, OSA (Objetivo de

Seguridad Alimentario, Food Safety Objective, FSO) ( ICMSF, 1997, 1998, 2002). Sin embargo,

son pocos los estudios que se encuentran sobre cuantif icación de interferencia tipo

amensalismo o competición entre microorganismos. En la base de datos de ComBase

(Combined Database of Microbial Responses to Food Environments) se encontraron algunos

trabajos de investigación relacionados con el tema de este estudio (ComBase, 2006); sin

embargo en ninguno de ellos se realizaron cultivos mixtos con las BAL, L. plantarum y L.

paracasei, y la cepas patógenas, E. coli y L. monocytogenes.

Los datos encontrados para E. coli, se refieren en su mayoría a la respuesta bacteriana frente a

diferentes factores ambientales y cómo éstos influyen en el crecimiento del microorganismo. Ogw aro et al. (2002) determinaron la supervivencia de E. coli O157:H7 (ATCC 43888) en yogurt

fermentado artesanalmente por un cultivo mixto de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus

(NCIMB 11778) y Streptococcus salivarius ssp. thermophilus (NCIMB 110368). Rash et al.

(1982) evaluaron el crecimiento de cepas de E. coli enteropatogénicas en queso Camembert

elaborado con leche ultrafiltrada, utilizando una cepa de Penicillium candidum como cultivo

iniciador. Similar a este estudio, Arocha et al. (1992) evaluaron el comportamiento de E. coli

enterohemorrágica O157:H7 en queso Cottage con un 4% de cultivo iniciador, mientras que

Feresu y Nyati (1990) evaluaron la viabilidad cepas de E. coli patógenas y persistencia de E.

coli O157:H7 en productos de fermentación diaria como mantequillas caseras.

15

Riordan et al. (2000) evaluaron el efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento de E. coli

O157:H7 en pepperoni. En un trabajo similar, Faith et al. (1997) determinaron la viabilidad de E.

coli O157:H7 durante la manufactura de pepperoni, teniendo en cuenta variables como la

atmósfera modif icada en el empaque al vacío. Clavero y Beuchat (1996) determinaron la

supervivencia de E. coli O157:H7 en salami procesado, evaluando el efecto del pH, la actividad

de agua y la temperatura e el desarrollo del patógeno.

Por otro lado, en estudios relacionados con el crecimiento de L. monocytogenes a nivel de industria alimentar ia, se encontraron varios trabajos relacionados con la inhibición competit iva

pero solo unos cuantos generaron modelos predictivos. Buchanan et al. (1997) evalúan la

efectividad de Carnobacterium piscicola LK5 para controlar el crecimiento de L. monocytogenes

Scott A en alimentos refrigerados. Jeppesen y Huss (1993) determinaron la actividad

antagónica de dos BAL contra L. monocytogenes y Y. enterocolitica en pescados refrigerados

a 5°C. Así mismo, Amezquita y Brashears (2002) evaluaron la inhibición competitiva de L.

monocytogenes en alimentos listos para el consumo por bacterias ácido lácticas y Schillinger et

al. (2001) evaluaron la eficacia de la nisina en combinación con cult ivos protectores contra L.

monocytogenes Scott A en tofú.

Se han realizado diferentes estudios para evaluar el crecimiento de L. monocytogenes en

productos cárnicos entre los cuales está el realizado por Duffy et al. (1994) quienes analizaron

el comportamiento de L. monocytogenes en presencia de L. innocua durante el

almacenamiento de f iletes de carne a 0 y a 10°C empacados al vacío. Katla et al. (2002)

evaluaron la inhibición de L. monocytogenes en pollo por adición de sakacina P y Lactobacillus

sakei productor de sakacina P. Barakat y Harris (1999) determinaron el crecimiento de L.

monocytogenes y Y. enterocolitica sobre carme cocida empacada en atmósfera modif icada en

presencia y ausencia de microbiota normal. Porto et al. (2002) establecieron la viabilidad de

cinco cepas de L. monocytogenes en salchichas empacadas comercialmente y preparadas con

y sin lactato de potasio al 2 y al 3%. Adicional a estos trabajos, Degnan et al. (1992) aplicaron

una cepa de Pediococcus acidilacti para controlar L. monocytogenes en beefs empacados.

Beumer et al. (1996) evaluaron el crecimiento de Listeria monocytogenes sobre tajadas de pollo

y carne procesados. Mano et al. (1995) determinaron el crecimiento y/o supervivencia de f lora

natural y L. monocytogenes sobre porciones de pavo y cerdo refrigeradas y empacadas bajo

atmósfera modif icada.

16

En cuanto a estudios relacionados con generación de modelos, Giménez y Dalgaard (2004)

modelaron el crecimiento simultáneo de L. monocytogenes y microorganismos deteriorativos en

salmón ahumado y propusieron una forma diferencial del modelo logístico. El crecimiento

simultáneo de E. coli O157:H7 y la microflora natural de la carne molida fue modelado por

Vimont et al. (2006) con un enfoque lineal de curvas fragmentadas. Breidt y Fleming (1998)

abordaron la modelación del crecimiento interactivo entre L. monocytogenes y Lactococcus

lactis en caldo de vegetales con un modelo dinámico de índole pseudo-mecanístico que

involucra el efecto del ácido láctico y el pH sobre el crecimiento de cult ivos en competencia. 2.5.1 INTRODUCCIÓN A LOS MODELOS PREDICTIVOS

La microbiología predictiva se construye a partir de las premisas de igualdad en la respuesta de

los microorganismos ante los mismos factores condicionales relevantes y de reconocer que el

efecto de estos factores puede predecirse por modelos matemáticos derivados de estudios

cuantitativos en poblaciones microbianas (Baranyi y Roberts, 1994).

El desarrollo de modelos predictivos contempla varias fases secuenciales entre las que se

encuentran el diseño experimental, la obtención sistémica de los datos experimentales, la

descripción matemática, la validación y el mantenimiento del modelo. Un buen diseño

experimental es fundamental para el desarrollo de los modelos, los cuales deben ser lo más

simples posible para su fácil aplicación. Este diseño contempla la definición de las

características relacionadas con las variables independientes y dependientes, el inóculo y el

modelo experimental. De esta forma, el comportamiento microbiano está determinado

básicamente por tres a cinco factores relevantes (variables independientes): temperatura, pH,

actividad de agua, atmósfera y/o presencia de inhibidores. Sin embargo, otros factores

particulares que influyen sobre el comportamiento microbiano deben ser identif icados para su

posterior inclusión en los modelos (Zw ietering, 1990).

En el área de la microbiología predictiva la variable dependiente inicialmente es la respuesta

primaria correspondiente a los cambios de concentración en una población microbiana en

función del tiempo (McMeekin et al., 1997). El resultado de este seguimiento son las llamadas

curvas de crecimiento o de inactivación de las cuales se pueden derivar los respectivos

parámetros cinéticos de crecimiento o inactivación (Zw ietering, 1990).

17

La curva de crecimiento microbiano en un sistema cerrado (como es un alimento) presenta tres

fases definidas (Zwietering, 1990). Una fase inicial, la fase lag, de latencia o de adaptación en la

que la tasa de crecimiento parte de cero y comienza a acelerarse durante cierto periodo de

tiempo. Durante esta fase, las células microbianas se adaptan f isiológicamente a su nuevo

ambiente llevando a cabo procesos de síntesis o de reparación si es el caso. La extensión de

esta fase depende del ambiente y del estado f isiológico de la población microbiana.

En la siguiente fase, la fase log, se alcanza la máxima tasa de crecimiento caracterizada por un crecimiento exponencial constante. A la tercera fase, la fase estacionaria, la antecede una

etapa de transición llamada de desaceleración que se caracteriza por una reducción gradual de

la tasa de crecimiento debido a limitación de nutrientes y/o a concentración de productos

tóxicos. Durante la fase estacionaria se alcanza el máximo número de microorganismos posible

y no se observa crecimiento neto, representando así la capacidad de soporte para el ambiente

en particular. Adicionalmente, durante el crecimiento microbiano también puede observarse una

fase f inal de decrecimiento o muerte (Zw ietering, 1990).

Así, cuando la curva de crecimiento se define por el logaritmo del número de organismos

presentes en una muestra determinada, a través del tiempo, estos cambios en la tasa de

crecimiento resultan en una curva sigmoidal (Zw ietering, 1990), como se presenta en la Figura

3.

Para efectos de modelación en el contexto de la microbiología predictiva las fases relevantes

las constituyen generalmente la fase lag y de crecimiento exponencial. Sin embargo, la fase

estacionaria y luego la fase de muerte pueden proveer información adicional para entender el

comportamiento microbiano en relación con los factores ambientales asociados a un alimento

en particular y para conocer el tipo de interacción con otras poblaciones microbianas

(Zw ietering, 1990).

La mayoría de los modelos describen el crecimiento o la inactivación de una sola cepa

microbiana, por tanto, para la generación de modelos de crecimiento seguros o conservadores,

se deben seleccionar cepas con la tasa de crecimiento más rápida y para modelos de

inactivación con las mismas características anteriores, las cepas más resistentes a los

tratamientos o condiciones de inhibición y en fase estacionaría como estado f isiológico más

resistente a condiciones de estrés (Baranyi y Roberts, 1994).

18

Figura 3. Curv a de crecimiento típica para una población bacteriana en un sistema cerrado. Fuente: Adaptada de Tullmin, M. 2001. Water Pages. Corrosion Club. www.corrosion-club.com/waterbactgrowth.htm.

En la actualidad se tiende a trabajar sobre la generación de modelos iniciados con cultivos

mixtos (cócteles de múltiples cepas microbianas) que representarían el peor escenario. La

mayor parte de los modelos de crecimiento utilizan como inóculo, cultivos de 18 a 14 horas en

caldo nutritivo y temperatura de crecimiento favorable, pero siempre se deben utilizar inóculos

estandarizados para garantizar así la reproducibilidad experimental. En general, el tamaño del

inóculo parece no afectar la velocidad de crecimiento ni la concentración de microorganismos

máxima posible. Pero si puede afectar la duración de la fase lag dependiendo de la metodología

de cuantif icación a emplear y por lo tanto de la variable de respuesta a ser modelada

(McMeekin et al., 1997).

En la microbiología predictiva se utilizan métodos de cuantif icación directos e indirectos. Los

métodos directos distinguen y cuantif ican individualmente los microorganismos mientras que los

indirectos miden alguna propiedad de la población microbiana. En el caso de los métodos

indirectos se requiere de una curva de calibración para poder relacionar la propiedad

cuantif icada con la concentración de microorganismos. El método de cuantif icación preferido

para el desarrollo de modelos predictivos es el recuento en placa, ya que una de las ventajas de

Fase Lag

Fase Exponencial

Fase Estacionaria

Fase de Muerte

Tiempo

Log UFC/mL

19

este método frente a otros, es que su límite mínimo de detección es inferior a 20 unidades

formadoras de colonia (UFC) por mL (Zw ietering, 1990).

En la actualidad se han desarrollado ya un buen número de modelos para describir el

crecimiento de microorganismos (patógenos y deteriorantes de alimentos), generalmente en

cultivo individual, en caldos óptimos para su crecimiento y en matrices simuladoras de alimentos

y en alimentos. De la misma manera se han generado modelos que describen la inactivación o

inhibición microbiana frente a diferentes condiciones de tratamiento (Baranyi y Roberts, 2004).

De acuerdo al tipo de curva, “crecimiento o sobrevivencia”, los modelos aplicados pueden

provenir de diferentes enfoques. Estos pueden ser modelos lineales, modelos no lineales o

modelos de distribución (McKellar y Lu, 2004). Ecuaciones como la logística, Gompertz

modif icado, Baranyi y Richards (Baranyi 1993) son funciones sigmoidales de uso frecuente que

describen de forma adecuada el crecimiento de microorganismos (número de células versus

tiempo) y la inactivación cuando se utilizan de forma inversa. También se encuentran algunas

aplicaciones de modelos dinámicos basados en ecuaciones diferenciales. Dentro de los pocos

estudios que describen el crecimiento de cultivos mixtos (BAL con diferentes patógenos como L.

monocytogenes), Breidt y Fleming (1998) proponen este t ipo de ecuaciones.

De forma general los modelos predictivos se construyen a partir de sistemas modelo (entorno

controlado) para luego ser validados en su propósito. La validación es una etapa importante en

el desarrollo de los modelos ya que ésta determina su aplicabilidad en alimentos (McMeekin et

al., 1997). En un proceso de validación las predicciones hechas por el modelo se comparan con

datos observados independientes provenientes de una matriz alimentar ía. Un modelo validado

debe predecir de forma consistente en la zona de seguridad. Por lo tanto, un modelo de

crecimiento para patógenos, debe ligeramente sobreestimar o idealmente coincidir exactamente

con las observaciones reales y para el caso de un modelo de inactivación, éste debe subestimar

ligeramente los datos experimentales de sobrevivientes (McKellar y Lu, 2004). La falta de

conocimiento de factores relevantes en los alimentos son los que realmente ocasionan la

inexactitud de algunos modelos. Los modelos pueden someterse a diferentes niveles de

validación. Se puede conducir una validación a partir de datos experimentales independientes a

los que se utilizaron para generar el modelo y también se pueden validar usando datos

experimentales provenientes de la literatura. Sin embargo, la validación más confiable es la

realizada sobre la propia matriz alimentaria, recolectando sistemáticamente datos

experimentales y evaluando el desempeño del modelo en dicha matriz, que f inalmente

20

representa las condiciones reales. Una vez que un modelo ha sido validado e implementado en

la práctica se debe definir un procedimiento que permita identif icar en qué momento el modelo

se torna obsoleto y que permita as í mantener el modelo actualizado (McMeekin et al., 1997).

2.5.2 TIPOS DE MODELOS

Actualmente la mayoría de los modelos predictivos son empíricos o pseudo-mecanísticos y

algunos pocos son considerados mecanísticos o teoréticos (“white box models”). Estos últ imos se basan en leyes físico-químicas y en el conocimiento de la estructura interna y funcional del

sistema. Los modelos empíricos o experimentales (“black box models”) sólo describen el

sistema observado y aunque su funcionalidad es ahora limitada, la evolución hacia modelos

más mecanísticos se logrará en la medida que se conozcan las bases y las causas de la

interacción entre los microorganismos y su entorno. Por lo tanto, la selección de un modelo

dependerá del conocimiento sobre un sistema o proceso. Otra clasif icación de los modelos los

divide en cinéticos y probabilísticos. Los cinéticos corresponden a la modelación de la extensión

y la velocidad de crecimiento o inactivación del microorganismo de interés, y los probabilísticos

prevén la probabilidad de algún evento (Ross y McMeekin, 2003).

2.5.3 DESARROLLO DE MODELOS

Los modelos predictivos se categorizan en modelos primarios, secundarios y terciarios. Los

primarios describen el comportamiento de los microorganismos en función del tiempo mientras

que los secundarios describen cómo los parámetros de la función dependen de las variables

independientes.

Los modelos de nivel primario describen el cambio en el número de microorganismos

(crecimiento o inactivación), la formación de una toxina u otro metabolito en función del tiempo.

En la Figura 4 se presentan los parámetros más relevantes dentro de un modelo de crecimiento

primario.

21

Figura 4. Modelo primario de crecimiento e identificación de los parámetros más relevantes. Fuente: García Gimeno, R.M. y Zurero Cosano, G. 1999.

Los modelos secundarios más empleados para caracterizar el crecimiento microbiano a

condiciones ambientales definidas respecto a sus parámetros cinéticos, fase lag, tasa de

crecimiento y concentración máxima son:

• Ecuación de Arrhenius: asume que la velocidad de crecimiento esta controlada por la velocidad límite de la reacción enzimática.

• Ecuación de Bélerádek: se basa en la relación lineal entre la raíz cuadrada de la velocidad de

crecimiento y la temperatura.

• Ecuaciones polinomiales: no asumen ninguna relación mecanística entre la variable

dependiente y la variable independiente. La ecuación solo representa el mejor ajuste a un

conjunto de datos en particular. Se obtienen superficies de respuesta cuando se cuantif ica la

interacción de más de un factor sobre un parámetro cinético (Figura 5).

22

Figura 5. Modelo secundario de superficie de respuesta. En la gráfica se describe la dependencia de la tasa específica de crecimiento en función de la temperatura y del pH. Fuente: Earnshaw, R. 1997.

Los llamados modelos terciarios comprenden rutinas de softw are basadas en modelos cinéticos

o probabilísticos primarios y/o secundarios (Whiting, 1995) como lo son:

• Pathogen Modeling Program PMP www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm (Figura 6)

• Growth Predictor www.ifr.ac.uk/Safety/Grow th Predictor/ (Figura 7)

• Sym´Previus www.symprevius.net

• Seafood Spoilage and Safety Predictor SSP www.dfu.min.dk/micro/sssp/

• Salmonella enteriditis Risk Assessment SERA (USDA)

• Microfit and DMFit www.ifr.bbsrc.ac.uk.

• ComBase Predictor http://ifrsvwwwdev.ifrn.bbsrc.ac.uk/CombasePMP/CBP/Login.aspx

(Figura 8)

23

• Perfringens Predictor (Figura 9) http://ifrsvwwwdev.ifrn.bbsrc.ac.uk/PerfringensPredictor/Login.aspx

24

25

Figura 6. Interfase Pathogen Modelling Program. Con diferentes opciones de aplicación (crecimiento, sobrevivencia, probabilidad)

Figura 7. Interfase Growth Predictor. Aplicación para predecir el crecimiento y sobrevivencia de microorganismos.

Figura 8. Interfase ComBase Predictor. Aplicación para predecir el comportamiento de microorganismos en diversas matrices.

26

Figura 9. Interfase Perfringens Predictor. Aplicación para predecir crecimiento de C. perfringens en carne.

La base datos Combase (www.combase.cc) que recopila miles de curvas de crecimiento e

inactivación en caldos y matrices alimentarias ha sido utilizadas para desarrollar el PMP y el

Growth Predictor. En la Figura 10 se presenta un ejemplo con los criterios de búsqueda (a) y

resultados del ComBase Internet brow ser (b).

a.

27

b. Figura 10. Criterios de búsqueda y resultados del ComBase Internet browser. Criterios de búsqueda (a) y resultados del ComBase Internet browser (b). 2.5.4 MODELOS PRIMARIOS DE CRECIMIENTO

El crecimiento de microorganismos en los alimentos está determinado por la acción conjunta de

diferentes factores físicos y químicos llamados factores intrínsecos, extrínsecos, implícitos y de

elaboración o tratamiento. Los factores intrínsecos comprenden los nutrientes, el pH, la

capacidad tampón, el potencial de redox, la actividad de agua, y los constituyentes y estructuras

antimicrobianas. La humedad relativa, la temperatura y la atmósfera gaseosa constituyen los

factores extrínsecos. Mientras que los factores implícitos se relacionan con las características

propias de cada microorganismo, como es la velocidad de crecimiento espec íf ica, por eso, la

identif icación de los factores más influyentes sobre el crecimiento de microorganismos se hace

necesaria para el desarrollo de los modelos predictivos. El lavado, envasado, irradiación,

pasteurización son entre otros los factores de elaboración o tratamiento (Ross y McMeekin, 1994).

Los modelos de crecimiento a nivel primario más utilizados se presentan en la Figura 11 y la

representación gráfica de algunos de ellos se representa en la Figura 12.

28

Figura 11 Representación matemática de algunos modelos de crecimiento primarios. Fuente: Dalgaard, P. 2004. Predictive microbiology – concept, models and software. www.df u.min.dk/mico7pd.htm.

Primary growth models

Primary growth models

29

Figura 12 Representación gráfica de algunos modelos de crecimiento primario. Fuente: Dalgaard, P. 2004. Predictive microbiology – concept, models and software. www.dfu.min.dk/mico7pd.htm.

Aunque existen diversas ecuaciones para modelar curvas de crecimiento microbiano de forma

sigmoidal, los modelos empleados con mayor frecuencia son: la ecuación modif icada de

Gompertz y la ecuación de Baranyi.

• Ecuación de Gompertz modificada (Zwietering et al., 1990) cuya expresión matemática es:

Donde:

L(t) = logaritmo decimal del recuento de microorganismos a un tiempo t.

A = logaritmo decimal del recuento inicial de microorganismos.

C = logar itmo decimal de la concentración máxima de microorganismos (valor as íntota

superior).

M = tiempo al cual el cultivo alcanza su máxima y absoluto velocidad de crecimiento (punto de

inflexión de la curva).

B = velocidad de crecimiento relativa al t iempo M.

Los cuatro parámetros de esta ecuación (A, C, M, y B) se encuentran relacionados

matemáticamente con los parámetros cinéticos característicos de crecimiento microbiano como

se muestra a continuación.

, velocidad de crecimiento exponencial

, tiempo de generación

, duración de la fase de latencia

, densidad máxima de población

)))(exp(exp()( MtBCAtL −−−+=

eBC

=µ

BCe

GT)2(log

=

)/1( BM=λ

CADMP +=

30

La ecuación modif icada de Gompertz es utilizada en los programas de predicción Pathogen

Modeling Program y Grow th Predictor.

• Ecuación de Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994) pretende incluir un enfoque más mecanístico: presenta una fase de crecimiento exponencial lineal y una fase lag determinada

por una función de ajuste α(t).

Siendo

N(t) = número de microorganismos en el t iempo t = 0.

A = valor asíntota inferior, log N-∞.

C = valor asíntota superior, densidad máxima, log N+∞.

µmax = tasa de crecimiento exponencial máxima.

A(t) = integral de la función de ajuste, α(t).

El modelo Baranyi presenta el importante concepto de la fase lag como una combinación del

estado f isiológico de las células (q0) y de la adaptación al nuevo ambiente (v). Cuando las

células microbianas no se encuentran relativamente listas para crecer (q0 es pequeño) o cuando

su adaptación es lenta (v es pequeño) entonces la fase lag se extiende. Así:

2.5.5 AJUSTE Y SELECCIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS Los modelos no lineales se ajustan mediante el método de regresión no lineal basado en el uso

de algoritmos de estimación iterativa. Durante el proceso de regresión se minimiza la suma del

cuadrado (residuos) de las distancias verticales de los puntos experimentales de la curva del

modelo. Por esta razón se le denomina como método de mínimos cuadrados. Una vez

ajustados los modelos matemáticos más adecuados al tema de estudio y a la condición experimental, se evalúa la bondad de ajuste que permitirá llegar a seleccionar el modelo más

adecuado (Baranyi y Roberts, 1994).

))/)1ln(()( )()(max)(max

ACtt eeAAtLogN −−−+= αµµ

))exp(/()( 00 vtqqt −+=α

31

La bondad de ajuste del modelo a los datos experimentales se relaciona con la capacidad de un

determinado modelo matemático para describir el comportamiento del microorganismo de

interés a condiciones establecidas. Los criterios para evaluar qué tan adecuadamente se ajusta

un modelo a los datos experimentales son generalmente: la medida del error o residuo, el

coeficiente de determinación, el análisis de residuos y la estimación de los parámetros. El

principio de parsimonia representa el aspecto de simplicidad de un modelo. Ante dos modelos

posibles, similares en otros aspectos, se debe preferir el más sencillo, el que requiera de menos

supuestos para su construcción, pues relacionado con la simplicidad de un modelo esta su aplicabilidad y facilidad de uso (Baranyi et al., 1999).

2.5.6 VALIDACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS Los modelos predictivos se desarrollan en condiciones controladas reproducibles de laboratorio

y medios de cultivo. Para evaluar la aplicabilidad del mismo modelo en otra matriz y condiciones

ambientales algo diferentes se requiere del proceso de validación del modelo. Un modelo

predictivo que no ha sido validado no es confiable ya que no se conoce su desempeño en

condiciones diferentes a las que lo generaron (Baranyi et al., 1999).

La validación es un proceso que consiste en ajustar un modelo predictivo en particular a datos

obtenidos bajo nuevas condiciones. Para evaluar el desempeño del modelo existen métodos

gráficos y estadísticos. El análisis visual consiste en la construcción de gráficas que muestren

los datos experimentales y la curva de predicción del modelo a validar. Si la curva de predicción

se sitúa cercana a los datos observados se puede concluir que el modelo predictivo cumple su

función adecuadamente. Otra forma visual de análisis consiste en generar gráficas que incluyan

los datos observados versus los predichos. Si los datos predichos se localizan sobre la línea de

equivalencia o cerca de ella se trata de un modelo que predice adecuadamente. Para este tipo

de gráfica el coeficiente de correlación (r) también puede ayudar a la determinación del

desempeño del modelo predictivo (Baranyi et al., 1999). Para la evaluación matemática del

desempeño de modelos predictivos se pueden calcular diferentes criterios: el factor de exactitud

(Af), el porcentaje de discrepancia (%D), el factor de sesgo o bias (Bf), el porcentaje de bias o

sesgo (%B), la prueba del Ji cuadrado.

El Af propuesto por Ross (1996) y su redefinición, el %D propuesto por Baranyi et al. (1999)

indican en cuánto dif ieren los valores predichos de los observados. Entre más alto sea el valor

de Af menos preciso es el estimado medio. Un valor Af de 1 representa un perfecto ajuste del

32

modelo a los datos experimentales. El Bf indica en cuánto el modelo sistemáticamente sobre-

(Bf > 1) o sub-estima (Bf < 1) los datos experimentales. Un ajuste perfecto entre valores

predichos y observados se representan por un valor de Bf de 1 (Ross, 1996). Sin embargo, el

valor medio de Bf debe interpretarse cuidadosamente ya que sub-estimaciones grandes pueden

ser suprimidas por sobre-predicciones grandes estableciendo un valor de Bf cercano a la

unidad. El %B es la redefinición del Bf en términos de porcentaje y propuesto por Baranyi et al.

(1999).

31

3. JUSTIFICACIÓN

Listeria monocytogenes y E. coli son patógenos de gran importancia en salud pública, porque

además de tener una alta incidencia a nivel mundial, las enfermedades que producen ocupan los primeros lugares en mortalidad (NHI, 2005). Se estima un total de 2.500 casos de listeriosis

por año, siendo esta enfermedad la que ocasiona mayor número de muertes dentro del grupo

de las ETAs (Escartin, 2000); y se sabe también, que el 80% de los casos de enfermedad

diarreica aguda (EDA) a nivel mundial se deben a E. coli (Escartin, 2000), donde esta patología

constituye la principal causa de muerte en los países en vías de desarrollo (Riverón, 1992);

siendo en ambos casos, los alimentos listos para el consumo y los manufacturados sin altos

estándares de calidad, los más susceptibles a su contaminación (Cutter y Henning 2003).

Adicionalmente, se ha comprobado que estos patógenos pueden sobrevivir a procesos de

congelación, son resistentes a desinfectantes convencionales y forman biopelículas en

superficies de contacto con los alimentos, convirtiéndose en un foco silencioso de

contaminación (Tompkin, 2005; Glass et al., 1992).

Por eso, en busca de nuevos mecanismos para controlar patógenos en alimentos, se ha

encontrado que las BAL tienen efectos antagónicos frente a diferentes microorganismos y de

ahí su potencial uso como agentes biocontroladores, pues además de secretar bacteriocinas,

tienen la capacidad de inhibir patógenos a través de compuestos como ácido láctico, diacetilo y

peróxido de hidrógeno, siendo la aplicación de f lora competitiva una buena alternativa para

garantizar la seguridad e inocuidad de los alimentos. Sin embargo, poco se conoce sobre la

interacción entre las BAL y los patógenos dentro de matr ices alimentarias y específ icamente en

la leche, donde el tipo de interacción, amensalismo o competición, así como la dinámica de

poblaciones de dichos productos es poco conocida en la actualidad (Tannock, 2004).

Teniendo en cuenta este panorama, se pretende con este trabajo utilizar la microbiología

predictiva como herramienta para el estudio y la modelación del crecimiento interactivo entre

BAL (L. plantarum y L. paracasei) y patógenos asociados a alimentos (L. monocytogenes y E.

coli), con el f in de establecer la viabilidad en la aplicación de las BAL dentro de los procesos de

biocontrol en la industria de alimentos y explicando también la cinética de dicha interacción. Con

32

la validación de los modelos predictivos, para este caso en leche entera UHT, se busca evaluar

el desempeño de los modelos desarrollados en caldo estándar, cuando son aplicados bajo otras

condiciones ambientales, siendo la leche entera un medio rico en nutrientes que además de

facilitar el crecimiento de los cuatro microorganismos en estudio, permitirá un acercamiento

controlado a la realidad de los procesos industriales.

A nivel nacional, este trabajo es pionero porque hasta el momento no se habían desarrollado

estudios sobre el crecimiento simultáneo entre BAL y patógenos de interés en alimentos utilizado la microbiología predictiva como herramienta para describir su comportamiento en una

matriz alimentaria. Adicionalmente, en otros países tampoco se han reportado trabajos similares

empleando cult ivos mixtos con las BAL, L. plantarum y L. paracasei, y las cepas patógenas, E.

coli y L. monocytogenes, siendo la literatura sobre la cuantif icación y matemática de

interacciones entre bacterias muy limitada. Todo esto constituye una buena oportunidad para

hacer que nuestro país participe activamente en la solución de las problemáticas que la

industria de alimentos presenta en el ámbito internacional, generando nuevas políticas y

planteando alternativas que pueden contribuir a la calidad y al mejoramiento continuo de los

productos.

Este estudio también representa un gran aporte al conocimiento y a la investigación en los

temas relacionados con ecología microbiana y dinámica de poblaciones, pues servirá de base a

la industria de alimentos en lo que se refiere a la reducción de la contaminación mediante el

biocontrol, y al desarrollo y optimización de productos, a través de la estimación cuantitativa de

las respuestas microbianas, favoreciendo de manera indirecta la salud y la calidad de vida de la

población en general, por la producción de alimentos sanos e inocuos.

33

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Estudiar y modelar el crecimiento de bacterias ácido lácticas (BAL) y patógenos asociados a

alimentos en cultivo mixto, a part ir de un medio de cult ivo estándar y una matriz alimentaria.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Modelar el crecimiento individual de dos especies de BAL, una como productora de

bacteriocinas (Lactobacillus plantarum) y otra como no productora de bacteriocinas

(Lactobacillus paracasei), en caldo MRS.

• Modelar el crecimiento individual de dos especies de patógenos asociados a alimentos,

Escherichia coli como bacteria Gram negativa y Listeria monocytogenes como bacteria

Gram positiva, en caldo MRS.

• Modelar el crecimiento en cultivo mixto de: L. plantarum y E. coli, L. plantarum y L.

monocytogenes, L. paracasei y E. coli; y L. paracasei y L. monocytogenes.

• Validar en leche entera UHT los modelos predictivos de crecimiento, tanto en cult ivo

individual como en cult ivo mixto, desarrollados previamente en medio estándar.

• Generar curvas de crecimiento en cultivo mixto extendidas y proponer un modelo

descriptivo preliminar.

34

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 FASES EXPERIM ENTALES

Generación de curv as de crecimiento bacteriano indiv iduales en medios de cultivo

Generación de curv as de crecimiento bacterianas mixtas en medios de cultivo

Selección de modelos predictivos

Ev aluación de la bondad de ajuste de los modelos predictiv os

FASE 1

FASE 2

Generación de curv as de crecimiento bacteriano indiv idual en leche entera UHT

Generación de curv as de crecimiento bacterianas mixtas en leche entera UHT

Validación de modelos predictiv os

FASE 3

Generación de curv as extensas de crecimiento mixto en caldo MRS

Generación de curv as extensas de crecimiento mixto en leche entera UHT

Selección de modelos predictivos

Ev aluación de la bondad de ajuste de los modelos predictivos

35

5.2 METODOLOGÍA 5.2.1 SELECCIÓN DE BAL PARA EL ESTABLECIMIENTO DE LOS CULTIVOS MIXTOS

CON PATÓGENOS ASOCIADOS A ALIMENTOS: Escherichia coli y L.

monocytogenes

Escherichia coli y L. monocytogenes fueron los dos patógenos asociados a alimentos

seleccionados para este estudio ya que se encuentran frecuentemente en muestras de leche cruda y se caracterizan por tener diferente estructura de la pared celular. Su procedencia se

describe a continuación:

• Escherichia coli ECO25: obtenida del cepario del Laboratorio de Ecología Microbiana

de Alimentos LEMA de la Universidad de Los Andes. Aislada de un jamón de plaza de

mercado.

• Listeria monocytogenes LM O26: obtenida del cepario del Laboratorio de Ecología

Microbiana de Alimentos LEMA de la Universidad de Los Andes. Aislada de un queso

comercial.

Como criterio de selección de las BAL se utilizó la capacidad de producir o no sustancias BLIS (bacteriocin-like inhibitory substances). Para poder obtener diferentes patrones de inhibición en

cultivo mixto se empleó una cepa BAL productora de BLIS y otra cepa no productora de BLIS.

Para seleccionar las BAL se verif icó el efecto inhibitorio de una colección de 11 cepas BAL de

origen alimentario (Tabla 26, Anexo 3) frente a los dos patógenos en estudio (E. coli y L.

monocytogenes).

Para la verif icación de la producción de BLIS se tuvo como referencia la técnica ¨Spot on the

law n̈ utilizada en diferentes trabajos previamente reportados (Cintas, 1998; Loessner, 2003;

Eppert, 1997) con algunas modif icaciones (Figura 13).

Para el ensayo se realizaron activaciones de las cepas reto por duplicado a partir de las perlas

de congelación, inoculándolas de manera independiente en 5mL de caldo MRS. Los inóculos

se incubaron a 37°C, hasta alcanzar concentraciones aproximadas del orden de 109 UFC/mL.

36

Cepas congelad as (Perlas de crio conservación)

Caldo MRS con 1 perla BAL Primera activación

BAL Réplica 1 Segunda activación

100µ L

Incubación 24 horas 37°C

Incubación 24 horas BAL Réplica 2

Segunda activación

Medición de pH Neutralización con N AOH 0.1N

Centrifugación 9335.3xg/ 10min

Sobrenadante neutralizado Sobrenadante no neutralizado

Concentración Incubación 37°C

1 semana

Cepa patógena Segunda activación

100 mL

Mueller Hinton Cepa patógena y sobrenadantes en

pozos

Medición de h alos de inhibición post in cubación

1 mL

40µ L 40µ L

Figura 13. Diagrama de flujo del ensayo de verificación de la producción de BLIS (Bacteriocin-Like Inhibitory Substances) en BAL.

37

A los caldos crecidos con las BAL se les determinó el pH por medio de potenciómetro y los

inóculos que presentaron pH menores a 6,0 fueron neutralizados con NaOH 0.1N (una de las

dos réplicas) hasta obtener valores entre 6,0 y 6,5. Finalmente todos los tubos se marcaron y

organizaron en dos grupos: la réplica neutralizada y la no neutralizada. Ambas réplicas de cada

inóculo se centrifugaron a 9335,3xg por 10 minutos y los sobrenadantes recolectados se

transfirieron en condiciones asépticas a tubos eppendorf estériles y se incubaron a 37°C

durante una semana para su concentración.

Después del periodo de incubación, se realizó la activación de las cepas indicadoras L.

monocytogenes y E. coli, teniendo en cuenta las mismas condiciones empleadas para la

activación de las cepas reto. De los caldos crecidos con las bacterias patógenas se transfirió

1mL de inóculo a 100mL de medio Mueller Hinton estéril. Después de homogenizado el medio

se prepararon cajas de Petri estériles con 20 mL y una vez solidif icado se realizaron cuatro

pozos con pipetas pasteur estériles en cada una de las placas de petri. Posteriormente se

tomaron 40µL de cada uno de los sobrenadantes concentrados y se transfirieron a pozos.

Todas las placas de petri se incubaron por 48 horas a 37°C. Las lecturas se efectuaron

midiendo el diámetro de los halos de inhibición. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Finalmente, después de evaluar y analizar los resultados de los ensayos de inhibición se

eligieron para el estudio las cepas Lactobacillus plantarum WS4174 y Lactobacillus paracasei

LB279 por presentar el mejor efecto antagónico frente a las cepas indicadoras (Anexo 3). 5.2.2 MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo empleados en este proyecto se enuncian a continuación y su

composición se presenta en el Anexo 1:

• Agar MRS (Agar para Lactobacillus según DE MA N, ROGOSA y SHARPE) (Scharlau

Chemie S.A).

• Caldo MRS (Caldo para Lactobacillus según DE MA N, ROGOSA y SHARPE) (Scharlau Chemie S.A).

• Agar Mueller Hinton (Merck KGaA).

• Agar EMB (Agar eosina-azul de metileno-lactosa según LEV INE) (Merck KGaA).

• Agar Palcam (Agar selectivo para Listeria según VAN NETTEN et al.) (Merck KGaA).

• Agar Plate Count (Agar peptona de caseína-glucosa-extracto de levadura) (Merck KGaA).

38

5.2.3 MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS

Las cepas bacterianas se conservaron a -70°C en viales de crio-conservación con perlas

CryoBankTM según instrucciones del fabricante (COPAN, 2005). La activación de las cuatro

cepas bacterianas se realizó en caldo MRS o en leche entera ultra pasteurizada (UHT) de una

reconocida marca comercial cuya composición química se encuentra referenciada en el Anexo

2 según las etiquetas del fabricante, dependiendo del caso, a 37°C por 24 horas.

Como control de identidad y verif icación de las cepas bacterianas se realizaron cultivos

constantes en diferentes medios de cultivo a 37°C por 24 horas: para L. plantarum y L.

paracasei en agar MRS, para E. coli en el medio EMB y para el mantenimiento de L.

monocytogenes en Palcam para Listeria con su respectivo suplemento. Adicionalmente se

verif icó su morfología y respuesta a la tinción de Gram bajo el microscopio.

5.2.4 MÉTODOS ESTADÍSTICOS

La determinación de diferencias signif icativas entre medias se realizó mediante análisis de

varianza (ANOVA) con P < 0.05 y después de un valor F signif icativo se aplicó el test de Tukey

con un nivel de signif icancia de 5% (Daniel, 2002). Este tratamiento se utilizó para el análisis de

los resultados obtenidos a partir de los siguientes procesos: validación estadística del método

modif icado de recuento en placa, estandarización de inóculos, validación estadística de cultivos

sincronizados, análisis de tasas de crecimiento, análisis de fases lag, análisis de la máxima

concentración alcanzada, análisis de la concentración inicial, análisis de valores de pH y

validación estadística en leche entera UHT del modelo desarrollado en caldo MRS.

La prueba T se empleó para determinar diferencias signif icativas entre dos medias y se aplicó

en la comparación estadística de la bondad de ajuste del modelo de Gompertz modif icado

versus la del modelo de Baranyi. La prueba del Ji cuadrado que proporciona una medida total

de la desviación (Daniel, 2002) se utilizó para la validación del modelo matemático desarrollado

en caldo MRS.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS (versión 13, SSPS Inc,

Chicago).

39

5.2.5 RECUENTO DE BACTERIAS

Para el recuento de bacterias, se empleó el método directo de recuento en placa y diluciones

seriadas, bajo las indicaciones del Bacteriological Analytical Manual (FDA, 2003). El método

original (estándar) fue modif icado con f ines de alcanzar una mayor eficiencia en el estudio de

modelación. Al método de conteo en placa modif icado se le denominará de “recuento en

cuartos” ya que la placa de Petri estándar se dividió en cuatro zonas iguales (cuatro cuartos)

con un volumen de siembra de 20 µL de muestra para cada cuarto (Figura 14).

La validación estadística del método modif icado de recuento en placa, “recuento en cuartos”,

pretende establecer si hay diferencias signif icativas entre los dos métodos (estándar versus

modif icado) y así mismo evaluar el desempeño del método modif icado para f ines de trabajos en

modelación (Anexo 4). Esta metodología de siembra en cuartos disminuye los costos de

investigación, permitiendo optimizar el t iempo y los recursos en el laboratorio. Para ilustrar la

ventaja del uso del método de “recuento en cuartos” se plantea la siguiente analogía: para la

obtención de una sola curva de crecimiento con al menos tres réplicas y 18 puntos de

observación por réplica se generan 54 muestras. Estas 54 muestras se diluyen y al sembrarse 4 diluciones por muestra se generan un total de 216 placas utilizando el método estándar. Por

el método de “recuento en cuartos” sólo se necesitan 54 placas y al sembrar las 4 diluciones de

cada muestra de manera simultanea en una sola placa, produciéndose as í un ahorro de 162

placas. Estos datos cobran mayor importancia si se tiene en cuenta que en este trabajo se

realizaron más de 16 curvas de crecimiento.

Para realizar la validación estadística del método modif icado de recuento en placa, se tuvieron

en cuenta diferentes niveles de análisis:

- Evaluación entre métodos: método estándar de recuento en placa (siembra en placa

de petri completa) versus método modif icado de recuento en placa (recuento en cuartos)

para todos los microorganismos y en todas las diluciones.

- Evaluación entre microorganismos: L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L.

monocytogenes se evaluaron de manera individual por el método estándar de recuento y

por el método modif icado en todas las diluciones.

40

- Evaluación entre diluciones: se evaluaron de manera independiente cuatro diluciones

para los cuatro microorganismos en análisis y por los dos métodos aplicados.

A continuación se describe protocolo de validación realizando cuatro réplicas por prueba (Figura

14):

• A partir de las cepas congeladas, se tomó una perla del microorganismo de interés y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Se incubó a 37ºC por 24 horas, correspondiente a la

primera activación.

• Después del per íodo de incubación se tomaron 100µL del inóculo y se transfirieron a

5mL de caldo MRS. Este nuevo inóculo se incubó a 37°C por otras 24 horas para

completar la segunda activación.

• A partir del segundo inóculo se tomaron 50µL de muestra y se transfirieron a 450 µL de

solución salina al 0.98%, para realizar diluciones seriadas hasta llegar a la dilución 10-4.

Partiendo de la dilución 10-4 se realizaron diluciones intermedias así:

Dilución A: Se tomaron 200µL de la dilución 10-4 y se transfirieron a un tubo eppendorf

con 800µL de solución salina al 0.98%.

Dilución B: Se tomaron 500 µL de la dilución A y se transfirieron a un tubo eppendorf

con 500µL de solución salina al 0.98%.

Dilución C: Se tomaron 500 µL de la dilución B y se transfirieron a un tubo eppendorf

con 500µL de solución salina al 0.98%.

Dilución D: Se tomaron 500 µL de la dilución C y se transfirieron a un tubo eppendorf

con 500µL de solución salina al 0.98%.

• Para el método estándar de recuento en placa se realizaron siembras masivas en

superficie con rastrillos estériles, para lo cual se transfirieron 100µL de cada una de las

diluciones (A, B, C y D) a cuatro placas de petri completas de manera independiente.

De cada siembra se realizaron cuatro réplicas.

• Para realizar el mismo proceso de siembra, pero desarrollando el método modif icado de

recuento en placa por cuartos, se transfirieron 20 µL de cada una de las diluciones (A, B,

C y D) y se sembraron en una misma placa de petri, previamente dividida por cuartos.

De cada siembra se realizaron cuatro réplicas.

• Todas las placas se incubaron a 37ºC por 24 horas. Después de la incubación se realizaron las lecturas y los cálculos correspondientes.

41

Figura 14. Diagrama de flujo del ensayo de validación del método modificado de recuento en placa (siembra en cuartos de placa). El procedimiento explicado a través del diagrama de flujo, se realizó para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes con 4 réplicas por cada microorganismo. Tanto las siembras finales realizadas mediante el método estándar como las efectuadas mediante el método modificado se incubaron por 24 horas a 37°C en agar MRS.

Inóculo A Segunda acti vación

Incubación 24H

50µ L

450µL Solución salina 0.98%

500µL Sol ución salina 0.98%

A

100µ L

MRS

B

100µ L

MRS

C

100µ L

MRS

D

100µ L

MRS

x 4 R éplicas x 4 Microorganismos

Cepas congeladas (Perlas de crio-conservación)

Caldo MRS con 1 perla Primera acti vación

Incubación 24H 37°C

100µ L

450µL Sol ución salina 0.98%

450µL Sol ución salina 0.98%

450µL Sol ución salina 0.98%

50µ L 50µ L 50µ L

800µL Sol ución salina 0.98%

500µL Sol ución salina 0.98%

500µL Sol ución salina 0.98%

500µ L 500µ L 500µ L

200µ L

D A C B

10-1 10-4 10-2 10-3

A B

C D

20µ L 20µ L

20µ L 20µ L

Método estándar

Método modificado

42

5.2.6 DESARROLLO DE CULTIVOS SINCRONIZADOS Para la obtención de curvas de crecimiento de 34 horas con 18 puntos de muestreo se

generaron cultivos sincronizados con un desfase de 13 horas (Tabla 4). Para tal f in y para

obtener curvas de crecimiento con mínima variabilidad entre las diferentes réplicas se

estandarizó el inóculo inicial garantizando que al momento de conectar los cultivos

sincronizados no se presentaran diferencias signif icativas entre los recuentos de cada uno

(Anexo 5). Al f inal del proceso de activación, los dos inóculos (A y B) para los dos cultivos sincronizados (A y B) debía ser similar en concentración (UFC/mL).

Tabla 4. Sincronización de cultiv os para la generación de curvas de crecimiento con una extensión de 34 horas y 18 puntos de muestreo. En negro: Periodo de muestreo. En blanco: Periodo no muestreado.

Día Hora Punto de muestreo/ Tiempo curv a Cultiv o A Cultiv o B

7:00 8:00 1 (0 horas de crecimiento) 9:00

10:00 2 (2 horas de crecimiento) 11:00 12:00 3 (4 horas de crecimiento) 13:00 14:00 4 (6 horas de crecimiento) 15:00 16:00 5 (8 horas de crecimiento) 17:00

1

18:00 6 (10 horas de crecimiento) 7:00 7 (13 horas de crecimiento) 8:00 8 (24 horas de crecimiento) 9:00 9 (15 horas de crecimiento)

10:00 10 (26 horas de crecimiento) 11:00 11 (17 horas de crecimiento) 12:00 12 (28 horas de crecimiento) 13:00 13 (19 horas de crecimiento) 14:00 14 (30 horas de crecimiento) 15:00 15 (21 horas de crecimiento) 16:00 16 (32 horas de crecimiento) 17:00 17 (23 horas de crecimiento)

2

18:00 18 (34 horas de crecimiento)

Para evaluar tiempos de activación y homogeneidad de los inóculos, se realizaron tres procedimientos diferentes de activación para las cuatro cepas bacterianas (L. plantarum, L.

paracasei, E. coli y L. monocytogenes) con cuatro réplicas cada uno.

43

Mediante la técnica de conteo en placa se determinó la concentración f inal de los dos inóculos

(A y B) para el establecimiento de los cultivos sincronizados. Adicionalmente, se determinó la

absorbancia de cada cultivo, evaluando su densidad óptica a 540nm (OD540) para correlacionar

estas mediciones con el respectivo recuento en placa obtenido de cada inóculo. Los diagramas

de f lujo de cada uno de los procedimientos se describen en las Figuras 15 a 17.

Procedimiento número 1: inóculo A y B con dos activaciones

• Se tomó una perla de crio-conservación y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Este inóculo A, se llevó a incubar a 37°C por 24 horas sin agitación (primera activación).

• Transcurridas las 24 horas y a part ir del inóculo A se realizó una segunda activación. 100µL

del inóculo A (primera activación) se transfirieron a 5mL de caldo MRS y se llevó a incubar a

37°C por 24 horas sin agitación (segunda activación).

• El inóculo B se estableció con el mismo procedimiento anterior pero con 13 horas de

desfase y el inóculo A se utilizó para iniciar el primer cultivo y el inóculo B para iniciar el

segundo cultivo con 13 horas de desfase.

Procedimiento número 2: inóculo A y B con una activación.

• Se tomó una perla de crio-conservación y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Este inóculo A,

se llevó a incubar a 37°C por 24 horas sin agitación (primera activación).

• El inóculo B se estableció con el mismo procedimiento anterior pero con 13 horas de desfase y el inóculo A se utilizó para iniciar el primer cultivo y el inóculo B para iniciar el

segundo cultivo con 13 horas de desfase.

Procedimiento número 3: inóculo A con una activación e inóculo B con dos activaciones.

• Se tomó una perla de crio-conservación y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Este inóculo A,

se llevó a incubar a 37°C por 24 horas sin agitación. De manera simultánea se realizó el

mismo procedimiento con el f in de activar al mismo tiempo otro inóculo, el inóculo B.

Transcurridas las 24 horas y a partir del inóculo A (en primera activación) se inició el primer

cultivo.

• Transcurridas las 24 horas y a part ir del inóculo B se transfirieron 100µL del inóculo B

(primera activación) y se inocularon en 5mL de caldo MRS y se llevó a incubación por 24

horas a 37°C sin agitación (segunda activación). Después de completar las 24 horas, el

inóculo B (segunda activación) se utilizó para iniciar el segundo cultivo.

44

Figura 15. Diagrama de flujo del procedimiento número 1 para la estandarización inóculos.

7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 1

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 2

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 3

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 4

24:00

Inicio de curva (Día 1)

Caldo MRS con 100µL Incubación 24 Horas 37°C

Inicio de curva (Día 2) SINCRONIZACIÓN

Primera Activación

Segunda Activación Primera Activación

Segunda Activación

INÓCULO A

Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C

Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C

Caldo MRS con 100µL Incubación 24 Horas 37°C

INÓCULO B

45

Figura 16. Diagrama de flujo del procedimiento número 2 para la estandarización inóculos.

7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 1

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 2

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 3

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 4

24:00

Primera Activación

Inicio de curva (Día 1) Primera Activación

Inicio de curva (Día 2) SINCRONIZACIÓN

INÓCULO A

Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C

Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C

INÓCULO B

46

Figura 17. Diagrama de flujo del procedimiento número 3 para la estandarización inóculos.

7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 1

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 2

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 3

24:00 7:00 8:00 9:00

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

DÍA 4

24:00

INÓCULO B

Inicio de curva (Día 1) Segunda Activación

Inicio de curva (Día 2) SINCRONIZACIÓN

Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C

Primera Activación Primera Activación

Caldo MRS con 1 Perla Incubación 24 Horas 37°C

Caldo MRS con 100µL Incubación 24 Horas 37°C

INÓCULO A

47

Para realizar esta validación estadística de esta metodología se realizaron curvas de

crecimiento microbiano con una extensión de 34 horas a partir de cult ivos sincronizados no

agitados. Para cada uno de los cuatro microorganismos en estudio (L. plantarum, L. paracasei,

E. coli, L. monocytogenes) se generaron cuatro curvas de crecimiento (4 réplicas) con 18

puntos de muestreo para evaluar un total de 34 horas de crecimiento (Tabla 5).

Tabla 5. Puntos de muestreo en cultiv os sincronizados a 13 horas de desfase.

DÍA 1

DÍA 2

HORA TIEMPO CULTIVO HORA TIEMPO CULTIVO 7:00am Preparación

Cultivo 1 7:00am 13 2 8:00am 0 1 8:00am 24 1 9:00am 9:00am 15 2

10:00am 2 1 10:00am 26 1 11:00am 11:00am 17 2 12:00m 4 1 12:00m 28 1 1:00pm 1:00pm 19 2 2:00pm 6 1 2:00pm 30 1 3:00pm 3:00pm 21 2 4:00pm 8 1 4:00pm 32 1 5:00pm 5:00pm 23 2 6:00pm 10

Preparación Cultivo 2

1 6:00pm 34 1

Las curvas de crecimiento continuas se realizaron utilizando un solo inóculo inicial ( inóculo A) y

evaluando de manera in-interrumpida los 18 puntos de muestreo, realizando as í siembras

constantes cada dos horas durante 34 horas seguidas. Estas curvas continuas se realizaron

para cada uno de los cuatro microorganismos en estudio (L. plantarum, L. paracasei, E. coli, L.

monocytogenes) realizando tres réplicas por curva.

5.2.7 GENERACIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO INDIVIDUAL EN MEDIO ESTÁNDAR

Se realizaron cuatro curvas de crecimiento individuales en caldo MRS con las cepas de L.

plantarum, L. paracasei, L. monocytogenes y E. coli con cuatro réplicas de cada una. Las

curvas de crecimiento se generaron a part ir de 18 puntos de muestreo que se tomaron cada dos

horas siguiendo el procedimiento a continuación:

48

• A partir de las cepas congeladas, se tomó una perla del microorganismo de interés y se inoculó en 5mL de caldo MRS. Se incubó a 37ºC por 24 horas, correspondiente a la

primera activación.

• Después del per íodo de incubación se tomaron 100µL del inóculo y se transfirieron a

5mL de caldo MRS. Este nuevo inóculo se incubó a 37°C por otras 24 horas para

completar la segunda activación.

• A partir de la segunda activación (concentración aprox. del inóculo de 109 UFC/mL) se

realizaron diluciones decimales seriadas tomando 100µL de muestra en 900µL de

solución salina al 0.98% hasta diluir el inóculo a 104 UFC/mL. De esta últ ima dilución se

transfirieron 100 µL de muestra a 12 tubos con 5mL de caldo MRS cada uno cuya

concentración f inal fue aproximadamente de 102 UFC/mL. Estos 12 tubos inoculados se

codif icaron con: cultivo 1.

• A las 24 horas de realizar la primera activación inicial, de manera separada e independiente se realizó el procedimiento anterior para sincronizar los cultivos y de esta

manera obtener mediciones del crecimiento bacteriano por 34 horas de incubación.

Para este segundo caso en lugar de 12 tubos con MRS se inocularon 6 para obtener las

18 mediciones totales de las curvas de crecimiento. Estos 6 tubos inoculados se

codif icaron con: cultivo 2. La Tabla 5 presenta la toma de muestras para la generación

de curvas de crecimiento con 34 horas de extensión.

• Con cada uno de los 18 tubos se realizaron diluciones decimales seriadas en tubos

eppendorf estériles, transfiriendo 50µL de muestra en 450µL de solución salina al

0.98%. Durante cada muestreo también se midieron los pH de cada inóculo para

obtener una medición de esta variable a través del tiempo.

• Las últimas cuatro diluciones efectuadas para cada punto de muestreo se sembraron por superficie en el agar MRS, transfiriendo 20 µL de cada dilución a los 4 cuadrantes

diferentes en los que estaba dividida cada placa de petri (método de recuento en placa

modif icado).

• Todas las placas de petri se incubaron a 37°C por 24 horas. Después de la incubación

se realizaron las lecturas de recuento prosiguiendo con los cálculos correspondientes,

49

para lo cual se multiplicó el número de colonias obtenidas en un cuadrante, por el factor

de dilución, por el factor 50 (valor correspondiente a la cantidad de muestra sembrada

en cada cuadrante).

5.2.8 GENERACIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANAS EN CULTIVO MIXTO A PARTIR DE M EDIO ESTÁNDAR

Se realizaron cuatro curvas de crecimiento mixtas en caldo MRS para evaluar la interacción entre las BAL y las bacterias patógenas en alimentos. Se realizaron curvas mixtas de L.

monocytogenes con L. plantarum, de E. coli con L. plantarum, de L. monocytogenes con L.

paracasei y de E. coli con L. paracasei, con tres réplicas cada una.

Las curvas de crecimiento se establecieron a partir de 18 puntos de muestreo que se tomaron

cada dos horas siguiendo el protocolo empleado para las curvas individuales (numeral 5.2.7),

pero en este caso los 18 tubos (cultivos 1 y 2) se sembraron con 100 µL de cada uno de los

cultivos de los dos microorganismos problema, para poder obtener los cultivos mixtos.

5.2.9 DESARROLLO DE MODELOS PRIMARIOS Como modelos de crecimiento primario se seleccionaron los modelos de Gompertz modif icado

(Gibson et al., 1988) y Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994), que son los más utilizados para

describir el crecimiento sigmoidal microbiano. Las ecuaciones se ajustaron a los datos

experimentales utilizando el método de mínimos cuadrados con el softw are DMfit curve-f itting

program (http.//www.ifr.bbsrc.ac.uk) bajo las premisas de normalidad, independencia y varianza

constante.

5.2.10 MODELOS PRIMARIOS SELECCIONADOS

5.2.10.1 Ecuación de Gompertz modificada:

A: valor asintótico de log10 UFC/mL cuando t decrece

B: tasa de crecimiento relativa M: tiempo donde la tasa de crecimiento es máxima

C: crecimiento máximo cuando t se incrementa

( )( )( )MtBCAN −⋅−⋅+= expexp)log(

50

Los parámetros cinéticos derivados de la ecuación de Gompertz modif icada son

los siguientes:

La máxima (exponencial) tasa de crecimiento (log10 UFC/mL/h):

Duración de la fase lag (fase de adaptación):

Tiempo de generación (h):

5.2.10.2 Ecuación de Baranyi:

: logaritmo natural de la concentración celular en el t = t0.

: logaritmo natural de la máxima concentración celular.

: función para el retraso gradual en el t iempo.

: tasa máxima de crecimiento

5.2.11 EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO Y LA BONDAD DE AJUSTE DE LOS MODELOS PRIMARIOS

Los siguientes fueron criterios empleados para evaluar la bondad de ajuste y de desempeño de

los modelos predictivos: error cuadrado medio (MSE), error estándar (SE) análisis de residuos,

coeficiente de determinación (R2) y análisis de los estimados de los parámetros cinéticos.

5.2.11.1 Error cuadrado medio (MSE): El modelo ajusta mejor a los datos experimentales

entre más pequeño el valor de MSE. Donde n es el número de observaciones y p es el número

de parámetros a estimar.

eBC

=maxµ( )BM 1−=λ

BCegt 2log10=

( ) ( )( )

( ) ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −+−+= − 0max

max

max01

1ln1

γγ

µ

µ m

tAm

ee

mtAyty

( )00 ln txy =

maxmax ln x=γ

( )tA

maxµ

51

5.2.11.2 Error estándar (SE): Es una medida de dispersión que corresponde a la raíz cuadrada

de la varianza de la distribución de todos los datos.

SE = σ

√n

5.2.11.3 Análisis de residuos: Los valores de los residuos permiten determinar si se cumplen

las hipótesis para el correcto uso de los modelos. Las gráficas de residuales permiten evaluar

desviaciones sistemáticas entre valores observados y predichos, “clustering” de residuales del

mismo signo y autocorrelación.

5.2.11.4 Coeficiente de determinación (R2): Es la proporción de variación explicada por el

modelo. Entre más alto sea su valor mejor será el ajuste del modelo.

Donde SSreg es la suma de las distancias entre los puntos y la curva de mejor ajuste

determinada por regresión no linear y SStot es la suma de los cuadrados de las distancias entre

los puntos de la línea occidental por el valor medio de todos los valores de Y.

5.2.11.5 Análisis de los parámetros cinéticos estimados: El propósito de este análisis es

evaluar los estimados de los parámetros de los modelos bajo los criterios de precisión y de

ajuste a la realidad.

5.2.12 VALIDACIÓN DE LOS MODELOS PREDICTIVOS Como los modelos predictivos se generan inicialmente en condiciones controladas y medios de

cultivos altamente reproducibles deben ser validados para su aplicación en condiciones

diferentes a las que los generaron. Para evaluar el desempeño de los modelos predictivos se

emplearon métodos gráficos y estadísticos.

( )2pnobservedpredictedMSE

−∑ −=

tot

reg

SSSS

R −= 0.12

52

5.2.12.1 MÉTODO GRÁFICO Para la evaluación visual se construyeron gráficas presentando el ajuste del modelo predictivo

desarrollado en caldo MRS a 37ºC a los datos experimentales obtenidos en leche entera UHT a

37ºC. Adicionalmente se graficaron los datos observados versus los predichos para determinar

que tan cercanos se situaban los datos predichos de los observados.

5.2.12.2 MÉTODO MATEMÁTICO

Para la cuantif icación matemática del desempeño de los modelos predictivos de crecimiento se

calcularon los siguientes factores:

5.2.12.2.1 Factores de exactitud (Af) y bias (sesgo) (Bf): Los factores Af y Bf son una medida

cuantitativa para el desempeño de los modelos (Mellefont et al. 2003; Ross et al. 2003; Ross,

1996).

5.2.12.2.2 Porcentaje de Discrepancia (%D) y porcentaje de Sesgo o Bias (%B): También

se aplicaron las formas modif icadas del Af y Bf propuestas por Baranyi et al. (1999): porcentaje

de Discrepancia (%D) y porcentaje de sesgo o bias (%B).

Donde,

( )n

observedpredicted

fB∑

=/log

10

( )n

observedpredicted

fA∑

=/log

10

100*)1(exp% −= fAD

n

obspred

fA∑

=− 2)ln(ln

exp

100*)1)(exp(% )( −= BabsfBsignoB

53

Donde,

5.2.12.2.3 Prueba del Ji cuadrado: proporciona una medida total de la desviación. Donde obs representa la frecuencia observada y esp la frecuencia esperada.

5.2.13 GENERACIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EXTENDIDAS Y SU

MODELACIÓN PRELIMINAR Siguiendo el protocolo para la generación de curvas de crecimiento en cultivo mixto se

construyeron las curvas de crecimiento extendidas a 82 horas en caldo MRS y leche entera

UHT a 37ºC.

Para el proceso de modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas se ajustaron

modelos polinomiales con el programa SPSS (versión 13, SSPS Inc, Chicago) y se evaluó su

bondad de ajuste. Para tal f in se calculó el MSE, r y R2 y se realizó una prueba formal para falta

de ajuste para modelos de regresión, que consistió en cuantif icar dentro del error lo que

correspondía al error puro y al error por falta de ajuste.

Donde SSres corresponde a la suma de cuadrados de residuales, SSep a la suma de cuadrados

debida al error puro y SSfa a la suma de cuadrados debidos a la falta de ajuste. Si la relación F

de la falta de ajuste no es signif icativa, se rechaza la hipótesis de la signif icancia de la regresión

y el modelo puede considerarse como satisfactorio.

n

obspred

fB∑

=−lnln

exp

∑ −=

..)( 2

2

espespobs

χ

faepres SSSSSS +=

54

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 GENERACIÓN Y MODELADO DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO INDIVIDUAL EN CALDO MRS

6.1.1 OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO INDIVIDUAL

La Figura 18 presenta las cuatro réplicas de las curvas de crecimiento sigmoidales obtenidas

para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes. Al analizar visualmente los datos

experimentales se observó que los cuatro microorganismos crecieron de manera similar en caldo MRS a 37°C durante 34 horas. Sin embargo, E. coli como las dos BAL (L. plantarum y L.

paracasei) no presentaron una fase lag bien definida como si se observó para L.

monocytogenes, que permaneció en proceso de adaptación entre 4 y 6 horas

aproximadamente.

Todas las curvas generadas, presentaron el mismo patrón de comportamiento entre las horas 8

y 10, donde se observó un ligero decrecimiento de la tasa de crecimiento en la fase

exponencial, sugiriendo el posible crecimiento bifásico de los cultivos, lo cual puede signif icar

que en el mismo cult ivo se estén desarrollando, a diferentes ritmos, dos poblaciones

microbianas obtenidas a partir de un mismo inóculo inicial. También se hace evidente que los

cultivos de las cuatro cepas alcanzaron concentraciones máximas similares en la fase

estacionaria que se establece entre las 25 y las 30 horas de crecimiento, obteniendo valores

entre 8 y 9 log10 UFC/mL.

6.1.2 SELECCIÓN Y EVALUACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS

A cada una de las réplicas de las curvas de crecimiento de las cepas individuales con patrón

sigmoidal se ajustaron las ecuaciones de Gompertz modif icada (Gibson et al., 1988) y la de

Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994) por ser las más utilizadas, por su desempeño, para describir

el crecimiento sigmoidal microbiano. La selección del modelo, para continuar con el estudio de

55

modelación, se realizó con base en el error estándar (SE) y el coeficiente de determinación (R2), así como en la estimación de los parámetros cinéticos.

Figura 18. Curvas de crecimiento en cultiv o individual. L. plantarum (a), L. paracasei (b), E. coli (c) y L. monocytogenes (d) en caldo MRS a 37ºC (4 réplicas por cepa).

El ajuste de estos modelos y los parámetros cinéticos estimados para cada una de las réplicas

de los cuatro microorganismos: la fase lag, la tasa de crecimiento, la concentración celular

inicial (mínima) y la máxima se resumen en la Tabla 6. Con base en el análisis de regresión no

lineal se pudo concluir que los dos modelos, Gompertz modif icado y Baranyi, presentaban un

buen ajuste. El SE y el R2 para cada uno de los modelos mostró que ambos modelos ajustaban

a b c d

L. plantarum 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 3 0 40

Tiem po (h )

log

UFC

/mL

L. plantarum 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 3 0 40

Tie mpo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum 3

0

2

4

6

8

10

0 10 2 0 30 40

Tiem po (h )

log

UFC

/mL

L. plantarum 4

0

2

4

6

8

10

0 10 20 3 0 40

Tiem po (h )

log

UFC

/mL

E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h )

log

UFC

/mL

E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 4 0

Tiem po (h )

log

UFC

/mL

E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 3 0 40

Tie mpo (h)

log

UFC

/mL

E. coli 4

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h )

log

UFC

/mL

L. monocytogene s 1

0

2

4

6

8

10

0 10 2 0 3 0 40

Tiem po ( h)

log

UFC

/mL

L. monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 1 0 20 3 0 40

T iemp o (h)

log

UFC

/mL

L. paraca sei 1

0123456789

10

0 10 20 30 40

Tiem po ( h)

log

CFU

/mL

L. parac asei 2

0

2

4

6

8

10

0 1 0 20 30 40

Tiemp o (h)

log

CFU

/mL

L. paraca sei 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tie mpo (h)

log

CF

U/m

L

L. paraca sei 4

0

2

4

6

8

10

0 10 2 0 30 4 0

Ti empo ( h)

log

CF

U/m

L

L. monocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 3 0 4 0

T iemp o (h)lo

g U

FC/m

L

L. monocy toge nes 4

0

2

4

6

8

10

0 10 2 0 30 40

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

56

adecuadamente a los datos experimentales, siendo 0,420 el SE más alto y 0,971 el R2 más bajo

para la totalidad de las 16 curvas de crecimiento individuales modeladas.

Tabla 6. Bondad de ajuste de los modelos predictiv os para curvas de crecimiento en cultivo indiv idual. a: L. plantarum. b: L. paracasei. c: E. coli. d: L. monocytogenes. R: Réplica. Mod: Modelo predictivo. B: Modelo Baranyi. G: Modelo Gompertz. C. Inicial: Concentración inicial observada (log10 UFC/mL). C. Máx: Máxima concentración obtenida (log10 UFC/mL). Tasa Cto: Tasa de crecimiento (horas-1). C. Inicial P: Concentración inicial predicha. C. Máx P: Máxima concentración predicha. SE: Error estándar. R2 : Coeficiente de determinación.

Cepa R Mod C. inicial C. Máx Tasa Cto (h-1)

Fase lag (horas) C. Inicial P C. Máx P SE R2

1 B 2,623 9,146 0,328 3,232 2,793 9,047 0,224 0,991 1 G 2,623 9,146 0,363 3,533 2,768 9,448 0,345 0,979

2 B 2,591 9,097 0,326 2,751 2,681 9,026 0,235 0,990

a 2 G 2,591 9,097 0,366 3,260 2,667 9,408 0,351 0,979

3 B 2,613 9,130 0,292 - 2,359 9,079 0,279 0,986

3 G 2,613 9,130 0,357 3,068 2,719 9,444 0,368 0,976

4 B 2,672 9,398 0,296 - 2,337 9,053 0,314 0,983

4 G 2,672 9,398 0,368 3,138 2,707 9,363 0,390 0,973

1 B 3,000 9,176 0,253 - 3,205 9,237 0,193 0,992

1 G 3,000 9,176 0,299 0,000 2,830 9,683 0,260 0,985

2 B 2,903 9,204 0,248 - 3,093 9,296 0,215 0,990 b 2 G 2,903 9,204 0,289 0,000 2,725 9,834 0,283 0,983

3 B 2,778 9,190 0,255 - 3,045 9,258 0,217 0,990

3 G 2,778 9,190 0,301 0,000 2,663 9,734 0,290 0,982

4 B 2,602 9,217 0,249 - 2,955 9,314 0,260 0,986

4 G 2,602 9,217 0,291 0,000 2,583 9,889 0,334 0,977

1 B 2,903 8,875 0,249 - 3,092 8,771 0,183 0,992

1 G 2,903 8,875 0,301 0,000 2,705 9,099 0,233 0,986

2 B 2,699 8,845 0,254 - 2,980 8,758 0,201 0,990 c 2 G 2,699 8,845 0,308 0,000 2,584 9,083 0,260 0,984

3 B 2,602 8,778 0,249 - 2,961 8,671 0,205 0,990

3 G 2,602 8,778 0,304 0,000 2,559 8,980 0,252 0,984

4 B 3,000 9,000 0,254 - 3,200 8,942 0,180 0,992

4 G 3,000 9,000 0,306 0,000 2,816 9,279 0,240 0,986

1 B 2,041 9,176 0,318 3,572 1,928 9,109 0,386 0,980

1 G 2,041 9,176 0,328 3,220 1,772 10,165 0,452 0,971

2 B 2,146 8,954 0,310 3,590 2,012 9,028 0,305 0,986 d 2 G 2,146 8,954 0,329 3,642 1,921 9,943 0,379 0,979

3 B 2,079 8,978 0,320 3,939 2,013 9,061 0,289 0,988

3 G 2,079 8,978 0,339 4,021 1,943 9,948 0,367 0,981 4 B 2,079 8,978 0,313 3,697 1,969 9,072 0,353 0,982 4 G 2,079 8,978 0,330 3,668 1,866 10,052 0,420 0,975

57

Sin embargo, para poder determinar cuál de los dos modelos presentaba un mejor ajuste, se

calculó la media aritmética del SE y la del R2 por microorganismo como se muestra en la Tabla

7. Los resultados obtenidos indican que para las cuatro cepas estudiadas, el modelo de Baranyi

tuvo el mejor ajuste con un SE menor y un R2 mayor comparado con el modelo de Gompertz.

Tabla 7. Evaluación de la bondad de ajuste de los modelos predictiv os. Réplica (R). Error estándar (SE). Coeficiente de determinación (R2).

Baranyi Gompertz Curva de

crecimiento R SE R2 SE R2 1 0,2240 0,9912 0,34496 0,97924

2 0,2348 0,9905 0,35063 0,97872 L. plantarum 3 0,2790 0,9862 0,36785 0,97603

4 0,3137 0,9826 0,39036 0,97314 Media 0,2629 0,9876 0,36345 0,97678 1 0,1934 0,9917 0,26030 0,98490 2 0,2147 0,9901 0,28270 0,98290

L. paracasei 3 0,2171 0,9900 0,28960 0,98230 4 0,2600 0,9862 0,33450 0,97700 Media 0,2213 0,9895 0,29178 0,98178 1 0,1825 0,9917 0,23335 0,98645

2 0,2013 0,9903 0,25997 0,98378 E. coli 3 0,2048 0,9897 0,25227 0,98435

4 0,1802 0,9921 0,24020 0,98597 Media 0,1922 0,9909 0,24645 0,98514 1 0,3864 0,9800 0,45173 0,97122 2 0,3050 0,9863 0,37893 0,97882

L. monocytogenes 3 0,2888 0,9880 0,36658 0,98073 4 0,3529 0,9821 0,42003 0,97466

Media 0,3333 0,9841 0,40432 0,97636

Para el modelo de Baranyi 94% y para el de Gompertz 56% de los SE estuvieron por debajo de

0,35 y el 100% de los R2 para ambos casos estuvieron por encima de 0,95. Adicionalmente, los

R2 de los dos modelos fueron analizados estadísticamente, donde la prueba de T arrojó

diferencias signif icativas para las cuatro cepas (Anexo 9), lo cual indicó que el modelo de

Baranyi generó valores de R2 más altos. Adicionalmente, el modelo de Gompertz modif icado

presentó ciertas dif icultades para establecer la duración de la fase lag de las BAL y de E. coli,

que con el modelo de Baranyi fueron omitidas en su mayoría.

58

Estos resultados establecieron que la ecuación de Baranyi presentó, efectivamente, un ajuste

superior a la ecuación modif icada de Gompertz, por lo cual el modelo de Baranyi se seleccionó

para continuar con su ajuste a las demás curvas de crecimiento generadas en este trabajo.

6.1.3 DESARROLLO DE LOS MODELOS PRIMARIOS

Para el desarrollo del modelo primario se ajustó la ecuación de Baranyi a la totalidad de los

datos obtenidos por cada cepa microbiana. Cada curva de crecimiento se construyó con 72

datos de observación (cuatro réplicas con 18 puntos muestreados por cada cepa bacteriana). El

ajuste del modelo de Baranyi (Baranyi y Roberts, 1994) a las cuatro curvas de crecimiento

obtenidas para cada cepa se presenta en la Figura 19.

Figura 19 Ajuste a las curvas de crecimiento indiv idual en caldo MRS a 37°C por el Modelo de Baranyi. (a) Ajuste del modelo de Baranyi a la curva de crecimiento de L. plantarum. (b) Ajuste del modelo de Baranyi a la curva de crecimiento de L. paracasei. (c) Ajuste del modelo de Baranyi a la curva de crecimiento de E. coli. (d) Ajuste del modelo de Baranyi a la curva de crecimiento de L. monocytogenes. Línea roja: Modelo Baranyi. Puntos negros: Datos observados.

El análisis gráfico evidencia el buen ajuste del modelo de Baranyi a los datos experimentales

para las cuatro cepas en estudio (L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes)

cuando crecen de manera individual en caldo MRS durante 34 horas a 37°C. La curva de

a b

L. plantarum

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UF

C/m

L

E. coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

log

UFC

/ml

T ie mpo (h)

c d

59

predicción (representada por la línea roja), no dif iere mucho de los datos observados (puntos

negros) y se encuentra muy cerca a ellos. De igual forma, con la Tabla 8 que presenta la

bondad de ajuste del modelo de Baranyi, con la estimación de los parámetros cinéticos, se pudo

concluir lo mismo, ya que el SE y del R2 presentaron valores adecuados de 0,230 y 0,986,

respectivamente.

Tabla 8. Bondad de ajuste del Modelo de Baranyi para curvas de crecimiento en cultiv o individual. C: Curva de crecimiento. a: L. plantarum. b: L. paracasei. c: E. coli. d: L. monocytogenes. n: Número de datos. C.I: Concentración inicial (log10 UFC/mL). C.M: Concentración Máxima obtenida (log10 UFC/mL). T. Cto: Tasa de crecimiento (horas-1). SE (t): Error estándar de la tasa de crecimiento. F lag: Fase Lag en horas. SE (lag): SE de la fase Lag. T lag: Tasa de Lag. C.I.P: Concentración inicial predicha (log10 UFC/mL). C.M.P: Concentración Máxima obtenida (log10 UFC/mL). SE (log M): SE del log10 UFC/mL máximo. SE: Error cuadrado. R2: Coeficiente de determinación.

C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag

(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log

M) SE R2

a 72 2,591 9,398 0,325 0,013 2,855 0,641 0,928 0,775 2,736 9,035 0,054 0,230 0,990 b 72 2,602 9,217 0,251 0,005 - - - - 3,076 9,274 0,063 0,224 0,989 c 72 2,602 9,000 0,251 0,005 - - - - 3,058 8,785 0,050 0,209 0,989 d 72 2,041 9,176 0,315 0,014 3,702 0,778 1,165 0,790 1,978 9,070 0,099 0,304 0,986 Los resultados de la Tabla 8 muestran que L. plantarum y L. monocytogenes presentaron las

tasas de crecimiento más altas mientras que L. paracasei y E. coli crecieron a igual velocidad

(0,251 de tasa de crecimiento por hora). Al realizar el ANOVA (Anexo 10) se pudo establecer

que tanto L. paracasei como E. coli tenían tasas de crecimiento signif icativamente diferentes a

L. plantarum y a L. monocytogenes y que L. monocytogenes crecía a una velocidad

signif icativamente diferente a L. plantarum. Las tasas de crecimiento obtenidas para los dos

patógenos (0,251 h-1 para E. coli y 0,315 h-1 para L. monocytogenes) fueron muy similares a las

que se encontraron con el Predictor, (http://www.combase.cc/predictor.html), en donde se

asignaron las mismas condiciones del proyecto (37°C, 34 horas de crecimiento, caldo de cult ivo

estándar, pH 5,5 a 7,0), encontrándose para E. coli tasas de 0,240 h-1 y de 0,330 h-1 para L.

monocytogenes. Esta coincidencia en los resultados sugiere que el comportamiento presentado

por las cepas estudiadas se encuentra dentro de los rangos microbiológicos establecidos en las

bases de datos y que su desarrollo en caldos estándar diferentes a MRS, es el mismo.

De igual forma, las tasas de crecimiento obtenidas para las cuatro cepas en cultivos individuales

coincidieron con las reportadas en diferentes estudios: Oh y Marshall (1993) obtuvieron tasas

de crecimiento para L. monocytogenes de 0,334h-1 cuando creció de manera individual en caldo

60

tripticasa soya a 35°C con pH 5,5. Kamau et al. (1990) también reportaron para L.

monocytogenes tasas de 0,372h-1 en cultivos en leche semidescremada a pH 6,6. En otros

trabajos, Teo et al. (1996) reportaron tasas de crecimiento de 0,2146 h-1 para E. coli O157:H7

en caldo estándar a 35°C. Koutsoumanis et al. (2000) obtuvieron tasas de crecimiento de

0,2940 h-1 en caldo nutrit ivo a 20°C para BAL aisladas de pescado fresco.

Por otro lado, la fase lag del cult ivo de L. monocytogenes (3,7 horas) fue la más prolongada

entre los cuatro microorganismos estudiados, seguida por la de L. paracasei con 2,8 horas. Las otras dos cepas, de acuerdo con el estimado por el modelo de Baranyi no presentan fase lag

(Anexo 11). Sin embargo, la estimación de este parámetro de crecimiento para esta fase solo

fue aceptable como lo indicaron los valores relativamente altos del SE. Así mismo al observar

las curvas de crecimiento en la Figura 19 se puede apreciar que el modelo tiene dif icultades con

la determinación de una fase lag de corta duración y por consiguiente con su tasa de

aceleración por no estar claramente definida por los datos experimentales.

La fase lag que presentó L. monocytogenes en estas curvas de crecimiento también ha sido

observada por otros investigadores en diferentes estudios: El-Shenawy et al. (1990) reportaron

para esta bacteria fases lag de 3 horas cuando se cultivó a 35°C en caldo tripticasa soya a pH

7,0, y Pinon et al. (2004), obtuvieron fases lag entre 3 y 6 de duración, para L. monocytogenes a

10°C en productos cárnicos frescos.

En cuanto a la concentración inicial microbiana, no se encontraron diferencias signif icativas

entre las cuatro cepas estudiadas (Anexo 12), con lo que se puede afirmar que todas las curvas

de crecimiento realizadas iniciaron con la misma concentración de bacterias. Estos resultados

también reafirman los datos obtenidos durante la estandarización de inóculos (Anexo 7).

Al analizar los estimados de la concentración máxima alcanzada por los cuatro

microorganismos evaluados se encontraron diferencias signif icativas (Anexo 13), con excepción

de L. plantarum y L. monocytogenes que presentaron concentraciones máximas (log10 UFC/mL)

muy similares, de 9,035 y 9,070 respectivamente y mantuvieron un patrón de crecimiento similar

a lo largo de todas las curvas.

Los datos de concentración máxima alcanzada obtenidos en este estudio para las dos cepas

patógenas, son muy similares a las encontradas por el Predictor de Combase

(http://www.combase.cc/predictor.html) en donde se encontraron concentraciones de 8,7

61

log10UFC/mL y de 9,0 log10UFC/mL, para L. monocytogenes y E. coli, respectivamente, bajo

condiciones ambientales iguales a las del proyecto (37°C, 34 horas de crecimiento, caldo de

cultivo estándar, pH 5,5 a 7,0). Estos hallazgos resultan importantes porque permiten

demostrar que durante las curvas de crecimiento, las patógenas están recibiendo el tratamiento

adecuado para desarrollarse normalmente en el caldo MRS, aún sabiendo que este medio no

es el más idóneo para el cultivo de E. coli y L. monocytogenes.

Los resultados de la Tabla 8 para las máximas concentraciones alcanzadas, presentan gran similitud con los datos publicados por diferentes autores: El-Shenawy et al. (1990) reportaron

concentraciones máximas para L. monocytogenes de 8,7 log10UFC/mL a 35°C en caldo

tripticasa soya; y para E. coli, Ogwaro et al. (2002) encontraron concentraciones máximas de 10

log10UFC/mL en cultivos en leche pasteurizada a 30°C; y Buchanan et al. (1991) reportaron

concentraciones máximas de 8,6 log10UFC/mL para la BAL Carnobacterium piscicola en leche

UHT a 19°C. Estas coincidencias con los datos reportados en otros trabajos, sirvieron también

para ratif icar que el comportamiento de los patógenos estudiados en este trabajo fue muy

similar al que presentan diferentes cepas de la misma especie en otro tipo de matrices

alimentarias.

6.2 GENERACIÓN Y MODELADO DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO MIXTO EN CALDO MRS

6.2.1 OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO MIXTO

En la Figura 20, se presentan las curvas de crecimiento en cultivo mixto realizadas en caldo

MRS a 37°C donde se hace evidente que el crecimiento de las cepas patógenas (en rojo) se

alteró cuando se cultivaron de manera simultánea con las BAL (en azul).

Tanto E. coli como L. monocytogenes no alcanzaron las concentraciones celulares máximas

previamente alcanzadas en cultivos individuales (solo el 0,003%), presentando también en este

caso, una fase estacionaria con iniciación prematura en comparación con los cultivos

individuales (de 10 a 15 horas antes). Listeria monocytogenes presentó una ligera tendencia a

declinar después de las 25 horas de crecimiento, mientras que en E. coli este hecho no fue tan

marcado.

62

Figura 20. Curv as de crecimiento en cultiv o mixto en caldo MRS a 37°C. A: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli con 3 réplicas. B: Curva s de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes con 3 réplicas. C: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli con 3 réplicas. D: Curva s de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes con 3 réplicas. En Azul: Cepas BAL. En Rojo: Cepas patógenas.

En cuanto a la fase lag, se encontró que Listeria monocytogenes presentó cuando se

encontraba en cultivo mixto con L. plantarum y L. paracasei, una fase lag más extendida (4 a 6

horas aproximadamente) que la mostrada en cultivo individual, mientras que E. coli en cultivo

mixto, al igual que en sus cultivos individuales, no presentó esta fase.

Por otro lado, L. plantarum y L. paracasei presentaron un comportamiento similar al observado

cuando se cultivaron de manera individual, lo cual sugiere que la interferencia en el crecimiento

L. plantar um + E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)lo

g U

FC/m

L

L. p lantarum + E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

L. p lantarum + E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. plantar um + L. monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. p lantarum + L. monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + L. monocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + E. co li 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + L. monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Ti empo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + L . monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. par acasei + L. monocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. par acasei + E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

A

B

C

D

63

de las patógenas no se debe al agotamiento de nutrientes en el medio (Efecto Jameson) y

podría estar más ligada a un antagonismo directo de las BAL debido a la producción de

sustancias inhibidoras y/o pH, presentándose as í un caso típico de amensalismo. En una

relación de amensalismo el crecimiento de un microorganismo (en este caso las BAL) no se vió

afectado por el crecimiento del otro microorganismo (en este caso E. coli y L. monocytogenes)

que si se vió inhibido por el primero, y tampoco toma ventaja de ninguna clase (Madigan, 1999).

Las BAL en cultivo mixto repitieron la ligera tendencia hacia un crecimiento bifásico. Entre los

patógenos, solo L. monocytogenes en co-cultivo con L. paracasei lo presentó.

6.2.2 DESARROLLO DE LOS MODELOS PRIMARIOS El modelo de Baranyi se ajustó a las curvas de crecimiento a partir de los datos observados y

los resultados de dicho ajuste se presentan en las Figuras 21 y 22 y en la Tabla 9.

Figura 21. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento en cultiv o mixto de L. plantarum en caldo MRS a 37°C. A. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento mixtas de L. plantarum y E. coli. B. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento mixtas de L. plantarum y L. monocytogenes. En azul: log10 UFC/mL observado de L. plantarum. En negro: log10 UFC/mL predicho de L. plantarum. En rojo: log10 UFC/mL observado de cepas patógenas. En verde: log10 UFC/mL predicho de cepas patógenas.

Como se hizo evidente al analizar los resultados del proceso de regresión no lineal la ecuación

de Baranyi describe adecuadamente el crecimiento de las dos cepas en cultivo mixto. El mayor

valor para el SE de 0,326 y el menor valor de R2 de 0,903 se obtuvo para el caso de L.

monocytogenes con L. plantarum. Los valores de los SE para todas las demás condiciones

estuvieron por debajo de 0,218 y los valores del R2 por encima de 0,965.

A BL. plantarum + E. coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UF

C/m

L

64

Figura 22. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento en cultiv o mixto de L. paracasei en caldo MRS a 37°C. A. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento mixtas de L. paracasei y E. coli. B. Ajuste del modelo de Baranyi a las curvas de crecimiento mixtas de L. paracasei y L. monocytogenes. En azul: log10 UFC/mL observado de L. paracasei. En negro: log10 UFC/mL predicho de L. paracasei. En rojo: log10 UFC/mL observado de cepas patógenas. En verde: log10 UFC/mL predicho de cepas patógenas.

Tabla 9. Comparación del Modelo de Baranyi para el crecimiento en cultiv o mixto de L. plantarum y E. coli, L. plantarum y L. monocytogenes, L. paracasei y E. coli, y L. paracasei y L. monocytogenes. A) L. plantarum y E. coli. B) L. plantarum y L. monocytogenes. C) L. paracasei y E. coli. D) L. paracasei y L. monocytogenes. C: Cepa. n: Número de datos. C.I: Concentración inicial (log10 UFC/mL). C.M: Concentración Máxima obtenida (log10 UFC/mL). T. Cto: Tasa de crecimiento (horas-1). SE (t): Error estándar de la tasa de crecimiento. F lag: Fase Lag en horas. SE (lag): SE de la fase Lag. T lag: Tasa de Lag. C.I.P: Concentración inicial predicha (log10 UFC/mL). C.M.P: Concentración Máxima obtenida (log10 UFC/mL). SE (log M): SE del log10 UFC/mL máximo. SE: Error estándar. R2: Coeficiente de determinación. A) L. plantarum (a) y E. coli (b)

C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag

(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log

M) SE R2

a 54 2,580 9,146 0,320 0,013 2,685 0,663 0,861 0,858 2,716 9,102 0,059 0,212 0,992

b 54 2,778 5,929 0,333 0,017 - - - - 2,767 5,754 0,028 0,170 0,965 B) L. plantarum (a) y L. monocytogenes (b)

C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag

(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log

M) SE R2

a 54 2,591 9,161 0,321 0,014 2,796 0,680 0,899 0,881 2,729 9,085 0,060 0,218 0,991

b 54 2,041 5,000 0,568 0,155 5,419 0,771 3,078 2,952 2,140 4,635 0,054 0,326 0,903 C) L. paracasei (a) y E. coli (b)

C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag

(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log

M) SE R2

a 54 2,845 9,204 0,250 0,005 - - - - 3,061 9,290 0,066 0,199 0,991

b 54 2,699 5,544 0,149 0,006 - - - - 2,971 5,311 0,023 0,120 0,978

A B

L. paracasei + E.coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

CFU

/mL

65

D) L. paracasei (a) y L. monocytogenes (b)

C n C. I C. M T. Cto (h-1) SE(t) F lag

(h) SE(lag) T lag SE (t lag) C. l. P C.M. P SE (log

M) SE R2

a 54 2,778 9,204 0,253 0,005 - - - - 3,033 9,274 0,068 0,210 0,990

b 54 2,041 5,176 0,170 0,008 1,618 0,748 0,275 0,903 1,967 5,134 0,029 0,121 0,989

Cuando se compararon las tasas de crecimiento de las cepas en cultivo individual frente a las

tasas obtenidas de las mismas cepas pero en cultivos mixtos, no se encontraron diferencias

signif icativas para las BAL (L. plantarum y L. paracasei), pero sí para los dos patógenos (E. coli

y L. monocytogenes) (Anexo 10). Estos resultados demostraron que el comportamiento de las

BAL en las curvas no se alteró por el crecimiento en cult ivo mixto con las cepas patógenas. Por

el contrario, las patógenas al cult ivarse en asocio con las BAL sí modif icaron su

comportamiento.

En presencia de L. plantarum, E. coli aumentó su tasa de crecimiento en un 33% mientras que

al crecer con L. paracasei su tasa de crecimiento se redujo en un 41%. Comportamiento similar

se observó con L. monocytogenes en cult ivo mixto. En presencia de L. plantarum su tasa de

crecimiento se aceleró en un 80% mientras que creciendo con L. paracasei su velocidad de

crecimiento diminuyó en un 46%. Se sugiere que la aceleración en la velocidad del crecimiento

de E. coli y L. monocytogenes, puede estar relacionada con el t ipo de sustancias que se

producen en el medio durante el proceso de producción de BLIS por parte de L. plantarum, las

cuales podrían inducir mecanismos de defensa en los patógenos, que los llevan a acelerar su

tasa de crecimiento para contrarrestar el efecto antagónico (Maldonado et al., 2003).

Cuando se comparó la fase lag de L. plantarum en cult ivo individual versus la presentada en

cultivo mixto con los dos patógenos de manera independiente, no se encontraron diferencias

signif icativas (Anexo 11), lo cual concuerda con lo discutido anteriormente donde se afirmó que

el comportamiento de las BAL no resulta afectado cuando se cultivan en asocio con L.

monocytogenes y E. coli, representando así un caso de amensalismo.

Por otro lado, al realizar esta misma comparación pero teniendo como referencia los cult ivos de

L. monocytogenes de manera individual y en cultivo mixto, se encontró que esta cepa conserva

la fase lag descrita en sus curvas de crecimiento individual, aunque con variaciones en la

duración, pues su fase lag se redujo de 3,7 horas a 1,6 horas cuando se realizaron co-cultivos

con L. paracasei. Pero por el contrario, al cultivarse en asocio con L. plantarum, la fase lag del

patógeno aumentó a 5,4 horas, lo cual pudo deberse también a la interacción del patógeno con

66

los metabolitos de la BAL, que impidieron que su crecimiento inicial se desarrollara

normalmente.

El aumento en la tasa de crecimiento de los dos patógenos cuando se encuentran en cult ivo

mixto con L. plantarum, as í como el aumento en la duración de la fase lag de L. monocytogenes

podrían estar relacionados con la actividad metabólica de la BAL cuando inicia la producción de

BLIS, lo que puede provocar alteraciones en el comportamiento las bacterias asociadas.

Maldonado et al. (2003) reportaron que la presencia de bacterias como E. coli y Streptococcus

pneumonie en co-cultivo con L. plantarum, actúa como señalización ambiental que induce en la

BAL el mecanismo de producción de bacteriocinas a través de quórum sensing, proceso

durante el cual las sustancias liberadas al medio pueden interferir con el desarrollo normal de

las otras bacterias.

Adicionalmente se compararon estadísticamente las máximas concentraciones bacterianas

obtenidas por las cepas en cultivo individual, versus cuando crecieron en asocio con otros

microorganismos (Anexo 13). En el caso de L. plantarum se presentaron diferencias

signif icativas entre su comportamiento en cultivo individual frente a su comportamiento cuando

creció en co-cultivo con E. coli, donde su máximo recuento celular aumentó, pasando de 9,0 a

9,1 log10 UFC/mL. Sin embargo, se sugiere que estas diferencias a nivel estadístico se deben a

la uniformidad de los datos obtenidos y a la poca variabilidad de los resultados experimentales,

lo que a su vez produce mayor sensibilidad en las pruebas estadísticas, detectándose así las

diferencias mínimas, que en la realidad y para este estudio en particular, no resultan

importantes. Por el contrario, para L. paracasei no se presentaron diferencias signif icativas

cuando se compararon sus máximos recuentos a nivel mixto y a nivel individual.

Por otro lado, en cuanto a máximas concentraciones alcanzadas, para E. coli sí se presentaron

diferencias signif icativas (Anexo 13) cuando se cultivó en asocio con L. plantarum y con L.

paracasei, reduciendo en gran medida sus recuentos celulares, pues al cult ivarse de manera

individual, su máxima concentración alcanzó los 8,7 log10 UFC/mL, pero al cult ivarse con L.

plantarum, el patógeno llegó a 5,7 log10 UFC/mL y a 5,3 log10 UFC/mL cuando se cultivó con L.

paracasei. El crecimiento de E. coli se modif icó signif icativamente hacia la hora 10 post

incubación, donde se observó una reducción de su crecimiento de casi tres ciclos logarítmicos

con respecto al crecimiento individual. Esta reducción se mantuvo constante a partir de la hora

10 donde después de una fase exponencial corta se produjo una fase estacionaria constante

67

hasta las 34 horas de medición. En este caso el crecimiento de L. plantarum y L. paracasei

tampoco se afectó por el desarrollo del patógeno en cultivo mixto.

Diferentes estudios muestran reducción del crecimiento de E. coli en presencia de sustancias

inhibidoras como ácidos (ácidos clorhídrico, láctico, c ítrico), donde se comprueba que altas

concentraciones de estas sustancias pueden reducir el crecimiento de E. coli hasta cinco ciclos

logar ítmicos (McWilliam et al., 2002 y Buchanan et al., 1999). Así mismo, Cheng et al. (2001)

reportaron una reducción en el crecimiento de E. coli O157:H7 (de 6,0 a 3,5 log10 UFC/mL) cuando se cultivó en productos lácticos fermentados tipo yogur durante 140 horas a 7°C, pH

3,6; y Ogwaro et al. (2002) observaron que E. coli O157:H7 redujo su crecimiento de 8,5 a 6,3

log10 UFC/mL después de 140 horas de cultivarse a 4°C en un yogur fermentado por

Lactobacillus delbreuckii ssp. Bulgaricus y Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus.

Por otro lado, para L. monocytogenes también se presentaron diferencias signif icativas cuando

se cultivó en asocio con L. plantarum y con L. paracasei. Aproximadamente a partir de la hora

10 post incubación, cuando apenas se iniciaba la fase exponencial, el crecimiento de L.

monocytogenes se inhibió manteniéndose estable como en fase estacionaria hasta la hora 34

(último punto del muestreo). El crecimiento de L. monocytogenes en estos cultivos mixtos se

redujo casi cuatro ciclos logarítmicos comparado con los recuentos obtenidos en las curvas

individuales, pasando de 9,0 log10 UFC/mL a 4,6 log10 UFC/mL con L. plantarum y a 5,1 log10

UFC/mL con L. paracasei. En este caso, el crecimiento y el comportamiento de L. plantarum y

L. paracasei en el cultivo mixto tampoco se afectó por el crecimiento del patógeno, ya que todos

sus parámetros cinéticos permanecieron iguales tanto en sus cultivos individuales como en los

mixtos. Esta reducción en el crecimiento de L. monocytogenes con valores en ciclos

logar ítmicos similares a los obtenidos en este trabajo ha sido reportada en otros estudios y se

ha asociado a la interacción con bacterias ácido lácticas o a metabolitos antagónicos. Por

ejemplo, Amézquita y Brashears (2002) evaluaron la inhibición competitiva de L.

monocytogenes en alimentos listos para el consumo por bacterias ácido lácticas, reportando

una reducción en el crecimiento del patógeno de 5,2 a 2,0 log10 UFC/mL después de un

almacenamiento de 600 horas a 5°C; y Schillinger et al. (2001) evaluaron la eficacia de la nisina

en combinación con cultivos protectores contra L. monocytogenes Scott A en Tofú de

manufactura casera, donde observaron una reducción de dos ciclos logarítmicos en el

crecimiento de esta bacteria en presencia de 700UI/mL (Unidades Internacionales por mililitro)

de nisina a 10°C.

68

Como se estableció anteriormente en las curvas de crecimiento individual, la concentración

inicial de todas las curvas de crecimiento mixto, tampoco presentaron diferencias signif icativas

(Anexo 12). En forma gráfica las diferencias iniciales en cuanto a la concentración pueden

obviarse normalizando las curvas de crecimiento. Este procedimiento se realizó para evidenciar

que el patrón de las curvas en co-cultivo sigue siendo el mismo a pesar de estas variaciones y

que las pequeñas diferencias no signif icativas en la concentración inicial de microorganismos no

afectan el comportamiento general (Figura 23).

Figura 23. Curvas de crecimiento en cultivo mixto normalizadas en caldo MRS a 37°C. A: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli. B: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes. C: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli. D: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes. En Azul: Cepas BAL. En Rojo: Cepas patógenas.

A B

L. plantarum + E. coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + E.coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35

Tie mpo (h)

log

UFC

/mL

C D

69

6.3 DETERMINACIÓN DEL PÉRFIL DE pH DURANTE EL CRECIMIENTO EN CULTIVO INDIVIDUAL Y MIXTO DE LAS CEPAS BACTERIANAS

Paralelo a los recuentos bacterianos, se determinaron los valores de pH a lo largo del

crecimiento para cada uno de los cultivos, individuales y mixtos. En la Figura 24 se presenta el

comportamiento del pH en función del tiempo, simultáneo al crecimiento bacteriano, donde los

valores del pH representan la media ar itmética de las tres réplicas, siendo 0,09 el valor de

desviación estándar más alto calculado.

La evaluación del comportamiento del pH inicial de los cultivos individuales y mixtos no presentó

diferencia signif icativa en el ANOVA (Anexo 14), lo cual confirma igualdad de condiciones al

momento de comenzar las curvas de crecimiento.

Adicionalmente se realizó el mismo análisis para el pH final de los medios, que correspondió al

valor de pH más bajo obtenido a las 34 horas de crecimiento. Se presentaron diferencias

signif icativas cuando se compararon los pH de las curvas de crecimiento individuales y mixtas

en medio MRS (Anexo 14). Con excepción de L. plantarum y L. paracasei que no presentaron

variabilidad entre los valores de pH obtenidos cuando crecieron de manera individual frente a lo

observado cuando crecieron en asocio con los dos patógenos, los otros cultivos si presentaron

diferencias signif icativas cuando se compararon estadísticamente los valores de pH finales

obtenidos de los cultivos individuales frente a los obtenidos de los mixtos. Así, el pH final para el

cultivo individual de L. monocytogenes fue de 5,1 aproximadamente, mientras que en cultivo

mixto con L. plantarum y L. paracasei, el pH del medio alcanzó valores de 3,7 y 3,1

respectivamente. Estos resultados mostraron que cuando el patógeno creció en asocio con las

BAL, el comportamiento del medio a nivel de pH fue similar al presentado cuando las BAL

crecieron de manera individual, donde las BAL fueron responsables en gran parte de generar

una mayor acidez. Lo mismo ocurrió con el cultivo de E. coli que de manera individual alcanzó

un pH de 4,9 pero cuando creció en asocio con L. plantarum y L. paracasei el pH final se redujo

a 3,6 y a 3,1 respectivamente. Cuando se analizó el perf il de pH (los 18 puntos de muestreo) en

todas las curvas de crecimiento, se presentaron diferencias signif icativas entre el pH de L.

plantarum y L. monocytogenes a nivel de cultivos individuales Así mismo entre el de L.

paracasei y E. coli, y L. paracasei y L. monocytogenes. De esta forma se pudo determinar que

L. monocytogenes y E. coli presentaron un comportamiento igual frente a esta variable durante

los 18 puntos evaluados (Anexo 14).

70

Figura 24. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo individual y mixto en caldo MRS a 37°C. En verde: pH. En azul: Curvas de crecimiento predichas para BAL. En rojo: Curvas de crecimiento predichas para patógenas. En rombos negros: Curvas de crecimiento observadas para BAL. En triángulos blancos: Curvas de crecimiento observadas para patógenas.

L. par acasei

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

log

CFU

/mL

01

23456

7

pH

L. plantarum

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

log

CFU

/mL

01234567

pH

E. coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

log

CFU

/mL

01234567

pH

L. monocytogenes

0

2

4

6

8

1 0

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

logC

FU/m

L

0

12

3

4

56

7

pH

L. plantarum + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

0

1

2

3

4

5

6

7

pH

L. plantarum + E. coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

0

1

2

3

4

5

6

7

pH

L. paracasei + E.coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

log

UFC

/mL

0

1

2

3

4

5

6

7

pH

L. paracasei + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

log

CFU

/mL

0

1

2

3

4

5

6

7pH

71

Los resultados de los análisis estadísticos y la observación de la Figura 24 mostraron que L.

paracasei produjo mayor acidez en el medio presentando valores de pH mucho más bajos que

los cultivos de las otras tres bacterias. Esta BAL alcanzó pH de 3,0 a partir de la hora 20 de

crecimiento.

En la Figura 24 se puede observar que la inhibición en el crecimiento de L. monocytogenes y E.

coli cuando se encontraban en cultivo mixto con L. plantarum no se relacionó directamente con

el pH del medio, pues ésta no coincidió con el inicio de la fase estacionaria que se observa en los patógenos, y tampoco pudo relacionarse con haber alcanzado el pH mínimo determinado en

sus cultivos individuales (4,9 para E. coli y 5,1 para L. monocytogenes), valores a partir de los

cuales, el crecimiento de los patógenos comenzó a desacelerarse.

De igual forma este hecho podr ía explicarse por la producción de metabolitos antimicrobianos

durante la fase exponencial de la BAL, donde las bacteriocinas podrían tener un papel

antagónico frente a E. coli y L. monocytogenes. Estos resultados coincidieron con lo reportado

por otros autores donde se demostró la efectividad de las bacteriocinas como inhibidores

naturales de patógenos en alimentos y cuya producción se da principalmente cuando el medio

se encuentra entre rangos de pH entre 6.0 y 5.0 (Jack, 1995; Talw alkar, 2003; Loessner, 2003).

También se sugiere que la reducción del crecimiento de L. monocytogenes y E. coli en los

cultivos mixtos con L. plantarum no se encuentra relacionada con agotamiento de nutrientes en

el medio (efecto Jameson), puesto que la BAL continúa creciendo normalmente, alcanzando las

mismas concentraciones que presentó en cultivo individual. Por otro lado, la inhibición que

presentó el crecimiento de L. monocytogenes y E. coli cuando se encontraban en cultivo mixto

con L. paracasei si podría estar más relacionada con la acidif icación del medio, pues ésta

coincide con el inicio de la fase estacionaria que se observa en los patógenos. Adicionalmente,

los cultivos de L. paracasei presentaron los valores de pH más bajos entre todos los cultivos,

llegando a pH entre 3,0 y 4,0, rango entre el cual ambos patógenos pueden verse afectados

disminuyendo su tasa de crecimiento (Escartin, 2000), ver también numeral 6.6.5 (Aproximación

al mecanismo inhibitorio de las BAL frente a las patógenas estudiadas) de la discusión f inal.

Finalmente, después de modelar el crecimiento en cultivo individual y mixto de L. plantarum, L.

paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS (correspondiente a la fase experimental

uno), se logró determinar que los modelos de Gompertz modif icado y Baranyi presentaron una

bondad de ajuste adecuada y fueron aptos para predecir el crecimiento microbiano de las cuatro

72

cepas en estudio a nivel individual y en cultivos mixtos. Sin embargo, el modelo de Baranyi

presentó mejor ajuste que la ecuación de Gompertz modif icada al evaluar los criterios de SE, R2

y estimación de parámetros.

Por otro lado, se observó que el crecimiento de los patógenos, E. coli y L. monocytogenes, se

redujo en cultivo mixto con las BAL. Mientras que el crecimiento de las BAL, L. plantarum y L.

paracasei, no se afectó con el crecimiento simultáneo de los patógenos, lo que sugiere un caso

de amensalismo. Esta inhibición del crecimiento de los patógenos al cultivarse con L. plantarum

no pudo correlacionarse de forma directa con la acidif icación del medio, ni con el agotamiento

de nutrientes y podría deberse a la producción de metabolitos antimicrobianos durante la fase

exponencial de la BAL. Pero la inhibición en el crecimiento de los patógenos al cultivarse con L.

paracasei sugiere estar más relacionada con el pH, debido a que la acidif icación del medio en

este caso se produjo de una forma más acelerada y de manera paralela a la entrada a la fase

estacionaria de L. monocytogenes y E. coli.

6.4 VALIDACIÓN DE MODELOS PREDICTIVOS

En este punto se presentan los resultados obtenidos para la fase dos de este estudio. Se

generaron las curvas de crecimiento individuales paras las cuatro cepas bacterianas (L.

plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes) y mixtas en leche entera UHT.

Posteriormente se realizó la validación de los modelos predictivos desarrollados en caldo MRS.

El proceso de validación de los modelos en leche contempló una validación gráfica y

matemática de los datos observados con los predichos.

6.4.1 GENERACIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO INDIVIDUAL EN LECHE ENTERA UHT.

A partir del protocolo utilizado para la generación de curvas de crecimiento bacteriano

individuales en caldos estándar se obtuvieron tres curvas independientes el leche entera UHT a

37ºC para cada uno de los cuatro microorganismos evaluados. La Figura 25 presenta las tres

réplicas de las curvas de crecimiento obtenidas para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L.

monocytogenes.

73

Figura 25. Curv as de crecimiento en cultivo individual en leche entera UHT a 37°C. L. plantarum (A), L. paracasei (B), E. coli (C) y L. monocytogenes (D) en leche UHT a 37ºC (3 réplicas por cepa).

El análisis visual del conjunto de curvas de crecimiento evidencia que tanto E. coli como las dos

BAL (L. plantarum y L. paracasei) no presentaron una fase lag bien definida como si se observó

para L. monocytogenes que permaneció en proceso de adaptación durante aproximadamente 4

a 6 horas. Los cultivos de las cuatro cepas alcanzaron concentraciones máximas similares (9,0

log10 UFC/mL) en la fase estacionaria que se estableció entre las 25 y las 30 horas de

crecimiento.

Paralelo a los recuentos bacterianos, se obtuvieron los valores de pH a lo largo de las curvas de

crecimiento para cada uno de los cultivos. En la Figura 26 se presenta el comportamiento del

pH en función del t iempo, simultáneo al crecimiento bacteriano. Los valores del pH en las

gráficas representan la media ar itmética de las tres réplicas, siendo 0,09 la desviación estándar

más alta.

Se observa en la Figura 26 que las BAL acidif icaron la leche mucho más rápido que las cepas

patógenas y alcanzaron valores de pH entre 3 y 4 después de 24 horas de cultivo, siendo L.

paracasei la cepa que presentó los valores más bajos. Listeria monocytogenes y E. coli

presentan valores de pH cercanos a 5 después de 24 horas de cultivo.

L. pla nta rum 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40Tiemp o (h)

log

UFC

/mL

L. pla nta rum 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40Tiemp o (h)

log

UFC/

mL

L. pl anta rum 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40Tiemp o (h)

log

UFC

/mL

E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40Tiem po (h)

log

UFC/

mL

E. c ol i 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 4 0

T iempo ( h)lo

g U

FC/m

L

L. monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 4 0Tiemp o (h)

log

UFC

/mL

L. monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 4 0T iempo ( h)

log

UFC/

mL

L. pa rac ase i 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiemp o (h)

log

CFU/

mL

L. parac ase i 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiemp o (h)

log

CFU

/mL

L. pa ra ca sei 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h)

log

CFU

/mL

L. m onocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 3 0 40

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

A

B

C

74

Figura 26. Comportamiento del pH en curvas de crecimiento en cultivo individual generadas en leche entera UHT a 37°C. En v erde: pH. En azul: log10 UFC/mL observada para BAL con tres réplicas. En rojo: log10 UFC/mL observada para patógenas con tres réplicas.

6.4.2 GENERACIÓN DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN CULTIVO MIXTO EN LECHE ENTERA UHT.

En la Figura 27 se presentan las curvas de crecimiento en cultivo mixto realizadas en leche

UHT a 37°C con sus respectivas réplicas. Las gráficas claramente muestran que el crecimiento

de las cepas patógenas (en rojo) se modif icó cuando se cultivaron de manera simultánea con

las BAL (en azul).

La interferencia en el crecimiento de E. coli y L. monocytogenes fue evidente al observar que en

cultivo mixto, estas bacterias no alcanzaron las concentraciones celulares previamente

obtenidas cuando se cultivaron de manera individual (9,5 y 9,9 log10 UFC/mL respectivamente),

presentando en este caso una fase estacionaria prematura (hacia las 10 horas de crecimiento).

Cuando E. coli creció en asocio con L. plantarum su crecimiento solo llegó a concentraciones de

5,8 log10 UFC/mL y de 5,4 log10 UFC/mL cuando se cultivó con L. paracasei. De igual forma,

L. paracasei

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

log

CF

U/m

L

0

12

34

5

67

pH

L. plantarum

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

log

CF

U/m

L

01234567

pH

E. coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Tie mpo (h)

log

CF

U/m

L

01234567

pH

L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

logC

FU/m

L01234567

pH

75

cuando L. monocytogenes creció en cultivo mixto con L. plantarum alcanzó concentraciones

máximas de 4,9 log10 UFC/mL y de 5,1 log10 UFC/mL con L. paracasei.

Figura 27. Curvas de crecimiento en cultiv o mixto en leche entera UHT a 37°C. A: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli con 3 réplicas. B: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes con 3 réplicas. C: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli con 3 réplicas. D: Curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes con 3 réplicas. En azul: log10 UFC/mL observada para BAL. En rojo: log10 UFC/mL observada para patógenas.

En todas las réplicas obtenidas para los cultivos mixtos de L. monocytogenes con BAL la

bacteria patógena presentó una marcada fase lag similar a la descrita cuando se cultivó de

L. plantar um + E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tie mpo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + E. co li 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Ti empo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

L. plantar um + L. monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + L. monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Ti empo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + L. m onocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Ti empo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + L . monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + L. monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Ti empo (h)

log U

FC/m

L

L. par acasei + L. monocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40

Tiempo (h)lo

g U

FC/m

L

A

B

C

D

76

manera individual en leche a 37°C, y muy parecida a la que presentó también en las curvas

crecimiento mixtas obtenidas en MRS, cuya duración en todos los casos fue de 4 a 6 horas

aproximadamente.

Por otro lado, L. plantarum y L. paracasei presentaron un comportamiento similar al observado

cuando se cultivaron de manera individual, lo cual sugiere que la interferencia en el crecimiento

de las patógenas no se debe al agotamiento de nutrientes en el medio y podría estar más ligada

a una interacción de amensalismo debido a la producción de sustancias inhibidoras, como bacteriocinas y ácidos orgánicos, por parte de las BAL.

Igual que para las curvas individuales, paralelo a los recuentos bacterianos, se obtuvieron los

valores de pH a lo largo de las curvas de crecimiento para cada uno de los cultivos. En la Figura

28 se presenta el comportamiento del pH en función del tiempo, simultáneo al crecimiento

bacteriano. Los valores del pH en las gráficas representan la media aritmética de las tres

réplicas estudiadas, siendo 0,08, el valor de desviación estándar más alto calculado.

La Figura 28 muestra que el comportamiento del pH para los cuatro tipos de cultivo mixto es

muy similar al obtenido para los cultivos individuales de BAL alcanzando valores entre 3 y 4 en

todos los casos. De igual forma, El A NOVA no determinó diferencias signif icativas entre el pH

de los cultivos individuales de las BAL y sus respectivos cultivos mixtos (Anexo 14). En las

curvas también se puede observar que tanto para E. coli como para L. monocytogenes los

valores de pH mínimos alcanzados en los cultivos mixtos se encuentran por debajo del rango de

su pH óptimo de crecimiento.

Con respecto a la inf luencia del pH en el proceso de inhibición del crecimiento de las cepas

patógenas, se encontró que en la leche se presentó la misma tendencia observada en los co-

cultivos en caldo MRS. Con L. plantarum la inhibición del crecimiento (establecimiento de la

fase estacionaria) tanto de E. coli como de L. monocytogenes no pudo relacionarse claramente

con los mínimos valores de pH alcanzados tanto en co-cultivo como en los respectivos cultivos

individuales.

En los cult ivos mixtos de las cepas patógenas en asocio con L. paracasei sí podr ía sugerirse

una posible influencia del pH sobre la inhibición en el crecimiento de las primeras. La fase de

desaceleración coincidió con los valores mínimos de pH alcanzados por estas cepas en cultivo

77

individual (4,9 para E. coli y 5,1 para L. monocytogenes), donde la fase estacionaria se

estableció casi sincrónicamente con los valores de pH mínimos alcanzados por los co-cultivos.

Figura 28. Comportamiento del pH en curv as de crecimiento en cultiv o mixto en leche entera UHT a 37°C. En verde: pH. En azul: log10 UFC/mL observada para BAL con tres réplicas. En rojo: log10 UFC/mL observada para patógenas con tres réplicas.

6.4.3 VALIDACIÓN DE LOS MODELOS DE CRECIMIENTO PREDICTIVOS

DESARROLLADOS EN CALDO MRS Se validaron en leche entera UHT los cuatro parámetros cinéticos de la ecuación de Baranyi

(Baranyi y Roberts, 1999). En la Tabla 10 se presentan los resultados obtenidos de las

predicciones de estos parámetros (tasa de crecimiento, fase lag, concentración inicial y

concentración máxima) para las curvas de crecimiento en cult ivos individuales y mixtos de L.

plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS a 37°C.

El análisis gráfico para determinar la bondad de ajuste y desempeño de los modelos predictivos

es un criterio muy importante y el primer paso en el proceso de su evaluación (Baranyi et al.,

1999). Las Figuras 29, 31, 33 y 35 presentan de forma visual el desempeño del modelo

L. plantarum + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Ti empo (h)

log

UFC/

mL

0

1

2

3

4

5

6

7

pH

L. plantarum + E. co li

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

0

1

2

3

4

5

6

7

pHL. paracasei + E.coli

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

log

UFC/

mL

0

1

2

3

4

5

6

7

pHL. paracasei + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Tie mpo (h)

log

CFU

/mL

0

1

2

3

4

5

6

7

pH

78

predictivo. La bondad de ajuste del modelo a validar se puede evaluar visualmente al ajustar el

modelo desarrollado en caldo estándar a los datos experimentales de crecimiento obtenidos, en

este caso, en leche entera UHT (Figuras 30, 32, 34 y 36).

Tabla 10. Parámetros cinéticos del modelo de Baranyi generado en MRS a 37°C para curvas de crecimiento en cultiv o individual y mixto.

Cultivo Tasa de

Crecimiento por hora

Fase lag en horas

Concentración Inicial predicha (log10 UFC/mL)

Concentración máxima predicha (log10 UFC/mL)

L. plantarum indiv idual 0,325 2,855 2,736 9,035 L. plantarum con E. coli 0,320 2,685 2,716 9,102 L. plantarum con L. monocytogenes 0,321 2,796 2,729 9,085 L. paracasei individual 0,251 - 3,076 9,274 L. paracasei con E. coli 0,250 - 3,061 9,290 L. paracasei con L. monocytogenes 0,253 - 3,033 9,274 E. coli indiv idual 0,251 - 3,058 8,785 E. coli con L. plantarum 0,333 - 2,767 5,754 E. coli con L. paracasei 0,149 - 2,971 5,311 L. monocytogenes indiv idual 0,315 3,702 1,978 9,070 L. monocytogenes con L. plantarum 0,568 5,419 2,140 4,635 L. monocytogenes con L. paracasei 0,170 1,618 1,967 5,134

Los factores bias o sesgo (Bf) y de exactitud (Af), propuestos por Ross (1996) como también

sus redefiniciones propuestas por Baranyi et al. (1999) se presentan en las Tablas 11, 12, 13 y

14. Adicionalmente se incluye el test del Ji cuadrado como otra prueba para determinar la

calidad del ajuste de los modelos.

6.4.3.1 Validación del modelo de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto

La Figura 29 presenta el ajuste del modelo predictivo de crecimiento desarrollado para el cult ivo

individual de L. plantarum y mixto con E. coli y L. monocytogenes. Las gráficas muestran que el

modelo presentó un buen ajuste en general ya que los valores predichos fueron muy próximos a

los datos observados tanto en cultivo individual (Figura 29a) como mixto (Figura 29b y c).

Sin embargo, para los cultivos mixtos el modelo presentó un mejor ajuste, pues al analizar la

Figura 29a de L. plantarum en cultivo individual se pudo observar que el modelo presentó una

ligera tendencia a subestimar los datos en la fase de desaceleración y estacionaria, que se

79

explica por un mejor crecimiento de L. plantarum en leche entera UHT que en medio MRS a

iguales condiciones.

En la Tabla 11 se presentan los criterios de evaluación de desempeño de los modelos de

predictivos de crecimiento en cultivo individual y mixto para L. plantarum. Los resultados

obtenidos demostraron que los modelos de crecimiento para este microorganismo tanto en

cultivo mixto como a nivel individual t ienen un buen desempeño. Tanto para el modelo

predictivo de crecimiento individual como para el de crecimiento en co-cultivo de L. plantarum

con E. coli y con L. monocytogenes la prueba de Ji cuadrado fue no signif icativa indicando el

buen ajuste de los modelos de estos modelos predictivos (Anexo 15).

Tabla 11. Validación del modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultiv o indiv idual y mixto.

(1) Ross 1996 (2) Barany i et.al 1999 N.S. = no significativ o El Af para el modelo de crecimiento individual de L. plantarum según Ross (1996) presentó un

valor de 1,05 que equivale a un 5,0% de inexactitud en la predicción total del modelo

matemático. Al traducirse en términos de porcentaje de discrepancia %D según de Baranyi et

al. (1999) corresponde al 5,8%. Estos criterios de desempeño indicaron que este modelo

predictivo de crecimiento desarrollado en MRS t iene una exactitud del 94% aproximadamente.

Curva Af (1) %D

(2) Bf (1) % Bias (2) Ji^2

L. plantarum 1,05 5,84 0,96 (-) 3,91 N.S

L. plantarum con E. coli 1,03 3,66 1,00 (-) 0,11 N.S

L. plantarum con L. monocytogenes 1,03 3.40 1,00 (-) 0,07 N.S

80

Figura 29. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. Línea roja: Valores predichos obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. Puntos negros: Valores observ ados obtenidos de curvas en leche entera UHT a 37°C a: L. plantarum. b: L. plantarum y E. coli. c: L. plantarum y L. monocytogenes.

L. plantarum en cultivo mixto con E. col i

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

L. plantarum

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC/

mL

a

b

c

81

Figura 30. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. plantarum en cultivo individual y mixto. Puntos rojos: Valores predichos obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C Línea negra: Valores observados obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. a: L. plantarum. b: L. plantarum y E. coli. c: L. plantarum y L. monocytogenes.

a

b

c

L. plantarum

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10

log UFC/mL observado

log

UFC

/mL

pred

icho

L. plantarum en cultivo mixto con E. coli

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10

log UFC/mL observado

log

UFC/

mL

pred

icho

L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10

log UFC/mL observado

log

UFC

/mL

pred

icho

82

Para los dos modelos predictivos de crecimiento en cultivo mixto, el Af según Ross (1996) fue

de 1,03 que se asemejó al calculado según Baranyi et al. (1999) en términos de porcentaje de

3,6 para el modelo de L. plantarum en co-cultivo con E. coli y de 3,4% para L. plantarum en co-

cultivo con L. monocytogenes. Con una exactitud de predicción de mínimo un 96,0% estos

modelos se pueden considerar confiables y aplicables para predecir comportamiento de L.

plantarum en leche entera UHT tanto en cult ivo individual como mixto. El modelo de crecimiento

individual para L. plantarum presentó un valor de 0,96 para el Bf según Ross (1996) y un % Bias

de (-) 3,9 según Baranyi et al. (1999) lo cual indicó que los valores predichos tendieron a diferir

subestimando los valores observados en aproximadamente 4,0%. El signo menos frente al %B

solo se refiere a que los modelos predictivos tienden a subestimar los datos experimentales.

En el caso de las curvas de crecimiento en cultivo mixto con E. coli y L. monocytogenes, el

modelo predictivo de crecimiento para L. plantarum presentó un ajuste casi perfecto a los datos

experimentales: según Ross (1996) el Af y el Bf fue de 1 y por otro lado según Baranyi et al.

(1999), el % Bias tuvo un valor de (-) 0,1% para el caso de L. plantarum en co-cultivo con E.

coli y de (-) 0,07% para L. plantarum en co-cultivo con L. monocytogenes.

El análisis de los valores de los criterios de desempeño anteriormente presentado y resumido

en la Tabla 11 confirma lo sugerido en la Figura 29, que muestra claramente el buen

desempeño tanto del modelo crecimiento predictivo individual como el de los modelos de

crecimiento predictivos para cultivos mixtos para describir los datos experimentales

determinados en leche entera UHT a 37ºC. Esta capacidad descripción de los modelos

predictivos para L. plantarum en cultivo individual y mixto con E. coli y L. monocytogenes

respectivamente se evidencia en la Figura 30, en las cuales los valores predichos se situaron

muy cerca de la línea de equivalencia. Los coeficientes de correlación calculados confirman

esta condición: r = 0.998 para el cultivo individual, r = 0.997 para L. plantarum en cultivo mixto

con E. coli y r = 0.998 para L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes.

6.4.3.2 Validación del modelo de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto

La Figura 31 muestra el ajuste de los modelos predictivos de crecimiento desarrollados en caldo

MRS a los datos experimentales de crecimiento obtenidos para el cultivo individual de L.

paracasei y mixto con E. coli y L. monocytogenes.

83

Se pudo apreciar que los modelos predictivos para el cult ivo individual y los cultivos mixtos

presentaron un buen ajuste como también lo demostraron los criterios para evaluar su

desempeño contenidos en la Tabla 12. La prueba de Ji cuadrado fue no signif icativa indicando

el buen ajuste de estos modelos predictivos; tanto para el modelo predictivo de crecimiento

individual como para el de crecimiento en co-cultivo de L. plantarum con E. coli y con L.

monocytogenes (Anexo 15).

Tabla 12. Validación del modelo en leche UHT a 37°C para curv as de crecimiento de L. paracasei en cultiv o mixto e individual.

Curva Af (1) %D

(2) Bf (1) % Bias (2) Ji^2

L. paracasei 1,08 9,12% 0,94 (-) 6,50% N.S

L. paracasei con E. coli 1,03 4,00% 1,00 (-) 0,41% N.S

L. paracasei con L. monocytogenes 1,03 3,76% 1,00 (-) 0,19% N.S

(1) Ross 1996 (2) Barany i et.al 1999 N.S. = no significativ o

El modelo predictivo de crecimiento individual para L. paracasei, presentó un valor de Af y Bf de

1,08 y 0,94 respectivamente. Estos valores indicaron que el modelo predijo con una exactitud

del 92,0% con una ligera tendencia a subestimar del 6,0%. Si observamos los mismos criterios

modif icados según Baranyi et al. (1999) se llegó a resultados similares: una discrepancia entre

los datos observados y predichos del 9,0% con una tendencia a la subestimación del 6,5%. Al

igual que L. plantarum, L. paracasei tuvo un mejor desarrollo en leche entera UHT comparado

con MRS a iguales condiciones. Los modelos predictivos de crecimiento para L. paracasei en

asocio con E. coli y con L. monocytogenes presentaron un mejor ajuste a los datos

experimentales. Los factores de Af y Bf de 1,03 y 1,00 respectivamente para los dos modelos.

Aunque el Bf muestra un valor de 1,00 el ajuste de los modelos no es perfecto ya que los otros

factores de evaluación de desempeño determinados no lo confirman. Según el Af los modelos

predicen con una exactitud del 97,0% y se constata con el valor de D del 4,0%. Los modelos

predictivos de crecimiento para crecimiento mixto tienen una tendencia subestimar menor al

0,5% según el % de sesgo. La Figura 32 muestra que los valores predichos se encuentran muy

cercanos a la línea de equivalencia. Los coeficientes de correlación calculados confirman esta

condición: r = 0,995 para el cultivo individual y r = 0,997 para L. paracasei en cultivo mixto con

E. coli o con L. monocytogenes.

84

Figura 31. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. Línea roja: Valores predichos obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. Puntos negros: Valores observ ados obtenidos de curvas en leche entera UHT a 37°C. a: L. paracasei. b: L. paracasei y E. coli. c: L. paracasei y L. monocytogenes.

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

L. paracasei en cultivo mixto con L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

L. paracasei en cultivo mixto con E. coli

L. paracasei

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

a

b

c

85

Figura 32. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. paracasei en cultivo individual y mixto. Puntos rojos: Valores predichos obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C Línea negra: Valores observados obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. a: L. paracasei. b: L. paracasei y E. coli. c: L. paracasei y L. monocytogenes.

a

b

c

L. paracasei

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10

log UFC/mL observado

log

UFC

/mL

pred

icho

L. paracasei en cultivo mixto con E. coli

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10

log UFC/mL observado

log

UFC

/mL

pred

icho

L. paracasei en cultivo mixto con L. monocytogenes

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10

log UFC/mL observado

log

UFC

/mL

pred

icho

86

6.4.3.3 Validación del modelo de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. La Figura 33 presenta el ajuste del modelo de crecimiento desarrollado para E. coli en MRS

para describir los datos experimentales obtenidos en leche entera UHT a 37°C. El análisis

gráfico y la Tabla 13 muestran que el modelo predictivo de crecimiento presentó un buen

desempeño, pues la prueba de Ji cuadrado no signif icativa determinó que el modelo predictivo

si mostró un buen ajuste (Anexo 15).

Sin embargo, el modelo predictivo describió mejor el crecimiento en cult ivo mixto de E. coli ya

que en cultivo individual el modelo tendió a subestimar ligeramente sobre la fase de

desaceleración y la fase estacionaria de crecimiento.

Tabla 13. Validación del modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de crecimiento de E. coli en cultiv o mixto e individual.

Curva Af (1) %D

(2) Bf (1) % Bias (2) Ji^2

E. coli 0,06 6,55% 0,96 (-) 4,40% N.S

E. coli con L. plantarum 0,02 3,01% 1,00 (-) 0,31% N.S

E. coli con L. paracasei 0,03 3,64% 0,99 (-) 1,39% N.S

(1) Ross 1996 (2) Barany i et.al 1999 N.S. = no significativ o

En cultivo individual el modelo predictivo para E. coli presentó un Af de 1,06, lo cual indicó que

el modelo predijo con una exactitud del 94,0%. El %D determinó una discrepancia entre lo

observado y lo predicho del 6,5%.

El valor de Bf de 0.96 muestra que el modelo predictivo de crecimiento tendió a subestimar en

un 4,0%. El criterio redefinido por Baranyi et al. (1999) es muy similar, pues el %B indicó una

subestimación del (-) 4,4%. Al igual que las BAL, E. coli creció mejor en leche entera UHT que

en MRS a iguales condiciones.

El modelo predictivo de crecimiento de E. coli en asocio con L. plantarum, predijo con una

exactitud del 98,0% (Af = 1.02) y según el criterio de Baranyi et al. (1999) el modelo discrepó

de 3,0% con los datos observados en leche entera UHT a 37ºC.

87

Resultados similares se obtuvieron para el modelo de E. coli en co-cultivo con L. paracasei,

donde el Af fue de 1,03 y el %D de 3,6. Al observar la Tabla 13, el modelo predictivo de E. coli

en asocio con L. plantarum, presentó un ajuste aparentemente perfecto a los datos

experimentales ya que el valor de Bf fue de 1.

Sin embargo el %B evidenció que, aunque pequeño, si hay una subestimación por parte del

modelo predictivo del (-) 0,3%. El modelo predictivo de crecimiento de E. coli en asocio con L.

paracasei no presentó casi sesgo con un Bf de 0,99 y un %B de (-) 1,4%, también con una

tendencia a subestimar.

La Figura 34 corroboró lo anteriormente explicado, pues los datos predichos se localizaron muy

cercanos a la línea de equivalencia, indicando buena exactitud de predicción para los modelos

tanto individual como mixto.

Los coeficientes de correlación de r = 0,997 para el cult ivo individual y de r = 0,994 para E. coli

en cultivo mixto con L. plantarum o L. paracasei confirman la buena capacidad de los modelos

predictivos para describir el crecimiento de este patógeno en leche.

6.4.3.4 Validación del modelo de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto

La Figura 35 presenta el modelos predictivos de crecimiento desarrollado en MRS para L.

monocytogenes describiendo los datos experimentales de crecimiento obtenidos para leche

entera UHT a 37ºC. Aunque el análisis visual indicó cierto desajuste del modelo predictivo para

la condición de crecimiento individual (Figura 35a), los criterios estadísticos indicaron un ajuste

adecuado (Tabla 14).

Para los tres modelos predictivos, el individual y los dos mixtos de L. monocytogenes con L.

plantarum y L. paracasei, la prueba del Ji cuadrado fue no signif icativa (Anexo 15).

88

Figura 33. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. Línea roja: Valores predichos obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. Puntos negros: Valores observ ados obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C. a: E coli. b: E. coli y L. plantarum. c: E. coli y L. paracasei.

E. coli en cultivo mixto con L. plantarum

02

468

1012

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

E. coli

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

02468

1012

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

E. coli en cultivo mixto con L. paracasei

a

b

c.

89

Figura 34. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de E. coli en cultivo individual y mixto. Puntos rojos: Valores predichos obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C. Línea negra: Valores observ ados obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. a: E coli. b: E. coli y L. plantarum. c: E. coli y L. paracasei.

a

b

c

E. coli

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10

log UFC/mL observadolo

g U

FC/m

L pr

edic

ho

E. coli en cultivo mixto con L. plantarum

2

3

4

5

6

7

2 3 4 5 6

log UFC/mL observado

log

UFC

/mL

pred

icho

E. coli en cultivo mixto con L. paracasei

2

3

4

5

6

7

2 3 4 5 6

log UFC/mL observado

log

UFC

/mL

pred

icho

90

Tabla 14. Validación del modelo en leche entera UHT a 37°C para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultiv o mixto e indiv idual.

Curva Af (1) %D

(2) Bf (1) % Bias (2) Ji^2

L. monocytogenes 0,19 21,03% 0,84 (-) 19,04% N.S

L. monocytogenes con L. plantarum 0,06 8,00% 1,00 (-) 0,28% N.S

L. monocytogenes con L. paracasei 0,03 3,81% 1,00 (-) 0,46% N.S

(1) Ross 1996 (2) Barany i et.al 1999 N.S. = no significativ o

Para el modelo predictivo de crecimiento individual para L. monocytogenes se determinó un Af de 1,19, lo cual indicó que el modelo predijo con una exactitud del 81,0%. Este resultado se

corroboró con el valor del %D obtenido del 21,0%. Al analizar los factores de sesgo Bf y %B se

estableció de manera matemática que el modelo predictivo presentó una tendencia algo más

marcada que en las situaciones anteriores con L. plantarum, L. paracasei y E. coli a subestimar.

El valor de Bf fue de 0,84 y el %B de (-) 19,0% para el cultivo individual de L. monocytogenes en

condición individual en leche entera UHT a 37ºC. El crecimiento de L. monocytogenes se

favoreció en leche entera UHT, de manera más importante que las otras tres cepas estudiadas.

Los modelos predictivos para L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum y L.

paracasei presentaron un ajuste bueno. Para el cultivo de L. monocytogenes con L. plantarum

el modelo predictivo presentó una exactitud de mínimo del 92,0% (Af = 1,06 y %D = 8,0%). En

crecimiento simultáneo con L. paracasei, el modelo para L monocytogenes predijo con una

exactitud de mínimo 97,0% (Af = 1,03 y %D = 4,0%). Aunque los factores de sesgo (Bf) para los

dos cultivos mixtos de L. monocytogenes presentaron un valor de 1, el %B evidenció una

subestimación del (-) 3,0% y del (-) 5,0% para L. monocytogenes con L. plantarum y con L.

paracasei respectivamente.

La Figura 36 muestra la representación gráfica de lo anteriormente expuesto. La Figura 36a

presenta la subestimación generalizada de L. monocytogenes en cultivo individual y el mejor

desempeño del modelo predictivo de L. monocytogenes en cultivo mixto L. paracasei (Figura

36c).

91

Figura 35. Desempeño del modelo predictivo para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. Línea roja: Valores predichos obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. Puntos negros: Valores observados obtenidos de curv as en leche entera UHT a 37°C. a: L. monocytogenes. b: L. monocytogenes y L. plantarum. c: L. monocytogenes y L. paracasei.

a

b

c

0

24

6

810

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei

0246

81012

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC/m

L

L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum

L. monocytogenes

02

46

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

logU

FC

/mL

92

Figura 36. Representación de la discrepancia entre los valores predichos y los valores observados para curvas de crecimiento de L. monocytogenes en cultivo individual y mixto. Puntos rojos: Valores predichos obtenidos de curvas en leche entera UHT a 37°C Línea negra: Valores observ ados obtenidos del modelo en caldo MRS a 37°C. a: L. monocytogenes. b: L. monocytogenes y L. plantarum. c: L. monocytogenes y L. paracasei.

a

b

c

L. monocytogenes

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10

log UFC/mL observado

log

UFC/

mL

pred

icho

L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum

2

3

4

5

6

2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

log UFC/mL observado

log

UFC

/mL

pred

icho

L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei

2

3

4

5

6

2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

log UFC/mL observado

log

UFC/

mL

pred

icho

93

Los coeficientes de correlación también reflejan este comportamiento: r = 0,994 para el cult ivo

individual y de r = 0,997 para L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei. El modelo

predictivo L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum (Figura 36b) presenta un r de

0,971 con ligeros problemas de predicción en la fase estacionaria.

Finalmente, la validación de los modelos predictivos de crecimiento evidenció que todos los

modelos desarrollados en caldo MRS para cult ivos individuales y mixtos presentaron un buen

desempeño con una tendencia generalizada a subestimar ligeramente y son aptos para su

aplicación en leche UHT a 37ºC, siendo los modelos desarrollados para cultivos mixtos los que

mostraron siempre un mejor desempeño.

6.5 MODELACIÓN PRELIMINAR DE CURVAS EXTENSAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVO

MIXTO

Las curvas de crecimiento en cult ivo mixto, tanto en MRS como en leche entera UHT a 37ºC,

con una extensión de 34 horas (Figuras 20 y 27) evidenciaron que las cepas patógenas, L.

monocytogenes y E. coli, tendían a disminuir su concentración hacia la fase f inal después de 26

horas de crecimiento. Este fenómeno fue más pronunciado para L. monocytogenes en asocio

con L. plantarum. Por esta razón se decidió construir curvas de crecimiento en cult ivo mixto más

extendidas en el t iempo, de 82 horas, para evaluar el comportamiento después de las 34 horas.

En esta sección se presentan los resultados correspondientes a la tercera fase experimental.

Las curvas de crecimiento generadas en cultivo mixto en medio de cultivo estándar y leche

entera UHT a 37ºC mostraron claramente que las concentraciones de los patógenos seguían

disminuyendo en función del tiempo.

6.5.1 CULTIVOS MIXTOS EN CALDO MRS

6.5.1.1 Generación de curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en caldo MRS

Durante 82 horas (17 puntos de muestreo) se evaluó el comportamiento de cada una de las

cuatro cepas al cultivarse en asocio con otro microorganismo. En la Figura 37 se presentan las

curvas de crecimiento para cultivos mixtos realizadas en caldo MRS a 37°C, donde se hizo

94

evidente que el crecimiento de las cepas patógenas (en rojo) se alteró cuando se cultivaron de

manera simultánea con las BAL (en azul).

Figura 37. Curvas extensas de crecimiento en cultiv o mixto en caldo MRS a 37°C. A: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli con 3 réplicas. B: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes con 3 réplicas. C: Curva s extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli con 3 réplicas. D: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes con 3 réplicas. En azul: Cepas BAL. En rojo: Cepas patógenas.

Cuando L. monocytogenes se cultivó en asocio con L. plantarum en caldo MRS a 37°C, el

recuento celular del patógeno llegó a cero hacia las 66 horas de incubación, mientras que

cuando creció con L. paracasei la concentración más baja alcanzada fue de aproximadamente

L. plantar um + E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. p lantarum + E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

L. p lantarum + E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. plantar um + L. monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. p lantarum + L. monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiem po (h)

log

UFC/

mL

L. plantarum + L. monocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + L. monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Ti empo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + L . monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. par acasei + L. monocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. par acasei + E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiem po (h)lo

g U

FC/m

L

A

B

C

D

95

1,6 log10 UFC/mL después de las 80 horas de incubación. Por otro lado, en estas curvas de

crecimiento extendidas las BAL también empezaron a declinar en concentración. La

concentración f inal de L. plantarum fue de 6,0 log10 UFC/mL y de L. paracasei de 6,1 log10

UFC/mL.

La Figura 37 también muestra que cuando E. coli y L. monocytogenes se cultivaron en asocio

con L. plantarum en caldo MRS a 37°C, aproximadamente hacia las 74 horas de incubación el

recuento celular de los patógenos llegó a cero, mientras que cuando crecieron con L. paracasei la concentración más baja alcanzada fue de aproximadamente 2,6 log10 UFC/mL y de 2,0 log10

UFC/mL para E. coli y L. monocytogenes respectivamente después de las 80 horas de

incubación.

En el caso de los co-cultivos de L. plantarum con las bacterias patógenas se evidenció que

estas últimas declinan en concentración a una tasa mayor que L. plantarum: L. monocytogenes

descendió a una tasa de aproximadamente de 0,085 h-1, E. coli de 0,107 h-1 y L. plantarum de

0,053 h-1. Cuando las patógenas se iniciaron en cult ivo con L. paracasei se obtuvo una

disminución bastante paralela de las dos cepas: L. monocytogenes declinó a una tasa de

aproximadamente 0,050 h-1, E. coli de 0,062 h-1 y L. paracasei de 0,050 h-1.

6.5.1.2 Determinación del perfil de pH durante el crecimiento en cultivo mixto de las cepas bacterianas en MRS

Paralelo a los recuentos bacterianos, se determinaron los valores de pH a lo largo del

crecimiento para cada uno de los cultivos mixtos. En la Figura 38 se presenta el

comportamiento del pH en función del tiempo, simultáneo al crecimiento bacteriano, donde los

valores de pH representan la media aritmética de tres réplicas con una desviación estándar

máxima de 0,08.

Cuando se analizó el perf il de pH (los 17 puntos de muestreo) en todas las curvas de

crecimiento, se pudo determinar que el cult ivo mixto de L. plantarum con L. monocytogenes

presentó un pH estable entre 3.7 y 3.6 a partir de la hora 34. Estos valores de pH también se

presentaron en el cultivo mixto de L. plantarum con E. coli, pero a partir de la hora 20 post-

incubación.

96

Por otro lado, los cultivos mixtos de L. paracasei en asocio con E. coli y con L. monocytogenes,

presentaron valores mínimos de pH entre 3.2 y 3.0 que se estabilizaron a partir de la hora 20

aproximadamente. Estos resultados demostraron que L. paracasei acidif icó el medio más

rápido que la otra BAL y alcanzó valores de pH más bajos.

Al observar la Figura 38, y como ya se discutió en el numeral 6.2.2.2, la inhibición del

crecimiento de L. monocytogenes y E. coli, en cultivo mixto con L. paracasei pudo relacionarse

con el pH del medio, por la entrada a fase estacionaria de los patógenos paralela al descenso del pH.

Figura 38. Curvas extensas de crecimiento en cultiv o mixto en caldo MRS a 37°C con el comportamiento del pH. A: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli. B: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes C: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli. D: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes. En verde: pH del cultivo mixto. En negro: pH de patógeno en cultivo individual. En azul: log10 UFC/mL de BAL. En rojo: log10 UFC/mL de patógenas.

A B

L. plantarum + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

1 0

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UF

C/m

L

0

2

4

6

8

10

pH

L. paracasei + E.coli

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

0

2

4

6

8

10

pH

L. paracasei + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 7 0 84Tiempo (h)

log

CF

U/m

L

0

2

4

6

8

10

pH

L. plantarum + E. col i

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 8 4

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

0

2

4

6

8

10

pH

C D

97

Para el caso de L. plantarum en cult ivo mixto con L. monocytogenes o E. coli, la causa de la

inhibición del patógeno no se pudo relacionar claramente con el descenso del pH durante el

cultivo. Podr ía sugerirse que en estos co-cultivos la inhibición del patógeno podría estar

relacionada con la producción de metabolitos antimicrobianos durante la fase exponencial de la

BAL, donde compuestos BLIS podr ían tener un papel antagónico frente a E. coli y L.

monocytogenes.

6.5.1.3 Modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en MRS

Las curvas de crecimiento extendidas no presentaron el patrón tradicional sigmoidal que incluye

solo tres fases principales: fase lag, fase log y fase estacionaria. Las curvas de crecimiento que

se obtuvieron presentaron la fase adicional de muerte o de declinación. Esto implicó que no se

podían utilizar los modelos generalmente empleados para describir el crecimiento microbiano

como son las ecuaciones de Gompertz modif icada (Gibson et al., 1988) y la de Baranyi (Baranyi

y Roberts, 1994).

Como en esta etapa tampoco se podían generar modelos dinámicos por no tener el

conocimiento necesario del sistema, se optó por ajustar modelos netamente descriptivos como

son las ecuaciones polinomiales.

Para justif icar el grado de complejidad requerido para obtener un buen ajuste se inició con una

función lineal (ecuación polinómica de primer grado) hasta llegar a una ecuación cúbica o

polinómica de tercer grado. El Anexo 16 presenta la justif icación de los parámetros relacionados

con la ecuación polinomial de tercer grado.

La Tabla 15 contiene el MSE, el r y R2 provenientes del análisis de regresión para los tres

modelos polinomiales ajustados a los datos experimentales. Como se hace evidente el modelo

cúbico presentó el mejor ajuste con valores de MSE entre 0.051 y 0.119 y valores de R2 entre

0.912 y 0.986.

Las Figuras 39 para L. plantarum, 40 para L. paracasei, 41 para E. coli y 42 para L.

monocytogenes muestran el ajuste adecuado del modelo cúbico con la ecuación

correspondiente para cada uno de los casos. Sin embargo, la aplicación de la prueba de falta de

98

ajuste arrojó resultados signif icativos determinando que el modelo polinómico de tercer grado

no era el más adecuado para describir los datos experimentales.

Se debe considerar que aunque el resultado de esta prueba estadística reflejó una falta

adecuada de ajuste, esta está influenciada por las características del sistema con un error puro

menor que el esperado en un contexto experimental biológico.

Tabla 15. Análisis de regresión para los tres modelos polinomiales ajustados a los cultiv os mixtos en caldo MRS a 37°C. r: Coeficiente de Correlación. R2: Coef iciente de Determinación. MSE: Error del Modelo

Modelo Lineal Modelo Cuadrático Modelo Cúbico Cultivo R MSE R2 MSE R2 MSE

L. plantarum con E. coli 0,403 2,804 0,930 0,465 0,986 0,067 L. plantarum con L. monocytogenes 0,385 2,873 0,932 0,449 0,986 0,065 L. paracasei con E.coli 0,489 2,702 0,901 0,680 0,977 0,119 L. paracasei con L. monocytogenes 0,384 3,205 0,913 0,620 0,978 0,095 E. coli con L. plantarum 0,761 1,691 0,947 0,426 0,979 0,084 E. coli con L. paracasei 0,462 0,857 0,867 0,276 0,912 0,108 L. monocytogenes con L. plantarum 0,764 1,243 0,917 0,487 0,978 0,069 L. monocytogenes con L. paracasei 0,451 0,876 0,894 0,225 0,952 0,051

En la literatura no se encontraron, hasta el momento, modelos predictivos para este tipo de

curvas completas: fase lag, exponencial, estacionaria y de muerte. Una primera y fácil

aproximación a la modelación de este tipo de curva de crecimiento es el uso de modelos

lineales segmentados. Sin embargo, en este tipo de modelos lineales fragmentados los puntos

de inflexión siempre son motivo de complejidad. Por lo tanto, se desarrollaron modelos

predictivos preliminares con solo la intención de describir el comportamiento microbiano de

manera continua. Al emplear modelos polinomiales, los parámetros de estas ecuaciones no

pueden relacionarse con parámetros cinéticos de crecimiento o de muerte microbiana. La

bondad de ajuste para este caso se evalúo mediante una prueba formal de falta de ajuste

donde se determinó la diferencia signif icativa entre el error por falta de ajuste y el error puro.

99

Figura 39. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. plantarum durante curv as de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. A: L. plantarum en cultivo mixto con E. coli. B: L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes. En azul: L. plantarum observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.

L. plantarum + E. coli

y = 5E-05x3 - 0,0091x2 + 0,4487x + 2,1409R2 = 0,9859

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + L. monocytogenes

y = 5E-05x3 - 0,0091x2 + 0,4524x + 2,1026R2 = 0,986

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

A

B

100

Figura 40. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. paracasei durante curv as de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. A: L. paracasei en cultivo mixto con E. coli. B: L. paracasei en cultivo mixto con L. monocytogenes. En azul: L. paracasei observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.

L. paracasei + E. coli

y = 6E-05x3 - 0,0107x2 + 0,5013x + 2,0546R2 = 0,9775

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + L. monocytogenes

y = 6E-05x3 - 0,0105x2 + 0,498x + 2,0508R2 = 0,978

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

A

B

101

Figura 41. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de E. coli durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. A: E. coli en cultivo mixto con L. plantarum B: E. coli en cultivo mixto con L. paracasei. En rojo: E. coli observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.

A

B

E. coli + L. plantarum

y = 5E-05x3 - 0,0083x2 + 0,3017x + 2,9548R2 = 0,9795

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

E. coli + L. paracasei

y = 4E-05x3 - 0,0059x2 + 0,236x + 3,1645R2 = 0,9123

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

102

Figura 42. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. monocytogenes durante curvas de crecimiento extensas en caldo MRS a 37°C. A: L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum B: L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei. En rojo: L. monocytogenes observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.

L. monocytogenes + L. plantarum

y = 6E-05x3 - 0,0086x2 + 0,3002x + 1,9727R2 = 0,9782

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. monocytogenes + L. paracasei

y = 4E-05x3 - 0,006x2 + 0,2411x + 1,7979R2 = 0,9527

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

A

B

103

6.5.2 CULTIVOS MIXTOS EN LECHE ENTERA UHT

6.5.2.1 Generación de curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en leche entera UHT

Al igual que en caldo MRS, se generaron en leche entera UHT tres réplicas independientes de

curvas extensas de crecimiento en co-cultivo por cada cepa bacteriana en estudio. Los cultivos

mixtos evaluados fueron: L. plantarum con E. coli, L. plantarum con L. monocytogenes, L.

paracasei con E. coli y L. plantarum con L. monocytogenes.

Durante 82 horas (17 puntos de muestreo) se evaluó el comportamiento de cada una de las

cuatro cepas al cultivarse en asocio con otro microorganismo. En la Figura 43 se presentan las

curvas de crecimiento mixtas realizadas en leche entera UHT a 37°C donde se hace evidente

que el crecimiento de las cepas patógenas (en rojo) se vio afectado cuando se cultivan de

manera simultánea con las BAL (en azul).

Tanto E. coli como L. monocytogenes no alcanzaron las concentraciones celulares máximas

previamente alcanzadas en cult ivos individuales (9,5 y 9,9 log10 UFC/mL en cult ivos individuales

y 5,8 y 5,0 log10 UFC/mL en cultivos mixtos, respectivamente). Sin embargo, el patrón de

comportamiento de las BAL fue muy similar para todos los co-cultivos alcanzando las

concentraciones celulares más bajas sobre las 82 horas aproximadamente de 7,0 log10

UFC/mL.

Entre las 70 y las 74 horas de incubación el recuento celular de L. monocytogenes llegó a cero

cuando se cultivó en asocio con L. plantarum en leche UHT a 37°C (Figura 43b). Escherichia

coli presentó un comportamiento similar a L. monocytogenes al cultivarse en asocio con L.

plantarum aunque las concentraciones celulares máximas fueron más altas para E. coli (5,8

log10 UFC/mL versus 5,0 log10 UFC/mL ) (Figura 43a).

Para el caso de los co-cultivos de L. paracasei con E. coli y L. monocytogenes se obtuvieron

patrones de crecimiento e inhibición similares para los dos patógenos. Las concentraciones

f inales no fueron de 0 UFC/mL, pero si disminuyeron a 1,6 log10 UFC/mL después de las 74

horas de incubación para L. monocytogenes (Figura 43d) y a 2,7 log10 UFC/mL para E. coli

(Figura 43c).

104

Los co-cultivos de BAL con patógenos presentaron un patrón de comportamiento similar

respectivamente en MRS y leche entera UHT a 37ºC como lo muestran la Figuras 37 y 43.

Figura 43. Curvas extensas de crecimiento en cultiv o mixto en leche entera UHT a 37°C. A: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli con 3 réplicas. B: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes con 3 réplicas. C: Curva s extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli con 3 réplicas. D: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes con 3 réplicas. En azul: Cepas BAL. En rojo: Cepas patógenas.

L. plantar um + E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. p lantarum + E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

L. p lantarum + E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. plantar um + L. monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. p lantarum + L. monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiem po (h)

log

UFC/

mL

L. plantarum + L. monocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + E. coli 1

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + E. coli 2

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + L. monocytogenes 1

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Ti empo (h)

log U

FC/m

L

L. paracasei + L . monocytogenes 2

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log U

FC/m

L

L. par acasei + L. monocytogenes 3

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. par acasei + E. coli 3

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiem po (h)

log

UFC

/mL

A

B

C

D

105

6.5.2.2 Determinación del perfil de pH durante el crecimiento en cultivo mixto de las

cepas bacterianas en leche entera UHT Paralelo a los recuentos bacterianos se determinaron los valores de pH a lo largo del

crecimiento para cada uno de los cultivos mixtos. La Figura 44 presenta el comportamiento del

pH en función del t iempo, simultáneo al crecimiento bacteriano, donde los valores del pH

representan la media aritmética de tres réplicas, siendo 0,09 el valor de desviación estándar

más alto calculado.

Cuando se analizó el perf il de pH (los 17 puntos de muestreo) en todas las curvas de

crecimiento en leche entera UHT, se pudo determinar que el cultivo mixto de L. plantarum con

L. monocytogenes presentó un pH estable entre 3,7 y 3,6 a partir de la hora 34. Estos valores

de pH también se obtuvieron para los cultivos mixtos de L. plantarum con E. coli, pero a partir

de la hora 20 post incubación.

Por otro lado, los cultivos mixtos de L. paracasei en asocio con E. coli y con L. monocytogenes,

presentaron valores mínimos de pH entre 3,2 y 3,0 que se estabilizaron a partir de la hora 20

aproximadamente. Estos resultados demuestran que L. paracasei tiende a acidif icar la leche

más rápido que la otra BAL y a alcanzar valores de pH más bajos al igual que como se observó

en caldo MRS.

Al igual que lo observado en los cultivos mixtos realizados en MRS, la inhibición del crecimiento

de L. monocytogenes y E. coli, en cultivo mixto con L. paracasei pudo relacionarse con el pH del

medio. Sin embargo, la inhibición del crecimiento de los patógenos por parte de L. plantarum

puede estar más relacionada con la presencia de sustancias inhibidoras.

6.5.2.3 Modelación preliminar de las curvas de crecimiento extendidas en cultivo mixto en leche entera UHT

Por las razones expuestas en el numeral 6.5.1.3 se ajustaron modelos netamente descriptivos

como son las ecuaciones polinomiales a los datos experimentales obtenidos para cultivos

mixtos en leche entera UHT. El Anexo 16 presenta la justif icación de los parámetros

relacionados con la ecuación polinomial de tercer grado.

106

Figura 44. Curvas extensas de crecimiento en cultiv o mixto en leche entera UHT a 37°C con el comportamiento del pH. A: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y E. coli. B: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L. monocytogenes C: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y E. coli. D: Curvas extensas de crecimiento en cultivo mixto de L. paracasei y L. monocytogenes. En verde: pH del cultivo mixto. En negro: pH de patógeno en cultivo individual. En azul: log10 UFC/mL de BAL. En rojo: log10 UFC/mL de patógenas.

La Tabla 16 contiene el MSE, el r y R2 provenientes del análisis de regresión para los tres

modelos polinomiales ajustados a los datos experimentales. El modelo cúbico presentó el mejor

ajuste con valores de MSE entre 0,053 y 0,119 y valores de R2 entre 0,907 y 0,980.

Las Figuras 45 para L. plantarum, 46 para L. paracasei, 47 para E. coli y 48 para L.

monocytogenes muestran el ajuste adecuado del modelo cúbico con la ecuación

correspondiente para cada uno de los casos.

A B

L. plantarum + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

1 0

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UF

C/m

L

0

2

4

6

8

10

pH

L. paracasei + E.coli

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 7 0 8 4

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

0

2

4

6

8

10pH

L. paracasei + L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 7 0 84Tiempo (h)

log

CFU

/mL

0

2

4

6

8

10

pH

L. plantarum + E. col i

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 8 4

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

0

2

4

6

8

10

pH

C D

107

Como para el caso anterior, la aplicación de la prueba de falta de ajuste arrojó resultados

signif icativos determinando que el modelo polinómico de tercer grado no era el más adecuado

para describir los datos experimentales.

De igual manera se debe considerar que aunque el resultado de la prueba estadística reflejó

una falta adecuada de ajuste, ésta fue determinada por las características del sistema con un

error puro muy pequeño. Tabla 16. Análisis de regresión para los tres modelos polinomiales ajustados a los cultiv os mixtos en leche UHT a 37°C. r: Coeficiente de correlación. R2: Coeficiente de determinación. MSE: Error del Modelo.

Modelo Lineal Modelo Cuadrático Modelo Cúbico Cultivo R MSE R2 MSE R2 MSE

L. plantarum con E. coli 0,551 2,323 0,912 0,574 0,980 0,094 L. plantarum con L. monocytogenes 0,551 2,323 0,910 0,584 0,977 0,085 L. paracasei con E.coli 0,489 2,702 0,901 0,680 0,975 0,119 L. paracasei con L. monocytogenes 0,491 2,701 0,897 0,713 0,970 0,109 E. coli con L. plantarum 0,767 1,607 0,947 0,411 0,975 0,095 E. coli con L. paracasei 0,462 0,857 0,867 0,276 0,907 0,108 L. monocytogenes con L. plantarum 0,782 1,011 0,935 0,333 0,977 0,087 L. monocytogenes con L. paracasei 0,464 0,838 0,890 0,227 0,961 0,053

Finalmente, se determinó que las curvas de crecimiento extendidas en cult ivo mixto, tanto en

MRS como en leche entera UHT, mostraron que el crecimiento de los patógenos, E. coli y L.

monocytogenes, no solamente no alcanzaron las concentraciones máximas para sus cultivos

individuales sino que presentaron una fase de muerte más marcada que las BAL,

especialmente para L. monocytogenes cuyos recuentos celulares después de las 66 horas

fueron de 0 UFC/mL. No obstante el resultado de la prueba de falta de ajuste, se puede decir

que la ecuación polinomial de tercer grado describió de manera satisfactoria el comportamiento

de las cuatro cepas bacterianas en los respectivos cultivos mixtos.

108

Figura 45. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. plantarum durante curv as de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. A: L. plantarum en cultivo mixto con E. coli. B: L. plantarum en cultivo mixto con L. monocytogenes. En azul: L. plantarum observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.

L. plantarum + E. coli

y = 6E-05x3 - 0,0094x2 + 0,4487x + 2,1791R2 = 0,9802

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. plantarum + L. monocytogenes

y = 6E-05x3 - 0,0102x2 + 0,4753x + 2,1001R2 = 0,9772

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

A

B

109

Figura 46. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. paracasei durante curv as de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. A: L. paracasei en cultivo mixto con E. coli. B: L. paracasei en cultivo mixto con L. monocytogenes. En azul: L. paracasei observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.

L. paracasei + E. coli

y = 6E-05x3 - 0,0105x2 + 0,4943x + 2,0521R2 = 0,975

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei + L. monocytogenes

y = 7E-05x3 - 0,0106x2 + 0,4964x + 2,0517R2 = 0,9707

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

A

B

110

Figura 47. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de E. coli durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. A: E. coli en cultivo mixto con L. plantarum B: E. coli en cultivo mixto con L. paracasei. En rojo: E. coli observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.

E. coli + L. plantarum

y = 5E-05x3 - 0,0081x2 + 0,2938x + 2,9363R2 = 0,9752

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

E. coli + L. paracasei

y = 4E-05x3 - 0,0057x2 + 0,2253x + 3,2624R2 = 0,9072

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

A

B

111

Figura 48. Ajuste de la Ecuación Polinomial Cúbica a los cultiv os mixtos de L. monocytogenes durante curvas de crecimiento extensas en leche entera UHT a 37°C. A: L. monocytogenes en cultivo mixto con L. plantarum B: L. monocytogenes en cultivo mixto con L. paracasei. En rojo: L. monocytogenes observado. En negro: Curva de tendencia de la Ecuación Polinomial Cúbica.

L. monocytogenes + L. plantarum

y = 4E-05x3 - 0,0069x2 + 0,2405x + 2,3459R2 = 0,9772

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. monocytogenes + L. paracasei

y = 4E-05x3 - 0,0061x2 + 0,2384x + 1,9915R2 = 0,9613

0

2

4

6

8

10

0 14 28 42 56 70 84

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

A

B

112

6.6 DISCUSIÓN FINAL

6.6.1 ANÁLISIS COMPARATIVO DEL COMPORTAMIENTO DE LOS PARÁM ETROS

CINÉTICOS ENTRE LOS MODELOS EN CALDO MRS Y EN LECHE ENTERA UHT PARA CULTIVOS INDIVIDUALES Y MIXTOS.

Los resultados contenidos en el numeral 6.4 sobre validación, demostraron que los modelos

predictivos desarrollados en MRS presentaron un buen desempeño y podían ser aplicados para

predecir el crecimiento de los cultivos individuales y mixtos en leche entera UHT a 37ºC no

obstante su tendencia generalizada a subestimar los datos experimentales. Este estudio, sin

embargo, no permitió ver de manera clara las diferencias y características en el crecimiento que

presentaron los cultivos individuales y mixtos cuando los cultivos se realizaron y MRS y leche

entera UHT respectivamente. Para tal f in, se realizó un análisis comparativo de los parámetros

cinéticos y de los valores de pH obtenidos en caldo MRS y en leche.

El ANOVA no arrojó diferencias signif icativas para los parámetros cinéticos de fase lag (Anexo

11), concentración inicial (Anexo 12) y pH (Anexo 14) calculados en caldo MRS versus los

obtenidos en leche entera UHT como se muestra en la Tabla 17

Tabla 17. Comparación de parámetros cinéticos y pH obtenidos en caldo MRS versus los obtenidos en leche entera UHT. CIP: Concentración inicial predicha (log10 UFC/mL). Tasa Cto: Tasa de crecimiento por hora. CMP: Concentración máxima alcanzada (log10 UFC/mL). N.S: No significativo. S: Significativo.

CULTIVO CIP Fase Lag Tasa Cto CMP pH L. plantarum individual N. S N. S S S N. S L. plantarum con E. coli N. S N. S N.S N. S N. S L. plantarum con L. monocytogenes N. S N. S N.S S N. S L. paracasei individual N. S N. S S S N. S L. paracasei con E.coli N. S N. S N.S N. S N. S L. paracasei con L. monocytogenes N. S N. S N.S S N. S E. coli individual N. S N. S S S N. S E. coli con L. plantarum N. S N. S N.S N. S N. S E. coli con L. paracasei N. S N. S N.S N. S N. S L. monocytogenes individual N. S N. S N.S S N. S L. monocytogenes con L. plantarum N. S N. S N.S N.S N. S L. monocytogenes con L. paracasei N. S N. S N.S N.S N. S

Cuando se compararon estadísticamente las tasas de crecimiento (Anexo 10) y las máximas

concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) (Anexo 13) en caldo MRS versus las obtenidas en

113

leche entera UHT se encontraron diferencias signif icativas para algunos cultivos individuales y

mixtos como se muestra en la Tabla 17. Sin embargo, en la Figura 49, donde se presentan las

curvas de crecimiento de los microorganismos con diferencias estadísticamente signif icativas,

se observó que el crecimiento de estos microorganismos era muy similar en caldo MRS y leche

entera UHT no obstante, que el crecimiento en caldo MRS fuera algo inferior que en leche

entera UHT.

Para L. plantarum en cult ivo individual se presentaron diferencias signif icativas en su tasa de crecimiento y en su máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL). Esta BAL presentó un

mejor crecimiento en leche que en caldo MRS, alcanzando concentraciones un poco más

elevadas en la matriz alimentaria (0,6 ciclos logar ítmicos aproximadamente) y con tasas de

crecimiento mayores (3,2%). Estos resultados demostraron que la leche entera constituyó un

medio de crecimiento con mejores condiciones nutricionales que el caldo MRS (Anexo 2), lo que

se reflejó en la subestimación de las predicciones del modelo desarrollado. Por otro lado, la

máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL) de esta BAL en cultivo mixto con L.

monocytogenes también presentó diferencias signif icativas (Anexo 13) y al igual que el caso

anterior se debe a las características f isicoquímicas de la leche que favorecen el crecimiento de

la BAL.

Para L. paracasei en cultivo individual también se presentaron diferencias signif icativas en su

tasa de crecimiento y en su máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL). La BAL aumentó

su tasa de crecimiento en leche en un 3,9% y su máxima concentración alcanzada (log10

UFC/mL) en 0,8 ciclos logarítmicos aproximadamente. La máxima concentración alcanzada

(log10 UFC/mL) de esta BAL en cultivo mixto con L. monocytogenes también presentó

diferencias signif icativas (Anexo 13) y al igual que el caso anterior se debe a las características

f isicoquímicas de la leche que favorecen el crecimiento de la L. paracasei (Figura 49b).

En la Figura 50 se presentan las curvas de crecimiento en cultivo mixto de L. plantarum y L.

paracasei en asocio con L. monocytogenes, tanto en MRS como en leche entera UHT, donde

se puede observar que a pesar de presentar diferencias signif icativas en la máxima

concentración alcanzada (log10 UFC/mL), las BAL tienen un patrón de comportamiento muy

similar en ambos medios cuando crecen en co-cultivos con L. monocytogenes.

114

Figura 49. Modelos de crecimiento para cultivos individuales de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS yen leche entera UHT a 37°C. En azul: Modelos de crecimiento para cultivos individuales en leche UHT. En rojo: Modelos de crecimiento para cultivos individuales en caldo MRS. a: L. plantarum. b: L. paracasei. c: E. coli. d: L. monocytogenes.

Figura 50. Modelos de crecimiento para cultiv os mixtos de L. plantarum y L. paracasei en asocio con L. monocytogenes en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C. En azul: BAL en leche entera UHT. En rojo: BAL en caldo MRS. En verde: Patógeno en leche entera UHT. En naranja: Patógeno en caldo MRS. a: L. plantarum con L. monocytogenes. b: L. paracasei con L. monocytogenes.

L. plantarum

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 2 5 3 0 35

Tiempo (h)

log

UF

C/m

L

E. coli

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 1 5 2 0 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

12

0 5 1 0 15 20 25 3 0 35

Tiempo (h)lo

g U

FC/m

L

L. paracasei

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 1 5 2 0 25 3 0 35

log

UFC

/ml

T ie mpo (h)

L. plantarum con L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 1 5 20 25 3 0 35

Tie mpo (h)

log

UF

C/m

L

L. paracasei con L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 1 5 20 25 3 0 3 5

log

UF

C/m

l

T iempo (h )

a b

115

Al comparar las tasas de crecimiento y las máximas concentraciones de E. coli en caldo MRS

versus las obtenidas en leche entera UHT se encontraron diferencias signif icativas para el

patógeno en cultivo individual (Anexos 10 y 13). Estas diferencias se presentaron, al igual que

en los casos anteriores, porque la bacteria presentó un crecimiento ligeramente mejor en leche

que en caldo MRS (Figura 49c), aumentando su tasa de crecimiento en un 2,7% y en 0,8 ciclos

logar ítmicos su máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL).

Cuando se compararon las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) por L. monocytogenes en cultivo individual en los dos medios, se encontraron diferencias

signif icativas. La bacteria presentó un crecimiento ligeramente inferior en caldo MRS que en

leche entera UHT (Figura 49d), con una reducción de aproximadamente 0,7 ciclos logar ítmicos

con respecto a su máxima concentración alcanzada (log10 UFC/mL).

Después de analizar el comportamiento de los cultivos, tanto individuales como mixtos, en los

dos medios estudiados (caldo MRS y leche entera UHT), se pudo concluir que las diferencias

existentes entre las tasas de crecimiento y las máximas concentraciones alcanzadas fueron

pequeñas no alterando el patrón de comportamiento de los cultivos que fue muy similar.

6.6.2 ANÁLISIS DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE LOS MODELOS DESARROLADOS EN CALDO MRS

Se compararon las tasas de crecimiento, las fases lag y las máximas concentraciones

alcanzadas obtenidas de los cultivos individuales versus los cultivos mixtos desarrollados en

MRS a 37°C. Este análisis se realizó con el f in de establecer si existían diferencias signif icativas

entre el comportamiento de los microorganismos cuando crecieron de manera individual, frente

a su comportamiento cuando lo hicieron en asocio con otros microorganismos.

Una forma sencilla de análisis lo constituye la determinación de coeficientes (parámetro cultivo

individual/parámetro cultivo mixto) para los tres parámetros mencionados. El valor de 1 para el

coeficiente signif icó por lo tanto equivalencia entre el parámetro cinético calculado para cult ivo

individual y el mixto. Valor superior a 1 representó un mayor valor para el parámetro cinético en

cultivo individual y un valor inferior a 1, un mayor valor para el parámetro cinético en cultivo

mixto.

116

6.6.1.1 Tasas de crecimiento

La Tabla 18 contiene los coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultivos individuales

versus los cultivos mixtos con todas las réplicas en MRS a 37°C. Se presentaron diferencias

signif icativas al comparar las tasas de crecimiento de los patógenos en cult ivo individual versus

sus tasas en cultivo mixto con las BAL, en caldo MRS (Anexo 10) y como se reportó en el

numeral 6.2.2, en presencia de L. plantarum, E. coli aumentó su tasa de crecimiento en un 33%

mientras que al crecer con L. paracasei su tasa de crecimiento se redujo en un 41%.

Comportamiento similar se observó con L. monocytogenes en cultivo mixto, pues en presencia

de L. plantarum su tasa de crecimiento se aceleró en un 80% mientras que creciendo con L.

paracasei su velocidad de crecimiento diminuyó en un 46% (Tabla 18a y 18b).

Por causas no identif icadas experimentalmente, tanto E. coli como L. monocytogenes

incrementaron su tasa de crecimiento al crecer en asocio con L. plantarum. Este tipo de

respuesta se observa normalmente cuando las condiciones de crecimiento ambientales y

nutricionales se mejoran para un microorganismo en particular. En este caso las condiciones

permanecen constantes con relación a las presentes durante los cultivos individuales.

Cualquiera fuera la causa de este aumento en la tasa de crecimiento se indujo por el

crecimiento interactivo entre las dos cepas bacterianas: síntesis de algún factor de crecimiento

o cualquier tipo de compuesto con función de señal.

Tabla 18 Coeficientes ente las tasas de crecimiento de los cultiv os individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en caldo MRS a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.

CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3 E. coli 4

E. coli con L. plantarum 1 1,70 1,72 1,71 1,71 E. coli con L. plantarum 2 1,73 1,74 1,70 1,73 E. coli con L. plantarum 3 1,75 1,73 1,72 1,72 E. coli con L. paracasei 1 0,74 0,75 0,74 0,73 E. coli con L. paracasei 2 0,76 0,77 0,73 0,76 E. coli con L. paracasei 3 0,73 0,76 0,73 0,75

117

b.

CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3 L. mono 4

L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,89 1,91 1,92 1,92 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,88 1,89 1,91 1,92 L. monocytogenes con L. plantarum 3 1,87 1,89 1,90 1,89 L. monocytogenes con L. paracasei 1 0,67 0,61 0,65 0,64 L. monocytogenes con L. paracasei 2 0,59 0,62 0,65 0,63 L. monocytogenes con L. paracasei 3 0,65 0,61 0,63 0,60

c.

CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3 L. planta 4

L. plantarum con E. coli 1 1,00 1,01 1,01 1,02 L. plantarum con E. coli 2 1,01 1,00 0,99 1,01 L. plantarum con E. coli 3 1,01 1,00 0,99 0,99

L. plantarum con L. monocytogenes 1 1,02 1,10 1,00 1,02 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,01 1,01 0,99 0,98 L. plantarum con L. monocytogenes 3 0,99 1,00 0,98 1,02

d.

CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3 L. parac 4

L. paracasei con E. coli 1 1,01 1,02 1,00 1,01 L. paracasei con E. coli 2 1,02 0,98 1,01 1,00 L. paracasei con E. coli 3 1,01 1,01 1,00 0,99

L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,00 1,00 0,98 L. paracasei con L. monocytogenes 2 1,01 1,01 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 1,02 0,98 1,00 1,00

Al comparar el comportamiento de las tasas de crecimiento en los cultivos individuales versus

los mixtos para las BAL, se pudo determinar que no existen diferencias marcadas entre las

tasas de crecimiento de las bacterias cuando crecieron de manera individual frente a sus

cultivos mixtos con los patógenos y así mismo, en los ANOVA realizados, tampoco se

presentaron diferencias signif icativas al comparar estas tasas (Anexo 10). Estos resultados se

pueden observar en la Tabla 18c y 18d, donde los coeficientes obtenidos para cada caso son

muy cercanos a la unidad. Estos resultados confirman lo planteado en el numeral 6.2.2 donde

se sugiere que la interacción que se presenta al interior de los cultivos mixtos puede tratarse de

un caso de amensalismo, donde en este caso, las bacterias patógenas resultaron afectadas y

fueron inhibidas, mientras las BAL no modif icaron su comportamiento y se desarrollaron bajo

condiciones normales.

118

6.6.1.2 Fase Lag

En la Tabla 19 se presentan los coeficientes calculados para comparar las fases lag de los

cultivos individuales versus los cultivos mixtos con todas sus réplicas en MRS a 37°C. Los

coeficientes obtenidos para los cultivos de E. coli (Tabla 19a) y L. paracasei (Tabla 19d)

demostraron que no existen diferencias en este parámetro cinético para estas bacterias cuando

crecieron de manera individual frente a cuando crecieron en asocio con otros microorganismos.

Lactobacillus plantarum presentó esta misma tendencia de equivalencia entre las fases lag, cuando se compararon sus cultivos mixtos frente a sus individuales, lo cual se reflejó en los

cocientes con valores muy cercanos a la unidad en todas sus réplicas (Tabla 19c).

Cuando se compararon las fases lag de L. monocytogenes, se pudo determinar que la duración

de esta fase se redujo considerablemente (de 3.7 horas a 1,6 horas) cuando el patógeno creció

en cultivo mixto con L. paracasei (Tabla 19b), siendo 2,41 el coeficiente más alto obtenido,

dando diferencias signif icativas en el ANOVA realizado (Anexo 11). Sin embargo cuando se

compararon los cultivos individuales de L. monocytogenes con los mixtos en asocio con L.

plantarum se presentó un aumento de 5,4 horas en la duración de la fase lag, que se vió

reflejado en cocientes menores a 1, siendo 0.60 el coeficiente más bajo. Tampoco se

presentaron diferencias signif icativas en este caso (Anexo 11).

El comportamiento observado en la fase lag de L. monocytogenes se mostró contrario a lo

observado con las tasas de aceleración. La causa de este patrón de crecimiento permanece

aún desconocida. Sin embargo, ya para la construcción de los modelos dinámicos tendrá que

identif icarse el factor asociado a este comportamiento.

Tabla 19. Coeficientes entre las fases lag de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en caldo MRS a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.

CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3 E. coli 4

E. coli con L. plantarum 1 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. plantarum 2 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. plantarum 3 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 1 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 2 1,00 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 3 1,00 1,00 1,00 1,00

119

b.

CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3 L. mono 4

L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,12 2,03 2,41 2,21 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,56 1,32 1,52 2,16 L. monocytogenes con L. plantarum 3 2,00 1,89 1,86 2,14 L. monocytogenes con L. paracasei 1 0,73 0,69 0,76 0,68 L. monocytogenes con L. paracasei 2 0,85 0,62 0,73 0,77 L. monocytogenes con L. paracasei 3 0,72 0,60 0,74 0,81

c.

CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3 L. planta 4

L. plantarum con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 1,00 L. plantarum con E. coli 2 0,99 0,98 0,97 1,01 L. plantarum con E. coli 3 1,01 0,99 1,00 1,00

L. plantarum con L. monocytogenes 1 1,00 1,02 1,00 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,02 1,01 0,97 0,99 L. plantarum con L. monocytogenes 3 1,03 0,98 1,00 1,01

d.

CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3 L. parac 4

L. paracasei con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 2 1,00 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 1,00 1,00 1,00 1,00

L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 2 1,00 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 1,00 1,00 1,00 1,00

6.3.1.3 Máxima concentración bacteriana alcanzada

En la Tabla 20 se presentan los cocientes obtenidos para comparar las máximas

concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cult ivos individuales versus los cultivos

mixtos con todas sus réplicas en MRS a 37°C.

Los coeficientes con valores superiores a la unidad, demostraron una reducción en las

concentraciones alcanzadas por los patógenos cuando crecen en asocio con las BAL (Tabla

20a y 20b).

120

Tabla 20. Coeficientes entre las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cultiv os individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en caldo MRS a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.

CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3 E. coli 4

E. coli con L. plantarum 1 1,78 1,76 1,75 1,70 E. coli con L. plantarum 2 1,69 1,68 1,66 1,71 E. coli con L. plantarum 3 1,75 1,70 1,67 1,75 E. coli con L. paracasei 1 1,63 1,83 1,81 1,86 E. coli con L. paracasei 2 1,72 1,77 1,59 1,61 E. coli con L. paracasei 3 1,63 1,62 1,71 1,59

b.

CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3 L. mono 4

L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,82 1,76 1,72 1,76 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,78 1,75 1,71 1,73 L. monocytogenes con L. plantarum 3 1,80 1,75 1,74 1,70 L. monocytogenes con L. paracasei 1 1,95 1,90 1,91 1,95 L. monocytogenes con L. paracasei 2 1,98 1,89 1,92 1,86 L. monocytogenes con L. paracasei 3 2,01 1,95 1,96 2,02

c.

CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3 L. planta 4

L. plantarum con E. coli 1 1,01 1,00 0,99 1,01 L. plantarum con E. coli 2 0,99 0,99 1,00 0,99 L. plantarum con E. coli 3 1,00 0,99 1,00 1,00

L. plantarum con L. monocytogenes 1 0,99 1,00 1,00 0,99 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,00 0,99 1,00 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 3 1,00 0,99 1,00 1,00

d.

CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3 L. parac 4

L. paracasei con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 0,99 L. paracasei con E. coli 2 1,01 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 0,99 1,00 0,99 1,00

L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,01 1,00 1,01 L. paracasei con L. monocytogenes 2 0,99 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 1,01 1,00 1,00 1,00

En la Figura 51 se presenta en el comportamiento alterado de los patógenos cuando crecen en

asocio con las BAL, donde se pudo evidenciar que esta reducción del crecimiento en caldo

MRS a 37°C, de L. monocytogenes y E. coli puede ser hasta de 3 y 5 ciclos logar ítmicos (log10

121

UFC/mL) respectivamente. Cuando se compararon estadísticamente las máximas

concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) entre las patógenas en cult ivo individual, frente a

sus cultivos mixtos, se presentaron diferencias signif icativas (Anexo 13).

Por otro lado, al comparar el comportamiento de las máximas concentraciones alcanzadas

(log10 UFC/mL), en los cultivos individuales versus los mixtos para las BAL, se pudo determinar

que no existen diferencias signif icativas entre las concentraciones de las bacterias cuando

crecen de manera individual frente a sus cultivos mixtos con los patógenos (Anexo 13). Estos resultados se pueden observar en la Tabla 20c y 20d, donde los índices obtenidos para cada

caso fueron muy cercanos a la unidad.

La similitud en este parámetro cinético confirma lo planteado en el numeral 6.2.2 donde se

sugiere que la interacción que se presenta al interior de los cultivos mixtos puede tratarse de un

caso de amensalismo, donde en este caso, las bacterias patógenas resultaron afectadas y

fueron inhibidas, mientras las BAL no modif icaron su comportamiento y se desarrollaron bajo

condiciones normales. En la Figura 52 se presenta la similitud del comportamiento de las BAL

cuando crecen en asocio de manera individual y en asocio con las patógenas, en caldo MRS a

37°C.

Figura 51. Modelos de crecimiento para cultivos individuales y mixtos de cepas patógenas en caldo MRS a 37°C. a: E. coli. b: L. monocytogenes. En rojo: Patógenos en cultivo individual. En azul: Patógenos en cultivo mixto con L. plantarum. En v erde: Patógenos en cultivo mixto con L. paracasei.

a b

E. coli

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC/

mL

L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)

log

UFC/

mL

122

Figura 52. Modelos de crecimiento para cultiv os individuales y mixtos de BAL en caldo MRS a 37°C. a: L. plantarum. b: L. paracasei. En rojo: BAL en cultivo individual. En azul: BAL en cultivo mixto con E. coli. En verde: BAL en cultivo mixto con L. monocytogenes.

6.6.3 ANÁLISIS DE LOS PARÁM ETROS CINÉTICOS ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE LOS MODELOS DESARROLADOS EN LECHE ENTERA UHT

Se compararon las tasas de crecimiento, las fases lag y las máximas concentraciones

alcanzadas obtenidas de los cultivos individuales versus los cultivos mixtos desarrollados en

leche entera UHT a 37°C. Este análisis se realizó con el f in de establecer si existían diferencias

signif icativas entre el comportamiento de los microorganismos cuando crecieron de manera

individual, frente a su comportamiento cuando lo hicieron en asocio con otros microorganismos.

Al igual que en el numeral anterior (6.6.2) se determinaron los coeficientes (parámetro cult ivo

individual/parámetro cult ivo mixto) para los tres parámetros mencionados.

6.6.3.1 Tasas de crecimiento

La Tabla 21 contiene los coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultivos individuales

versus los cultivos mixtos con todas las réplicas en leche entera UHT a 37°C. Se presentaron

diferencias signif icativas al comparar las tasas de crecimiento de los patógenos en cultivo

individual versus sus tasas en cultivo mixto con las BAL (Anexo 10). En la Tabla 21a, se pudo

observar que E. coli aumentó su tasa de crecimiento al cult ivarse en asocio con L. plantarum,

presentando coeficientes por encima de la unidad y siendo 1,75 el valor más alto. Contrario a

esto, cuando E. coli creció en co-cultivo con L. paracasei su tasa de crecimiento disminuyó, lo

cual se vió reflejando por coeficientes por debajo de la unidad, siendo 0,71 el valor más bajo

(Tabla 21b). Este mismo patrón de comportamiento se observó en los cultivos mixtos de L.

monocytogenes y en la Tabla 21b se pudo observar que en asocio con L. plantarum se

L. plantarum

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. paracasei

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

log

UFC/

ml

Tiempo (h)

a b

123

obtuvieron coeficientes por encima de la unidad y en asocio con L. paracasei coeficientes por

debajo de ella, siendo 0,92 y 0,51 los coeficientes más alto y bajo, respectivamente.

Tabla 21. Coeficientes entre las tasas de crecimiento de los cultiv os indiv iduales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en leche entera UHT a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.

CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 4

E. coli con L. plantarum 1 1,71 1,70 1,73 E. coli con L. plantarum 2 1,71 1,72 1,75 E. coli con L. plantarum 3 1,65 1,69 1,66 E. coli con L. paracasei 1 0,74 0,74 0,75 E. coli con L. paracasei 2 0,79 0,80 0,81 E. coli con L. paracasei 3 0,72 0,71 0,74

b.

CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3

L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,91 1,92 1,91 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,85 1,90 1,82 L. monocytogenes con L. plantarum 3 1,83 1,85 1,84 L. monocytogenes con L. paracasei 1 0,51 0,51 0,52 L. monocytogenes con L. paracasei 2 0,62 0,65 0,60 L. monocytogenes con L. paracasei 3 0,52 0,56 0,54

c.

CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3

L. plantarum con E. coli 1 1,00 1,02 1,00 L. plantarum con E. coli 2 1,01 1,04 0,98 L. plantarum con E. coli 3 1,01 1,01 0,90

L. plantarum con L. monocytogenes 1 1,12 1,11 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,01 1,00 0,97 L. plantarum con L. monocytogenes 3 1,01 1,00 0,98

d.

CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3

L. paracasei con E. coli 1 1,01 1,03 1,01 L. paracasei con E. coli 2 0,99 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 1,02 1,03 1,01

L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,00 0,98 L. paracasei con L. monocytogenes 2 1,01 1,02 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 0,99 1,00 1,00

124

Al comparar el comportamiento de las tasas de crecimiento en los cultivos individuales versus

los mixtos para las BAL, se pudo determinar que no existen diferencias marcadas entre las

tasas de crecimiento de las bacterias cuando crecieron de manera individual frente a sus

cultivos mixtos con los patógenos y así mismo, en los ANOVA realizados, tampoco se

presentaron diferencias signif icativas al comparar estas tasas de crecimiento (Anexo 10). Estos

resultados se pueden observar en la Tabla 21c y 21d, donde los coeficientes obtenidos para

cada caso son muy cercanos a la unidad.

6.6.3.2 Fase Lag

En la Tabla 22 se presentan los coeficientes calculados para comparar las fases lag de los

cultivos individuales versus los cultivos mixtos con todas sus réplicas en leche entera UHT a

37°C. Los coeficientes obtenidos para los cultivos de E. coli (Tabla 22a) y L. paracasei (Tabla

22d) demostraron que no existen diferencias en este parámetro cinético para estas bacterias

cuando crecieron de manera individual frente a cuando crecieron en asocio con otros

microorganismos. Lactobacillus plantarum presentó esta misma tendencia de equivalencia entre

las fases lag, cuando se compararon sus cultivos mixtos frente a sus individuales, lo cual se vió

reflejado en los cocientes con valores muy cercanos a la unidad en todas sus réplicas (Tabla

22c).

Cuando se compararon las fases lag de L. monocytogenes, se pudo determinar que la duración

de esta fase se redujo de tres a horas a una hora, aproximadamente cuando el patógeno creció

en cultivo mixto con L. paracasei, siendo 3.64 el coeficiente más alto obtenido (Tabla 22b). En el

ANOVA realizado para este caso se presentaron también diferencias signif icativas (Anexo 11).

Sin embargo cuando se compararon los cultivos individuales de L. monocytogenes con los

mixtos en asocio con L. plantarum se presentó un aumento de tres horas aproximadamente en

la duración de la fase lag, que se vió reflejado en coeficientes menores a 1, siendo 0.67 el

coeficiente más bajo y no se presentaron diferencias signif icativas en este caso (Anexo 11).

125

Tabla 22. Coeficientes entre las fases lag de los cultivos individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en leche entera UHT a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.

CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3

E. coli con L. plantarum 1 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. plantarum 2 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. plantarum 3 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 1 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 2 1,00 1,00 1,00 E. coli con L. paracasei 3 1,00 1,00 1,00

b.

CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3

L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,23 3,64 3,20 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,54 2,55 2,39 L. monocytogenes con L. plantarum 3 2,01 1,96 1,84 L. monocytogenes con L. paracasei 1 0,71 0,73 0,68 L. monocytogenes con L. paracasei 2 0,75 0,76 0,71 L. monocytogenes con L. paracasei 3 0,71 0,70 0,67

c.

CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3

L. plantarum con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 L. plantarum con E. coli 2 0,92 0,97 1,07 L. plantarum con E. coli 3 0,95 1,08 0,98

L. plantarum con L. monocytogenes 1 1,05 1,00 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 2 0,97 1,10 0,94 L. plantarum con L. monocytogenes 3 0,92 0,98 0,98

d.

CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3

L. paracasei con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 2 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 1,00 1,00 1,00

L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 2 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 1,00 1,00 1,00

126

6.6.3.3 Máxima concentración bacteriana alcanzada

En la Tabla 23 se presentan los coeficientes obtenidos al comparar las máximas

concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cult ivos individuales versus los cultivos

mixtos con todas sus réplicas en leche entera UHT a 37°C.

Tabla 23. Coeficientes entre las máximas concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) de los cultiv os individuales versus las tasas de crecimiento de los cultiv os mixtos en leche entera UHT a 37°C. a: Cultivos de E. coli. b: Cultivos de L. monocytogenes. c: Cultivos de L. plantarum. d: Cultivos de L. paracasei. a.

CULTIVO E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3

E. coli con L. plantarum 1 1,66 1,65 1,70 E. coli con L. plantarum 2 1,64 1,63 1,68 E. coli con L. plantarum 3 1,64 1,63 1,68 E. coli con L. paracasei 1 1,53 1,51 1,56 E. coli con L. paracasei 2 1,52 1,50 1,55 E. coli con L. paracasei 3 1,52 1,51 1,56

b.

CULTIVO L. mono 1 L. mono 2 L. mono 3

L. monocytogenes con L. plantarum 1 1,80 1,76 1,77 L. monocytogenes con L. plantarum 2 1,79 1,75 1,76 L. monocytogenes con L. plantarum 3 1,80 1,76 1,77 L. monocytogenes con L. paracasei 1 1,99 1,94 1,95 L. monocytogenes con L. paracasei 2 1,99 1,95 1,96 L. monocytogenes con L. paracasei 3 2,00 1,95 1,96

c.

CULTIVO L. planta 1 L. planta 2 L. planta 3

L. plantarum con E. coli 1 0,99 0,99 0,99 L. plantarum con E. coli 2 0,99 1,00 0,99 L. plantarum con E. coli 3 1,00 1,00 1,00

L. plantarum con L. monocytogenes 1 0,99 1,00 0,99 L. plantarum con L. monocytogenes 2 1,00 1,00 1,00 L. plantarum con L. monocytogenes 3 1,00 1,00 1,00

127

d.

CULTIVO L. parac 1 L. parac 2 L. parac 3

L. paracasei con E. coli 1 1,00 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 2 0,99 1,00 1,00 L. paracasei con E. coli 3 0,99 1,00 0,99

L. paracasei con L. monocytogenes 1 1,00 1,01 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 2 0,99 1,00 1,00 L. paracasei con L. monocytogenes 3 0,99 1,00 1,00

Los coeficientes con valores superiores a la unidad, demostraron una reducción en las

concentraciones alcanzadas por los patógenos cuando crecen en asocio con las BAL (Tabla

23a y 23b).

En la Figura 53 se presenta en el comportamiento alterado de los patógenos cuando crecen en

asocio con las BAL, donde se pudo evidenciar que esta reducción del crecimiento en leche

entera UHT a 37°C, de L. monocytogenes y E. coli fue de hasta de 3 y 5 ciclos logar ítmicos

(log10 UFC/mL) respectivamente. Cuando se compararon estadísticamente las máximas

concentraciones alcanzadas (log10 UFC/mL) entre las patógenas en cult ivo individual, frente a

sus cultivos mixtos, se presentaron diferencias signif icativas (Anexo 13).

Por otro lado, al comparar el comportamiento de las máximas concentraciones alcanzadas

(log10 UFC/mL), en los cultivos individuales versus los mixtos para las BAL, se pudo determinar

que no existen diferencias signif icativas entre las concentraciones de las bacterias cuando

crecen de manera individual frente a sus cultivos mixtos con los patógenos (Anexo 13). Estos

resultados se pueden observar en la Tabla 23c y 23d, donde los índices obtenidos para cada caso fueron muy cercanos a la unidad.

La similitud en este parámetro cinético confirma lo planteado en el numeral 6.2.2 donde se

sugiere que la interacción que se presenta al interior de los cultivos mixtos puede tratarse de un

caso de amensalismo, donde en este caso, las bacterias patógenas resultaron afectadas y

fueron inhibidas, mientras las BAL no modif icaron su comportamiento y se desarrollaron bajo

condiciones normales. En la Figura 54 se presenta la similitud del comportamiento de las BAL

cuando crecen de manera individual y en asocio con las patógenas, en leche entera UHT a

37°C.

128

Finalmente, cuando se compararon las tasas de crecimiento, las fases lag y las máximas

concentraciones alcanzadas de los cultivos individuales versus los cultivos mixtos desarrollados

en leche entera UHT, se obtuvieron resultados iguales a los obtenidos en MRS y se pudo

comprobar que el patrón de comportamiento de las bacterias tanto en cult ivo individual, como

mixto fue igual en los dos medios (Anexos 10, 11 y 13).

Figura 53 Modelos de crecimiento para cultiv os indiv iduales y mixtos de cepas patógenas en leche entera UHT 37°C. a: E. coli. b: L. monocytogenes. En rojo: Patógenos en cultivo individual. En azul: Patógenos en cultivo mixto con L. plantarum. En verde: Patógenos en cultivo mixto con L. paracasei. Figura 54. Modelos de crecimiento para cultiv os indiv iduales y mixtos de BAL en leche entera UHT a 37°C. a: L. plantarum. b: L. paracasei. En rojo: BAL en cultivo individual. En azul: BAL en cultivo mixto con E. coli. En verde: BAL en cultivo mixto con L. monocytogenes.

L. plantarum

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (h)

log

UFC/

mL

L. paracasei

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35

log

UFC

/ml

T iempo (h)

a b

E. coli

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 2 0 25 30 35

Tiempo (h)

log

UFC

/mL

L. monocytogenes

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 2 5 30 35

Tiempo (h)lo

g U

FC/m

L

a b

129

6.6.4 ANÁLISIS COMPARATIVO DEL pH ENTRE CULTIVOS INDIVIDUALES Y CULTIVOS MIXTOS EN CALDO MRS Y EN LECHE ENTERA UHT A 37°C

En la Figura 55 se presenta el comportamiento del pH en los cultivos individuales de L.

plantarum y L. paracasei desarrollados en MRS y en leche entera UHT a 37°C, comparado con

los valores obtenidos en sus cultivos mixtos. Con las curvas de pH contenidas en la Figura 55

se pudo comprobar lo planteado en el Anexo 14, donde se demostró que no existen diferencias

signif icativas entre el comportamiento del pH de los cultivos individuales de las BAL versus sus

cultivos mixtos con los patógenos tanto en caldo MRS como en leche entera UHT. Como se

mostró en la Tabla 17, se pudo confirmar que los valores del pH de estos cultivos fueron muy

similares en caldo MRS y en leche entera UHT. Por otro lado, en la Figura 56 se presenta el

comportamiento del pH en los cult ivos individuales de E. coli y L. monocytogenes desarrollados

en MRS y en leche entera UHT a 37°C, comparado con el que presentaron sus cultivos mixtos.

Figura 55. Comportamiento del pH en cultivos individuales y mixtos de las BAL en caldo MRS y leche entera UHT a 37°C. A: Cultivos de las BAL en MRS. B: Cultivos de las BAL en leche entera UHT. En rojo: pH de las BAL en cultivo indiv idual. En azul: pH de las BAL en cultivo mixto con E. coli. En verde: pH de las BAL en cultivo mixto con L. monocytogenes.

L. paracasei en MRS

01

23

4

56

7

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

pH

01

23

4

56

7

pH

L. plantarum en MRS

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

pH

0

1

2

3

4

5

6

7

pH

L. paracasei en leche entera UHT

01

2

345

67

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

pH

01

2

345

67

pH

L. plantarum en leche entera UHT

0

12

3

45

6

7

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

pH

0

12

3

45

6

7

pH

A

B

130

Las gráficas en la Figura 56 permitieron concluir, al igual que lo discutido en el numeral 6.3, que

el pH de los cultivos mixtos con las cepas patógenas en asocio con las BAL, disminuyó

considerablemente al compararse con el pH de sus cultivos individuales. Adicionalmente se

pudo observar que el pH de los cultivos mixtos de los patógenos fue similar al presentado en los

cultivos individuales de las BAL, lo cual sugiere que la acidez que presentan los medios en los

cultivos mixtos, está mediada por la acción de las BAL con su producción de ácidos orgánicos.

También se pudo determinar que los cultivos mixtos con L. paracasei presentaron valores de pH

más bajos que los que se reportaron con L. plantarum, con una diferencia aproximada entre ambos de 0,6 y 0,7 unidades. Como se mostró en la Tabla 17, se pudo confirmar que los

valores de pH de los cultivos fueron muy similares en caldo MRS como en leche entera UHT,

respectivamente.

Figura 56. Comportamiento del pH en cultiv os individuales y mixtos de las bacterias patógenas en caldo MRS y leche entera UHT a 37°C. A: Cultivos de las patógenas en MRS. B: Cultivos de las patógenas leche entera UHT. En rojo: pH de las patógenas en cultivo individual. En azul: pH de las patógenas en cultivo mixto con L. plantarum. En v erde: pH de las patógenas en cultivo mixto con L. paracasei.

L. monocytogenes en MRS

0

12

3

4

5

67

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

pH

0

12

3

4

5

67

pH

E. coli en MRS

0

1

2

34

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

pH

0

1

2

34

5

6

7

pH

L. monocytogenes en leche entera UHT

0

12

34

5

67

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

pH

0

12

34

5

67

pH

E. coli en leche entera UHT

0

12

34

5

67

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (h)

pH

0

12

34

5

67

pH

A

B

131

6.6.5 APROXIMACIÓN AL M ECANISMO INHIBITORIO DE LAS BAL FRENTE A LAS PATÓGENAS ESTUDIADAS

Como se mencionó anteriormente en el numeral 6.3, la inhibición en el crecimiento de E. coli y

L. monocytogenes por parte de L. plantarum y L. paracasei en los cultivos mixtos estudiados en

este trabajo, puede deberse principalmente a efectos del ácido láctico producido por las BAL o a

sus metabolitos secundarios, tipo bacteriocinas, o incluso, a la acción combinada de ambos

factores. Por esto, y teniendo en cuenta que se ha publicado que bajo rangos de pH entre 3,0 y

4,0, el crecimiento de estos patógenos puede verse afectado disminuyendo su tasa de

crecimiento (Escartin, 2000), se realizó un estudio de viabilidad para determinar a qué valores

de pH resultaban afectadas las cepas de E. coli y L. monocytogenes empleadas en este trabajo.

Para el estudio de viabilidad se realizaron cultivos individuales de las cuatro cepas estudiadas

(L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes), en caldo MRS a 37°C por 24 horas.

Como control se utilizó caldo MRS estándar a pH 6.5. Se evaluaron en total nueve cultivos

bacterianos con diferentes valores de pH inicial (6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0 y 2,5), cuyo

ajuste se efectuó con HCL 0.1N. Después del periodo de incubación se sembraron 100µL de

cada cultivo en placas de MRS y se llevaron a incubar nuevamente por 24 horas a 37°C. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y las lecturas f inales se efectuaron mediante recuento

en placa.

En la Tabla 24 se presentan los resultados obtenidos del estudio de viabilidad donde se pudo

determinar que para las dos cepas patógenas la disminución del pH en el medio afectó

considerablemente su concentración inicial (9,0 log10 UFC/mL para E. coli), mientras que el

crecimiento de las BAL, por ser menos sensibles a bajos valores de pH, no se alteró cuando

crecieron en medios de mayor acidez. También se pudo establecer que la cepa de L

monocytogenes fue inhibida totalmente, presentando una concentración de 0 log 10 UFC/mL al

inocularse en los medios con pH de 3,5 y menores a él. Por otro lado, la cepa de E. coli resultó

inhibida y presentando recuentos de 0 log 10 UFC/mL cuando se inoculó en medios con pH de 3,0 y menores a este valor. Los resultados obtenidos concuerdan con los datos mencionados

anteriormente publicados por Escartin (2000).

Teniendo en cuenta los rangos de pH en que son inhibidas las cepas patógenas estudiadas en

este trabajo, se pudo hacer un análisis más detallado del comportamiento de esta variable en

132

las curvas de crecimiento mixto previamente desarrolladas y así establecer si el pH del medio

fue el factor responsable del efecto inhibitorio en cada caso.

Tabla 24. Evaluación del crecimiento de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en caldo MRS con diferentes valores de pH a 37°C por 24 horas.

En la Figura 57 se presenta el crecimiento de las BAL cuando se encuentran en cult ivo

individual y en cultivo mixto en caldo MRS, donde, como ya se ha discutido en esta sección, el

patrón de comportamiento permaneció siempre constante y su crecimiento no se alteró cuando

crecieron en asocio con las patógenas, por lo que se habla de amensalismo. En la misma

figura, se presenta también el perf il del pH de los cultivos individuales y mixtos de ambas BAL

con las dos patógenas de manera independiente, donde se pudo observar que el pH del medio

fue muy similar para los cult ivos individuales y mixtos de las BAL, (entre 4,0 y 3,5 para L.

plantarum, y entre 3,5 y 3,0 para L. paracasei), sobretodo para el caso de L. paracasei, cuyos

cultivos no presentaron mayores diferencias en cuanto a pH.

En la Figura 58 se presentan las curvas de crecimiento de las dos patógenas (E. coli y L.

monocytogenes), tanto en cult ivos individuales como en cultivos mixtos, con su correspondiente

curva de pH. En esta gráfica se pudo observar que cuando E. coli, al crecer en asocio con L.

plantarum, entró de manera prematura (después de 10 horas de crecimiento) a fase

estacionaria, el pH del medio se encontraba entre 5.0 y 4,5 rango entre el cual, teniendo en

cuenta los resultados de la Tabla 24, se presentó una ligera reducción en la viabilidad de la

cepa, sin alterar signif icativamente su concentración, por lo que se concluyó que la inhibición de

E. coli por parte de L. plantarum no se encuentra directamente relacionada con el pH del medio

y podría estar más asociada con la producción de bacteriocinas. La fase de desaceleración y la

fase estacionaria se establecieron antes de la aparición de condiciones estresantes de pH.

Recuento en placa (log 10 UFC/mL), 37°C por 24horas pH del medio L. plantarum L. paracasei E. coli L. monocytogenes

6,5 9,041392685 9,130333768 9 9,041392685 6,0 9 9,096910013 8,977723605 8,977723605 5,5 9,021189299 9,113943352 8,977723605 8,977723605 5,0 9 9,096910013 8,929418926 8,929418926 4,5 8,977723605 9,06069784 8,875061263 7,84509804 4,0 9 9,041392685 5,544068044 3,77815125 3,5 8,977723605 9,06069784 3,954242509 0 3,0 8,929418926 9,041392685 0 0 2,5 8,84509804 8,977723605 0 0

133

Figura 57. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las BAL en cultiv os individuales y mixtos en caldo MRS a 37°C por 34 horas.

L. plantarum

01

23

45

6

7

89

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo (horas)

log

UFC

/mL

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

MRS ind. MRS mix. E.coli MRS mix. L. mon.pH MRS ind. pH MRS mix. E. coli pH MRS mix. L.mon.Crecim. individual

pH. individual pH mix con E. coli pH mix con L. mono

Mixto con E. coli Mix to con L. mono

L. paracasei

01

2

34

56

78

910

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo (horas)

log

UFC

/mL

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

MRS ind. MRS mix. E. coli MRS mix. L.mon.pH MRS ind. pH MRS mix. E. co li pH MRS mix. L. mon.

Crecim. individualpH. individual pH mix con E. coli pH mix con L. mono

Mixto con E. coli Mixto con L. mono

134

Figura 58. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las cepas patógenas en cultiv os indiv iduales y mixtos en caldo MRS a 37°C por 34 horas.

E. coli

0

1

2

3

45

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34Tiempo (horas)

log

UFC

/mL

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

MRS ind. MRS mix. L. plant. MRS mix. L. parac.pH Mrs ind. pH MRS mix. L.plant. pH MRS mix. L. parac.

Crecim. individual

pH. individual pH mix con L. plantarum pH mix con L. paracasei

Mixto con L. plantarum Mixto con L. paracasei

L. monocytogenes

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo (horas)

log

UFC

/mL

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

MRS ind. MRS mix. L. p lant. MRS mix. L. parac.pH MRS ind. pH MRS mix. L. plant. pH MRS mix. L. parac.

Crecim. individual

pH. individual pH mix con L. plantarum pH mix con L. paracasei

Mixto con L. plantarum Mixto con L. paracasei

135

Para el estudio de verif icación de BLIS a partir de cultivos mixtos, se utilizó el mismo

procedimiento explicado anter iormente (Figura 13), pero evaluando sobrenadantes obtenidos a

partir de cult ivos de las BAL en asocio con las dos cepas patógenas. Los ensayos se realizaron

tanto en caldo MRS como en leche entera UHT y se realizaron por duplicado. Los resultados

de esta evaluación se presentan en la Tabla 25, donde también se incluyeron los resultados

obtenidos en los estudios anteriores a partir de cultivos individuales para facilitar su análisis.

Tabla 25. Verificación de BLIS a partir de sobrenadantes de cultiv os mixtos de las BAL y las cepas patógenas estudiadas en caldo MRS y en leche entera UHT a 37°C por 24 horas. SSN: Sobrenadante sin neutralizar. SN: Sobrenadante neutralizado.

Caldo MRS Leche entera UHT

Inhibición de L. monocytogenes

(mm de diámetro)

Inhibición de E. coli (mm de diámetro)

Inhibición de L. monocytogenes

(mm de diámetro)

Halos de Inhibición para E. coli (mm d e

diámetro) Cultivo

SSN SN SSN SN SSN SN SSN SN

Lactobacillus p aracasei 15 0 14 0 14 0 15 0

Lactobacillus plantarum 17 17 16 15 16 17 17 15

L. paracasei + L. monocytogenes

14 14 15 14 15 14 14 14

L. paracasei + E. coli 15 15 14 13 16 15 14 14

L. plantarum + L. monocytogenes 16 17 15 16 17 16 16 14

L. plantarum + E. coli 17 15 15 16 16 15 16 15

Los resultados presentados en la Tabla 25 coinciden en su mayor ía con lo reportado en el

Anexo 3. Sin embargo, se observó que a diferencia de los resultados de la verif icación de BLIS

anteriores, en este caso, con los sobrenadantes neutralizados de L. paracasei y obtenidos a

partir de sus cultivos mixtos con E. coli y L. monocytogenes, se inhibió el crecimiento de

ambos patógenos, sugiriendo la producción de bacteriocinas por parte de esta BAL, actividad

que anteriormente se había descartado.

Estos resultados coinciden con Maldonado et al. (2003) quienes reportaron que la presencia de

bacterias como E. coli y Streptococcus pneumonie en co-cultivo con L. plantarum, actúa como

señalización ambiental que induce en la BAL el mecanismo de producción de bacteriocinas a

través de quorum sensing, proceso durante el cual las sustancias liberadas al medio pueden

interferir con el desarrollo normal de las otras bacterias.

136

Estos resultados permitieron sugerir que la reducción en el crecimiento de E. coli en co-cultivo

con L. paracasei estuvo mediada por la disminución en el pH del medio hasta rangos

potencialmente inhibitorios, que coincidieron con la entrada a fase estacionaria del patógeno.

Este antagonismo, también pudo haberse debido a la producción de bacteriocinas por parte de

la BAL que desde el inicio del co-cultivo interf irieron con el desarrollo de E. coli así como se

presentó en la Figura 58.

Por otro lado, al analizar el comportamiento de L. monocytogenes en cultivo mixto con las dos BAL (Figura 58) se pudo determinar que cuando el patógeno creció en asocio con L. plantarum

ingresó de manera prematura (después de 12 horas de crecimiento) a fase estacionaria, el pH

del medio se encontraba entre 5.0 y 4,5 rango entre el cual, teniendo en cuenta los resultados

de la Tabla 24, se presentó una ligera reducción en la viabilidad de la cepa, sin alterar

directamente su concentración, por lo que se concluyó que la inhibición de L. monocytogenes

por parte de L. plantarum no se encuentra directamente relacionada con el pH del medio y

podría estar más asociada con la producción de bacteriocinas. Sin embargo después de 34

horas de crecimiento, al presentarse una disminución más signif icativa en el crecimiento del

patógeno, el pH del medio alcanzó valores inhibitorios, por lo que se sugiere que este factor

potencializa el antagonismo al f inal de la curva. Al igual que ocurrió con E. coli, cuando L.

monocytogenes creció en asocio con L. paracasei, su reducción en el crecimiento y su entrada

a fase estacionaria a partir de la hora 22 post incubación, coincidió con valores de pH

inhibitorios (Tabla 25), pues el pH del medio para este cult ivo mixto a dicha hora se encontraba

entre 3,5 y 3,0.

Sin embargo, como se observa en la Figura 58, desde el inicio de la curva, L. monocytogenes

en este co-cultivo, presentó un crecimiento atípico desde el principio, por debajo de su

crecimiento normal, lo cual sugiere que desde el inicio del cultivo se está presentando algún

factor antagónico, diferente al pH, que interf iere con el comportamiento del patógeno y como se

comprobó anteriormente, este factor puede obedecer a la interacción de bacteriocinas en el

medio producidas por L. paracasei.

En las Figuras 59 y 60 se presenta el comportamiento de las cuatro cepas estudiadas, en

cultivos individuales y mixtos, desarrolladas en leche entera UHT a 37°C. Este comportamiento

fue muy similar al presentado por las cepas en caldo MRS, donde también se sugiere que el pH

del medio y la producción de BLIS constituyen los principales mecanismos inhibitor ios. Sin

embargo, los cultivos mixtos desarrollados en leche entera UHT para L. monocytogenes en

137

asocio con las BAL, presentaron desde las primeras horas, niveles de crecimiento por debajo de

las concentraciones normales alcanzadas por el patógeno en cultivo individual, aunque

conservando el patrón general de inhibición (Figura 60).

Después de analizar el comportamiento de las cuatro cepas en estudio, en cultivo individual y

mixto, se pudo concluir que las diferencias existentes entre las tasas de crecimiento y las

máximas concentraciones alcanzadas que se presentaron al comparar los dos medios

estudiados (caldo MRS y leche entera UHT), fueron realmente pequeñas y no alteraron el patrón de comportamiento que fue muy similar para todos los casos.

Los resultados obtenidos demostraron que la leche entera constituyó un medio de crecimiento

con mejores condiciones nutricionales que el caldo MRS, ya que todos los microorganismos se

desarrollaron mejor en ella, lo que se reflejó en la subestimación de las predicciones del modelo

matemático desarrollado en caldo MRS.

El comportamiento del pH en los cultivos mixtos fue igual al presentado por las BAL a nivel

individual, lo que confirma que la acidif icación del caldo MRS y de la leche entera UHT está

mediada principalmente por las BAL. Este comportamiento también influyó en la reducción del

crecimiento de las patógenas en los cultivos mixtos.

Lactobacillus paracasei presentó actividad antagónica por sustancias BLIS frente a E. coli y L.

monocytogenes cuando se utilizaron sobrenadantes provenientes de cult ivos mixtos de la BAL y

las patógenas. Se pudo determinar que valores de pH menores a 3,5 inhibieron completamente

el crecimiento de L. monocytogenes y valores de pH menores a 3,0, el de E. coli. La reducción

en el crecimiento de E. coli y L. monocytogenes al crecer en asocio con L. plantarum se pudo

relacionar directamente con la producción de bacteriocinas por parte de la BAL. Los resultados

sugieren que el mecanismo inhibitorio de L. paracasei en los cultivos mixtos con E. coli y con L.

monocytogenes fue la acción conjunta del ácido láctico y de las bacteriocinas producidas por la

BAL desde el inicio del cult ivo mixto.

138

Figura 59. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las BAL en cultiv os individuales y mixtos en leche entera UHT a 37°C por 34 horas.

L. plantarum

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo (horas)

log

UFC

/mL

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

Milk ind. Milk mix. E. coli Mi lk mix. L. monpH mi lk ind. pH milk mix. E. coli pH milk mix. L.mon.Crecim. individual Mixto con E. coli Mixto con L. mono

pH. individual pH mix con E. coli pH mix con L. mono

L. paracasei

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo (horas)

log

UFC

/mL

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

Milk ind. Milk mix. E. coli Milk mix. L. monpH milk ind. pH milk mix. E. coli pH milk mix. L. mon.

Crecim. individualpH. individual pH mix con E. coli pH mix con L. mono

Mixto con E. coli Mixto con L. mono

139

Figura 60. Relación entre el pH del medio y el crecimiento de las cepas patógenas en cultiv os indiv iduales y mixtos en leche entera UHT a 37°C por 34 horas.

E. coli

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo (horas)

log

UFC

/mL

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

Milk ind. Mi lk mix. L. plant. Milk mix. L. parac.pH milk ind. pH mi lk mix. L.plant. pH milk mix. L. parac.

Crecim. individual

pH. individual pH mix con L. plantarum pH mix con L. paracasei

Mixto con L. plantarum Mixto con L. paracas ei

L. monocytogenes

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34Tiempo (horas)

log

UFC

/mL

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

pH

Milk ind. Milk mix. L. plant. Milk mix. L. parac.pH milk ind. pH milk mix. L.plant. pH milk mix. L. parac.Crecim. individual

pH. individual pH mix con L. plantarum pH mix con L. paracasei

Mixto con L. plantarum Mixto con L. paracasei

140

CONCLUSIONES

1. El crecimiento de los patógenos en co-cultivo con BAL se redujo signif icativamente tanto

en caldo MRS como en leche entera UHT mientras que el crecimiento de las BAL no se

modif icó presentándose un claro caso de amensalismo. Esta relación de interferencia

fue evidente porque E. coli y L. monocytogenes modificaron sus patrones de comportamiento, disminuyendo sus máximas concentraciones alcanzadas, y entrando a

fases estacionarias prematuras (en comparación con sus cultivos individuales) en tanto

que las BAL no presentaron ningún tipo de variación en los cultivos mixtos.

2. El modelo de Baranyi se ajustó adecuadamente al crecimiento de las BAL y al de las

patógenas en cultivo individual y mixto en caldo MRS, describiendo con alta precisión el

comportamiento de las bacterias en cada caso. El buen desempeño del modelo se

reflejó en la similitud encontrada entre los datos observados a nivel experimental y las

estimaciones obtenidas a partir del modelo, de donde se obtuvieron valores altos en los

coeficientes de determinación y valores bajos en los errores estándar.

3. El modelo predictivo desarrollado para cultivos individuales y mixtos se validó

satisfactoriamente en leche entera UHT y se determinó a nivel estadístico que las

predicciones obtenidas de los modelos desarrollados en caldo MRS explican con

precisión los datos experimentales obtenidos a partir de las curvas de crecimiento

realizadas en leche entera UHT. También se estableció que la leche entera constituye

un mejor medio de cultivo para las cuatro cepas estudiadas, en comparación con el

caldo MRS, porque en todos los casos el desarrollo de los microorganismos fue mejor

en el alimento que en el medio estándar, observándose concentraciones microbianas

más elevadas en la leche.

4. En las curvas extensas de crecimiento, se observó que la fase de muerte en las

bacterias patógenas se estableció con anterioridad a la fase de muerte de las BAL y de

forma más acelerada en co-cultivos, lo cual está directamente relacionado con el

proceso de antagonismo que se evidenció en los cultivos mixtos, sugiriéndose también

141

que la disminución en el crecimiento de las patógenas no se encuentra asociada con

agotamiento de nutrientes y obedece más a inhibición por parte de las BAL.

5. El modelo polinomial de tercer grado describió de manera satisfactoria el

comportamiento de las cuatro cepas estudiadas en cultivo mixto, tanto en caldo MRS

como en leche entera UHT cuando se desarrollaron curvas de crecimiento extensas, lo

cual se confirmó por los altos valores obtenidos en los coeficientes de determinación en

cada caso. Sin embargo es necesario plantear nuevos modelos matemáticos a partir de los cuales se puedan explicar los parámetros cinéticos.

6. Los resultados sugieren que el factor pH y la producción de BLIS pueden estar

involucrados en el mecanismo de inhibición del crecimiento de las cepas patógenas en

co-cultivo con BAL. Se sugiere también que la inhibición de las patógenas cuando

crecieron en asocio con L. plantarum se encuentra más relacionada con la producción

de BLIS por parte de la BAL, que con la acción directa de la acidez del medio, pues la

caída del pH parece no coincidir con la entrada prematura a fase estacionaria por parte

de los patógenos. Por otro lado se sugiere que la disminución en el crecimiento de los

patógenos en los co-cultivos con L. paracasei tiene mayor relación con la acidif icación

del medio, puesto que hay mayor coincidencia entre los valores bajos de pH y la entrada

a fase estacionaria. Sin embargo, en este caso, la producción de BLIS también parece

estar asociada a la inhibición, sobretodo durante las primeras horas de crecimiento

donde tanto L. monocytogenes como E. coli presentaron un crecimiento rezagado desde

el principio.

7. Finalmente, se comprobó el gran potencial de las BAL dentro de los procesos de

biocontrol, como importantes inhibidores de patógenos en una matriz alimentaria y a

través de la microbiología predictiva se logró cuantif icar esta inhibición, estableciéndose

también una aproximación al mecanismo inhibitorio.

142

RECOMENDACIONES

1. Validación de los modelos predictivos para cultivos individuales y mixtos

desarrollados en caldo MRS para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en otras matrices alimentarias diferentes a leche.

2. Estudio del posible comportamiento bifásico del crecim iento microbiano observado

en caldo MRS y leche entera UHT para L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L.

monocytogenes.

3. Estudio de cultivos m ixtos iniciados a diferentes concentraciones de BAL y

patógenos (E. coli y L. monocytogenes), con el fin de establecer el patrón de

crecimiento de los m icroorganismos y generar modelos secundarios que pueden ser

de gran aplicabilidad a nivel industrial.

4. Estudio de cultivos m ixtos con ot ras cepas de BAL y patógenos de origen

alimentario.

5. Estudio de cultivos m ixtos con cócteles de BAL y patógenos de origen alimentario.

6. Estudio de curvas extendidas de BAL con patógenos para completar la totalidad de

las fases de crecimiento y poder identificar el tipo de interacción entre ellas.

7. Seguimiento de las variables fi sico-químicas del medio de cultivo para la

construcción de modelos dinámicos.

8. Seguimiento de la producción de compuestos antimicrobianos durante el crecimiento

en cultivos m ixtos para la construcción de modelos dinámicos.

9. Verificación de la producción de BLIS por parte de las BAL en ot ras matrices

alimentarias y producción de BLIS en co-cultivos.

143

REFERENCIAS Amézquita, A. y Brashears, M. M. 2002. Competitive inhibition of Listeria monocytogenes in ready-to-eat meat products by lactic acid bacteria. J. Food Protection, 65: 316-325. Arocha, M., McVey, M., Loder, S., Rupnow, J., Bullerman, L. 1992. Behaviour of haemorrhagic Escherichia coli O157:H7 during the manufacture of cottage cheese. Journal of Food Protection. 55: 379 – 381. Barakat, R.K. y Harris, L.J. 1999. Grow th of Listeria monocytogenes and Yersinia enterocolitica on cooked modif ied-atmosphere-packaged poultry in the presence and absence of a naturally occurring microbiota. Applied and Environmental Microbiology 65: 342 – 345. Baranyi, J. y Roberts, T.A. 2004. Predictive microbiology-quantitative microbial ecology. Culture, March. Consultado de la red mundial el 13 de Junio de 2006. Disponible en www.ifr.ac.uk/safety/comicro/Culture.25pdf. Baranyi, J., Pin, C., Roos, T. 1999. Validating and comparing predictive models. International Journal of Food Microbiology, 48: 159-166. Baranyi, J. y Roberts, T.A. 1994. Review paper: A dynamic approach to predicting bacterial grow th in food. International Journal of Food Microbiology, 23: 277-294.

Baranyi, J., Roberts, T.A. y McClure, P. 1993. A non-autonomous differential equation to model bacterial grow th. Food Microbiology. 10: 43-59. Barreto, G., Jiménez, O. y Díaz, S. 1998. E. coli verotoxigénico (VTEC): una nueva variedad; un nuevo riesgo. Rev. Productos Animales, 10: 5-26. Beerens, H., Luquet, F.M. 1990. Guía práctica para el análisis microbiológico de la leche y los productos lácteos. Acribia, Zaragoza. pp 83-91. Beumer, R.R., te Giffel, M.C., de Boer, E., Rombouts, F.M. 1996. Grow th of Listeria monocytogenes on sliced cooked meat products, Food Microbiol. 13: 333-340. Boone, D. R. 2001. Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd edición. Vol 1: 1208-1234. Boyce, T.G., Swerdlow, D.L. y Griffin, P.M. 1995. E. coli O157:H7 and the hemolytic uremic syndrome. New England Journal of Medicine, 10: 364-368. Breidt, F. y Fleming, H.P. 1998. Modeling of the competitive grow th of Listeria monocytogenes and Lactococcus lactis in vegetable broth. Applied and Environmental Microbiology, 7: 3159-3165.

144

Buchanan, R.L. y Bagi, L. K. 1997. Microbial competition: Effect of culture conditions on the suppression of Listeria monocytogenes Scott A by Carnobacterium piscicola. Journal of Food Protection. 60: 254-261. Buchanan, R., Edelson, S. 1999. pH-Dependent Stationary-Phase Acid Resistance Response of Enterohemorrhagic Escherichia coli in the Presence of Various Acidulants. Journal of Food Protection. 62: 211–218. Caridi, A. 2002. Selection of Escherichia coli-inhibiting strains of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29: 303–308. Cayré, M.E., Vignolo, G., Garro, O. 2004. Modelo dinámico para el crecimiento de bacterias lácticas sobre emulsiones cárnicas. Universidad Nacional del Nordeste, Comunicaciones Científ icas y Tecnológicas. Volumen 8. pp. 76-90. Casadei, M.A., Mañas, P., Niven, G., Needs, E. y Mackey, B.M. 2002. The role of membrane f luidity in pressure resistance of Escherichia coli 8164. Applied and Environmental Microbiology. 68: 5965-5972. Chae, M., Schraft, H. 2000. Comparative evaluation of adhesion and biofilm formation different Listeria monocytogenes strains. International Journal of Food Microbiology, 62: 103-111. Cheng, H. y Hoover, D.G. 2003a. Bacteriocins and their food applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2: 82-100. Cheng, H. y Hoover, D.G. 2003b. Modeling the combined effect of high hydrostatic pressure and mild heat on the inactivation kinetics of Listeria monocytogenes Scott A in w hole milk. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 4, 25-34. Cheng, H.Y., Yang, H.Y. y Chou, C.C. 2001: Acid adaptation and temperature effect on the survival of E. coli O157:H7 in acidic fruit juice and lactic fermented milk product. International Journal of Food Microbiology 70:189-195. Cintas, L., Casaus, P., Fernandez, F. y Hernandez, P. E. 1998. Comparative antimicrobial activity of enterocin L50, pediocin PA-1, nisin A, and lactocin S against spoilage and foodborne pathogenic bacteria. Food Microbiology. 15: 289–298. Clavero, M.R., Beuchat, L.R. 1996. Survival of Escherichia coli O157:H7 in broth and processed salami as influenced by pH, w ater activity and temperature and suitability of media for its recovery. Applied Environmental Microbiology. 62: 2735-2740. ComBase, Combined Database of Microbial Responses to Food Environments. 2006. Food Standards Agency and the Institute of Food Research from the United Kingdom; the USDA Agricultural Research Service and its Eastern Regional Research Center from the United States; and the Australian Food Safety Centre of Excellence. Consultado de la red mundial el 10 de Agosto de 2006. Disponible en http://www.combase.cc/. Consejo Nacional de Educación para la Vida y El Trabajo (CONEVyT). 2006. Portal de matemáticas. Instituto Nacional de Educación para los Adultos (INEA). California. Consultado de la red mundial el 3 de Agosto de 2006. Disponible en Disponible en http://www.conevyt.org.us

145

COPAN Diagnostics Inc. (USA). 2005. Sistema CryoBankTM para conservación de cepas. Consultado de la red mundial el 9 de Marzo de 2006. Disponible en http://www.copanusa.com/html/spanishCryo.html Cutter, C., Henning, W. R. 2003. Control de Listeria monocytogenes en plantas pequeñas procesadoras de carnes y aves. College of Agricultural Sciences. Agricultural Research and Cooperative Extensión. Penn State. Vol 3. pp 55-72. Dalgaard, P. 2004. Predictive microbiology – concept, models and softw are. Consultado de la red mundial el 10 de Agosto de 2006. Disponible en http://www.dfu.min.dk/mico7pd.htm Daniel, W. 2002. Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud. Cuarta edición. Limusa Wiley. pp 186-188, 295. Degnan, A.J., Yousef, A.E. y Luchansky, J.B. 1992. Use of Pediococcus acidilacti to control Listeria monocytogenes in temperature-abused vacuum-packaged Wieners. Journal of Food Protection. 55: 98 – 103. Duffy, L.L., Vanderlinde, P.B., Grau, F.H. 1994. Grow th of Listeria monocytogenes on vacuum-packed cooked meats: effects of pH, aw , nitrite and ascorbate. Int J Food Microbiol. 23:377-90. Earnshaw, R. 1997. Predictive modeling: shaping food safety and quality. Department of Microbiology, Campden & Chorleyw ood Food Research Association, Chipping Campden, Glos, G155 6LD, UK. pp. 812–816. Eck, A. 1990. El queso. Editorial Omega, Barcelona, España. Vol. 3. pp 123-135. Ekici, K., Bozkurt, H. y Isleyici, O. 2004. Isolation of some pathogens from raw milk of different milk animals. Pakistan Journal of Nutrition. 3: 161-162. El-Shenawy, M.A. y Marth, E.H. 1990. Behavior of Listeria monocytogenes in the presence of Gluconic Acid and during preparation of cottage cheese curd using Gluconic acid. J. Dairy Sci. 73: 1429-1438. Eppert, I., Valde´s-stauber, N. y Scherer, S. 1997. Grow th Reduction of Listeria spp. Caused by Undefined Industrial Red Smear Cheese Cultures and Bacteriocin-Producing Brevibacterium linens as Evaluated In Situ on Soft Cheese. Applied And Environmental Microbiology. 63: 124812–4817. Escartin. F. E. 2000. Microbiología e Inocuidad de los Alimentos. Universidad Autónoma de Querétalo. pp. 252,23,240-243. Faith, N.G., Parniere, N., Larson, T., Lorang, T.D., Luchansky, J.B. 1997. Viability of Escherichia coli O157:H7 in pepperoni during manufacture of sticks and the subsequent storage of slices at 21, 4 and -20°C under air, vacuum and CO2. International Journal of Food Microbiology. 37: 47 – 54. Feresu, S. y Nyati, H. 1990. Fate of pathogenic and non-pathogenic Escherichia coli strains in tw o fermented milk products. Journal of Applied Bacteriology. 69: 814 – 821.

146

Foegeding, P.M., Thomas, A.B., Pilkington, D.H. y Klaenhammer, T.R. 1992. Enhanced control of Listeria monocytogenes by in situ produced pediocin during dry fermented sausage production. Applied and Environmental Microbiology, 4: 884-890. Food & Drug Administration. 2003. Center for Food Safety & Applied Nutrit ion FDA. Conventional Plate Count Method. Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 3. Consultado de la red mundial el 3 de Agosto de 2006. Disponible en http://www.usda.gov/fda.ol.bam.htm Fox, P.F., Guinee, T.P., Cogan, T.M. y McSweeney, P.L.H. 2000. Fundamentals of cheese science. Ed. Aspen, USA. pp. 113-116. Garcia, G.M., Zurera, G. 1994. Modelamiento predictivo del crecimiento microbiano en los alimentos. II: Tipos de procesos de predicción y aplicaciones. Alimentaria. 256: 89-96. Garneu, S. Martín, N.I., Vederas, J.C. 2002. Tw o peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria. Biochimie 84: 577-592.

Gibson, A.M., Bratchell, N. y Roberts, T.A. 1988. Predicting microbial grow th: growth responses of salmonellae in a laboratory medium as affected by pH, sodium chloride and storage temperature. International Journal of Food Microbiology, 6: 155-178. Giménez, B.C., Dalgaard, P. 2004. Modelling and predicting the simultaneous grow th of Listeria monocytogenes and spoilage microorganisms in cold-smoked salmon. Journal of Applied Microbiology, 96: 96-109. Glass, K.A., Loeffelholz, J.M., Ford, J.P. y Doyle, M.P. 1992. Fate of Escherichia coli O157:H7 as affected by pH or sodium chloride and in fermented, dry sausage. Appl Environ Microbiol. 58:2513-6. Gombas, D.E. 1989. Biological competit ion as a preserving mechanism. Journal of Food Safety, 10: 107-117. Holzapfel, W.H., Geisen, R. y Schillinger, U. 1995. Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins, and food-grade enzymes. International Journal of Food Microbiology, 24: 343-362. ICMSF. 1998. Potential application of risk assessment techniques to microbiological issues related to international trade in food and food products. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Journal of Food Protection. 61: 1075-1086. ICMSF. 1997. Establishment of microbiological safety criteria for food in international trade. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. World Health Statistics Quaterly. Institute of Food Technologists. 50: 119-123. Jack, R. Tagg, J.R. y Ray, B. 1995. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria. Microbiological Review s. 59: 171-200. Jeppesen, V.F. y Huss, H.H. 1993. Antagonistic activity of two strains of lactic acid bacteria against Listeria monocytogenes and Yersinia enterocolitica in a model f ish product at 5°C. International Journal of Food Microbiology. 19: 179 – 186.

147

Kalalou, I., Faid, M. y Touhamy Ahami, A. 2004. Extending shelf life of fresh minced camel meta at ambinet temperatura by Lactobacillus delbrueckii Subs. Delbrueckii. Electronic Journal of Biotechnology. 7: 246-250. Kalmokoff, M. L., E. Daley, J. W. Austin y J. M. Farber. 1999. Bacteriocin-like inhibitory activities among various species of Listeria. International Journal of Food Microbioly. 50:191–201. Kamau, D.N., Doores, S. y Pruitt, K.M. 1990. Antibacterial activity of the lactoperoxidase system against Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in milk. Journal of Food Protection, 53: 1010 – 1014. Katla, T., Moretro, T., Sveen, I., Aasen, I.M., Axelsson, L., Rorvik, L.M., Naterstad, K. 2002. Inhibit ion of Listeria monocytogenes in chicken cold cuts by addit ion of sakacin P and sakacin P-producing Lactobacillus sakei. J. Applied Microbiology, 93: 191-196. Kelly, A.F., Park, S., Bovill, R. y Mackey, B.M. 2001. Survival of Campylobacter jejuni during stationary phase: Evidence for the absence of a phenotypic stationary-phase response. Applied and Environmental Microbiology. 67: 2248-2254. Koutsoumanis, K.P., Taoukis, P.S., Drosinos, E.H. y Nychas, GJ. 2000. Applicability of an Arrhenius model for the combined effect of temperature and CO2 packaging on the spoilage microflora of f ish. Applied Environemental Microbiology. 66: 3528-3534. Leroy, F. y De Vuyst, L. 2005. Modeling bacteriocin resistance and inactivation of Listeria innocua LMG 13568 by Lactobacillus sakei CTC 494 under sausage fermentation condit ions. Applied and Environmental Microbiology, 9: 7567-7570. Leroy, F. y De Vuyst, L. 2004. Modelling interactions betw een bacteriocin-producing sausage starter culture or cocultures and Listeria monocytogenes revels how to improve the eff iciency of Listeria killing. In: III International Symposium on Applications of Modelling as an Innovative Technolohy in the Agri-Food Chain. pp. 234- 236. Leroy, F. y De Vuyst, L. 2003. A combined model to predict the functionality of the bacteriocin-producing Lactobacillus sakei strain CTC 494. Applied and Environmental Microbiology, 2: 1093-1099. Leroy, F. y De Vuyst, L. 1999. Temperature and pH condit ions that prevalí during fermentation of sausages are optimal for production of the antilisterial bacteriocin sakacin K. Applied and Environmental Microbiology, 3: 974-981. Loessner, M., Guenther, S., Steffan, S. y Scherer, S. 2003. A Pediocin-Producing Lactobacillus plantarum Strain Inhibits Listeria monocytogenes in a Mult ispecies Cheese Surface Microbial Ripening Consortium. Applied and Environmental Microbiology. 69:1854–1857. Lozo, J., Vukasinovic, M., Strahinic, I., Topisirovic, L. 2004. Characterization and antimicrobial activity of bacteriocin 217 produced by natural isolate Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGBUK2-16. Journal of Food Protection. 67: 2727-34. Mackey, B.M., Kelly, A.F., Colvin, J.A., Robbins, P.T. y Fryer, P.J. 2005. Predicting the thermal inactivation of bacteria in a solid matrix: simulation studies on the relative effects of

148

microbial thermal resistance parameters and process conditions. International Journal of Food Microbiology 65: 267-273 Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. 1999. Brock Biología de los microorganismos. Octava edición revisada. Prentice Hall Iberia. Madrid. pp. 819-833. Makras, L., Van Acker, G, y De Vuyst, L. 2005. Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 8700:2 Degrades Inulin-Type Fructans Exhibiting Different Degrees of Polymerization. Appl Environ Microbiol. 11: 6531–6537. Maldonado, A., Jiménez, R. Ruiz, B. 2004. Induction of Plantaricin Production in Lactobacillus plantarum NC8 after Coculture w ith Specif ic Gram-Positive Bacteria Is Mediated by an Autoinduction Mechanism. Journal of Bacteriology. 186: 1556-1564 Mano, S.B., Ordoñez, J.A., Garcia, G.D. 1995. Grow th/survival of natural f lora and Listeria monocytogenes on refrigerated uncooked pork and turkey packaged under modif ied atmospheres. Journal of Food Safety. 15: 305-319. Martinez, J.A. 1999. “Epizootiología en el año 2000”. Memorias de la IX Jornada Provincial de Ciencias Veterinarias. Camagüey, Cuba. Ed. Camagüey. pp. 81-86. Martinez-Rodriguez, A. y Mackey, B. M. 2005. Factors affecting the pressure resistance of some Campylobacter species. Letters in Applied Microbiology. 41: 321-326. McEntire, J. 2004. IFT Issues update on foodborne pathogens. News & Análisis, Vol. 58, No. 7.pp. 123-126. McKellar, R.C., Lu, X. 2004. Modelling microbial responses in food. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Journal of Food Protection. 62: 1024-1036. McMeekin, T.A., Brown, J., Krist, K., miles, D., Neumeyer, K., Nichols, D.S., Olley, J., Presser, K., Ratkowsky, D.A., Ross, T., Salter, M. y Soontranon, S. 1997. Quantitative microbiology: a basis for food safety. Emerging Infectious Diseases. 4: 541-549.

McMeekin, T.A. y Ross, T. 1994. Predictive Microbiology. International Journal of Food Microbiology. 2: 241-264. McWilliam Leitch, E.C. y Stewart, C. S. 2002. Susceptibility of Escherichia coli O157 and non-O157 isolates to lactate. Letters in Applied microbiology, 35: 176-180. Mellefont, L.A., McMeekin, T.A. y Ross, T. 2003. Performance evaluation of a model describing the effects of temperature, w ater activity, pH and lactic acid concentration on the grow th of Escherichia coli. International Journal of Food Microbiology. 82: 45-58. Montville, T.J. y Chen, H. 1998. Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and unresolved questions Appl Microbiol Biotechnol 50: 511-519 Muriana, P. M. 1996. Bacteriocins for control of Listeria spp. in food. International Journal of Food Microbioly. Prot. Suppl. 59:54–63.

149

Murry, A.C., Hinton, A. y Morrison, H. 2004. Inhibition of grow th of Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Clostridium perfringens on chicken feed media by Lactobacillus salivarius and Lactobacillus plantarum. International Journal of Poultry Science, 3: 603-607. Nataro, R.J. y Kaper, J.B. 1998. Diarrheagenic E. coli. Clinical Microbiology Reviews, 23: 869-872. Nacional Institute Health. 2005. Consultado de la red mundial el 26 de abril de 2005. Disponible en http//:www.niaid.nih.gov/factsheets/foodbornedis.htm. Niven, G.W., Fuks, T., Morton, J.S., Rua, S.A. y Mackey, B.M. 2005. A novel method for the automated measurement of lag time of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Mehods 48: 35-42 Ogwaro, B.A., Gibson, H., Whitehead, M. y Hill, D.J. 2002. Survival of Escherichia coli O157:H7 in tradit ional African yoghurt fermentation. International Journal of Food Microbiology. 79: 105-112. Oh, D.H. y Marshall, D.L. 1993. Antimicrobial activity of ethanol, glycerol monolaurate or lactic acid against Listeria monocytogenes. Int J Food Microbiology. 20: 239-46. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO). 2006. Problemas relativos a la calidad e inocuidad de los alimentos y su repercusión en el comercio. Boletín del Departamento de Agricultura, Bioseguridad, Nutrición y Protección del Consumidor. Consultado de la red mundial el 17 de Agosto de 2006. Disponible en http//:www.fao.gov//foodcontrol.htm. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) 1998. Boletín del Departamento de Agricultura, Bioseguridad, Nutrición y Protección del Consumidor. Consultado de la red mundial el 20 de abril de 2006. Disponible en http//:www.fao.gov//foodsafety/feedbach.htm. Pagán, R., Jordan, S., Benito, A. y Mackey, B.M. 2001. Enhanced acid sensitivity of pressure-damaged Escherichia coli O157 cells. Applied and Environmental Microbiology. 67: 1983-1985. Paustian, T. 2000. Metabolism – Fermentation. University of Wisconsin-Madison. Consultado de la red mundial el 22 de abril de 2006. Disponible en http://dw b.unl.edu. Pelczar, M.J., Reid, R., Chan, E.C.S. 1999. Microbiología de los Alimentos. Cuarta edición. McGraw -Hill, Mexico. 703-724. Pinon, A., Zwietering, M., Terrier, L., Vialette, M. 2004. Development an validation of Experimental protocols for use of cardinal model for prediction of microorganism grow th in food products. Applied and Environmental Microbiology. 70: 1081-1087. Porto, A.C., Franco, B.D., Santanna, E.S., Call, J.E., Piva, A., Luchansky, J.B. 2002. Viability of a f ive-strain mixture of Listeria monocytogenes in vacuum-sealed packages of Frankfurters, commercially prepared w ith and w ithout 2.0 or 3.0% added potassium lactate, during extended storage at 4 and 10C. Journal of Food Prot. 65:1705. Rabel, L. K. y Hillier, S. L. 2003. Optimization of Media for Detection of Hydrogen Peroxide Production by Lactobacillus Species Journal of Clinical Microbiology. 41: 3260-3264.

150

Rash, K.E. y Kosikowski, F.V. 1982. Behaviour of enteropathogenic Escherichia coli in Camembert cheese made from ultrafiltered milk. Journal of Food Science. 47: 728 – 732 Reilly, S.S. y Gilliland, S.E. 1996. Consultado de la red mundial el 23 de junio de 2006. Disponible en http//:www.ansi.okstate.edu/research/1996rr/8.pdf. Riordan, D.C., Duffy, G., Sheridan, J.J., Whiting, R.C., Blair, I.S., McDowell, D.A. 2000. Effect of acid adaptation, product pH, and heating on survival of Escherichia coli O157:H7 in pepperoni. Applied and Environmental Microbiology. 66: 1726 - 1729. Riverón, R.L. 1992. Etiología infecciosa de las EDA. Ed. Ciencias Médicas. La Habana. pp. 14-16. Rodríguez, A. 1988. Manual de Elaboración de productos lácteos fermentados. Tecnología de Elaboración de Suero Costeño. ICTA. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá D.C. pp. 57-62. Ross, T. 1996. Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology. Journal of Applied Bacteriology. 81: 501-508. Ross, T. y McMeekin, T.A. 1994. Predictive microbiology. International Journal of Food Microbiology. 23: 241-264. Ross, T., Ratkowsky, D.A., Mellefont, L.A. y McMeekin, T.A. 2003. Modelling the effects of temperature, w ater activity, pH and lactic acid concentration on the grow th rate of Escherichia coli. International Journal of Food Microbiology. 82: 33-43. Savadogo, A., Ouattara, C.A.T., Bassole, I.H.N. y Traore, A.S. 2004. Antimicrobial activities of lactic acid bacteria strains isolated from Burkina Faso fermented milk. Pakistan Journal of Nutrition,3: 174-179. Schillinger, U., Becker, B., Vignolo, G. y Holzapfel, W.H. 2001. Eff icacy of nisin in combination w ith protective cultures against Listeria monocytogenes Scott A in tofu. Int. J. Food Microbiology, 71: 159-168. Schillinger, U., Geisen, R., Holzapfel, W.H. 1996. Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends of Food Science Technology. 7: 158–164. SIVIGILA. Ministerio de la Protección Social - Instituto Nacional de Salud. 2004. Reporte Epidemiológico de ETAs en Colombia. Consultado de la red mundial el 14 de abril de 2005. Disponible en http//:www.sivigila.ins.co/repepidem/2004/pdf Sookkhee, S., Chulasiri, M. y Prachyabrued, W. 2001. Lactic acid bacteria from healthy oral cavity of Thai volunteers: inhibit ion of oral pathogens. Journal of Applied Microbiology. 90: 172-179. Stanley, G. 1998. Microbiología de los productos lácteos fermentados. Tecnología de los productos lácteos. 2ª Edición. Ed. Acribia. Zaragoza, España. pp. 93-97. Talwalkar, A. y Kailasapathy, K. 2003. Metabolic and Biochemical Responses of Probiotic Bacteria to Oxygen. American Dairy Science Association. J. Dairy Sci. 86: 2537–2546.

151

Tannock, G.W. 2004. Reviews: A Special Fondness for Lactobacilli. Applied And Environmental Microbiology. 70: 3189–3194. Teo, A.Y., Ravishankar, S., Sizer, C.E. 1996. Synergistic effect of high temperature and high pH on the destruction of Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7. Journal of Food Protection, 59: 1023-1030. Tompkin, J. 2005. Consultado de la red mundial el 26 de abril de 2006. Disponible en http://www.icmsf.iit.edu/pdf/045-051_Tompkin.pdf Tullmin, M. 2001. Water Pages. Corrosion Club. Consultado de la red mundial el 29 de abril de 2006. Disponible en http//:www.corrosion-club.com/w aterbactgrowth.htm. Vamanu, E., Vamanu, A., Popa, O., Campeanu, G. 2005. Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders. African Journal of Biotechnology, 4: 403-408. Vimont, A., Vernozy-Rozand, C., Montet, M.P., Lazizzera, C., Bavai, C., Delignette-Muller, M.L. 2006. Modeling and predicting the simultaneous grow th of Escherichia coli O157:H7 and ground beef background microflora for various enrichment protocols. Applied and Environmental Microbiology 3: 261-268. Whiting, R.C. 1995. Microbial modelling in foods: Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35: 467-494. Zalán, Z., Németh, E., Baráth, A. y Halász, A. 2005. Inf luence of Grow th Medium on Hydrogen Peroxide and Bacteriocin Production of Lactobacillus Strains. Food Technol. Biotechnol. 43: 219–225. Zwietering, M.H., Jongen Burger, I., Rombouts, F.M., van´t Riet, K. 1990. Modeling of the bacterial grow th curve. Applied and Environmental Microbiology, 56: 1875-1881.

152

ANEXO 1

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO (Gramos/Litro)

AGAR EM B (Agar eosina-azul de metileno-lactosa según LEVINE)

• Peptona universal......................... .................. .................. .................. .................10.0 • Lactosa................................... ................. .................. .................. .................. .......10.0 • Hidrogenofosfato dipotásico.................... ................. .................. .................. ..........2.0 • Eosina amarillenta................. .................. .................. .................. .................. .........0.4 • Azul de metileno.................... .................. .................. .................. .................. .....0.065 • Agar agar....................................... ................. .................. .................. ..................13.5

AGAR M RS (Agar para Lactobacillus según DE MAN, ROGOSA y SHARPE)

• Peptona Universal............................ .................. .................. .................. ..............10.0 • Extracto de carne...................... .................. .................. .................. .................. .....5.0 • D (+) –Glucosa..................... .................. .................. .................. .................. ........20.0 • Hidrogenofosfàto dipotásico.................... ................. .................. .................. ..........2.0 • Tw eenR 80........................................ ................. .................. .................. .................1.0 • Hidrogencitrato diamónico............ .................. .................. .................. ................. ..2.0 • Acetato sódico......................................... .................. .................. .................. .........5.0 • Sulfato de Magnesio..................... .................. .................. ................. .................. ..0.1 • Sulfato de Manganeso....... .................. .................. ................. .................. ...........0.05 • Agar Agar.................................................... .................. .................. .................. ...12.0

AGAR M UELLER HINTON

• Infusión de carne................... .................. .................. .................. ................. ..........2.0 • Hidrolizado de caseína.......... .................. .................. .................. ................. ........17.5 • Almidón............. .................. .................. ................. .................. .................. ............1.5 • Agar agar....................................... ................. .................. .................. ..................13.0

AGAR PALCAM (Agar selectivo para Listeria según VAN NETTEN et al.)

• Peptona universal......................... .................. .................. .................. .................23.0 • Almidón............. .................. .................. ................. .................. .................. ............1.0 • Cloruro sódico............................ ................. .................. .................. .................. .....5.0 • Agar agar....................................... ................. .................. .................. ..................13.0 • D (-) manitol................. .................. .................. .................. ................. ..................13.0 • Citrato de amonio y hierro (III)...... .................. .................. .................. .................. ..0.5 • Esculina................ .................. .................. ................. .................. .................. .........0.8 • Glucosa.................... .................. .................. ................. .................. .................. .....0.5 • Cloruro de lit io.......... .................. ................. .................. .................. .................. ...15.0 • Rojo de fenol............ ................. .................. .................. .................. .................. ...0.08

153

AGAR PLATE COUNT (Agar peptona de caseína-glucosa-extracto de levadura) • Peptona de caseína........... .................. .................. ................. .................. .............5.0 • Extracto de levadura.......... .................. .................. .................. .................. ............2.5 • D (+) –glucosa............................. .................. .................. .................. ................. ....1.0 • Agar agar....................................... ................. .................. .................. ..................14.0

CALDO MRS (Caldo para Lactobacillus según DE MAN, ROGOSA y SHARPE)

• Peptona Universal............................ .................. .................. .................. ..............10.0 • Extracto de carne...................... .................. .................. .................. .................. .....5.0 • D (+) –Glucosa..................... .................. .................. .................. .................. ........20.0 • Hidrogenofosfàto dipotásico.................... ................. .................. .................. ..........2.0 • Tw eenR 80........................................ ................. .................. .................. .................1.0 • Hidrogencitrato diamónico............ .................. .................. .................. ................. ..2.0 • Acetato sódico......................................... .................. .................. .................. .........5.0 • Sulfato de Magnesio..................... .................. .................. ................. .................. ..0.1 • Sulfato de Manganeso....... .................. .................. ................. .................. ...........0.05

154

ANEXO 2

COMPOSICIÓN FISICOQUÍMICA DE LA LECHE ENTERA UHT

Según etiqueta del fabricante

• Grasa Total.................. .................. .................. ................. .................. ..................6.0g/L • Grasa saturada............................. .................. .................. .................. ..................4.0g/L • Colesterol................. .................. .................. ................. .................. .................. ..30mg/L • Sodio...... .................. .................. ................. .................. .................. .................. ..96mg/L • Carbohidratos totales................ .................. .................. .................. ................. ......10g/L • Azúcares............................................... ................. .................. .................. ............10g/L • Proteína................ .................. ................. .................. .................. .................. ..........6g/L • Vitamina A....................... .................. ................. .................. .................. .................. .4% • Vitamina D............ .................. .................. ................. .................. .................. ..........40% • Calcio................ .................. .................. .................. ................. .................. ..............48% • Hierro........................... .................. .................. .................. ................. .................. .....1%

155

ANEXO 3

ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE BLIS

Con los sobrenadantes neutralizados se comprobó que la inhibición observada (determinada

por el diámetro en mm de halos) no se relaciona directamente con bajos pH debidos a la

producción de ácido láctico (Figura 61). Durante los ensayos, el pH de los cultivos de BAL se

mantuvieron entre 5,0 y 6,5, rangos entre los cuales la producción de bacteriocinas es óptima

(Jack, 1995; Talw alkar, 2003). Por otro lado, medios de cultivo como el MRS y el BHI

empleados en la verif icación de BLIS, tienen dentro de su composición química

hidrogenofosfato dipotásico (2g/L y 2.5g/L respectivamente) que actúa como buffer, impidiendo

cambios acelerados de pH, lo cual permit ió sugerir con mayor seguridad que el mecanismo

inhibitorio con los sobrenadantes neutralizados obedece más a la acción de metabolitos

secundarios tipo bacteriocinas, que a acidez del medio.

Figura 61. Fotografía de los resultados de verificación de la producción de BLIS. Sobrenadante neutralizado de Lactobacillus plantarum (A), sobrenadante neutralizado de Leuconostoc mesenteroides (B), sobrenadante neutralizado de Pediococcus acidilacti (C) y sobrenadante neutralizado de Lactobacillus paracasei. (D). Cepa indicadora: L. monocytogenes. Medio Mueller Hinton a 37°C.

La posibilidad que la inhibición en el crecimiento de las patógenas por parte de las BAL se deba

a la acción de peróxidos también fue descartada, pues se ha reportado que el medio MRS es

excelente para el aislamiento y crecimiento de la mayoría de Lactobacillus spp. pero su

A B

C D

156

composición química inhibe la producción de peróxidos por parte de las cepas (Rabel y Hillier,

2003). En otro estudio, cepas de Lactobacillus spp. fueron evaluadas con catalasa y tetra-

methylbenzidina en diferentes medios de cultivo, comprobando que producían peróxidos; sin

embargo, estas mismas cepas, al ser cultivadas en MRS no presentaron dicha actividad, por lo

que recomendaron no utilizar el MRS para los ensayos de producción de peróxido de hidrógeno

(Sookkhee, 2001), lo cual hace que este medio sea ideal para evaluar la producción de BLIS.

En la Tabla 26 se presentan los resultados obtenidos al evaluar los sobrenadantes neutralizados y sin neutralizar de diferentes BAL. El sobrenadante neutralizado de L. plantarum

(productor de bacteriocinas) mostró efectos inhibitorios frente a L. monocytogenes y E. coli con

halos de inhibición de 17 y 15mm de diámetro respectivamente, siendo esta cepa entre las 11

evaluadas la de mejor desempeño en cuanto a potencial de inhibición. Por otro lado, con el

sobrenadante sin neutralizar de L. paracasei (no productor de bacteriocinas) se logró inhibir el

crecimiento de L. monocytogenes y E. coli con halos de inhibición de 15 y 14mm de diámetro

respectivamente, siendo esta BAL entre las reportadas como no productoras de bacteriocinas,

la de mayor efecto antagónico.

Finalmente, después de evaluar y analizar los resultados de los ensayos de inhibición se

eligieron para el estudio las cepas Lactobacillus plantarum WS4174 y Lactobacillus paracasei

LB279 por presentar el mejor efecto antagónico frente a las cepas indicadoras. Los resultados

de esta verif icación coinciden con lo publicado por Cintas et al. (1998) y por Schillinger et al.

(1996) quienes reportaron efectos inhibitorios satisfactorios de bacteriocinas producidas por L.

lactis, L. plantarum y P. acidilacti frente a diferentes patógenos de importancia en alimentos,

entre ellos L. monocytogenes y E. coli.

Adicionalmente, varios autores (Kalmokoff, 1999; Eppert, 1997; Muriana, 1996) han reportado el

uso y la aplicación de la pediocina producida por L. plantarum para el control de cepas de

Listeria spp. resistentes a temperaturas de refrigeración y a tratamientos con desinfectantes

convencionales en la industria alimentaria. Murry et al. (2004) también reportaron la inhibición en el crecimiento de cepas de E. coli, Salmonella spp. y Clostridium spp. debida a la presencia

de L. plantarum y L. salivarius en el medio.

157

Tabla 26. Resultados de v erificación de la producción de BLIS en MRS a 37°C.

En este ensayo de verif icación de producción de BLIS se encontró que la cepa de Lactobacillus paracasei LB279 aislada de Suero Costeño, no produjo metabolitos antimicrobianos de tipo

bacteriocinas, puesto que con el sobrenadante neutralizado no se presentó ninguna inhibición

frente a las cepas indicadoras (L. monocytogenes y E. coli).

Contrario a estos resultados, Lozo et al. (2004) reportaron que la cepa Lactobacillus paracasei

subsp. paracasei BGBUK2-16 aislada de un queso casero, produjo la bacteriocina 217 (Bac217;

aproximadamente de 7 kDa de peso), la cual presentó actividad bactericida frente a cepas de

Staphylococcus aureus y Bacillus cereus. Sin embargo, estos resultados contrarios pueden

deberse a que se utilizaron distintas cepas de L. paracasei y diferentes condiciones de

crecimiento en ambos estudios.

CEPAS RETO Halos de Inhibición para L. monocytogenes LMO026

(mm de diámetro)

Halos de Inhibición para E. coli ECO25 (mm de diámetro)

Ref. BAL

PROCEDENCIA

Sobrenadante sin neutralizar

Sobrenadante neutralizado

Sobrenadante sin neutralizar

Sobrenadante neutralizado

LB2 Lactobacillus pentosus Suero Costeño.

Universidad de La Sabana 13 11 11 10

LB10 Lactobacillus acidophilus

Suero Costeño. Universidad de La

Sabana 14 12 13 12

LB40 Lactobacillus brevis Suero Costeño.

Universidad de La Sabana 15 0 12 0

LB156 Pediococcus acidilacti Suero Costeño.

Universidad de La Sabana 14 13 13 11

LB206 Lactococcus lactis Suero Costeño.

Universidad de La Sabana 15 10 12 0

LB381 Lactococcus lactis spp lactis

Suero Costeño. Universidad de La

Sabana 14 11 14 12

LB279 Lactobacillus paracasei Suero Costeño.

Universidad de La Sabana 15 0 14 0

LB238 Lactobacillus plantarum

Suero Costeño. Universidad de La

Sabana 14 12 13 11

WS4174 Lactobacillus plantarum

Queso. Technische Universitat Munchen

17 17 16 15

P120 Pediococcus acidilacti Crema de Leche.

Universitie de Poitiers de Francia 17 16 16 14

Y105 Leuconostoc mesenteroides

Vegetales frescos. Universitie de

Poitiers de Francia 15 13 16 13

158

Caridi (2002) reportó que cepas de L. paracasei subs. paracasei aisladas de queso de cabra

manufacturado artesanalmente presentaron una marcada actividad antagónica frente a cepas

de E. coli, aseguró que la aplicación de esta BAL en la leche cruda garantiza un mayor tiempo

en la conservación del alimento; sin embargo, no atribuye esta actividad antagónica a la

presencia de bacteriocinas.

Luego de determinar la actividad antagónica de L. plantarum WS4174 y L. paracasei LB279

frente E. coli ECO25 y L. monocytogenes LMO26 en caldo MRS a 37°C, se realizó el mismo procedimiento de verif icación de BLIS con estas cuatro cepas pero utilizando como medio de

crecimiento leche entera UHT (las pruebas se hicieron por duplicado). Este estudio se realizó

con el f in de determinar si en ambos medios (MRS y leche) se presentaba el mismo patrón de

comportamiento y las BAL seguían inhibiendo a las patógenas de la misma manera. En la

Tabla 27 se presentan los resultados obtenidos de esta verif icación en leche entera UHT, donde

también se incluyen, para facilitar la comparación, los resultados previamente discutidos

obtenidos en MRS.

Tabla 27. Resultados de v erificación de la producción de BLIS en leche entera UHT a 37°C.

Leche entera UHT Halos de Inhibición para L. monocytogenes

LMO026 (mm de d iámetro) Halos de Inhibición para E. coli ECO25

(mm de diámetro) Cultiv o Sobrenadante sin neutralizar

Sobrenadante neutralizado

Sobrenadante sin neutralizar

Sobrenadante neutralizado

Lactobacillus p aracasei LB279 14 0 15 0

Lactobacillus plantarum WS4174 16 17 17 15

Caldo MRS Halos de Inhibición para L. monocytogenes

LMO026 (mm de diámetro) Halos de Inhibición para E. coli ECO25

(mm de diámetro) Cultiv o Sobrenadante sin neutralizar

Sobrenadante neutralizado

Sobrenadante sin neutralizar

Sobrenadante neutralizado

Lactobacillus p aracasei LB279 15 0 14 0

Lactobacillus plantarum WS4174 17 17 16 15

Como se presenta en la Tabla 27, se pudo determinar que en leche entera UHT a 37°C las dos

BAL siguen teniendo efectos antagónicos frente a las dos cepas patógenas evaluadas. Así

mismo se confirmó que en este medio, la cepa de L. paracasei LB279, no produjo metabolitos

159

antimicrobianos de tipo bacteriocinas, puesto que con el sobrenadante neutralizado no se

presentó ninguna inhibición frente a las cepas indicadoras (L. monocytogenes y E. coli),

mientras que con el sobrenadante sin neutralizar se obtuvieron halos de inhibición de 14mm y

15mm respectivamente.

Por otro lado, L. plantarum WS417 inhibió el crecimiento de los dos patógenos cuando se utilizó

su sobrenadante neutralizado y sin neutralizar, sugiriéndose también en este caso, su potencial

como productor de bacteriocinas. Frente a E. coli, L. plantarum generó halos de inhibición de 15mm (sobrenadante neutralizado) y de17mm (sobrenadante sin neutralizar). Frente a L.

monocytogenes generó halos de inhibición de 17mm y 16mm respectivamente.

Finalmente se comprobó que en ambos medios, MRS y leche entera UHT se presentó el mismo

patrón de inhibición y que el comportamiento de las BAL frente a las cepas patógenas no se

alteró por el cambio de medio.

160

ANEXO 4

ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS VALIDACIÓN ESTADÍSTICA DEL MÉTODO MODIFICADO DE RECUENTO EN

PLACA

Los resultados obtenidos para la validación del método modif icado de recuento en placa o en

cuartos se presentan en la Tabla 28. El recuento de las colonias (UFC/mL) realizado

directamente del cultivo, se mult iplicó por el factor de dilución correspondiente y se cuantif icó a

UFC/mL (se multiplicó por 10 para siembra en placa de petri completa y por 50 para la siembra

en cuartos de caja). Fotografías del crecimiento bacteriano obtenido a partir de siembras

realizadas en cuartos de placa se presentan en la Figura 62.

El ANOVA muestra que no hay diferencia signif icativa entre los resultados de conteo (UFC/mL)

obtenidos por ambos métodos, el estándar y el modif icado demostrándose que el método

modif icado de “recuento en cuartos” puede utilizarse con confiabilidad como técnica alterna al

método estándar. El ANOVA de los dos métodos por microorganismo (L. plantarum, L.

paracasei, E. coli y L. monocytogenes), tampoco presentó diferencia signif icativa lo que

demuestra que el método modif icado puede ser empleado para el recuento de diferentes

microorganismos (Anexo 6).

Sin embargo, el A NOVA por método, microorganismos y dilución si arrojó diferencias

signif icativas. El test de Tukey evidencia que a mayores diluciones los dos métodos tienden a contabilizar una mayor concentración de bacterias (UFC/mL). De los 16 grupos analizados

(cuatro microorganismos por cuatro diluciones), cuatro presentaron diferencia signif icativa a

nivel de dilución. Los grupos con diferencia signif icativa se presentaron en las muestras con las

dos mayores diluciones, así: L. plantarum en la dilución C, L. paracasei en la Dilución C y E. coli

en las diluciones C y D (Anexo 6). Sin embargo, en el 75% de los resultados no se obtuvo

diferencia signif icativa.

161

Tabla 28. Validación estadística del método modificado de recuento en placa (siembra en cuartos en placa de petri estándar).

Figura 62. Fotografías del método modificado de recuento en placa (siembra en cuartos en placa de petri estándar). L. monocytogenes en agar MRS a 37°C (Diluciones decimales -2, -3, -4, -5) (A) y L. plantarum en agar MRS a 37°C (Diluciones decimales -3, -4, -5, -6) (B).

RECUENTO EN PLACA (Número de colonias obtenidas x factor de dilución)

Dilución A Dilución B Dilución C Dilución D

CEPA Réplica Placa

completa Placa x cuartos

Placa completa

Placa x cuartos

Placa completa

Placa x cuartos

Placa completa

Placa x cuartos

1 8280 8150 4850 4700 3140 3000 1850 1750 2 8190 8000 4880 4750 3220 3100 1970 1950 3 8270 8250 4950 4900 3250 2900 1940 1900

Lactobacillus plantarum

4 8220 8100 4920 4850 3200 3150 1890 1850

1 8230 8250 4410 4450 2540 2500 1340 1350

2 8170 8000 4380 4400 2480 2300 1350 1400

3 8210 8200 4450 4300 2500 2400 1300 1400

Lactobacillus paracasei

4 8250 8150 4400 4350 2510 2400 1310 1250

1 4400 4250 2240 2350 1280 1100 710 600

2 4290 4350 2350 2250 1330 1050 750 500 3 4450 4100 2380 2300 1310 1250 770 600

Esch erichia coli

4 4370 4300 2200 2250 1220 1200 700 700

1 2260 2250 1100 1200 620 650 300 300

2 2340 2300 1170 1150 640 600 280 300 3 2300 2200 1120 1000 650 550 290 250

Listeria monocytogenes

4 2270 2250 1190 1100 650 600 300 300

A B

162

Como se trata de una tendencia a sobreestimar observada en ambos métodos (error inherente

a la técnica básica de ambos métodos) no afecta la validez del método modif icado de “recuento

en cuartos” para f ines de cuantif icación de células bacterianas. Estas discrepancias también se

encuentran reportadas en el Bacteriological Analytical Manual (FDA, 2003) donde se afirma que

pueden presentarse desviaciones al realizar diluciones muy altas (mayor número de

transferencias) o al seleccionar muestras con muy baja concentración microbiana, por lo que se

recomienda emplear las diluciones más bajas (las más concentradas), para las técnicas de

recuento celular.

La metodología de “recuento en cuartos” no se encuentra publicada de forma detallada en todos

artículos indexados que la emplean, por conocerse ya su validez como método de conteo con

f ines de investigación y en especial para estudios de modelación del comportamiento

microbiano. Sin embargo, existen diferentes trabajos publicados sobre microbiología predictiva

que utilizan esta metodología (Mackey et al., 2005; Martínez-Rodriguez y Mackey, 2005; Niven

et al., 2005; Casadei et al., 2002; Pagán et al., 2001; Kelly et al., 2001).

163

ANEXO 5

ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS VALIDACIÓN DE CULTIVOS SINCRONIZADOS

Los resultados obtenidos a partir de los tres procedimientos realizados para la estandarización

de inóculos se presentan en la Tabla 29. Para los tres casos, el inóculo A representó el cultivo

utilizado para iniciar el primer cultivo y el inóculo B representó el cultivo que se sincroniza para

continuar con la curva el segundo día.

En el procedimiento número 1 (donde ambos inóculos recibieron dos activaciones) no se

presentaron diferencias signif icativas entre los inóculos A y B para los cuatro microorganismos

evaluados (Anexo 7). Estos resultados indicaron que con ambos inóculos se obtuvieron

concentraciones bacterianas iguales, lo cual garantizó una mínima en la variabilidad de los

recuentos celulares cuando se realizan curvas de crecimiento a partir de cultivos sincronizados.

En el procedimiento número 2 (donde ambos inóculos recibieron sólo una activación) se

presentaron diferencias signif icativas entre los inóculos A y B para L. monocytogenes. De igual

forma, el procedimiento número 3 (inóculo A con una activación y B con dos activaciones)

presentó diferencia signif icativa entre los inóculos A y B de L. monocytogenes. Los

procedimientos 2 y 3 fueron, por lo tanto, descartados como método de preparación de inóculo.

Los resultados anteriores demuestran que dos activaciones son necesarias para obtener

poblaciones bacterianas más homogéneas en número (UFC/mL) y estado f isiológico. Esta

condición permitió sincronizar exitosamente cultivos bacterianos y garantizó la menor

variabilidad entre las réplicas de un mismo experimento.

A través de este estudio también se pudo establecer que para la estandarización de inóculos, la

técnica de recuento en placa es más apropiada que los métodos turbidimétricos. Los resultados

de medición de la densidad óptica (OD540) presentaron mayor variabilidad entre las mediciones

realizadas a los inóculos de una misma cepa bacteriana (Figura 63).

164

Tabla 29. Estandarización de inóculos para la sincronización de cultiv os paralelos. L. plantarum (a), L. paracasei (b), E. coli (c), L. monocytogenes (d), en caldo MRS a 37ºC.

a. Lactobacillus plantarum

Procedimiento 1 Procedimiento 2 Procedimiento 3 Réplicas Método Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B

Recuento 1,2 x 109 1,5 x 109 1,0 x 109 2,0 x 109 1,2 x 109 9,0 x 108 Réplica 1 Absorbancia 1,4995 1,7943 1,6334 1,8956 1,9871 1,4823

Recuento 1,0 x 109 1,5 x 109 9,5 x 108 2,0 x 109 1,2 x 109 9,5 x 108 Réplica 2 Absorbancia 1,8754 2,1046 1,9065 2,1268 2,3123 1,9322

Recuento 9,5 x 108 1,0 x 109 8,0 x 108 1,5 x 109 9,5 x 108 1,3 x 109 Réplica 3 Absorbancia 1,0228 1,2424 1,9260 2,046 1,0342 1,2523

Recuento 9,5 x 108 1,0 x 109 9,0 x 108 1,5 x 109 9,0 x 108 8,5 x 108 Réplica 4 Absorbancia 1,9056 2,0233 1,8561 2,049 2,0342 1,7399

b. Lactobacillus paracasei Procedimiento 1 Procedimiento 2 Procedimiento 3

Réplicas Método Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Recuento 1,4 x 109 1,6 x 109 1,5 x 109 2,0 x 109 1,3 x 109 1,0 x 109 Réplica

1 Absorbancia 1,9991 1,9948 2,0114 1,9952 2,0873 1,9887 Recuento 1,1 x 109 1,5 x 109 1,3 x 109 1,6 x 109 1,1x 109 9,0 x 108 Réplica

2 Absorbancia 2,0761 2,1046 2,0659 2,0163 2,1128 1,9390 Recuento 1,0 x 109 1,3 x 109 1,0 x 109 1,3 x 109 1,5 x 109 1,3 x 109 Réplica

3 Absorbancia 2,1268 2,0417 2,0846 2,0141 2,0545 2,0526 Recuento 1,5 x 109 1,2 x 109 1,2 x 109 1,5 x 109 9,5 x 108 1,2 x 109 Réplica

4 Absorbancia 1,9958 2,1150 2,0841 2,1013 2,1146 2,1691

c. Escherichia coli Procedimiento 1 Procedimiento 2 Procedimiento 3

Réplicas Método Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Recuento 7,5 x 108 8,0 x 108 8,0 x 108 9,5 x 108 8,0 x 108 9,5 x 108

Réplica 1 Absorbancia 0,6425 0,6998 0,7056 0,8977 0,8675 0,6723 Recuento 8,0 x 108 7,5 x 108 8,5 x 108 1,0 x 109 8,5 x 108 1,0 x 109

Réplica 2 Absorbancia 0,7013 0,7684 0,7564 0,9768 0,9115 0,876 Recuento 6,0 x 108 6,5 x 108 8,0 x 108 1,5 x 109 1,5 x 109 2,0 x 109

Réplica 3 Absorbancia 0,9082 0,9229 1,1065 1,2123 0,9123 0,9365 Recuento 7,0 x 108 7,5 x 108 7,0 x 108 9,5 x 108 7,0 x 108 1,2 x 109

Réplica 4 Absorbancia 0,6285 0,6994 0,8112 1,0865 0,6113 0,6456

d. Listeria monocytogenes Procedimiento 1 Procedimiento 2 Procedimiento 3

Réplicas Método Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Inóculo A Inóculo B Recuento 5,5 x 108 6,0 x 108 6,0 x 108 7,5 x 108 6,5 x 108 9,0 x 108

Réplica 1 Absorbancia 0,4986 0,5523 0,5954 0,621 0,4112 0,4034 Recuento 6,0 x 108 6,5 x 108 5,5 x 108 8,5 x 108 6,0 x 108 9,5 x 108

Réplica 2 Absorbancia 0,5492 0,6012 0,6089 0,6993 0,6123 0,5542 Recuento 5,5 x 108 5,5 x 108 5,5 x 108 8,5 x 108 5,5 x 108 8,5 x 108

Réplica 3 Absorbancia 0,5489 0,6137 0,4567 0,6098 0,4901 0,4558 Recuento 6,5 x 108 7,5 x 108 6,0 x 108 8,0 x 108 5,5 x 108 8,0 x 108

Réplica 4 Absorbancia 0,4889 0,4198 0,5954 0,621 0,4072 0,4873

165

0123456789

10

List

eria

E.co

li

L. p

lant

arum

L. p

arac

asei

log 1

0 U

FC/m

L

0

0,5

1

1,5

2

2,5

OD

540

log10 UFc/mL OD

Los resultados también evidencian que las BAL presentan valores de absorbancia más altos

que los patógenos E. coli y L. monocytogenes a concentraciones similares. La lectura de un

inóculo de E. coli al alcanzar concentraciones de 12,8 x 108 UFC/mL presentó una OD540 de

0,7826, mientras que la de un inóculo de L. paracasei al alcanzar concentraciones similares (de

12,5 x 108 UFC/mL) presentó una absorbancia mucho más alta (2,0615). Estas diferencias entre

absorbancias y recuentos pueden relacionarse a las diferencias existentes entre las cuatro

cepas evaluadas en cuanto características de crecimiento (como variaciones morfológicas y

estado fisiológico), o a cambios en la composición del medio originado por el metabolismo característico de cada cepa.

En la Tabla 30 se presentan los resultados obtenidos a partir de las curvas de crecimiento

fraccionadas y las curvas continuas desarrolladas para validar la sincronización de cultivos a

través del tiempo. Los recuentos bacterianos (log10 UFC/mL) obtenidos para L. plantarum, L.

paracasei, E. coli y L. monocytogenes durante 34 horas de crecimiento se sometieron a un

ANOVA para determinar la validez del uso de curvas de crecimiento fragmentadas a partir de

cultivos sincronizados.

Figura 63. Relación entre el recuento celular y la densidad óptica (OD540) de cultiv os de L. plantarum, L. paracasei, E. coli y L. monocytogenes en MRS a 37°C.

166

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R40 2,845 2,699 2,778 2,903 2,699 2,602 3,0002 3,462 3,477 3,491 3,505 3,477 3,398 3,6814 3,929 3,875 3,903 3,929 3,875 3,875 4,0416 4,699 4,602 4,653 4,699 4,602 4,653 4,8138 5,398 5,477 5,301 5,398 5,301 5,301 5,60210 5,875 5,903 5,813 5,875 5,903 5,778 6,02113 6,301 6,290 6,301 6,398 6,301 6,301 6,47715 6,778 6,740 6,699 6,778 6,699 6,602 6,92917 7,097 7,061 7,041 7,114 7,079 7,041 7,30119 7,477 7,544 7,301 7,544 7,544 7,398 7,81321 7,903 7,845 7,813 7,875 7,845 7,778 8,06123 8,477 8,398 8,301 8,398 8,398 8,176 8,69924 8,740 8,653 8,602 8,699 8,653 8,544 8,84526 8,740 8,845 8,699 8,740 8,813 8,699 8,92928 8,875 8,845 8,778 8,875 8,845 8,778 9,00030 8,778 8,813 8,699 8,778 8,813 8,602 8,90332 8,699 8,740 8,602 8,602 8,544 8,544 8,87534 8,653 8,699 8,602 8,653 8,602 8,602 8,778

b. Escherichia coli

Tiempo (h)Curvas continuas Log 10 (UFC/mL) Curvas sincronizadas Log 10 (UFC/mL)

Tabla 30. Resultado de los recuentos en placa para la validación estadística de las curvas de crecimiento bacteriano a partir de cultiv os sincronizados. Recuentos (log10 UFC/mL) obtenidos de L. plantarum (a), E. coli (b), L. paracasei (c) y L. monocytogenes (d) en agar MRS a 37ºC por 34 horas.

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R40 2,623 2,602 2,580 2,623 2,591 2,613 2,6722 3,041 3,000 3,146 3,079 3,000 3,146 3,0414 3,362 3,279 3,322 3,362 3,255 3,342 3,3426 3,978 3,954 3,845 3,778 3,740 3,778 3,6538 4,740 4,778 4,875 4,699 4,778 4,903 4,90310 5,398 5,301 5,477 5,301 5,301 5,398 5,54413 5,903 5,875 5,978 5,813 5,875 5,778 5,92915 6,544 6,398 6,477 6,398 6,398 6,477 6,47717 6,929 6,903 6,929 6,903 6,903 6,929 6,92919 7,929 7,978 7,903 7,954 7,978 7,929 8,02121 8,477 8,477 8,301 8,477 8,398 8,398 8,39823 8,954 8,978 9,000 8,954 8,978 9,000 8,97824 9,041 9,079 9,079 9,041 9,079 9,097 9,06126 9,061 9,097 9,061 9,146 9,097 9,130 9,39828 9,021 9,041 9,000 9,097 9,079 9,097 9,04130 9,021 8,929 9,000 9,021 9,000 9,000 8,84532 8,978 8,954 8,929 8,778 8,740 8,813 8,69934 8,929 8,954 8,903 8,813 8,778 8,740 8,778

a. Lactobacillus plantarum Curvas continuas Log 10 (UFC/mL)

Tiempo (h)Curvas sincronizadas Log 10 (UFC/mL)

167

El ANOVA no mostró diferencia signif icativa (Anexo 8), lo cual comprueba que la metodología

empleada en la realización de curvas de crecimiento a partir de cult ivos sincronizados es

adecuada y valida para el trabajo de modelación, pues no genera mayor variabilidad en las

concentraciones microbianas alcanzadas versus las obtenidas al realizar una evaluación

continua y de manera in- interrumpida.

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R40 2,699 2,903 2,778 3,000 2,903 2,778 2,6022 3,613 3,602 3,591 3,681 3,505 3,477 3,3984 4,041 4,041 3,954 4,041 3,929 3,954 3,8756 4,813 4,740 4,740 4,813 4,699 4,699 4,6538 5,602 5,398 5,544 5,602 5,398 5,477 5,30110 6,000 5,978 5,929 6,021 5,875 5,929 5,77813 6,544 6,477 6,602 6,477 6,398 6,398 6,30115 6,903 6,778 6,875 6,929 6,778 6,845 6,60217 7,301 7,176 7,176 7,301 7,114 7,097 7,04119 7,778 7,602 7,699 7,813 7,544 7,602 7,39821 8,061 7,929 7,978 8,061 7,875 8,000 7,77823 8,653 8,477 8,602 8,699 8,398 8,602 8,17624 9,079 9,097 9,097 9,130 9,097 9,097 9,11426 9,190 9,204 9,190 9,176 9,204 9,176 9,21728 9,146 9,176 9,161 9,161 9,190 9,161 9,17630 9,146 9,176 9,176 9,146 9,176 9,190 9,19032 9,161 9,190 9,161 9,176 9,190 9,146 9,16134 9,130 9,161 9,146 9,130 9,176 9,146 9,204

c. Lactobacillus paracasei

Tiempo (h)Curvas continuas Log 10 (UFC/mL) Curvas sincronizadas Log 10 (UFC/mL)

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R40 2,041 2,146 2,204 2,041 2,146 2,079 2,0792 2,114 2,176 2,230 2,114 2,176 2,204 2,1764 2,204 2,301 2,279 2,204 2,279 2,255 2,2556 2,740 2,699 2,653 2,602 2,740 2,653 2,4778 3,740 3,778 3,813 3,778 3,699 3,813 3,81310 4,699 4,602 4,544 4,740 4,602 4,398 4,60213 5,021 5,000 4,978 4,954 5,000 4,929 4,92915 5,398 5,267 5,279 5,130 5,267 5,290 5,11417 5,903 6,000 5,954 5,954 6,000 5,978 5,95419 6,544 6,477 6,653 6,398 6,477 6,653 6,47721 7,041 7,061 7,061 7,079 7,061 7,061 7,04123 7,653 7,740 7,813 7,653 7,699 7,813 7,60224 8,699 8,845 8,778 8,813 8,653 8,778 8,74026 8,903 8,875 8,929 8,845 8,875 8,813 8,81328 9,041 8,954 8,978 9,176 8,954 8,978 8,97830 8,978 8,875 8,903 8,929 8,845 8,903 8,92932 8,929 8,875 8,954 8,903 8,875 8,954 8,90334 8,903 8,929 8,845 8,875 8,813 8,845 8,845

d. Listeria monocytogenes

Tiempo (h)Curvas continuas Log 10 (UFC/mL) Curvas sincronizadas Log 10 (UFC/mL)

168

ANEXO 6

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO MODIFICADO DE RECUENTO EN PLACA

ANOVA Evaluación entre métodos:

METODOS F Sig. Estándar versus modificado 0,027 0,869 Evaluación entre microorganismos:

CULTIVO F Sig. L. plantarum individual 0,015 0,902 L. paracasei individual 0,002 0,962 E. coli individual 0,038 0,848 L. monocytogenes individual 0,012 0,914 Evaluación entre diluciones:

DILUCIONES F Sig. L. plantarum Dilución A 4,187 0,087 L. plantarum Dilución B 3,896 0,096 L. plantarum Dilución C 7,534 0,034 L. plantarum Dilución D 0,988 0,359 L. paracasei Dilución A 1,317 0,295 L. paracasei Dilución B 0,974 0,362 L. paracasei Dilución C 6,339 0,045 L. paracasei Dilución D 0,449 0,528 E. coli Dilución A 4,024 0,092 E. coli Dilución B 0,000 1,000 E. coli Dilución C 6,856 0,040 E. coli Dilución D 9,052 0,024 L. monocytogenes Dilución A 2,442 0,169 L. monocytogenes Dilución B 0,466 0,520 L. monocytogenes Dilución C 3,429 0,114 L. monocytogenes Dilución D 0,140 0,722

169

ANEXO 7

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA ESTANDARIZACIÓN DE INÓCULOS

ANOVA

PROCEDIMIENTO 1 F Sig. L. plantarum individual 1,082 0,338 L. paracasei individual 1,000 0,356 E. coli individual 0,222 0,654 L. monocytogenes individual 1,043 0,346

PROCEDIMIENTO 2 F Sig. L. plantarum individual 1,635 0,248 L. paracasei individual 3,769 0,1 E. coli individual 5,165 0,063 L. monocytogenes individual 85,714 0,000

PROCEDIMIENTO 3 F Sig. L. plantarum individual 0,559 0,483 L. paracasei individual 1,010 0,354 E. coli individual 1,029 0,350 L. monocytogenes individual 51,194 0,000

170

ANEXO 8

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA VALIDACIÓN DE CULTIVOS SINCRONIZADOS

ANOVA Comparación entre concentraciones celulares (log10 UFC/mL) de cultivos sincronizados versus continuos

CULTIVO F Sig. L. plantarum 0,003 0,958 L. paracasei 0,014 0,905 E. coli 0,009 0,926 L. monocytogenes 0,004 0,949

171

ANEXO 9

COMPARACIÓN ESTADÍSTICA DE LA BONDAD DE AJUSTE DEL MODELO DE

GOMPERTZ MODIFICADO VERSUS LA DEL MODELO DE BARANYI

Prueba de T para dos muestras de varianzas iguales

Coeficientes de determinación para modelos ajustados a curvas de crecimiento individual

CULTIVO T Sig. L. plantarum 4,445 0,002 L. paracasei 3,767 0,004 E. coli 6,762 0,000 L. monocytogenes 2,745 0,001

172

ANEXO 10

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE TASAS DE CRECIMIENTO

ANOVA Cultivos individuales versus individuales

MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. paracasei individual 51,251 0,000 E. coli indiv idual 51,251 0,000 L. plantarum indiv idual L. monocytogenes indiv idual 51,251 0,894 L. plantarum indiv idual 51,251 0,000 E. coli indiv idual 51,251 1,000 L. paracasei individual L. monocytogenes indiv idual 51,251 0,000 L. plantarum indiv idual 51,251 0,000 L. paracasei individual 51,251 1,000 E. coli indiv idual L. monocytogenes indiv idual 51,251 0,000 L. plantarum indiv idual 51,251 0,894 L. paracasei individual 51,251 0,000

MRS

L. monocytogenes indiv idual E. coli indiv idual 51,251 0,000 L. paracasei individual 218,482 0,000 E. coli indiv idual 218,482 0,000 L. plantarum indiv idual L. monocytogenes indiv idual 218,482 0,000 L. plantarum indiv idual 218,482 0,000 E. coli indiv idual 218,482 0,034 L. paracasei individual L. monocytogenes indiv idual 218,482 0,001 L. plantarum indiv idual 218,482 0,000 L. paracasei individual 218,482 0,034 E. coli indiv idual L. monocytogenes indiv idual 218,482 0,000 L. plantarum indiv idual 218,482 0,000 L. paracasei individual 218,482 0,001

Leche entera UHT

L. monocytogenes indiv idual E. coli indiv idual 218,482 0,000

173

Cultivos individuales versus mixtos

MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,039 0,977 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,039 0,965 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,840 0,862 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,840 0,688 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 247,782 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 247,782 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 163,694 0,000

MRS

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 163,694 0,000 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 1,317 0,295 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 1,317 0,362 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,222 0,654 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,222 0,346 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 610,276 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 610,276 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 157,375 0,000

Leche entera UHT

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 157,375 0,000

174

ANEXO 11

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE FASES LAG

ANOVA Cultivos individuales versus individuales

MEDIO CULTIVO VERSUS F Sig. L. paracasei individual 12,037 0,492 E. coli indiv idual 12,037 0,492 L. plantarum indiv idual L. monocytogenes indiv idual 12,037 0,070 L. plantarum indiv idual 12,037 0,492 E. coli indiv idual 12,037 1,000 L. paracasei individual L. monocytogenes indiv idual 12,037 0,000 L. plantarum indiv idual 12,037 0,492 L. paracasei individual 12,037 1,000 E. coli indiv idual L. monocytogenes indiv idual 12,037 0,000 L. plantarum indiv idual 12,037 0,070 L. paracasei individual 12,037 0,000

MRS

L. monocytogenes indiv idual E. coli indiv idual 12,037 0,000 L. paracasei individual 15,898 0,001 E. coli indiv idual 15,898 0,001 L. plantarum indiv idual L. monocytogenes indiv idual 15,898 0,001 L. plantarum indiv idual 15,898 0,001 E. coli indiv idual 15,898 1,000 L. paracasei individual L. monocytogenes indiv idual 15,898 1,000 L. plantarum indiv idual 15,898 0,001 L. paracasei individual 15,898 1,000 E. coli indiv idual L. monocytogenes indiv idual 15,898 1,000 L. plantarum indiv idual 15,898 0,001 L. paracasei individual 15,898 1,000

Leche entera UHT

L. monocytogenes indiv idual E. coli indiv idual 15,898 1,000

175

Cultivos individuales versus mixtos

MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,138 0,977 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,138 0,965 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,941 0,862 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,941 0,688 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 0,788 0,367 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 0,789 0,199 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 63,690 0,092

MRS

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 63,690 0,000 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 1,816 0,295 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 1,816 0,367 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,222 0,654 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,222 0,346 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 610,276 0,230 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 610,276 0,224 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 55,372 0,103

Leche entera UHT

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 55,372 0,000

176

ANEXO 12

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL

(log10 UFC/mL)

ANOVA Cultivos individuales versus mixtos

MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,769 0,527 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,769 0,631 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,387 0,677 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,387 0,971 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 0,089 0,998 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 0,089 0,922 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 0,049 0,954

MRS

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 0,049 0,968 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,039 0,967 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,039 0,970 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,236 0,953 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,236 0,973 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 1,311 0,495 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 1,311 0,339 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 16,422 0,294

Leche entera UHT

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 16,422 0,231

177

ANEXO 13

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA MÁXIMA CONCENTRACIÓN

ALCANZADA (log10 UFC/mL)

ANOVA Cultivos individuales versus mixtos

MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 5,782 0,134 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 5,782 0,114 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,235 0,841 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,235 0,994 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 2146,766 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 2146,766 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 40212,49 0,000

MRS

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 40212,49 0,000 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 1,317 0,295 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 1,317 0,362 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,225 0,654 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,225 0,346 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 14968,74 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 14968,74 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 68171,167 0,000

Leche entera UHT

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 68171,167 0,000

178

ANEXO 14

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL pH

ANOVA Comparación pH total de cultivos indiv iduales versus mixtos

MEDIO CULTIVO Versus F Sig. L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 0,135 0,917 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 0,135 0,960 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,841 0,812 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,841 0,609 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 47,782 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 47,782 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 13,699 0,000

MRS

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 13,699 0,000 L. plantarum indiv idual L. plantarum con E. coli 1,317 0,225 L. plantarum indiv idual L. plantarum con L. monocytogenes 1,317 0,162 L. paracasei individual L. paracasei con E.coli 0,222 0,554 L. paracasei individual L. paracasei con L. monocytogenes 0,222 0,646 E. coli indiv idual E. coli con L. plantarum 10,278 0,000 E. coli indiv idual E. coli con L. paracasei 10,278 0,000 L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. plantarum 17,376 0,000

Leche entera UHT

L. monocytogenes indiv idual L. monocytogenes con L. paracasei 17,376 0,000

179

ANEXO 15

VALIDACIÓN ESTADÍSTICA EN LECHE ENTERA UHT DEL MODELO GENERADO

EN CALDO MRS ANOVA Comparación del log10 UFC/mL predicho en MRS versus log10 UFC/mL observado en leche entera UHT.

CULTIVO F Sig. L. plantarum individual 0,160 0,691 L. plantarum con E. coli 0,000 0,990 L. plantarum con L. monocytogenes 0,002 0,999 L. paracasei individual 0,493 0,487 L. paracasei con E.coli 0,004 0,994 L. paracasei con L. monocytogenes 0,001 0,969 E. coli individual 0,275 0,603 E. coli con L. plantarum 0,002 0,963 E. coli con L. paracasei 0,066 0,798 L. monocytogenes individual 1,278 0,266 L. monocytogenes con L. plantarum 0,002 0,999 L. monocytogenes con L. paracasei 0,002 0,960

180

ANEXO 16

VALIDACIÓN ESTADÍSTICA DE LA ECUACIÓN POLINOMIAL DE TERCER GRADO

PARA MODELACIÓN ANOVA Ajuste de las Ecuaciones Polinomiales a los datos experimentales

Lineal Cuadrática Cúbica MEDIO

CULTIVO F Sig. F Sig. F Sig.

L. plantarum con E. coli 9,515 0,003 152,573 0,000 794,989 0,000 L. plantarum con L. monocytogenes 8,505 0,005 159,955 0,000 833,612 0,000 L. paracasei con E.coli 15,407 0,000 104,007 0,000 473,650 0,000 L. paracasei con L. monocytogenes 6,755 0,012 120,055 0,000 608,891 0,000 E. coli con L. plantarum 67,243 0,000 206,683 0,000 768,822 0,000 E. coli con L. paracasei 13,295 0,001 72,790 0,000 148,274 0,000 L. monocytogenes con L. plantarum 68,604 0,000 126,037 0,000 690,998 0,000

MRS L. monocytogenes con L. paracasei 12,487 0,001 95,654 0,000 334,214 0,000 L. plantarum con E. coli 21,397 0,000 118,405 0,000 564,651 0,000 L. plantarum con L. monocytogenes 21,405 0,000 115,933 0,000 623,943 0,000 L. paracasei con E.coli 15,407 0,000 104,007 0,000 473,650 0,000 L. paracasei con L. monocytogenes 15,605 0,000 98,443 0,000 516,926 0,000 E. coli con L. plantarum 69,929 0,000 208,696 0,000 653,742 0,000 E. coli con L. paracasei 13,295 0,001 72,790 0,000 148,274 0,000 L. monocytogenes con L. plantarum 77,190 0,000 167,815 0,000 473,931 0,000

LECHE L. monocytogenes con L. paracasei 13,471 0,001 91,220 0,000 312,284 0,000