MOSQUITOS, MINERÍA Y PETRÓLEO. LYSINIBACILLUS SPHAERICUS:LA VERSATILIDAD DE UN MICROORGANISMO EN BENEFICIO DEL AMBIENTE Y LA SALUD PÚBLICAJENNY DUSSÁN GARZÓN, LUCÍA C. LOZANO ARDILA,

TITO D. PEÑA MONTENEGRO, VIVIAN A. BOJACÁ

MOSQUITOS, MINERÍA Y PETRÓLEO. LYSINIBACILLUS SPHAERICUS:LA VERSATILIDAD DE UN MICROORGANISMO EN BENEFICIO DEL AMBIENTE Y LA SALUD PÚBLICAJENNY DUSSÁN GARZÓN, LUCÍA C. LOZANO ARDILA,

TITO D. PEÑA MONTENEGRO, VIVIAN A. BOJACÁ

http://bancaynegocios.com/wp-content/uploads/2013/07/000_Hkg8843310.jpghttp://commons.wikimedia.org/wiki/File:Culex_sp._Tanzania.jpgFotografía de Alejandro Arango, http://www.flickr.com/photos/alejoarango/4991333208/

42 Hipótesis, apuntes científicos uniandinos, número especial, 2013

MÁS DE DOS DÉCADAS DE ESTUDIO

Quizás lo más maravilloso cuando nos acercamos al conocimiento del mundo microscópico es en-tender cómo organismos con un tamaño promedio de 1 µm y un cromosoma casi mil veces más pequeño que el del hombre tienen una capacidad metabólica incalculable que es funcional según el ambiente donde se encuentre.

Un ejemplo sorprendente es la bacteria Lysinibacillus sphaericus, un microorganismo que durante más de veinte años ha sido el actor central de los proyectos desarrollados por profesores y varias ge-neraciones de estudiantes (microbiólogos, biólogos, ingenieros químicos, ambientales, etc.) vincula-dos al centro de investigaciones Microbiológicas (ciMic). el entendimiento de por qué este microor-ganismo es tan particular y versátil nos ha posibilitado responder algunos interrogantes, como por qué tiene capacidad para matar larvas de mosquitos que son vectores de enfermedades tropicales como el dengue, qué características sobresalientes le permiten desarrollar una actividad fisiológica

Jenny Dussán GarzónPh. D., profesora asociada del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de los Andes.jdussan@uniandes.edu.co

Lucía C. Lozano ArdilaPh. D., investigadora del Centro de Investigaciones Microbiológicas de la Universidad de los Andeslulozano@uniandes.edu.co

Tito D. Peña Monte-negroM. Sc., investigador del Centro de Investigaciones Microbiológicas de la Universidad de los Andestd.pena86@uniandes.edu.co

Vivian A. BojacáM. Sc., asistente graduada del Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental de la Universidad de los Andesva.bojaca23@uniandes.edu.co

Figura 1. Microscopia electrónica de esporas de Lysinibacillus sphaericus. Fuente: Klein D, Uspensky I, Braun S. Tightly Bound Binary Toxin in the Cell Wall of Bacillus sphaericus. Applied and Environmental Microbiology 2002; 68(7): 3300-3307, http://aem.asm.org/content/68/7/3300/F5.large.jpg. Se publica con autorización del American Society for Microbiology Journals.

Mosquitos, minería y petróleo. Lysinibacillus sphaericus: la versatilidad de un microorganismo en beneficio del ambiente y la salud pública

Universidad de los Andes, Facultad de ciencias 43

específica cuando se encuentra en suelos o cuerpos de agua contaminados con compuestos provenientes de la extracción de petróleo, qué lo potencia para acumular en su superficie metales como el plomo, cromo, uranio etc., por qué puede tener un papel dual —matar larvas de mosquitos y remediar ambientes—.

en la década de los años noventa, pensando que colombia es un país megadiverso en flora y fauna, y que de la misma for-ma seguramente lo era en la microbiota presente en ambientes acuáticos y terrestres, decidimos realizar un muestreo en varias partes del territorio colombiano. la gran diversidad encontrada nos llevó a iniciar un viaje fascinante por el conocimiento, desde el nivel microscópico hasta el molecular, de uno de los microor-ganismos más interesantes y versátiles del mundo microbiano.

¿QUIÉN ES LYSINIBACILLUS SPHAERICUS?

Lysinibacillus sphaericus (ls), conocido antes como Bacillus sphaericus, fue aislado en 1904 por neide y Meyer en ambien-tes acuáticos [1]. es un microorganismo que tiene la capacidad de formar una estructura especializada conocida como espora, que tienen una forma circular, en posición terminal del esporan-gio, y vista por el microscopio tiene forma similar a una raqueta (figura 1 y 2) [2, 8].

en 2007 se propuso transferirlo al nuevo género Lysinibacillus, por presentar lisina y asparagina en el peptidoglicano de la pa-red celular [3]. su importancia a nivel mundial, y por lo cual es ampliamente conocido, quedó asentada en los años ochenta, cuando la organización Mundial de la salud (oMs) aprobó el control biológico de mosquitos en países tropicales con una

formulación mixta de dos bacterias: Bacillus thuringiensis y Bacillus sphaericus [4]. en el año 2006 el grupo de Pollmann y colaboradores [5] lo aisló en una mina de uranio y encontró uranio acumulado en una proteína adherida a su pared celular, hoy conocida como capa-s.

DÉCADA DE LOS AÑOS NOVENTA

L. sphaericus y su papel en el control de mosquitos transmisores de enfermedades tropicales

¿Por qué L. sphaericus mata larvas de mosquitos que transmi-ten enfermedades tropicales como el dengue?

Una de las características más apasionantes que tienen las bacterias que pertenecen al grupo conocido comúnmente como bacilos es la de formar una espora. Pero ¿qué es una espora, por qué la forman y qué ventaja le confiere a este tipo de mi-croorganismos?

la vida del mundo microbiano se basa en utilizar los nutrientes del medio que habitan estos microorganismos para metaboli-zarlos, y en utilizar la energía y los compuestos obtenidos para dividirse, generar más células y continuar su crecimiento. los bacilos tienen en su genoma información genética para respon-der según el ambiente en que se encuentre. Por ello pueden detener el crecimiento y la división, y comenzar un proceso de diferenciación celular en el que forman una estructura espe-cializada conocida como espora (figura 3) [8]. Particularmente, L. sphaericus, durante el proceso de esporulación, tiene una ventaja especial: parte de su metabolismo puede sintetizar dos

Figura 2. Microscopia electrónica de célula vegetativa de Lysinibacillus sphaericus. Fuente: Jenny Dussán Garzón, CIMIC. En [8].

Figura 3. Microscopia electrónica de la espora madura de Lysinibacillus sphaericus. Fuente: Jenny Dussán Garzón, CIMIC. En [8].

44 Hipótesis, apuntes científicos uniandinos, número especial, 2013

toxinas, conocidas como bina de 42 kDa y binb de 51 kDa, que conforman el cristal paraesporal [6] y que tienen la capacidad de matar larvas de mosquitos de los géneros Anopheles, Aedes y Culex, vectores de enfermedades como la malaria, el dengue, la filariasis, etc. (figura 4). estas enfermedades, endémicas en países tropicales, se propagan por medio de los mosquitos, y el ciclo se ve favorecido por las condiciones climáticas, lo cual genera un problema de salud pública [7]. no es de extrañar, entonces, que a comienzos de los noventa iniciáramos un mues-treo por colombia en busca del L. sphaericus, con el objetivo de encontrar cepas nativas con actividad entomopatógena.

en regiones como la zona del Pacífico, del atlántico, los lla-nos orientales y el altiplano cundiboyacense realizamos más de quinientos aislamientos, a partir de los cuales seleccionamos veintidós cepas con características típicas de Ls y activas contra larvas de tercer instar de Culex quinquefasciatus, entre las que producían una mortalidad del 100% en 24 horas, comparable a la de la cepa de referencia 2362 del L. sphaericus de la oMs (figura 5) [8].

con estos resultados iniciamos la línea de investigación de L. sphaericus en control biológico de Culex quinquefasciatus. los estudios a nivel fisiológico, bioquímico y molecular de las veinti-dós cepas determinaron que teníamos Ls con alta, media y baja actividad entomopatógena. se evidenció la actividad y codifica-ción genética de la toxina binaria, y en algunas de las cepas estudiadas encontramos otras proteínas toxígenas, como la Mtx-

1, Mtx-2 y Mtx-3, activas también contra mosquitos cuando la bacteria se encuentra en estado vegetativo y no en espora [9]. los resultados de su gran capacidad de ejercer control biológico han sido aún más interesantes porque en los proyectos actuales se ha podido relacionar su actividad toxigénica con la de otra proteína, conocida como capa-s [10]. entonces, es un hecho que la gran diversidad y la alta actividad entomopatógena del L. sphaericus podría ser utilizada en formulaciones para el control integrado de plagas de mosquitos presentes en regiones donde año tras año se reportan brotes de dengue, una enfermedad que merece toda la prevención y atención.

PRIMERA DÉCADA DEL SIGLO XXI

L. sphaericus y su impacto en la minería: biorremediación de metales

¿Por qué este microorganismo puede acumular en su superficie metales como el plomo, cromo y uranio?

la remoción de metales constituye uno de los mayores retos de descontaminación de ambientes a nivel mundial, y, por supues-to, a nivel nacional, debido a que entre las fuentes de contami-nación se encuentran los procesos de extracción de recursos naturales como el carbón, los minerales y el petróleo. También se ha reportado contaminación por procesos industriales como la fabricación de baterías, pinturas, revestimientos, soldaduras y curtiembres, además de productos de uso agropecuario, como

Figura 4. Adulto de Culex quinquefasciatus. Fuente: http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/02122002/00025/PHIL_1771.tif

Universidad de los Andes, Facultad de ciencias 45

pesticidas, fertilizantes y aditivos de alimentación animal [10]. entre 2003 y 2007, en diferentes sitios del mundo dedicados a la minería, se aislaron bacterias cuya clasificación correspondía a L. sphaericus. Resultó muy interesante determinar que en la parte externa de su pared tenían metales acumulados en una cubierta hexagonal que recuerda una cubeta llena de huevos (fi-gura 6). los trabajos de Pollmann con la cepa del L. sphaericus Jg-a12 mostraron cómo este hallazgo podría derivar en alter-nativas para el tratamiento in situ de aguas de minas de uranio [11]. los estudios bioquímicos y moleculares demostraron que la bioadsorción se debía a la presencia de una proteína conocida como capa-S, que conforma nanoclústers en los que se pueden acumular diferentes tipos de metales [11]. otro mecanismo am-pliamente descrito, relativo a un grupo de microorganismos muy diferentes de los bacilos, es la presencia de bombas de eflujo que permiten la entrada de compuestos, antibióticos y otros ele-mentos como metales a la célula [12].

así pues, necesariamente teníamos que responder tres pre-guntas: ¿los aislamientos de L. sphaericus que previamente habíamos estudiado en control de mosquitos también tenían la capacidad de acumular metales como el plomo, cromo, arsénico y mercurio? ¿la proteína capa-s, responsable de la bioadsor-ción/unión de metales en estos microorganismos se encontraba presente? ¿Pueden tener bombas de eflujo para la entrada y

remoción de metales por acumulación interna? entonces, a co-mienzos del año 2000 iniciamos una nueva línea de investiga-ción centrada en L. sphaericus y la biorremediación de metales. Decidimos trabajar con lodos aceitosos provenientes de los pro-cesos de extracción del petróleo, que tienen diferentes metales asociados; por lo tanto, estos residuos se convierten en pasivos ambientales de gran impacto en las regiones de los llanos y la orinoquia colombianos. la capacidad de bioadsorción de arséni-co, cobalto y cromo fue evidente en varias de las cepas estudia-das. De igual forma, aislamientos con alta actividad toxigénica contra larvas de Culex quinquefasciatus mostraron tolerancia a concentraciones mayores de 10.000 ppm de arsenato, de 750 ppm de plomo y de 200 ppm de cromo hexavalente [13]. en todos los aislamientos estudiados se determinó la presencia de la proteína capa-s (> 100KDa), con una alta expresión durante la fase vegetativa de crecimiento (no en espora) (figura 7) [14]. adicionalmente se encontró níquel en extractos celulares y plo-mo atrapado en el periplasma y la membrana celular (resultados actuales) (figura 8 y 9) [12, 15]. De manera que es probable que este microorganismo tenga mecanismos dependientes de bombas de eflujo también para acumular metales. estos resulta-dos en remoción de metales mostraron el potencial de este mi-croorganismo y su aplicación en un futuro cercano en procesos de biorremediación en campo impactados por la extracción de recursos naturales como petróleo y minería.

Figura 5. Larva de Culex quinquefasciatus. Fuente: http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/12554/12554.tif

46 Hipótesis, apuntes científicos uniandinos, número especial, 2013

Figura 7. Electroforesis de proteínas extraidas de cultivos en fase vegetativa de Lysinibacillus sphaericus. La banda de alto peso molecular (mayor a 148 kDa) corresponde a proteínas Capa-S. Fuente: Fotografía de Lucía C Lozano Ardila, CIMIC. En [10].

1 2 3 4 5 M

250 kDA

148 kDA

98 kDA

64 kDA

50 kDA

36 kDA

Figura 6. Vista tridimensional de una capa recristalizada de proteínas Capa–S de Lysinibacillus sphaericus por microscopía de fuerza atómica. Fuente: Tomado de Progress in Organic Coatings 47, Sleytr et al. 2003.

Universidad de los Andes, Facultad de ciencias 47

DÉCADA DE 2010

L. sphaericus y la era de las ómicas: genómica, transcriptómica filogenómica y más… petróleo

en este fascinante viaje por el conocimiento y entendimiento de la versatilidad metabólica del L. sphaericus necesariamen-te teníamos que detenernos y preguntarnos: ¿cómo podemos profundizar más en el conocimiento de este microorganismo y entender su relación con los aislamientos de otras partes del mundo? naturalmente, la respuesta nos condujo a la secuencia-ción del genoma de aislamientos, que mostraron los resultados más interesantes, menos similares al comportamiento espera-do, con mayor versatilidad en cuanto a remoción de metales, al tipo y número de metales absorbidos y/o acumulados y a la actividad entomotoxigénica contra mosquitos. Del género Lysi-nibacillus se encuentran secuenciados hasta el momento cinco genomas, uno de los cuales corresponde a L. sphaericus, cepa c3-41, patógena para larvas de mosquitos comercializada prin-cipalmente en china [16]; Lysinibacillus fusiformis, cepas Zc1, que presenta la capacidad de reducir cromo hexavalente [17], y cepa Zb2; Lysinibacillus massiliensis 4400831 y Lysinibacillus boronitolerans F1182 [18].

así, en el inicio de esta tercera década de estudio del L. sphae-ricus nos hemos concentrado en el análisis de las secuencias de los genomas de dos aislamientos nativos. la cepa cbaM5, aislada a partir de muestras de lodos corte-base-aceite prove-nientes de la exploración petrolera en la región del casanare [19]. en la secuencia de su genoma se determinó la presencia de genes que codifican para toxinas con actividad larvicida en mosquitos, genes relacionados con la proteína de capa-s, así como genes involucrados en la resistencia a arsénico, cromo y plomo [20].

en el segundo aislamiento, L. sphaericus oT4b.31, proveniente de larvas de coleóptero encontradas en la sabana de bogotá, identificamos diferentes regiones con operones implicados en la bioacumulación de cd, Zn, co, cu, ni, cr y as, al igual que secuencias codificantes y homólogas para la proteína de la capa-s, genes implicados en la degradación de hidrocarburos aromáticos como el tolueno y el fenol, y ningún gen compartido codificante para la toxicidad de mosquitos (figura 10) [21].

¿Qué significado, en términos de aplicación ambiental y salud pública, aporta la secuenciación de genomas? Pues bien, el hecho de tener secuenciados los genomas de varias cepas del género Lysinibacillus nos permitirá, desde el conocimiento básico, continuar relacionando las actividades biológicas con los genes que las codifican, y así podremos dirigir los estudios de transcriptomas para la expresión de genes específicos de interés en condiciones ambientales con miras a la remoción de metales y a la actividad entomopatógena. Por otra parte, con los genomas secuenciados trataremos de entender y acerca-nos más a la clasificación filogenética de este grupo de mi-croorganismos que siempre ha sido controvertida y modificada [22]. la utilización de la filogenómica es importante porque se presenta como una nueva alternativa en la que los genes con anotación funcional presentes en los genomas secuenciados permiten realizar la comparación y clasificación de organismos de forma más discriminada [12]. los dos genomas secuencia-dos mostraron un plus adicional en L. sphaericus: la capacidad de degradar compuestos aromáticos y saturados. De manera que con algunos de los aislamientos de mayor interés extraídos de los lodos aceitosos grado aPi medio y liviano provenientes de la región del casanare iniciamos una evaluación preliminar. los resultados obtenidos hasta el momento han mostrado que la anotación en los genomas de las cepas cbaM5 y oT4b.31 es funcional y se expresa exitosamente en términos de de-

Figura 8. Microscopía electrónica de barrido de células vegetativas de Lysinibacillus sphaericus cepa OT4b.31. Fuente: Fotografía de Tito D Peña Montenegro, CIMIC. En [21].

Figura 9. Absorción de plomo en periplasma, membrana celular y citoplasma de células vegetativas de Lysinibacillus sphaericus cepa OT4b.31. Fuente: Imagen de Vivian Andrea Bojacá, CIMIC. En [15].

120 %

100 %

80 %

60 %

40 %

20 %

0 %

Conc

entra

ción

relat

iva

CBAM5 3(III)7 Ot4b31

Citoplasma Membrana Periplasma

48 Hipótesis, apuntes científicos uniandinos, número especial, 2013

gradación de lodos aceitosos provenientes de las prácticas de explotación del petróleo.

Importancia de la riqueza presente en Colombia de L. sphaericus

luego de más de dos décadas de estudio de la bacteria L. sphaericus podemos afirmar que colombia posee una riqueza de valor incalculable de este microorganismo. Ubicados en el trópico, donde la presencia de mosquitos vectores de enferme-dades como el dengue es un problema de salud pública que merece atención, L. sphaericus es una excelente opción para el manejo de plagas en épocas de invierno, pues está ampliamente documentado que las cepas nativas pueden ejercer control bio-lógico al matar larvas de Culex quinquefasciatus por tres meca-nismos: 1. Producción de la toxina binaria (bina, binb) durante la esporulación; 2. Producción de toxinas Mtx-1, Mtx-2 y Mtx-3 por la célula vegetativa, y 3. Por la proteína capa-s, asociada a la pared celular durante el crecimiento exponencial.

en el campo de la biorremediación, la aplicación del L. sphaeri-cus es fundamental y prioritaria. colombia cuenta con una gran

riqueza de recursos naturales en carbón, minería y petróleo. sin embargo, las prácticas de explotación de estos recursos gene-ran altísimos impactos ambientales por los residuos sólidos y/o líquidos que quedan como pasivos en el suelo o que terminan contaminando aguas y, en consecuencia, generando un proble-ma de salud pública y efectos negativos en la flora, fauna y la mi-crobiota de la región afectada. en el sector minero, por ejemplo, para la extracción de metales como el oro se generan residuos con altas concentraciones de otros metales sin valor comercial, pero sumamente tóxicos, como el arsénico, el cromo y el plomo, que son separados a su vez con cianuro o mercurio para obtener el oro puro, etc. estos elementos nocivos son comparables con los lodos aceitosos provenientes de la explotación del petróleo, que vienen igualmente acompañados con alta concentración de metales muy tóxicos, como el bario, el cadmio y el plomo. De manera que la implementación de la capacidad dual que tie-ne L. sphaericus en la remoción por adsorción y/o acumulación de diferentes metales por los dos mecanismos documentados —bombas de eflujo o por adsorción a la proteína capa-s—, contribuiría inmensamente al desarrollo de tecnologías limpias, amigables con el ambiente, y se reflejaría en el crecimiento del sector minero debido a la innovación de tecnologías dirigidas

Figura 10. Mapa genómico de Lysinibacillus sphaericus cepa OT4b.31. Desde fuera hacia el centro: scaffolds orientados y ordenados cromosomales (azul y rojo) y extracromosomales (naranja y negro), genes anotados en cadena positiva, genes anotados en cadena negativa, genes de RNA, contenido de GC y GC skew. Fuente: Imagen de Tito D Peña Montenegro, CIMIC. En [21].

Universidad de los Andes, Facultad de ciencias 49

a la captura de metales de interés económico en cuerpos de agua, así como a las prácticas generales de biorremediación de pasivos ambientales provenientes de la extracción del petróleo.

NOTA

el conocimiento año tras año ha sido enriquecedor gracias a la tesis doctoral de lucía c. lozano ardila (2012), las tesis de maestría de Diana R. andrade linares (1997), lucía c. lozano

ardila (1998), sandra del Pilar Vanegas Moyano (2001), geidy X. ortega Trujillo (2004), Julián e. Zamora Prieto (2006), silvia c. Rivera Rodríguez (2007), lina Velásquez brun (2009), Vivian a. bojacá bautista (2013), Tito D. Peña Montenegro (2013), Javier e. Vargas calle (en curso), lina e. Manchola Muñoz (en curso), Darío a. Rangel shaw (en curso) y los trabajos de pregrado de silvia c. Rivera Rodríguez (2005), Ruth ortiz castro (2007), lina Velásquez brun (2008), Vivian a. bojacá bautista (2010) y Javier e. Vargas calle (2012). •

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