Monografia Sobre Cromatografía

7/24/2019 Monografia Sobre Cromatografa

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AGRADECIMIENTO

Esta monografa se empez a realizar en julio del2008 y se culmin en agosto del 2008. Durantetodo este tiempo fue necesario tener muchadedicacin y paciencia para la composicin,diagramacin y revisin de los contenidos, sinduda una tarea verdaderamente invalorale, por

lo !ue nos sentimos agradecidos de lacolaoracin de nuestros profesores"

#$%&'( )E*+DE- /E((E('

s mismos a todos !uienes contriuyeron dealguna u otra forma en la elaoracin de lamonografa, pero muy especialmente !uien

1gura en la lista de colaoradores.

DEDICATORIA


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Dedicamos este traajo anuestro profesor #ctor)el3ndez uerrero, poriniciarnos en lainvestigacin y por sergua en nuestras primerase4periencias acad3micasuniversitarias.

Dedicamos el traajo anuestros padres por!ue sonnuestros guas y luz para

alcanzar nuestros m5s grandesanhelos.

NDICE

$&('D/%%$677777777777777777777777..7..77777777777777 0%9:&/*' $" ;$


3/122

2. 9remio el77.77..7777777.77777.7...77777777777777

@. De1nicin777777777777777777777777777777777777

%9:&/*' $$" %*$%%$6 DE %(')&'(>: . %romatografa de reparto 77777777777777...7777777777777 8 2. %romatografa deadsorcin777777777777777777777777777. 2 @. %romatografa engel7777777777777777777777777777777. 2 . %romatografa en gel de capa1na77777777777777777777777.. @2 A. %romatografa de intercamioinico7777777777777777777777 @ B. %romatografa dea1nidad7777777777777777777777777777 2 ?. %romatografa depenetrailidad777777777777.................................. A0

8. %romatografa de interaccin hidrofica77777..7777777777777 AC

%9:&/*' $$$" )+&'D'< DE %(')&'(>: . %romatografaplana77777777777777777........................................B@

.. %romatografa en papel.... [email protected]. %romatografa de capa1na...................................................................B?

2. %romatografa encolumna..............................................................................? @. %romatografa degases7777777777777777777777777777..... 80 . %romatografa de l!uidos de alta resolucin;9*%......................................8A

%9:&/*' $#">/D)E&' &E'($%'7.7777777...........................7.77777777777777788

$)'(&%$ DE * %(')&'(>$7.

777777777777777777777777..7C0

9*$%%$'E< * *$


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9*$%%$'Eue desarrolla por )artin. &iene como soporte un papel de celulosa.

d!uiri una gran e4tensin por su sencillez y presenta la ventaja

de poder utilizar miligramos y microgramos, adem5s presenta la

opcin de utilizar tanto la t3cnica descendente en columna, etc...

como la t3cnica ascendente.

C)oma,o")a45a # %apa 9a

>ue originada por los traajos de los investigadores rusos $zmailov y


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Es una de las t3cnicas m5s utilizadas e importantes, de forma !ue

ha revolucionado el campo de la !umica analtica.


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!ue genera una seJal !ue puede depender de la concentraciny

del tipo de compuesto.

E 1>?@ Ts+#,, *#9': (a %)oma,o")a45a %omo

)3todo en el cual los componentes de una mezcla son separados

en una columna adsorente dentro de un sistema Luyente.

R#%'#,#m#,# (a I.U.P.A.C *#9# (a %)oma,o")a45a *# 4o)ma

mBs amp('a %omo

)3todo usado principalmente para la separacin de los

componentes de una muestra, en el cual los componentes son

distriuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria,

mientras !ue la otra es mvil. *a fase estacionaria puede ser un

slido o un l!uido soportado en un slido o en un gel matriz.

*a fase estacionaria puede ser empa!uetada en una columna,

e4tendida en una capa, distriuida como una pelcula, etc.


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S#" -#!(#mas ha *#9'*o (a %)oma,o")a45a %omo

/n m3todo fsico de separacin en el cual los componentes a

separar se distriuyen entre dos fases, una de las cuales constituye

la fase estacionaria, de gran 5rea super1cial, y la otra es un Luido

fase mvil !ue pasa a trav3s o a lo largo de la fase estacionaria.

*a fase estacionaria puede ser un slido o un l!uido dispuesto

sore un slido !ue actKa como soporte, de gran 5rea super1cial.

*a fase mvil es un Luido puede ser gas, l!uido o Luido

supercrtico !ue se usa como portador de la mezcla.

En la cromatografa ocurren dos fenmenos muy importantes y !ue

son pr5cticamente los rectores del proceso de separacin" la

adsorcin y la asorcin.

*a adsorcin es la retencin de una especie !umica en los sitios

activos de la super1cie de un slido, !uedando delimitado el

fenmeno a la super1cie !ue separa las fases o super1cie

interfacial.

Esta retencin super1cial puede ser fsica o !umica. *a adsorcin

depende de la naturaleza de la sustancia adsorida, de la

temperatura, de la naturaleza y estado de sudivisin del

adsorente, y de la concentracin.

*a asorcin es la retencin de una especie !umica por parte de

una masa y depende de la tendencia !ue tiene 3sta a formar

mezcla o reaccionar !umicamente con la misma.

8


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C


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CAPITULOII

CLASIFICACIN DE CROMATOGRAFIA

9ara clasi1car gloalmente los procesos cromatogr51cos es

necesario atender a dos criterios 5sicos"

>undamento del proceso cromatogr51co, lo !ue conduce a los

tipos de cromatografas.

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ciones ponen d3 mani1esto !ue en un caso ideal en el !ue la

distriucin venga Knicamente determinada por el reparto, la

resolucin de dos sustancias mejorar5 con el aumento de la

longitud de la fase estacionaria.

1.1 Ejemplos de cromatografa de reparto

*os dos tipos de cromatografa de reparto m5s corrientes son la

cromatografa en papel y la de capa 1na. En los dos casos la matriz

contiene un l!uido, en la cromatografa en papel se trata de las

mol3culas de agua unidas a la celulosa y en la cromatografa de

capa 1na el l!uido unido al soporte es el disolvente utilizado para

formar la capa 1na v3anse las p5ginas CANCC. Estas t3cnicas a

veces se consideran como tipos de cromatografa de adsorcin,

por!ue los efectos de adsorcin entran dentro de la consideracin

de separacinI sin emargo, el principal tipo de accin !ue tiene

lugar es el reparto.

*a cromatografa de reparto tami3n puede realizarse en columnas,

utilizando una matriz !ue no adsora los solutos. *os materiales de

soporte m5s corrientes son la tierra de diatomeas p. e., %elita, el

gel de slice, la celulosa en polvo y algunos de4tranos !ue forman

tramas p. e.,


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*a cromatografa de reparto se utiliza, sore todo, para mol3culas

de ajo pesoN molecular. 9ara reducir la e4tensin por difusin es

decir, el ensanchamiento de los picos, son necesarias zonas de

iniciacin muy pe!ueJas y una separacin r5pida. En los apartados

!ue tratan de cromatografa en papel y en capa 1na, se descriir5

con detalle cmo se realizan estos procesos.


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se une no es una fraccin constante, sino !ue disminuye a medida

!ue disminuye la concentracin. *a velocidad con !ue se mueve la

sustancia est5 relacionada con la fuerza de unin, siendo m5s lento

el movimiento cuanto m5s 1rme es la unin. En consecuencia, las

mol3culas pueden separarse si tienen isolneas de adsorcin

diferentes, deido a !ue sufriran un grado diferente de retraso.

&ala . )ateriales de uso corriente en la cromatografa de

adsorcin.

)aterial


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separados se encuentran e identi1can titulando alcuotas de cada

fraccin ^haciendo mediciones espectroscpicas, prueas

!umicas, radiactividad, etc. En los casos en !ue el an5lisis se

realiza midiendo la asorcin de la luz, se utiliza un

espectrofotmetro de registro continuo. *a muestra pasaO 5 trav3s

de un tuo antes del fraccionamiento, se mide la asorancia en la

longitud de onda apropiada y se representan los valores en un

registrador gr51co de forma continua.

*as columnas pueden ser eluidas de tres formas" el m3todo m5s

sencillo consiste en un Lujo continuo del disolvente a trav3s de la

columna. Este m3todo es de uso corriente en la cromatografa de

intercamio inico y en la cromatografa en gel.

*a elucin por pasos se utiliza, en general, cuando la columna

funciona con propsitos preparativos. *a columna es eluida con un

disolvente hasta !ue se alcanza un volumen previamente

determinado. continuacin se aJade un segundo disolvente. Este

m3todo tiene la ventaja de !ue se pueden disponer las condiciones

de forma !ue un material concreto pueda eluirse en un volumen

astante pe!ueJo. %onsid3rese, por ejemplo, una mezcla de

sustancias en la !ue la sustancia F sufre un fuerte retardo cuando

se emplea el disolvente , mientras !ue las dem5s sustancias

e4perimentan un retraso muy pe!ueJoI adem5s F e4perimenta Oun

retraso muy d3il con el disolvente G. 9or lo tanto, si se lava la

columna con un e4ceso de disolvente , la mayor parte del material

es eluido de la columna, mientras !ue la mayor parte de F

permanece unido a ella.


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se preparan por medio de aparatos del tipo !ue se muestra en la

1gura 8NA. Estos aparatos constan de dos recipientes, un depsito y

una c5mara de mezcla, !ue est5n conectados por sus ases. El

depsito contiene el disolvente m5s concentrado. El l!uido sale de

la c5mara de mezcla y entra en la columna. %omo los niveles

hidrost5ticos deen corresponderse las alturas de los l!uidos no

tienen !ue ser necesariamente iguales, por!ue las densidades de

los l!uidos en amos recipientes puede variar, el li!uido Luye

simult5neamente del depsito a la c5mara de mezcla.


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9or lo tanto, las mol3culas son eluidas de la columna por orden de

tamaJos decrecientes, o, si la forma es relativamente constante

por ejemplo, gloular o cilndrica, por orden de pesos moleculares

decrecientes.

En un an5lisis detallado de la cromatografa en gel, !ueda claro !ue

este efecto est3rico, aun!ue es el principal factor, no e4plica por si

slo el comportamiento cromatogr51co de todas las mol3culas.

'tro factor importante es la carga de la mol3cula, aun!ue 3sta se

mani1esta slo en condiciones de aja fuerza inica, en las !ue las

mol3culas pe!ueJas, fuertemente cargadas, parecen !uedar

e4cluidas de los poros, independientemente de !ue su tamaJo sea

lo su1ciente pe!ueJo. Este efecto se dee, con proailidad, a la

repulsin electrost5tica entre las mol3culas, !ue limita el nKmero

de mol3culas en un poro en cual!uier momento dado. %uando la

fuerza inica es muy pe!ueJa, tami3n parecen e4istir efectos de

adsorcin, al menos en apariencia y en algunos tipos de geles.

3.1 Materiales para la cromatografa en gel

/n gel es un retculo tridimensional cuya estructura se dispone, por

lo general, al azar. *os geles !ue se utilizan como tamices

moleculares constan de polmeros entrecruzados, por lo general,

inertes, !ue no se unen ni reaccionan con el material analizado y

!ue no presentan carga el3ctrica. El espacio del interior del gel est5

ocupado por un l!uido !ue rellena la mayor parte del gel.

*os geles de uso corriente son de tres tipos" de4trano, agarosa y

poliacrilamida.


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recie el nomre de hinchazn. El de4trano se otiene

comercialmente con el nomre de ine

%hemicals, $nc..

*a agarosa !ue se otiene de ciertas algas marinas es un

polmero lineal de DNgalactosa y @,BNanhidroNNgalactosa y forma un

gel !ue se mantiene compacto sin necesidad de

entrecruzamientos, por medio de puentes de hidrogeno.


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*os geles descritos hasta el momento se dilatan en agua y en unos

pocos disolventes org5nicos" glicol, formamida y dimetiisulf4ido.

o sufren hinchazn en alcohol puro, hidrocaruros y la mayora de

los disolventes org5nicos, tanto polares como no polares. o

ostante, sustancias como lpidos, esferoides y algunas vitaminas,

se manejan con mayor facilidad en estos disolventes.


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. Deido a !ue el comportamiento cromatogr51co de casi todas

las sustancias en los geles es independiente de la temperatura, p;,

fuerza inica y composicin de los lampones, se pueden realizar

separaciones pr5cticamente ajo cual!uier condicin. %uando se

traaja con materiales muy l5iles p. e., enzimas esto signi1ca

!ue pueden mantenerse las condiciones para una estailidad

m54ima.

2. )uchas sustancias l5iles no resultan afectadas por la

cromatografa en gel, puesto !ue no hay pr5cticamente adsorcin.

9or ejemplo, algunos enzimas resultan inactivados o alterados por

la unin a super1cies adsorentes o resinas de intercamio inico.

@. E4iste menos dispersin de las andas !ue con otras t3cnicas

cromatoNgr51cas por razones !ue no est5n claras.

. El volumen de elucin se relaciona de forma sencilla con el peso

molecular.

&ala 2.

)ateriales de uso corriente en la cromatografa en gel.

)aterial y nomre

comercial

)argen de

fraccionamiento peso

molecular

De4trano


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GioNgel 9N@00 B0 000 00 000garosa


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dar como resultado la p3rdida de las muestras inestales. o

ostante, la cromatografa en gel proporciona un camino r5pido

para realizar este proceso. 9or ejemplo, las sales y las mol3culas

pe!ueJas pueden eliminarse con rapidez deido a !ue resultan

retrasadas en todos los geles. El intercamio de tampones puede

realizarse haciendo pasar una disolucin de macromol3culas a

trav3s de una columna e!uilirada previamente con el tampn

deseado. %omo las macromol3culas se mueven con m5s facilidad a

trav3s del gel !ue los componentes del tampn original, podr5n ser

eluidas en el tampn en el !u3 se ha e!uilirado el gel. *a

concentracin de macromol3culas se logra con facilidad aJadiendo

partculas secas de gel y utilizando un tipo cuyo tamaJo de poro

sea menor !ue el de las mol3culas con la !ue se est3 traajando.

medida !ue se hinchan los gr5nulos, asoren el agua pero no las

macromol3culas, concentr5ndose 3stas Kltimas. *a mayor parte de

los m3todos de concentracin de macromol3culas presenta el

prolema de !ue tami3n concentran las sales y una concentracin

e4cesiva de sales puede alterar e incluso disociar y desnaturalizar

algunas macromol3culas. Este prolema no e4iste si se utilizan

geles !ue asoran el agua y las sales.

continuacin se descrien algunos ejemplos espec1cos de

cromatografa en traajos preparativos"

. En la sntesis !umica de algunos reactivos es necesario, en

general, separar el producto de las sustancias iniciales. 9or

ejemplo, cuando se preparan anticuerpos Luorescentes haciendo

reaccionar los anticuerpos con isotiocianuro de Luorescena, la

protena conjugada dee separarse del colorante !ue no ha

reaccionado. Esto puede realizarse con


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2. En la titulacin de enzimas o en la determinacin de los

re!uerimientos de cofactores, la preparacin de enzimas contiene a

veces inhiidores de pe!ueJo tamaJo molecular o los mismos

cofactores. &ami3n en los estudios fsicos de algunas mol3culas p.

e., en la espectroscopia de Luorescencia pueden estar presentes

sustancias de interferencia. Estas mol3culas pe!ueJas pueden

eliminarse con facilidad utilizando geles de de4trano o de

poliacrilamida.

@. De forma similar, pueden e4istir contaminantes de gran tamaJo

molecular en mezclas en las !ue est5n analizando mol3culas

pe!ueJas. En estos casos pueden utilizarse de4tranos de poro

pe!ueJo. &ami3n en ocasiones deen separarse 5cidos nucleicos

de protenasI esto puede hacerse algunas veces mediante el

empleo de geles de agarosa, !ue impiden el paso a las protenas y

permiten el paso a los 5cidos nucleicos por el volumen vaco.

. En la mayora de los an5lisis fsicos de 5cidos nucleicos, la

muestra dee estar lire de protenas. Esto puede hacerse con

facilidad. /n ejemplo de inter3s en mi propio laoratorio es la

preparacin de D a partir de e4tractos celulares en crudo, para

el an5lisis con el microscopio electrnico, utilizando la t3cnica del

citocromo c de Hleinschmidt v3ase el captulo @.


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dem5s. El paso en el !ue tiene lugar la separacin por tamaJos

utiliza, casi invarialemente, la cromatografa en gel.

*a cromatografa en gel es tami3n un valioso instrumento

analtico. *a determinacin de pesos moleculares !ue se ha citado

anteriormenteO es un ejemplo importante. 'tros ejemplos son"

. En el estudio del metaolismo del (, algunas fracciones del

( se distinguen, en general, por centrifugacin zonal, o aKn

mejor, por electroforesis en geles de poliacrilamida. *a

cromatografa en gel de agarosa es tami3n muy utilizada. En la

1gura 8N20 se muestra un ejemplo.

2. *as fracciones proteicas del plasma deen ser, a menudo,

determinadas cuantitativamente paraN el diagnstico de algunas

enfermedades humanas. 9uede hacerse directamente en geles de

de4trano y se ha desarrollado como una pruea de utilidad en la

macrogloulinemia e hipergioulinemia.

@. El intercamio de tritio para el e4amen de la estructura de la

protena o el D, re!uiere !ue la macromol3cula sea separada con

rapidez del @;2'. Esto puede hacerse en unos 0 segundos

utilizando geles cargados, deido a !ue el @;2' sufre grandes

retrasos en todos los geles.


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. CROMATOGRFIA EN GEL DE CAPA FINA

*a cromatografa en capa 1na tiene las ventajas de una r5pida

separacin, el empleo de un e!uipo sencillo y una f5cil elucinI

como m3todo analtico, est5 reemplazando a la cromatografa en

papel. *a cromatografa en gel de capa 1na &*, _thinNlayer gel`

ofrece las mismas ventajas, adem5s de todas a!uellas

proporcionadas por la utilizacin de geles.

*a cromatografa en gel de capa 1na es similar a la cromatografa

en capa 1na, en la !ue se e4tiende una 1na capa de material sore

una placa de vidrio, se coloca una gota de la muestra y una fase

mvil atraviesa la capa 1na.


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)ientras !ue la cromatografa en capa 1na se utiliza, sore todo,

con amino5cidos, azKcares, oligosac5ridos, lpidos, esferoides y

otras mol3culas pe!ueJas, la cromatografa en gel de capa 1na se

aplica a protenas, p3ptidos, 5cidos nucleicos, nucletidos y otras

sustancias hidroflicas de gran tamaJo.

El principal uso de la cromatografa en gel de capa 1na se

encuentra en la determinacin de los pesos moleculares de

protenas y p3ptidos.


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la primera, las sustancias a separar se unen al intercamiador

utilizando condiciones !ue originan una unin fuerte y estaleI a

continuacin, se eluye la columna con tampones de diferente p; o

diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del tampn

con el material, por los sitios de unin.

*.1 #ropiedades de los intercam+iadores inicos

/n intercamiador inico es, por lo general, un retculo

tridimensional o matriz !ue tiene grupos cargados unidos.


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importante deido a !ue, si se e4cede en su capacidad, los iones

pasar5n a trav3s de la columna sin unirse.

&ala @

9ropiedades de algunos intercamiadores inicos.

)atriz

$ntercamiad

ork

rupo funcional omre

comercialDe4trano >%

D%

>

D


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de4

%elulosa

%

%

%aro4imetilo

>osfo

Dietilaminoetilo

9oliletilenimina

Dietilaminoetilo,

enzoiladoN

naftolilado

%)Ncelulosa

9Ncel

DEEN

celulosa

9E$N celulosa

DEE GDN

celulosa

9G

celulosaEstirenoN

divinilNenceno

>% cido sulfnico A0

crlica D% %aro4lico GioN(e4 ?0>enlica >% cido sulfnico Gio (e4 0Epo4iamina D mino terciario N@

La capacidad aprovechablees la capacidad ajo unas condiciones

e4perimentales determinadas es decir, p;, fuerza inica. 9or

ejemplo, la e4tensin con la !ue un intercamiador inico est5

cargado depende del p; el efecto del p; es menor con los

intercamiadores inicos fuertes. 'tro factor es la fuerza inica,

deido a !ue los iones pe!ueJos situados cerca de los grupos

cargados compiten con las mol3culas de la muestra por estos

grupos. Esta competicin es astante e1caz si la muestra es una

macromol3cula, deido a !ue el elevado coe1ciente de difusin del

ion implica un mayor nKmero de encuentros. 9or lo tanto, conforme

aumenta la concentracin del lampn, la competicin se hace, m5s

intensa.

La porosidadde la matriz es una caracterstica importante, deido

a !ue los grupos cargados se encuentran dentro y fuera de la

matriz. *as mol3culas mayores pueden ser incapaces de penetrar

en los poros, de forma !ue la capacidad disminuye segKn

aumentan las dimensiones moleculares. *a porosidad de las resinas

asadas en el poliestireno se determina por la cantidad de

2


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entrecruzamientos producidos por el divinilenceno la porosidad

disminuye segKn aumenta la cantidad de divinilenceno. %on las

series DoXe4, el porcentaje de divinilenceno viene indicado por un

nKmero situado despu3s de una FI por lo tanto, DoXe4NA0NF8

signi1ca !ue contiene un 8 b de divinilenceno.

*os intercamiadores inicos vienen en distintos tamaJos de

partcula !ue recien el nomre de tamaJo de malla. *as mallas

m5s 1nas presentan una mayor relacin super1cieNvolumen y, por

lo tanto, aumentan la capacidad del intercamiador. 9or otra parte,

las mallas 1nas implican una velocidad de Lujo menor, con lo !ue

puede aumentar la e4tensin por difusin.

De entre tal conjunto de intercamiadores inicos con propiedades

tan diferentes ^carga, capacidad, porosidad, malla^ se puede

hacer la seleccin del m5s apropiado para realizar una separacin

particularmente difcil. En los siguientes apartados se descrie

cmo decidir el tipo de material de la columna y las condiciones

para la unin de los iones y la elucin de los mismos.

*.2 Eleccin del intercam+iador inico

*a primera eleccin !ue se dee hacer es si el intercamiador ser5

aninico o catinico.


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los intercamiadores no deparan la oportunidad de aparejar la

porosidad con el peso molecular.

*os intercamiadores de celulosa han proado ser los mejores para

la puri1cacin de mol3culas grandes como protenas, y

polinucletidos. Ello es deido a !ue la matriz es 1rosa, por lo !ue

todos los grupos funcionales se encuentran en la super1cie y

disponiles, incluso, para las mol3culas mayores.

*a seleccin del tamaJo de malla es di1cultosa. *os tamaJos de

malla pe!ueJos mejoran la resolucin pero disminuyen la velocidad

de Lujo, lo !ue incrementa la dispersin zonal y disminuye la

resolucin. 9or lo tanto, el tamaJo de malla se determina, por lo

general, de forma emprica.

*.( Eleccin del p/ tampn , condiciones inicas

Deido a !ue los lampones est5n formados por iones, tami3n

pueden intercamiar y como resultado puede afectarse el e!uilirio

del p;. 9ara evitar estos prolemas se adopta la llamada regla de

los tampones" se deen utilizar tampones catinicos con los

intercamiadores amnicos y tampones amnicos con los

intercamiadores catinicos. Deido a !ue la fuerza inica es un

factor a tener en cuenta para la unin, dee escogerse un tampn

con elevada capacidad de tamponacin, de modo !ue su fuerza

inica pueda ser lo su1cientemente aja. dem5s, para otener

una uena resolucin se ha encontrado !ue, por lo general, las

condiciones inicas utilizadas para colN car la muestra en la

columna las denominadas condiciones iniciales deen ser

apro4imadamente las mismas !ue las !ue se utilizan para la

elucin de la columna.

*.* E0uili+rio de intercam+io de iones

%ual!uier intercamiador de iones tendr5 sus grupos cargados

unidos electrost5ticamente a contratnos, de forma !ue el conjunto

sea el3ctricamente neutro. *os distintos intercamiadores pueden

A


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mostrar diferente a1nidad por unos contraiones u otros. s, un

conjunto de contraiones de uso frecuente en io!umica, ordenados

de mayor a menor a1nidad, para un intercamiador de aniones

gen3rico, es cfralo o4alato %lN formiato acetato ';N, o,

para un intercamiador de cationes gen3rico, %a2 )g2 H

; a ;. *os otros iones a tomar en cuenta en el

proceso de intercamio son los propios solutos de la mezcla 5

separar. *a mayor parte de las iomol3culas son de naturaleza

inica. *os grupos 5cidos desprotonados aportar5n carga negativa,

mientras !ue la protonacin de los 5sicos dar5 carga positiva. En

el caso particular de los iopolmeros, la presencia de varios grupos

funcional de uno u otro tipo, da cuenta de su car5cter de

polielectrlifos, por lo !ue se podr5n comportar como cationes o

como aniones, segKn !ue el p; del medio sea inferior o superior a

su p$, respectivamente.


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primera es !ue las variaciones del p; del medio !ue alteren la

carga del soluto, modi1car5n la posicin del e!uilirio anterior,

desplaz5ndolo a la derecha o a la iz!uierda segKn !ue ad!uiera

m5s o menos carga. 9or otra parte, dicho e!uilirio podr5 ser

desplazado en un sentido u otro segKn sea la concentracin de a

en el medio ley de accin de masas. s, si el valor de K fuese

muy elevado, el soluto < !uedar5 unido a la resina desplazando a

los iones a.


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intercamiador. En el lmite, cuando la fuerza inica sea muy

elevada, todos los solutos tendr5n fe ' e4clusin de la fase

estacionaria, por lo !ue no podr5n ser resueltos, pero, si se

emplean fuerzas inicas compatiles con la retencin, ser5 posile

resolver los distintos solutos sin m5s !ue ir modi1cando la fuerza

inica. En suma, !ue la elucin con fuerzas inicas programadas

elucin en gradiente, permite al e4perimentador un control 1no

de la resolucin. De hecho, se pueden separar iopolmeros con

muy pocas diferencias en su carga neta ej." resolucin de dos

protenas !ue di1eran slo en uno de sus amino5cidos ionizales.

*. plicaciones de la cromatografa de intercam+io inico

En principio, cual!uier sustancia cargada puede ser

cromatogra1ada con un intercamiador inico. *as resinas

intercamiadoras son las m5s Ktiles para las mol3culas org5nicas

pe!ueJas y pueden utilizarse incluso para separar iones met5licos

p. e., %a2de )g2. *as protenas y los polisac5ridos se separan

mejor con los intercamiadores da celulosa, de4trano y

poliacrilamida. *os intercamiadores de de4trano y poliacrilamida

se han utilizado tami3n e4tensamente en la separacin de

nucletidos, amino5cidos y otras mol3culas pe!ueJas de

importancia iolgica.

@. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

*a cromatografa de a1nidad es un tipo de cromatografa !ue

utiliza la a1nidad espec1ca entre la sustancia !ue dee aislarse y

una mol3cula a la !ue 3sta puede unirse de forma espec1ca un

ligando. El material de la columna se sintetiza por unin covalente

del ligando !ue puede ser una macromol3culas o una mol3cula

pe!ueJa con una matriz insolule. partir de este momento la

columna es capaz de adsorer de manera espec1ca, a partir de la

disolucin, la sustancia !ue va a ser aislada. *a elucin se realiza

8


49/122

camiando las condiciones, de forma !ue la unin ya no tenga

lugar.

9ara poder llevar a cao la cromatografa de a1nidad deen

comunicarse varias condiciones" la matriz no dee adsorer por

s misma mol3culas de forma signi1cativaI 2 el ligando dee

unirse a la matriz sin alteracin de sus propiedades de uninI @

dee escogerse un ligando cuya unin se fuerte, por!ue aun!ue

una unin d3il consiga retrasar la elucin puede no resultar

adecuada para la separacinI dee ser posile elucin la elucin

sin destruccin de la muestra. *a matriz m5s Ktil es la agasa

ine %hemicals, $nc., deido a !ue presenta

una adsorcin mnima, mantiene unas uenas propiedades de Lujo

despu3s del enlace !umico con el ligando y tolera los e4tremos de

p; y fuerza inica, as como el cloruro de guanidinio ?) y la urea,

!ue se necesitan a menudo para una elucin efectiva. Es posile

ad!uirir agarosa a la cual est3n unidos covalentemente reactivos

!ue puedan enlazar protenas, memranas y esteroidesI o

concavalina , un adsoreI !ue preparado para polisac5ridos y

glucoprotenas !ue contengan residuos TNDNmanosilo y aNDN

glucosilo p. e., memranas celulares y c3lulas enteras, lo cual es

una ayuda adicional.

El principal uso de la cromatografa de a1nidad hasta el momento

ha sido la puri1cacin de protenas, memranas y polisac5ridos.

continuacin se indican algunos ejemplos"

#uri)cacin de enimas:


50/122

#uri)cacin de anticuerpos


51/122

viajan en la fase mvil. En esos casos es conveniente !ue el ligando

no se ancle directamente, sino !ue !uede separado de la matriz

por un razo espaciador.


52/122

matrices para cromatografa de a1nidad, as como los tipos de

ligandos uniles a cada una de ellas.

El anclaje consiste 5sicamente en incuar, ajo agitacin suave, la

suspensin formada por la matriz activada y una disolucin del

ligando. esta suspensin se le aJade la carodiimida si se precisa

de un agente condensante. *as variales e4perimentales a

controlar son, p;, fuerza inica, temperatura y tiempo de

incuacinI

estas dos Kltimas suelen estar inversamente relacionadas ej." para

agarosa activada con %Gr, 2N horas a temperatura amiente o B

horas en c5mara fra a %.

Es imprescindile !ue en la unin covalente del ligando no !ueden

involucradas regiones de su mol3cula !ue sean cruciales para la

interaccin iolgica, o !ue, por encontrarse tan pr4imas al centro

de interaccin, dejen a 3ste inaccesile. )uchas veces, este

ojetivo no se consigue, lo !ue impide la realizacin de este tipo de

cromatografas. 'tras veces, para preservar la capacidad de

interaccin del ligando, se hace preciso reducir su concentracin en

la mezcla de incuacin con la matriz activada. En el mismo

sentido suele resultar efectivo traajar con matrices cuya

proporcin de grupos activos sea reducida, ien por!ue se

ad!uieren con un ajo ndice de activacin, ien por!ue se

someten a un proceso previo de desactivacin lenta y controlada.

%ual!uiera !ue sea la opcin, el ojetivo es reducir la e4tensin del

anclaje covalente, fundamentalmente para evitar las uniones del

ligando por mKltiples sitios. Estas uniones multipunto suelen ser las

principales responsales de la inactivacin de los ligandos, en

especial cuando se trata de ligandos macromoleculares.

&erminada la incuacin entre el ligando y la matriz cromatogr51ca,

se procede a eliminar el e4ceso de ligando y reactivos por

decantacin o 1ltracin del sorenadante, seguido de lavado con

lampn.


53/122

+stos deen ser eliminados para evitar interacciones inespec1cas

con los solutos de la muestra. 9ara ello se suelen lo!uear con

aminas o 5cidos en concentraciones su1cientemente altas 0, a

,0 ). *a incuacin con lampones catinicos asados en &ris, o

amnicos asados en 5cido ac3tico, suele ser su1ciente. En

esencia, se trata de unir en los sitios remanentes otros ;2

%''; distintos a los del ligando. &ras el lo!ueo, un lavado

e1ciente, seguido de e!uilirado en el lampn adecuado, dejar5 a

la fase estacionaria lista para ser empa!uetada en la columna.

.2 plicacin de la muestra , elucin

9or regla general, el volumen de lecho cromatogr51co

empa!uetado es el necesario para traajar segKn la modalidad

descrita en el apartado B.?.2, o en una modalidad intermedia entre

y 2. %uando se emplean fases estacionarias asadas en ligandos

espec1cos de grupo %uadro B.B puede ser necesario traajar con

columnas m5s largas, a 1n de resolver diferentes solutos del mismo

grupo !ue muestren a1nidades parecidas por la fase estacionaria.

El lampn de e!uilirado se har5 escogido de forma !ue se

favorezca la interaccin iolgica de inter3s, a la vez !ue se

reduzcan al mnimo otras interacciones inespec1cas. Dada la

elevada a1nidad !ue suelen mostrar las mol3culas

interaccionantes, lo normal es traajar con fuerzas inicas

relativamente elevadas ej." a%l 0,2 ). /na vez aplicada la

muestra, se continuar5 pasando tampn de e!uilirado hasta lavar

todos los contaminantes. El Lujo de la columna, durante la

aplicacin de la muestra y su posterior elucin, puede ser una

variale crtica en a!uellos casos en !ue las constantes de

velocidad de las reacciones de asociacin y disociacin sean ajas.

%on car5cter general, es recomendale emplear Lujos ajos

durante la aplicacin y la elucin, mientras !ue en los lavados se

podr5n utilizar Lujos altos.

A@


54/122

En ocasiones, la unin del soluto de inter3s es tan fuerte !ue su

elucin slo es posile ajo condiciones incompatiles con la

funcionalidad iolgica, con lo !ue har5 !ue e4cluir el empleo de

este tipo de cromatografa. En situaciones menos e4tremas, se

podr5 acudir a eluciones espec1cas o inespec1cas.

/na elucin espec1ca es la !ue se consigue cuando la fase mvil

tiene algKn agente !ue compite por unirse al ligando anclado.

%omo ejemplo se puede citar la frecuente utilizacin de eluyentes

asados en Nal!uilglucsidos para la elucin de glicoprotenas

puri1cadas mediante cromatografa en %on Nagarosa. Este tipo de

elucin espec1ca ser5 el preferido siempre !ue resulte factile.'viamente, la columna !uedar5 contaminada por el agente

eluyente empleado, pero 3ste se podr5 eliminar por medios m5s

dr5sticos, cuando ya la funcin iolgica no sea una limitacin.

En las eluciones inespec1cas se suele acudir a alterar la fuerza

inica del eluyente, o el p;, o incluso la temperatura. veces es

necesario cominar estos tres recursos, o siendo m5s dr5stico,

alterar la conformacin del ligando, en caso de !ue 3ste sea

macromolecular. %omo Kltima opcin, en caso de !ue todo lo

anterior fallase, se puede acudir al empleo de agentes caotrpicos

ej." Higura B.@0 se recoge un ejemplo de

puri1cacin de una protena inhiidora de una enzima, la cual se

utiliz como ligando anclado covalememente.

.3 Tipos especiales de cromatografa de a)nidad

A


55/122

continuacin se descrien tres sistemas cromatogr51cos !ue

presentan peculiaridades su1cientes para reciir un tratamiento

conceptual diferenciado.

%romatografa de a1nidad sore metales inmovilizados. Esta

variedad cromatogr51ca no se asa en el concepto de

funcionalidad iolgica !ue suyace en otras cromatografas de

a1nidadI de ah !ue muchos autores pre1eran engloarla dentro de

otros tipos cromatogr51cos, en concreto, dentro del intercamio

inico, en una suvariedad !ue podra llamarse intercamio de

ligandos. *o cierto es !ue la denominacin !ue a!u se emplea es

la m5s aceptada en Gio!umica, y justi1ca la areviatura por la !ue

tami3n se la conoce" $)% del ingl3s $mmoilized )etal nity

%hromatographyI tami3n conocida como )%% de )etal %helate

nity %hromatography.

%onviene mencionar !ue se trata de una cromatografa indicada

para la separacin de protenas. s, e4plota las propiedades

!uelantes de muchas protenas, capaces de formar compuestos de

coordinacin con metales de transicin ej." %u2, -n2, i2,

%o2. igura B.@.

El empa!uetado de una matriz de este tipo, seguida del paso de un

eluyente conteniendo alguno de los cationes anteriores, deja la

columna cargada con el metal de transicin. *a posterior aplicacin

de la muestra conteniendo las protenas de inter3s se traducir5 en

la retencin de 3stas, siempre !ue la a1nidad del metal por el

grupo !uelante de la matriz sea superior !ue por las protenas. &al

retencin se muestra muy dependiente del p;, deiendo

AA


56/122

asegurarse un p; en torno a la neutralidad. p; alcalinos los

grupos amino de las protenas se encontrar5n desprotoNnados,

convirti3ndose en los principales responsales de la unin al metal.

Esta situacin ha de evitarse en $)%, ya !ue se trata de favorecer

a las histidinas como principales responsales de la interaccin.

dicionalmente, como forma de eliminar interacciones

electrost5ticas inespec1cas, los lampones de aplicacin y lavado

suelen tener fuerzas inicas elevadas 0,AN,0 ) de a%l.

*a elucin de las protenas retenidas puede llevarse a cao como

en cromatografa de a1nidad, de forma espec1ca o inespec1ca. En

el primer caso, el lampn eluyente ha de contener un agente !ue

compita con las protefnas, desplazandoNlasI por ejemplo,

imidazol, histamina o glicocola. %on vistas a separar diferentes

protenas se puede emplear un gradiente de concentracin de

estos agentes, !ue introduzca la selectividad adecuada. El p; del

lampn de elucin se suele mantener constante a lo largo de todo

el proceso. En el caso de elucin inespec1ca, se emplean

gradientes de p; decrecientes, !ue ir5n protonando los residuos de

histidina. *a selectividad vendr5 entonces determinada por los

particulares valores de pH de las histidinas.


57/122

aprovecharse para puri1car protenas recominantes en un solo

paso.

%romatografa de a1nidad por unin covalente. diferencia de las

cromatografas de a1nidad, y en general de interaccin, 3sta se

caracteriza por la retencin de los solutos mediante unin

covalente a la fase estacionaria. pesar de ello la reversiilidad de

la retencin !ueda asegurada, ya !ue se trata de uniones por

puentes disulfuro. Gajo condiciones reductoras suaves ej." 2N

mercaptoetanol o D&& AN20 m) se puede conseguir la elucin.

eneralmente, la fase estacionaria est5 constituida por una matriz

cromatogr51ca a la !ue se ha anclado covalentemente un grupo

tiopropilo o glutation >igura B.@2. Estas columnas est5n indicadas

para la puri1cacin de protenas con grupos


58/122

temperatura pueden ser incompatiles con la viailidad de las

c3lulas.

. CROMATOGRAFIA DE PENETRA0ILIDAD

+ste es el m5s simple, conceptual y metodolgicamente, de todos

los tipos de cromatografa. El nomre !ue se le ha dado es una

propuesta m5s entre las muchas e4istentesI algunas de ellas son"

cromatografa de 1ltracin en gel, cromatografa de permeacin en

gel, cromatografa de tamizado molecular y cromatografa de e4cluN

sin por tamaJo. %uando este tipo de cromatografa se lleva a cao

en sistemas de alta presin, parece !ue e4iste un consenso en

denominarla como cromatografa de e4clusin por tamaJo

areviado


59/122

m5s empleados en Gio!umica, especi1cando el nomre comercial

por el !ue normalmente se los conoce.

*as micropartculas en !ue est5n divididos estos soportes son

esferas formadas por enrejados de 1ras del polmero

correspondiente. *os huecos o poros de estos enrejados tendr5n un

tamaJo determinado por la concentracin de 1ras y su grado de

entrecruzamiento. En suma, las micropartculas esf3ricas son como

esponjas. Este smil es especialmente v5lido, ya !ue, adem5s de

ser huecas, al ponerse en contacto con el agua se hinchan

consideralemente. En un lecho cromatogr51co empa!uetado con

un soporte de estas caractersticas, har5 !ue considerar !ue hay

l!uido, no slo en los intersticios entre partculas, sino tami3n en

el $nterior de las mismas. l arir la salida del eluyente, el l!uido

en los intersticios se desplazar5 con la velocidad de la fase mvil. El

l!uido atrapado por las partculas del gel no, sufrir5 este arrastre,

protegido como se encuentra por el entramado de 1ras !ue actKa

como matriz de contencin. En esencia, este l!uido intern se

comporta como la fase estacionaria en cromatografa de

penetrailidad.

9ara formarse una uena idea de la o!uedad de las partculas,

asta considerar !ue con ciertos tipos de geles, m5s del 8Ab del

lecho empa!uetado es l!uido. En otras palaras, !ue el volumen

ocupado por las 1ras de polmero lo Knico slido dentro de la

columna es muy pe!ueJo en comparacin con el volumen total del

lecho cromatogr51co >igura B.A. Este volumen total, #&,

calculale a partir del di5metro de la columna, , y de la altura del

lecho, *, ser5

gi VVVL ++=

0

2

.4

.

Donde" #0, volumen de los intersticios entre partculas o volumen

de e4clusinI #, volumen interno de las partculas de gel, o

AC


60/122

volumen de fase estacionariaI #g, volumen ocupado por las 1ras

del polmero. Dado !ue #g, es consideralemente menor !ue #&, es

f5cil intuir la gran esponjosidad de estos geles. En consecuencia,

son geles landos !ue slo pueden emplearse con ajas presiones

hidrost5ticas, so pena de colmatacin y deterioro de la matriz.

En cromatografa de penetrailidad hay !ue camiar un poco los

conceptos !ue se venan manejando. s, no hay !ue considerar

!ue la fase estacionaria permanece completamente est5tica

durante el proceso cromatogr5fco. El eluyente puede acceder al

interior de las micropartculasI a 1n de cuentas, la composicin de

la fase estacionaria y el eluyente es la misma. 9ero, este acceso del

eluyente al volumen interno, #i, no es la consecuencia del Lujo

dictado por la presin hidrost5tica o el omeo perist5ltico. Es la

difusin de las mol3culas del eluyente hacia el interior de las

partculas del gel la !ue da cuenta de la progresiva renovacin de

la fase estacionaria. 9or tal motivo, si se pretende desplazar todo el

volumen interno o fase estacionaria de un lecho cromatogr51co de

este tipo, y para ello se empieza a pasar eluyente, caen dos

opciones" o !ue el Lujo de eluyente sea muy r5pido en compaN

racin con la velocidad de difusin al interior de las partculas, o

!ue sea lento. En este segundo caso, es f5cil ver !ue la renovacin

completa de la fase estacionaria se har5 producido cuando el

volumen de eluyente pasado por la columna sea igual a

#0 #i #t

donde #, es el smolo empleado para hacer referencia al volumen

total de l!uido contenido en el lecho cromatogr51co. 'viamente,

#t #& #g

En el caso de !ue el Lujo de eluyente sea muy r5pido en

comparacin con la difusin de sus mol3culas, puede resultar !ue

la cantidad de eluyente necesaria para la renovacin completa de

la fase estacionaria sea superior a la calculada a partir de B.2@.

En la pr5ctica esto no es deseale, y oliga al empleo de Lujos relaN

B0


61/122

tivamente ajos, como corresponde a una t3cnica donde la

distriucin de los solutos en #, viene goernada por la difusin.

En efecto, pi3nsese en el caso de un soluto cuyas mol3culas fuesen

de un tamaJo tan grande !ue no pudieran penetrar por el

entramado de 1ras de las partculas del gel. &ales mol3culas no se

distriuiran en asoluto en la fase estacionaria, vi3ndose en todo

momento oligadas a viajar por los espacios intersticiales. Esta

situacin sera radicalmente distinta a la de un soluto de mol3culas

tan pe!ueJas !ue no encontraran restriccin alguna, no slo para

desplazarse por los espacios intersticiales, sino tampoco para

difundir a los espacios internos. En todo momento, la concentracin

de estas mol3culas pe!ueJas seria la misma dentro y fuera de las

partculas, 3sto es, en los volKmenes #0y #i.

9ara diferenciar estas dos situaciones e4tremas se suele utilizar el

coe1ciente de reparto, Kav, de1nido como la proporcin del volumen

interno !ue le resulta accesile a una mol3cula de soluto"

i

acc

avV

V

K =

donde #acces el volumen interior de las partculas de gel al !ue

puede acceder un soluto dado. En el caso del soluto de gran

tamaJo antes mencionado, #acc 0 Kav0, mientras !ue para el

soluto pe!ueJo, #acc #i Kav .

En la pr5ctica podr5n encontrarse situaciones como las

comentadas, o intermedias entre ellas. 9or tanto, con car5cter

general, 0 #acc#i y 0 Kav . Es f5cil ver !ue el volumen de

elucin de un soluto vendr5 dado por

#e #0 #acc

y, de acuerdo con B.2A,

#e#0Kav#i

El soluto e4cluido de la fase estacionaria Kav 0 presentar5 un

volumen de elucin igual a #0, lo !ue e4plica !ue a este volumen

B


62/122

se le conozca como volumen de e4clusin. 9or su parte, un soluto

tan pe!ueJo !ue Kav , eluir5 con #e #0 #i#t.

9ara geles muy porosos #g #&, y, de acuerdo con la e4presin

B.2, se puede asumir !ue # t#&. *o anterior tiene una inmediataaplicacin pr5ctica" en cromatografa de penetrailidad se ha de

cumplir !ue, una vez aplicada la muestra, el paso de un volumen

de eluyente igual al volumen geom3trico del lecho cromatogr51co,

dee traducirse en la elucin de todos los solutos presentes en la

muestra >igura B.B.


63/122

de las mol3culas. /n an5lisis en mayor profundidad oligara a

tratar la penetrailidad como una funcin, no slo del tamaJo, sino

tami3n de la forma molecular. mos par5metros est5n presentes

en lo !ue se conoce como di5metro hidrodin5mico de una

mol3cula.

9ara entender el concepto !ue hay detr5s de este par5metro hay

!ue recordar !ue las mol3culas en disolucin est5n en continuo

movimiento traslacional y rotacional. %omo consecuencia de sus

r5pidos movimientos rotacionales en las tres direcciones del

espacio, las mol3culas se comportan como si ocuparan m5s

volumen !ue el de1nido por sus dimensiones geom3tricas. En

concreto, ese volumen de inLuencia descrito por el volteo continuo

tendra forma esf3rica, cuyo di5metro seria el di5metro

hidrodin5mico.


64/122

per1l sigmoidal en las representaciones semilogartmicas de masa

molecular frente a Kav. >igura B.8

igura B.8. *os v3rtices de esta representacin terica

de1nen el llamado intervalo de fraccionamiento de un gel. Es 3sta

una propiedad intrnseca de cada gel, !ue depende de cu5l sea el

tamaJo promedio de sus poros y la distriucin de tamaJo de

3stos. En el %uadro B. se muestran los intervalos de

fraccionamiento de soportes comerciales para cromatografa de

penetrailidad.

En la pr5ctica, los per1les sigmoidales como el de la >igura B.8

tienen una porcin central Kav 0.2 N 0.8 !ue puede ser

considerada lineal. Ello tiene utilidad en la estimacin de masas

moleculares mediante cromatografa de penetrailidad.

.2 Estimacin de masas moleculares

*a metodologa a seguir es ien sencilla.


65/122

molecular uscada. El conjunto de operaciones a realizar se

resumen en el ejemplo pr5ctico !ue se recoge en la >igura B.C.

%on frecuencia, estos an5lisis se llevan a cao sin calcular los

valores de Kav,sino utilizando en su lugar los cocientes #e#0, o

incluso utilizando slo #e. &al forma de operar oliga a traajar

siempre con la misma columna mismo #0, mismo #t.

*a m54ima utilidad de esta evaluacin cromatogr51ca de masas

moleculares de protenas se otiene cuando se comina con la

correspondiente determinacin mediante 9EN


66/122

cuyo intervalo de fraccionamiento sea muy amplio, y a ser posile

caliradas. El per1l de elucin !ue se otenga ej." 280 de las

fracciones recogidas, en el caso de mezclas de protenas,

informar5 sore la distriucin de tamaJo de los componentes en

la mezcla prolema.


67/122

por lo !ue el per1l de elucin !ue engloe sus distriuciones

zonales podr5 resultar asim3trico >igura B.2. En el supuesto de

!ue casualmente dos solutos no resueltos est3n presentes en la

misma concentracin, el per1l de elucin conjunto podra resultar

sim3trico, pero proalemente presentar5 una anchura superior a

la esperale.

*a cromatografa de penetrailidad proporciona un criterio de

pureza negativo m5s severo !ue otros tipos de cromatografa. Ello

tiene !ue ver con la ausencia de interacciones entre solutos y fase

estacionaria. En el resto de tipos cromatogr51cos, el pico de

elucin de un soluto puro puede presentar cierta asimetra lo !ue

se conoce como caeceo o coleo, !ue puede e4plicarse

atendiendo a la dependencia de la interaccin solutoNfase

estacionaria con la concentracin de soluto. %uando esta

dependencia es lineal, el per1l de elucin suele ser sim3trico y

resulta v5lido lo e4puestoI sin emargo, para dependencias no

lineales lo !ue suele ocurrir con cierta frecuencia, la asimetra de

los picos de elucin est5 asegurada, tanto m5s cuanto mayor sea la

concentracin del soluto en la muestra aplicada. *a conclusin es

inmediata, la asimetra de un pico no puede emplearse como

criterio para negar la pureza de una muestra, salvo !ue se pueda

asegurar una interaccin lineal en las cromatografas de adsorcin,

o cuando se trate de un pico de elucin de cromatografas de

penetrailidad, donde la adsorcin no ha de jugar ningKn papel.

nalizar la forma de los picos re!uiere disponer de un registro

gr51co, por ejemplo medidas de asorancia del eluido. igura B.22 ilustra la utilidad de estos registros cominados.

.* !esalado de muestras. %am+io de disol4ente

B?


68/122

/na Ktil aplicacin de la cromatografa de penetrailidad en el

terreno preparativo es el desalado yo camio de disolvente. !u,

el papel !ue ejerce el gel cromatogr51co no es separar diferentes

iopolmeros entre s, sino separarlos del disolvente o las sales !ue

les acompaJen.

Determinados geles %uadro B., est5n formados por un

entramado de 1ras tan tupido, !ue slo los solutos de pe!ueJo

tamaJo podr5n acceder al # i. %asi cual!uier iopolmero presentar5

un Hav 0 en una columna empa!uetada con estos geles.


69/122

cromatografa de intercamio inico los mismos planteamientos

e4perimentales" retencin de los solutos en la columna y posterior

elucin mediante camios en la composicin de los eluyentes.

*a interaccin hidrofica no es una interaccin en s misma, sino

el resultado de la asociacin entre regiones apelares promovida por

entornos acuosos. Esta agregacin hidrofica est5 favorecida

termodin5micamente por el aumento de entropa !ue supone. En

efecto, la solvatacin de las super1cies hidroficas re!uiere !ue

las mol3culas de agua implicadas adopten un orden estricto. l

interaccionar las regiones hidroficas entre s, su super1cie

e4puesta disminuye, y con ello el nKmero de mol3culas de agua

ordenadasI en suma, disminuye el orden gloal. De a!u se derivan

dos conclusiones de importancia pr5ctica" a *a solvatacin inica

disminuye el nKmero de mol3culas de agua disponiles para

solvatar las super1cies hidroficasI la consecuencia es el

favorecimiento de las interacciones hidroficas por las fuerzas

inicas altas, El car5cter entrpico de las interacciones

hidroficas, justi1ca !ue se vean favorecidas por aumentos en la

temperatura.

En una columna de interaccin hidrofica las muestras !ue se

apli!uen han de contener iones en su1ciente cantidad para

favorecer la retencin de los solutos. hora ien, no todos los iones

favorecen por igual las interacciones hidroficasI

incluso, determinados iones las desfavorecen. continuacin, se

listan diferentes aniones y cationes en orden decreciente de su

capacidad favorecedora de las interacciones hidroficas"

9'@N


70/122

caotrpicos.


71/122

En cromatografa de interaccin hidrofica, gran parte de las

veces, las muestras !ue se aplican proceden de un paso previo de

precipitacin con sulfato amnicoI de este modo se asegura !ue la

muestra se encuentre en condiciones idneas para su retencin.


72/122

CAPITULOI II

?2


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TECNICAS CROMATOGRAFICAS

1. CROMATOGRAFIA PLANA

*a cromatografa plana, la integran un conjunto de tecnicas

ampliamente difundidas por la sencillez del e!uipo e4perimental

re!uerido, !ue pueden considerarse incluidas dentro de la

cromatografa li!uida *% deido a !ue la fase mvil es li!uida.

En ella, la fase estacionaria no se encuentra en el interior de unacolumna sino e4tendido en una super1cie plana y la fase mvil

li!uida se desplaza por capilaridad o por adsorcin.

En funcin del tipo de super1cie !ue actue como soporte, e pueden

distinguir dos tipos fundamentales de cromatografa plana"

*a cromatografa de papel

*a cromatografa en capa 1na

?@


74/122

1.1 CROMATOGRAFA EN PAPEL

*a cromatografa de reparto puede realizarse en columnas de

celulosa. *a cromatografa en papel es una variante de este

m3todo, en la !ue el soporte de celulosa adopta la forma de unahoja de papel. *a celulosa contiene una gran cantidad de agua

enlazada, incluso cuando ha sufrido procesos de deshidratacin. El

reparto tiene lugar entre el agua y el disolvente de revelado.

menudo este disolvente es tami3n agua, por lo !ue cae preN

guntarse si realmente el modo de accin en este caso es por

adsorcin o no.


75/122

muestra al comienzo de la migracin de sus componentes, uno de

los factores !ue determina la separacin de los componentes es la

velocidad de soluilizacin de los mismos dentro de la fase mvil.

Despu3s de !ue el $rente del disolvente haya alcanzado un punto

situado cerca del otro e4tremo del papel v3ase la 1gura 8NB, se

saca la hoja de la c5mara y se seca. *as manchas, !ue pueden ser

visiles o no, se detectan a continuacin y se marcan sus

posiciones. *a distancia relativa recorrida por una mancha con

respecto a la distancia recorrida por el frente del disolvente, se

denomina (f. *os valores !ue adopta %$dependen de la sustancia,

del papel y del disolvente utilizado. *os cromatogramas en papel

pueden ser revelados por Lujos ascendentes o descendentes del

disolvente. En la 1gura 8N? se muestra la disposicin e4perimental

para cada uno de los dos tipos. ;ay muy poca diferencia en la

calidad de los cromatogramas y la eleccin, por lo general, es

cuestin de preferencias personales. *a cromatografa con Lujo

descendente tiene dos ventajas"

es m5s r5pida deido a !ue la .gravedad ayuda al Lujo.

2 en las separaciones cuantitativas de materiales !ue poseen

valores de %$ muy pe!ueJos y !ue, por lo tanto, re!uieren

recorridos largos, el disolvente puede recorrer todo el papel.

9resenta la desventaja de !ue el aparato dee montarse con

cuidado, ya !ue la e4istencia de suciedad o un mal contacto en la

zona en la !ue el papel pasa al otro lado de la varilla soporte,puede ocasionar un Lujo no homog3neo y el susiguiente Lujo

acanalado.

/na variante muy Ktil es la cromatografa idimensional en papel.

En este m3todo, despu3s de haerse realizado la cromatografa en

una direccin, se seca el papel y se vuelve a cromatografar en

5ngulo recto con respecto a la direccin original del Lujo, utilizando

un disolvente diferente 1gura 8N8. De esta forma las sustancias

?A


76/122

!ue no se separan en el primer disolvente, pueden separarse en el

segundo disolvente.

D#,#%%': # '*#,'9%a%': *# (as ma%has

*as manchas en los cromatogramas de papel pueden detectarse

por su color, Luorescencia, por las reacciones !umicas !ue tienen

lugar tras pulverizar el papel con distintos reactivos, o por la

radiactividad de las manchas 1gura 8NC. *a deteccin de las

manchas por medio de la autorradiografa utilizando pelcula de

rayos F, se ha descrito en el captulo B. *a identi1cacin se asa,

por lo general, en la comparacin con est5ndar de %,conocido o

por elucin. *a elucin se realiza recortando la mancha y

sumergiendo el papel en el disolvente apropiadoI esto puede

hacerse a menudo de una forma cuantitativa.

H!#((as *a%,'(a)#s !a ap('%a%': #sp#%'a( *# (a

%)oma,o")a45a # pap#( a( #s,!*'o *# (as p)o,#5as

/n prolema importante de la iologa molecular consiste en

identi1car una protena una vez aislada o en identi1car el lugar

donde ha camiado un amino5cido en una protena mutante. *a

t3cnica de la _huella dactilar`, desarrollada por #emon $ngram,

permite realizar identi1caciones de una forma relativamente

sencilla.


77/122

*a huella dactilar de una protena mutante con un Knico camio de

amino5cidos se diferencia de la huella de la proteina normal 1gura

8N0.


78/122

identi1cacin del amino5cido insertado por cada i uno de los t(

supresores conocidos.

'dentifcacin de los cambios de bases producidos por mut(genos

determinados Deido a !ue se conoce la clave gen3tica, esposile identi1car los camios de ases !ue producen una

mutacin en particular.


79/122

sitKa en el intervalo de 0NA m, con lo !ue se pueden conseguir

super1cies especi1cas de hasta 00 m2g. dem5s, mientras en

cromatografa en papel el soporte es normalmente un papel de

1ltro, o lo !ue es lo mismo, las 1ras de celulosa !ue lo forman, en&*% son muchos los slidos !ue pueden actuar como soporte, una

vez pulverizados y e4tendidos" celulosa, poliamida, alKmina o gel

de slice. Este Kltimo, tami3n llamado slica+gel o slica, es, con

diferencia, el !ue m5s se utiliza.


80/122

*a estructura !umica en la super1cie de estas partculas se

caracteriza por presentar grupos silanoles


81/122

punta de una esp5tula en la posicin donde se encuentre un

soluto !ue se desee e4traer. El polvo, o fase estacionaria, raspado

se suspende en algKn disolvente adecuado, con lo !ue el soluto

emeido en 3l se disolver5. )ediante una simple 1ltracin o

centrifugacin se dispondr5 de una disolucin de tal soluto,

separado del resto de contaminantes !ue le acompaJaan en la

muestra inicial. 9ara esta utilizacin de la &*% con 1nes

preparativos suele ser deseale cromatogra1ar un volumen de

muestra mayor O 200 q$ al !ue se cromatografa en aplicaciones

analticas N0 jid.


82/122

%on car5cter general, el procedimiento a seguir ser5 el de rociar la

placa con un l!uido !ue provo!ue la reaccin de deteccin. inalmente, conviene recordar !ue si las muestras

sometidas a &*% se encuentran marcadas radiactivamente, ser5n

de aplicacin los m3todos autorradiogr51cos ya descritos %aptulo

.

CUADRO < M7,o*os *# D#,#%%': # C)oma,o")a45a *# Capa

F'a

M7,o*o Ap('%a%': Co(o)

$nespec1co

#apores de yodo

c.


83/122

ina

g'@';N

cidoiodoplatnico

#erde deromocresol

inhidrina

(odamina

caronlicos

%ompuestoscaronlicos

Gases

cidos

minas primariasamino5cidos

minas secundarias

*pidos

aranja

)arrn

9Krpura negro

zul viol5ceo

)arrn

>luorescenciaamarillo ros5cea

e4c @BB nm


84/122

se consigue depositando la disolucin prolema sore la parte

superior del lecho cromatogr51co >igura B.@. /na vez aplicada la

muestra, se are la columna por el e4tremo opuesto y se deja !ue

la disolucin prolema vaya Luyendo hacia el interior del lecho.

ntes de !ue la parte superior de 3ste se se!ue, se aporta nueva

fase mvil, y as se sigue de modo continuado hasta el 1n del

proceso. El ir pasando fase mvil hasta la salida de los solutos se

llama elucin, y el t3rmino eluidohace referencia a la fase mvil

!ue se. recoge desde la aplicacin de la muestra hasta la salida de

todos los solutos. %on car5cter general, a la fase mvil se la suele

llamar tami3n elu&ente

En su viaje a trav3s de la fase estacionaria, los solutos no slo se

ir5n separando cromatogr51camente sino !ue tami3n difundir5n,

por lo !ue la zona en la !ue viaja cada uno se ir5 ensanchando y

sus lmites difuminando. De este modo, la distriucin de cada

soluto en el eluido de la columna ser5 de tipo gaussiano. Elperfl

de elucin, perfl cromatogr(fco o cromatogramaes la sucesin de

curvas gaussiaNnas !ue informa sore la salida de los diferentessolutos >igura B..

9ara cada soluto, la posicin en el eje de ascisas del

correspondiente pico gaussiano, informa sore el tiempo

transcurrido desde !ue se aplic la muestra hasta !ue se produjo

la elucin de la columna. este tiempo se le llama tiempo de

retencin, t%

ormalmente, el caudal a-u.o de fase mvil /01 mlmin se

mantiene constante durante la elucin cromatogr51ca, luego,

RR tFV .=

8


85/122

siendo 2% el volumen de retencin, tami3n llamado volumen de

elucin, 2e,!ue es el volumen de fase mvil !ue ha de pasar a

trav3s de la columna para !ue eluya un soluto dado.

/n soluto !ue no sufra retraso alguno por la fase estacionariasoluto a en la >igura B., viajar5 en todo momento con la

velocidad de la fase mvil, u9ara una columna de longitud L el

tiempo !ue tarda en eluir este soluto vendr5 dado por"

u

LtM =

donde el sundice 3hace referencia a la fase )vil. El volumen de

elucin de este soluto no retrasado ser5"

MM tFV ..

%on frecuencia t3 yo 23 se designan tami3n como o y 24,

respectivamente, d5ndoles los nomres de tiempo o volumen de

exclusin,pues corresponden a un soluto !ue ni interacciona ni se

reparte con la fase estacionaria, esto es, !ue !ueda e4cluido

completamente de ella. l volumen 23tami3n se le suele llamar

volumen vacio o hueco en ingl3s void volume#, ya !ue

corresponde al volumen del lecho cromatogr51co no ocupado por

las propias partculas de la fase estacionaria fraccin de volumen

de lecho cromatogr51co ocupado por la fase mvil.

%uando un soluto se encuentra en la fase mvil se desplaza con la

velocidad de 3sta, u,pero cuando interacciona o se reparte con la

fase estacionaria su velocidad es nula. 9or tanto, se puede a1rmar

!ue el tiempo de un soluto es la suma del tiempo durante el cual

sus mol3culas viajan en la fase mvil /t3#,m5s el tiempo neto !ue

permanecen inmviles en la fase estacionaria t(I tiempo de

retencin a.ustado#:

8A


86/122

RMR ttt '+=

De la anterior e4presin se deduce !ue el tu de un soluto !ue

e4perimenta un retraso cromatogr51co soluto ben la >igura B.,

se calcula como la diferencia entre su tiempo de retencin t (, y el

tiempo de elucin de un soluto no retrasado t). Este tiempo

ajustado da una idea directa de la mayor o menor intensidad de la

interaccin o reparto del soluto con la fase estacionaria, Onene

sentido utilizar este t(, no en t3rminos asolutos, sino referido al

tiempo de e4clusin, t).

kt

tt

t

t

M

MR

M

R=

=

'

Este cociente, !ue se designa con la letra 5,recie el nomre de

$actor de capacidad,y es caracterstico de cada soluto para unasfases mvil y estacionaria dadas, independientemente de cu5les

sean los valores del Lujo, 0, y de la longitud de la columna, L

(eordenando la ecuacin B.B se llega a

( )kttMR += 1

o en t3rminos de volumen de eluido,

( )kVV mR += 1

8B


87/122

En la puesta a punto de un m3todo cromatogr51co, el ojetivo es

alcanzar un per1l de elucin en el !ue la separacin entre los picos

cromatogr5fcos de dos solutos, y 2, !ue eluyan uno detr5s de

otro, sea ptima. De acuerdo con las ecuaciones B.? y B.8, estas

diferencias vendr5n dadas por

( )

( )121,2,

121,2,

kkVVV

kkttt

MRR

MRR

=

=

donde t(,, t(,2, #(,y #(,2, son los tiemposvolKmenes de retencin

o elucin de los solutos y 2, y 56&M2son sus respectivos factores

de capacidad. %on vistas a la separacin efectiva de amos

solutos, es preciso asegurar !ue las diferencias entre sus valores

de 5 sean adecuadasI pero, adem5s, el ensanchamiento de sus

picos cromatogr51cos no ha de ser tan acusado !ue arruine los

efectos de una uena separacin entre los m54imos. En la >igura

B.A se presentan dos situaciones ien distintas en cuanto a

separacin y anchura de dos picos cromatogr5fcos. El caso

representa un resultado cromatogr51co peor !ue el caso GI

mientras en este Kltimo los dos picos est5n perfectamente

separados, en el caso hay solapamiento entre ellos, lo !ue se

pone de mani1esto en !ue no se alcanza la lnea asal entre la

salida del primer soluto y la del segundo. En de1nitiva, adem5s de

la separacin entre picos, hay !ue tener en cuenta su anchura.

9ara un par de solutos, y 2, un sistema cromatogr51coproporcionar5 un $actor de separacin o selectividad, a,!ue vendr5

dado por

( )12

1

2kksiendo

k

k>=

)odi1car la separacin entre esos dos solutos implicar5, por tanto,

la modi1cacin en la selectividad de la columnaI en suma, alterarla termodin5mica valores de 5#del sistema.

8?


88/122

diferencia de la separacin entre picos, la anchura de 3stos no

viene determinada por factores termodin5micos, sino por factores

cin3ticos apartado B.A. igura.

B.A, en comparacin con el I y ello, a pesar de su menor

selectividad. En t3rminos cualitativos, una columna cromatogr51ca

ser5 m5s e1ciente cuantos m5s estrechos sean los picos de elucin

!ue genere.

En cromatografa se utiliza el concepto deplato terico,para hacer

referencia a cada una de las l5minas en !ue OimaginariamenteO se

puede considerar dividida una columna cromatogr51ca. igura

B.B.

88


89/122

En la pr5ctica, para el c5lculo de nse mide la anchura total del pico

gaussiano a la mitad de su altura, lo !ue se conoce como 8hdel

ingl3s,OXidth at halfNheightO. 9ara un pico gaussiano perfecto,

Xh2.@A +

con lo !ue la e4presin B. se transforma en

2

54.5

=

h

R

w

tn

o en t3rminos de volumen,

2

54.5

=

h

R

w

Vn

donde ahora 8,,tami3n se medira en unidades de volumen.

El valor de nes independiente del pico cromatogr51co escogido

para su evaluacin. %uanto mayor sea el t(o el 2%, deun soluto,

mayor ser5 la anchura de su pico de elucinI pero el cociente de

amos se mantendr5 constante. *gicamente, n depende de la

longitud de la columna. 9or ello, es frecuente halar de platos

tericos por unidad de longitud de lecho cromatogr51co.

lternativamente, se puede especi1car la altura del plato terico,

h,!ue ser5 el resultado de dividir la longitud de la columna, *, por

su nKmero de platos tericos, n"

n

Lh=

*a altura del plato terico se e4presa en unidades de longitud

generlamente milmetros y su valor est5 inversamente

relacionado con la e1ciencia de la colulmna, siendo adem5s

8C


90/122

independiente de la longitud del lecho cromatogr51co. Desde un

punto de vista pr5ctico, la determinacin de n o de h permite tener

una medida de la calidad del empa!uetado de una columna.

;asta a!u se han introducido dos conceptos claves encromatografaI selectividad y e1ciencia. *os respectivos

par5metros y n se han de optimizar con vistas a conseguir !ue

los diferentes solutos de la mezcla inicial eluyan como picos

independientes.


91/122


92/122

largos. *a mejor forma de mejorar este factor cin3tico es

empa!uetar lo mejor posile el lecho cromatogr51co, y utilizar

fases estacionarias con un tamaJo de partcula pe!ueJo y

homog3neo apartado B.A.

9or su parte, los factores termodin5micos a considerar son dos,

capacidad, MM, y selectividad,NN. En cuanto al primero, el

margen de maniorailidad es relativamente estrecho. En efecto, 5

puede variar desde ' hasta , sin emargo el cociente MM

tiene un valor lmite de >igura B.8, y 3ste se alcanza

relativamente pronto. s, utilizar sistemas cromatogr51cos !ue

proporcionen valores de fe superiores a 0 no aporta grandes

ventajas, y s considerales inconvenientes en cuanto al

alargamiento de los tiempos de elucin. inalmente, el t3rmino a N6#6 ade la e4presin B.2 es el !ue

resulta m5s Ktil para mejorar la resolucin. El intervalo en !ue

normalmente suele encontrarse a es entre y 2, donde

correspondera a un par de solutos cuya separacin en el

correspondiente sistema cromatogr51co sera imposile, mientras

!ue en el otro e4tremo 2, la separacin cromatogr51ca sera

ciertamente f5cil. %on a variando en el intervalo mencionado, es

f5cil ver !ue el t3rmino /+6#lpuede llegar a variar hasta en tres

rdenes de magnitud >igura B.8.

)ejorar la relacin N se limita, en esencia, a encontrar el par

fase estacionariafase mvil m5s adecuado. &ami3n 3se es el

camino para mejorar en lo posile el otro factor termodin5mico !ue

C2


93/122

inLuye en la resolucin, MM. En la pr5ctica, la seleccin de la

fase estacionaria est5 muchas veces limitada por el tipo de

muestra prolema. En tales casos slo !ueda como variale la

modi1cacin de la fase mvil. fortunadamente en %* se puede

llevar a cao la elucin de los solutos con fases mviles cuya

composicin !umica vaya variando durante la propia elucin, lo

!ue se conoce como elucin en gradienteDe esta forma se puede

ejercer un uen control sore la resolucin de dos solutos, al poder

modi1car los factores termodin5micos sore la marcha.

. CROMATOGRAFA DE GASESEn los tipos de cromatografa de reparto descritos hasta ahora, la

muestra es arrastrada por una fase mvil l!uida sore una fase

estacionaria l!uida, en la !ue el l!uido est5 inmovilizado por

adsorcin o asorcin a un soporte slido. En la cromatografa de

gases *%, _gasNli!uid chromatography` la fase mvil es un gasI

la fase estacionaria es un l!uido adsorido a la super1cie interna

de un tuo o columna /$uncionamiento tubular o capilar#o a unsoporte slido /$uncionamiento en columna empaquetada# como la

tierra de diatomeas, &eLon en polvo o 1nas cuentas de vidrio. En

general, el l!uido se aplica como un slido disuelto en un

disolvente vol5til, como el 3ter. 9or ejemplo, las cuentas de vidrio

se sumergen en una disolucin de polietilenglicol en 3ter. %uando

el 3ter se evapora, cada cuenta !ueda recuierta de

polietilenglicol. la temperatura utilizada para la cromatografa degases, el polietilenglicol funde y permanece en las cuentas como

una pelcula l!uida. *a muestra, !ue puede ser cual!uier

compuesto capaz de ser volatilizado sin sufrir descomposicin, se

introduce como l!uido con un gas inerte ^helio, argn o nitrgeno

^ y a continuacin se calienta. Esta mezcla gaseosa pasa a trav3s

del tuo !ue est5 dispuesto segKn se muestra en la 1gura 8N@.

C@


94/122

En el funcionamiento en columna empa!uetada el tuo tiene de

a 20 metros de longitud y 0,A cm de di5metro. En el m3todo capilar

la longitud es de @0 a 00 metros. 9ara conseguir resoluciones muy

elevadas, se utilizan sistemas capilares de dos Milmetros de tuo.

*os compuestos vaporizados se redistriuyen continuamente entre

la fase mvil gaseosa y la fase estacionaria l!uida, de acuerdo con

sus coe1cientes de reparto y son, en consecuencia,

cromatogra1ados. l 1nal de la columna se usa un detector

apropiado.

D#,#%%': *# s!s,a%'as # #( #!#,#

En el traajo analtico se utilizan, por lo general, tres tipos de

detectores"

*a c3lula de conductividad t3rmica con una sensiilidad

apro4imada de 0 pg, el detector de ionizacin de argn

sensiilidad de 0NA g y el detector de ionizacin de llama

sensiilidad de apro4imadamente 0NAg. *a accin de la c3lulade conductividad t3rmica est5 asada en el hecho de !ue la

resistencia el3ctrica de un alamre es dependiente de la temperaN

tura.


95/122

columna similar a un contador de eigerN)ller y es ionizado

mediante omardeo con partculas


96/122

%ada uno de los detectores indica la cantidad de material !ue sale

de la columna en funcin del tiempo. o ostante, no hay una

indicacin directa de la identidadN del material !ue produce un pico

concreto ni de la cantidad de 3ste !ue e4iste en el pico. 9or

ejemplo, si las sustancias presentes en una mezcla se conocen por

adelantado y el propsito de la cromatografa es determinar la

cantidad de cada una de ellas, los picos suelen identi1carse

preparando una muestra duplicada !ue contenga una pe!ueJa

cantidad de una sustancia conocida !ue se ha aJadido, y volviendo

a cromatogra1ar.


97/122

utilizar un detector no destructivo p. e., la c3lula de conductividad

t3rmica.

*a determinacin cuantitativa de la cantidad de material en un pico

no es un procedimiento directo. 9ara cual!uier compuesto, lacantidad de material es directamente proporcional al 5rea del pico.

o ostante, la constante de proporcionalidad vara con las

sustancias. 9or tanto, lo primero !ue se necesita es identi1car el

material !ue se encuentra en un pico determinado. *a

cuanti1cacin re!uiere la preparacin de una curva est5ndarI es

decir, deen cromatogra1arse diferentes cantidades de la

sustancia y hacer una gr51ca !ue relacione el 5rea del pico con lacantidad de material.

J#,aKas *# (a %)oma,o")a45a *# "as#s

%on la cromatografa de gases se consiguen e4celentes

separaciones. *a velocidad y la sensiilidad son e4traordinarias,

siendo detectales cantidades del orden de 0N2 gramos para

muchas sustancias. Deido a !ue la rapidez del revelado de los

cromatogramas depende de la velocidad de difusin entre las fases

mvil y estacionaria, y deido a !ue la velocidad de difusin de los

gases es mucho mayor !ue la de los l!uidos, el cromatograma de

gases puede ser realizado unas mil veces m5s r5pido !ue el

e!uivalente en la cromatografa l!uida en columna. 9or

consiguiente, las separaciones pueden otenerse, con frecuencia,

en menos de un minuto. dem5s, utilizando un detector no

destructivo y condensando la muestra en la recogida 1nal, es

posile utilizar la cromatografa de gases deN forma preparativa.

*os instrumentos de preparacin en masa pueden puri1car

cantidades importantes del material !ue se est5 tratando, hasta

llegar a gramos.

*a cromatografa de gases puede utilizarse con cual!uier sustancia!ue pueda volatilizarse. 9or lo tanto, hay miles de compuestos

C?


98/122

org5nicos !ue pueden separarse con este tipo de cromatografa.

*as sustancias no vol5tiles pueden e4aminarse, si es posile,

convirti3ndolas en derivados vol5tiles por o4idacin, acilacin,

al!uilacin u otros procesos.


99/122

longitudes entre A0 y A00 cm. *os tiempos de separacin de lasdistintas muestras, eran largos y frecuentemente duraan variashoras.

*os primeros intentos para acelerar el procedimiento cl5sico

mediante la aplicacin de vacio o por omeo, no resultaronefectivo.

*os avances tecnolgicos de los Kltimos aJos han permitido poneren funcionamiento una serie de m3todos cromatogr51cos para los!ue se emplea la denominacin de cromatografa de l!uidos dealta resolucin ;9*%!ue son los m5s utilizados en la actualidad, yse caracterizan por"


100/122

permite la aplicacin de la muestra. la salida de la columna secoloca un detector generalmente de asorcin ultravioleta o deLuorescencia y si se desea recuperar las mol3culas !ue eluyen dela columna, se re!uiere un colector.

En los sistemas modernos el an5lisis de la informacin otenida serealizan mediante una computadora acoplada al e!uipoI lo !uepermite estandarizar la cromatografa, identi1car la naturaleza lospicos eludos y cuanti1car su contenido. *os picos se relacionansegKn su Otiempo de retencinO con est5ndares, !ue permitenidenti1car los amino5cidos presentes en la mezcla. *a cantidadrelativa de cada uno de ellos se determina calculando el 5rea lacurva del pico correspondiente.

00


101/122

CAPITULO

IJ

0


102/122

FUNDAMENTO TERICO

*a cromatografa es la t3cnica !ue separa una mezcla de solutos

asada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos!ue se estalece al ser arrastrados por una fase mvil li!uida o

gaseosa a trav3s de un lecho cromatogr51co !ue contiene la fase

estacionaria, la cual puede ser slida o l!uida.

;ay !ue indicar !ue el nomre de la t3cnica es incorrecto, ya !ue no

consiste en escriir con colores. Este nomre proviene de la primera

e4periencia cromatogr51ca realizada, la cual se utilizo para separarpigmentos coloreados de plantas. *a cromatografa fue descuierta

por el ot5nico ruso de origen italiano )ijail &sXett en C0@. &sXett

separo los pigmentos de las plantas cloro1la vertiendo e4tracto de

hojas verde en 3ter de petrleo sore una columna de caronato de

calcio en polvo en el interior de una proeta. o ostante, no e4isten

datos sore la utilizacin de esta t3cnica hasta C@0 cuando Mhun y

*ederer separaron tami3n pigmentos de las plantas usando comoadsorentes alKmina y caronato de calcio. >ue a partir de ah cuando

se inicio el verdadero desarrollo de la cromatogra1a.

9ara e4plicar el fenmeno cromatogr51co es necesario estalecer dos

tipos de fundamento" uno remoto y otro pr4imo

F!*am#,o )#mo,oEste fundamento se encuentra en alguna o

algunas propiedades fsicas o fsico !umicas de los analitos"

soluilidad, adsorcin tendencia a ser retenidos en slidos 1namente

02


103/122

divididos, volatilidad, tamaJo, carga, reactividad !umica o

io!umica, etc. *a mezcla de sustancias a separar se coloca en una

situacin e4perimental din5mica donde e4hien dos de estas

propiedades, o ien una de ellas pero por duplicado tal como la

soluilidad en dos l!uidos diferentes como ocurre en cromatografa

li!uido N li!uido. Deen cumplirse las condiciones siguientes"

N *os componentes de los sistemas empleados deen estar en intimo

contacto entre si.

N El e!uilirio estalecido entre esos componentes dee ser lo mas

completo posile.

F!*am#,o p):'mo


104/122

cromatogr51ca concreta depender5 de la naturaleza y cantidad de la

muestra, del ojetivo de la separacin y de las limitaciones del

tiempo y e!uipo ase!uile.

9uede hacerse una primera distincin entre las t3cnicas

cromatogr51cas atendiendo a la integracin continua o no del

sistema de deteccin. s, la cromatogra1a no conlleva a un sistema

de deteccin, mientras !ue cual!uier cromatgrafo de l!uidos o

gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, aut3nticos

instrumentos.

IMPORTANCIA DE LA COMATOGRAFA

9uri1cacin de la penicilina.

9uri1cacin de las protenas terapeKticas.

*a t3cnica cromatogr51ca con un enfo!ue al 5rea clnica nos sirve

para identi1car acterias mediante la comparacin otenida del

cromatograma otenido con un patrn predispuesto, para

identi1car distintos tipos de" amino5cidos, protenas, nucletidos,hemogloina, esteroides etc.


105/122


106/122

F(a/oo'*#s y 4#o(#s" en el vino la medicin de estas

sustancias permite la determinacin del color, la edad y las

variedades de uva usadas. El ;9*% en cominacin con

colormetros, permiten la determinacin de hasta 22compuestos diferentes simult5neamente.

L5p'*os la determinacin de lpidos animales y vegetales

como" colesterol, triglic3ridos, glic3ridos y esteroles, se asa en

el uso del ;9*% y un detector de Dispersin de *uz Evaporativa

E*


107/122

T)'"('%7)'*os ;9*% con E*


108/122

plicaciones de la cromatografa inica " el an5lisis de drogas y

sus metaolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas

para vitaminas, azKcares, y preparaciones farmac3uticas.

plicaciones referidas a productos alimenticios encromatografa por e4clusin de tamaJos" separacin de 5cidos

grasos, determinacin de glucosa fructosa y sacarosa en zumos

enlatados.

plicaciones de *a cromatografa de ases.


109/122

Determinacin delperfl del (cido graso, acide & valor del

perxido en la calidad del aceite de oliva contra el almacena.e.

Determinacin cuali y cuantitativa de componentes vol(tiles en

hierbas & especias


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ANEQOS

CROMATOGRAFIA DE REPARTICION

F'"!)a ;=

F'"!)a ;

CROMATOGRAFIA EN GEL


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F'"!)a ;1

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F'"!)a ;


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CROMATOGRAFIA DE PENETRA0ILIDAD

A


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GLOSARIO

B


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%romatografa5*a cromatografa es un

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Monografia Sobre Cromatografía