Montaje de Cariograma

MONTAJE DE CARIOGRAMA BLGA. MARIELA VINCES

ESTUDIO DE CARIOTIPO: Cultivo de linfocitos de sangre periférica Se colecta la muestra de manera

aséptica con la ayuda de una jeringa con un anticoagulante: heparina (3 mL)

Algunas gotas de sangre pueden ser inoculadas en medio de cultivo o pueden ser sedimentadas.

Se siembre el plasma que contienen los leucocitos.

MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: Presenta los compuestos y elementos

necesarios para la sobrevivencia y multiplicación de las células.

Contiene antibióticos: impiden el crecimientos de bacterias

FITOHEMAGLUTININA: AGENTE MITOGÉNICO

Moderador

Notas de la presentación

La Fitohemaglutinina (conocida como PHA por la abreviación de Phytohaemagglutinin) es una lectina ampliamente distribuida entre la legumbres y en algunas oleaginosas incluida la soja Glycine max. Las lectinas son proteínas que reconocen carbohidratos y se caracterizan por su habilidad para combinarse con receptores de membrana de carbohidratos. Estructuralmente están formadas por un dominio tipo lectina y otro globular que es el que reconoce a los carbohidratos. La PHA fue reconocida por su capacidad para aglutinar eritrocitos y leucocitos. Además estimula inespecíficamente la proliferación de células T y es esta característica mitogénica lo que le da su principal aplicación. Se emplea en el protocolo de preparación de las células para hacer un cariotipo de detección de posibles anomalías cromosómicas. Las células se incuban con esta lectina que induce su mitosis y proliferación. Una vez que se considera que una gran parte del cultivo se encuentra en metafase, se añade colchicina que es un agente que detiene el ciclo en metafase, estado necesario para hacer el cariotipo. Una vez que las células se encuentran detenidas en metafase, se produce un choque osmótico para que se hinchen y poder fijar sus núcleos para el estudio de los cromosomas. Ahora que se encuentran fijados en un porta se procede a la tinción de los mismos. Recientes estudios con ratas alimentadas con lectinas purificadas aisladas de semilla de frijol rojo Phaseolus vulgaris han mostrado uniones directas de lectina a la mucosa intestinal (Almeida et al. 1991; Santiago et al. 1993), interaccionando directamente con los enterocitos e interfiriendo la absorción y transporte de nutrientes (i.e. carbohidratos) durante la digestión (Santiago et al. 1993) y causando lesiones epiteliales en el intestino (Oliveira et al. 1989). Lectinas Las lectinas son glicoproteínas, presentes tanto en animales como en vegetales bacterias o virus, que se caracterizan por ser capaces de unirse a carbohidratos especificos, libres o que forman parte deglicanos de de glicoproteinas. Si estos carbohidratos se encuentran en las membranas deloe eritrocitos, las lectinas que los reconocen provocan su aglutinación, por lo que reciben el nombre de hemaglutininas, fitohemaglutininas en el caso de ser lectinas vegetales. La primera lectina, extremadamente tóxica, fue descubierta por Stillmark en 1888, en las semillas del ricino, y se les dio el nombre de “lectinas” en la década de 1950, pero por el momento no se sabe exactamente cual puede ser su función biológica. Es posible que sea muy diversa, desde el reconocimiento del propio polen a la defensa frente a insectos. Independientemente de esto, las lectinas son heramientas muy utilizadas en bioquímica, para el estudio de glicoproteínas, así como en biología celular y en investigación médica ��

PROPIEDADES DE LA FITOHEMAGLUTININA

Tiene como función promover la desdiferenciación de los linfocitos que retornan a la condición blástica, adquiriendo la capacidad de dividirse.

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Las células blásticas son activamente móviles y capaces de experimentar, mitosis. Los linfocitos estimulados con PHA facilitan la repoblación del sistema hematopoyético en receptores de irradiación subletalmente. Se puede conseguir la transformación mediante antigeneos “no específicos” antigenos “específicos” y cultivos mixtos de leucocitos. Los antigenos no específicos son las fitohemaglutinina (PHA), el mitógeno hierba carmin, etc. El PHA es una mucoproteína que se obtienen del extracto acuoso de la judía roja (Phaseolus vulgaris). Provoca aglutinación de los eritocitos, de ahí su termino y durante muchos años se ha utilizado para extraer los globulos rojos de las suspensiones celulares mixtas. Más tarde se descubrió que este producto estimulaba la mitosis y otros cambios en los linfocitos y de ahí el nombre de “mitógeno”. Cuando se añade PHA a un cultivo de linfocitos pequeños, el compuesto interacciona con la membrana linfocitica y estimula la sintesis de ácidos nucleicos, primero de ARN y luego de ADN, y la célula se convierte en un forma blástica mitóticamente activa, esta caracteristica de respuesta es tipica de los Linfocitos T, aunque otros investigadores han demostrado que tambien los B responden al PHA

En un tubo falcon previamente esterilizado colocar 4 mL de Medio Mínimo Escencia (MEM) o RPMI – 1640, adicional 1 mL de Suero Fetal Bovino (SFB), 0,35 mL de fitohemaglutinina (PHA) P, y aproximadamente 0,5 mL de sangre heparinizada (12 gotas).

Se incuban las células a 37 oC por aproximadamente 69 horas

La siembra debe hacerse en cámara de aire de fluno laminar para evitar la contaminación.

La recolección de la muestra es el proceso que se obtienen células en metafase, de las cuales se obtendrán cromosomas.

La calidad de las metafases se debe a principalmente de la solución hipotónica que se utilice, lo que garantiza una buena dispersión de los cromosomas dentro de la célula, como el uso de una solución fijadora encargada de remover los restos de organelos y membranas celulares, permitiendo obtener preparaciones limpias y analizables.

La colchicina, un inhibidor del huso mitótico es esencial dentro del proceso que permite manipular las células para llegar al producto final de interes: los cromosomas.

LA RECOLECCIÓN se incia con la adición de 0,1 mL de Colchicina durante los 25 minutos finales de cultivo.

Las células se centrifugan por 10 minutos a 1200 RPM; se descarga el sobrenadante y el botón celular se resuspende con una pipeta Parteur; luego se adicionan 8 mL de solución hipotónica (Cloruro de potasio al 0,075 M), la cual debe estar a 37oC; se vuelve a resuspender con pipeta Pasteur evitando la formación de burbujas, y se incuba por 10 minutos a 37oC.

Adicionar 1 mL de solución fijadora fría (Metano – ácido acético glacial) y centrifugar (10 min a 1200 RPM),

Descargar el sobrenadante, desprender el botón celular por medio de golpes suaves al tubo, adicionar 5 mL de solución fijadora (siempre fría) lentamente por las paredes del tubo; resuspender, tapar e icubar por 20 minutos en la nevera.

Adicionar 5 mL de solución fijadora, resuspender, tapar e incubar por 10 min en nevera. Centrifugar y descartar el sobrenadante

Por cada cultivo deben prepararse de tres a cuatro láminas portaobjetos, las cuales tienen que ser de óptima calidad . Deben sumergirse con anterioridad en un recipiente de etanol puro, por mínimo 24 horas (en congelación) y se limpian energéticamente con una toalla que no deje motas.

Al botón celular se le agrega 5 gotas de fijador, se resuspende y se extiende de 2 a 3 gotas de preparación en láminas portaobjetos previamente desengrasadas a una distancia de 1 mt sobre un plano inclinado a 45°.

Luego se procede a realizar la coloración Giemsa

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Colorante Giemsa para tinción de Frotis sanguíneo o médula ósea de gran importancia en Hematología, ya que el diagnóstico de muchas enfermedades hematológicas puede realizarse con sólo observar las características morfológicas de las células sanguíneas. �Romanowsky (Wrigth, Giemsa, Leishman, May Grünwald) son mezclas de 2 colorantes primarios, el Azul de metileno y la eosina. El azul de metileno (color azul), es un colorante básico, en las células se une a sustancias ácidas que se tiñen de color azul. La eosina es un colorante ácido, en las células se unen a las proteínas básicas que se observan de color naranja, Durante el proceso de maduración de los colorantes de Romanowsky, el azul de metileno se oxida dando lugar a colorantes secundarios. Los más importantes son los Azures de metileno, de color azul brillante, que son también colorantes metacromáticos. Cuando las moléculas de un colorante metacromático estan desordenados en una solución, el color observado es el natural (azul), sin embargo, cuando dichas moléculas se ordenan en el espacio muy juntas unas de otras forman un color distinto (Rojo).

HIBRIDACIÓN IN SITU CON SONDAS FLUORESCENTES (FISH) Se aplica esta técnica de genética molecular para la preparación

de cromosomas de núcleos en metafase o interfase. El objetivo es dectar reordenamientos cromosómicos pequeños

que no puden ser detectados en microscopia. Durante FISH una sonde de ADN marcada es hibridada in situ con

ADN cromosómico de cadena simple sobre un portaobjetos. La hibridadción sito-específica resulta en una señal visualizada

sobre el cromosoma. En la marcación directa, la marca fluorescente, un nucleótido

modificado (con frecuencia 2´deoxiuridina 5´trifosfato) que contiene un fluoróforo, es incorporado directamente al ADN; la marcación indirecta requiere de una sonda de ADN con un fluoróforo para hacer visible la señal

Tinción sólida

Tinción con Giemsa Bandeo G

Tinción con Mostaza de quinacrina Bandeo Q

Bandeo C tiñe específicamente regiones centroméricas

Bandeo 550 bandas Bandeo 650 bandas

Bandeo de alta resolución

CARIOTIPO Conjunto de cromosomas

característico de una especie determinada.

En cada cromosoma, la cromátida izquierda muestra las bandas que aparecen en la metafase y a la derecha el mayor número de bandas encontradas en la profase tardía.

p: brazo corto q: brazo largo Los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22

tienen satélites que corresponden a los organizadores nucleolares y que no deben confundirse con el llamado ADN satélite de secuencias repetidas.

Los organizadores nucleolares contienen el ADN con los genes de los ARN ribosómicos de 18 S, 28 S y 5,8 S

CARIOGRAMA HUMANO Para la construcción del carigrama

humano, los cromosomas son recortados y depositados de forma ordenada, de acuerdo con la morfología, en orden decreciente de tamaño, a menos que hayan sido sometidos a coloración especial, en ese caso se deberán tomar en cuenta el patrón de bandas

En los laboratorios de citogenética humana, el análisis cromosómico para rutina con fines de diagnóstico se realizan teniendo como base los cromosomas que hayan sido diferenciados en bandas G o alguna otra banda equivalente, que permita la identificación inequívoca de cada para de cromosomas homólogos.

Moderador


La célula con cuyo cariotipo vamos a trabajar se ha obtenido a partir de un cultivo de sangre periférica, después se hizo un tratamiento con tripsina y posteriormente tinción con Giemsa para obtener un bandeo G. La microfotografía así obtenida pertenece a una persona que no tiene ninguna anomalía cromosómica. La dotación cromosómica normal de la especie humana es de 46,XX para las mujeres y de 46, XY para los varones. En el cariotipo humano los cromosomas se ordenan de mayor a menor. Hay cromosomas grandes, medianos y pequeños. Al ordenar los comosomas se constituyen 7 grupos atendiendo no sólo al tamaño sino también a la forma de las parejas cromosómicas, dentro del cariotipo humano podemos encontrar cromosomas metacéntricos (tienen los dos brazos aproximadamente iguales en longitud), submetacéntricos (con un brazo más pequeño que otro) y acrocéntricos (con un brazo corto muy pequeño). Concretamente en el cariotipo humano hay 7 grupos de cromosomas. Dentro de cada grupo vamos a ordenar y reconocer los cromosomas con la ayuda de un ideograma:

Los 46 cromosomas humanos forman 23 pares 22 pares son autosómicos y un par sexual Los pares de cromosomas autosómicos son

numerados del 1 al 22 de manera decreciente en cuanto a su tamaño

Los cromosomas sexuales son denominados X e Y.

Los pares cromosómicos, incluyendo los sexuales son reunidos en 7 grupos, designadoles las letras del A hasta la G, y clasificándolos por grupos.

Para la distribución de los cromosomas en los diferentes grupos, después de la coloración convencional, se debe obedecer a los siguientes criterios:

GRUPO A Presenta a los 6

cromosomas más grandes El par 1 es metacéntrico El par 2 es

submetacéntrico El par 3 es metacentrico

pero más pequeño que el primero,

GRUPO B Incluye los pares 4 y 5:

submetacéntricos El tamaño de los brazos

cortos equivale a los 1/3 de sus brazos largos.

No existe diferenciación morfológica entre los pares de cromosomas homólogos.

GRUPO C Presenta 15 cromosomas en el hombre 7 16 cromosomas

en la mujer, debido a que el cromosomas X se encuentra incluido en este grupo.

Son metacéntricos y submetacéntricos, siendo difícil su identificación individual.

Los pares 6 y 7 son identificados por ser los de mayor tamaño en el grupo, así como el cromosoma X; su tamaño se encuentra comprendido entre el par 7 y 8.

Los cromosomas del par 9 son identificados en un solo par (raramente ambos) debido a una constricción secundaria intersticial en los brazos largos.

GRUPO D Presenta tres pares de cromosomas acrocéntricos,

de tamaño mediano. Presentan constricción secundaria y satélites en los

brazos cortos (pero no siempre visibles). Los pares 13, 14 y 15 no son morfológicamente

diferenciados entre si

GRUPO E Incluye 3 pares de cromosomas El par 16 es metacéntrico, e identificable

morfológicamente. Los pares 17 y 18 son submetacéntricos; el

par 17 presenta los brazos cortos ligeramente de mayor tamaño a los del par 18.

GRUPO F Presenta dos pares de cromosomas Los pares 19 y 20 Son metacéntricos pequeños Nos diferenciados morfológicamente

entre si

GRUPO G Presenta 4 cromosomas en las mujeres y 5 cromosomas en los

hombres, aquí se encuentra el cromosoma Y Los pares 21, 22 y el cromosoma Y son acrocéntricos, y los

más pequeños. Los cromosomas 21 y 22 presentan constricciones secundarias

y satélites en el brazo corto (no siempre se pueden observar). No existe diferencia morfológica en ambos pares El cromosoma Y se caracteriza por la ausencia de

constricción secundaria y satélite; se reconoce por el tamaño mayor o menor que los autosómicos, y por la posición paralela de los brazos largos

PRÁCTICA CARIOGRAMA OBJETIVOS:

Aprender el protocolo adecuado para el cultivo de linfocitos

Armar un cariograma humano

MATERIALES Fotografía de célula humana en metafase Tijeras Goma

PROCEDIMIENTOS Descartar la hoja que trae la copia fotográfica de

la metafase Contar el número de cromosomas, prestar

atención con la ocurrencia de superposiciones, asociaciones de acrocéntricos, constricciones secundarias, satélites, etc.; que pueden confundir al contar.

Con la identificación preliminar del grupo al cual pertenece, recortar cada cromosoma, manteniendo un pequeño margen alrededor.

Obtener los pares de cada uno de los grupos del A al G

Dejar para el final los cromosomas del grupo C por ser los más numerosos y semenjantes entre sí.

Colocar cara par cromosómico en la tabla anexa.

http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/traits/karyotype/

http://learn.genetics.utah.edu/content/disorders/whataregd/klinefelter/



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Montaje de Cariograma