MÉTODO DE DETECCIÓN DE NOROVIRUS Y HEPATITIS A

Jornadas de Referencia sobre Análisis de Alimentos Centro Nacional de Alimentación Majadahonda, 11 junio 2014

Mercedes Álvarez García Servicio de Microbiología Alimentaria CNA (AECOSAN)

Centro

Nacional de

Alimentación

VIRUS

Parásitos intracelulares obligados

Infección a dosis muy bajas

Resistentes a condiciones ambientales

Centro

Nacional de

Alimentación

• Intestino de humanos y animales Hábitat

• Oral - Fecal Ruta de

transmisión

• Vertidos (ríos, lagos y mares) Presentes en

aguas residuales

VIRUS ENTÉRICOS

Centro

Nacional de

Alimentación

He

pat

itis

A • ARNss +

• Grupo de riesgo 2

• Incubación: 4 semanas

• Síntomas: Fiebre, náuseas, vómitos, diarrea, ictericia

• Duración: meses

• No estacional

No

rovi

rus

• ARNss +

• Grupo de riesgo 2

• Incubación: 1 - 4 días

• Síntomas: Fiebre, náuseas, vómitos, diarrea

• Duración: 2 días

• Estacional: Invierno

Virus de la Hepatitis A y Norovirus

Centro

Nacional de

Alimentación

MOLUSCOS BIVALVOS

Acumulación de virus en el aparato digestivo

Sedimento marino

Riesgo consumo

Aguas superficiales

Centro

Nacional de

Alimentación

ISO/TS 15216:2013

Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Método horizontal para la detección de virus de la hepatitis A y norovirus en alimentos utilizando RT-PCR en tiempo real.

Parte 1: Método para la determinación cuantitativa

Parte 2: Método para la determinación cualitativa

Método de detección de HAV y NoV en moluscos bivalvos

Centro

Nacional de

Alimentación

Método de detección de HAV y NoV en moluscos bivalvos

1. Extracción del virus

2. Extracción del ARN viral

3. RT-PCR en tiempo real

Centro

Nacional de

Alimentación

Método de detección de HAV y NoV en moluscos bivalvos

1. Extracción del virus

2. Extracción del ARN viral

3. RT-PCR en tiempo real

Centro

Nacional de

Alimentación

1. Extracción del virus

Hepatopáncreas (glándula digestiva): zona preferente de bioacumulación del virus

2 g

hepatopáncreas

2 ml

proteinasa K

Lisis de los tejidos del animal

y

liberación de las partículas virales

1 h, 37ºC

Centro

Nacional de

Alimentación

Método de detección de HAV Y NoV en moluscos bivalvos

1. Extracción del virus

2. Extracción del ARN viral

3. RT-PCR en tiempo real

Centro

Nacional de

Alimentación

2. Extracción del ARN viral

Lisis

Lavados

Elución

Centro

Nacional de

Alimentación

Método de detección de HAV Y NoV en moluscos bivalvos

1. Extracción del virus

2. Extracción del ARN viral

3. RT-PCR en tiempo real

Centro

Nacional de

Alimentación

5´ 3´ ARN viral

RT

5´ 3´ 3´ 5´

ADNc

PCR

3´ 5´ 5´ 3´

RT

RT Master Mix ARN viral

PCR

PCR Master Mix ADNc

RT-PCR en dos pasos

RT y PCR

RT Master Mix

ARN viral

PCR Master Mix

RT-PCR en un paso

3. RT-PCR en tiempo real

Centro

Nacional de

Alimentación

3. RT-PCR en tiempo real. Primers y sondas

Norovirus GI

Norovirus GII

Hepatitis A

5291 CGCTGGATGC GCTTCCATGA CCTCGGATTG TGGACAGGAG ATCGCGATCT TCTGCCCGAA TTCGTAAATG ATGATGGCGT CTAAGGACGC

5011 AATGTTCAGA TGGATGAGAT TCTCAGATCT GAGCACGTGG GAGGGCGATC GCAATCTGGC TCCCAGTTTT GTGAATGAAG ATGGCGTCGA

61 TGATACCTCA CCGCCGTTTG CCTAGGCTAT AGGCTAAATT TTCCCTTTCC CTTTTCCCTT TCCTATTCCC TTTGTTTTGC TTGTAAATAT TAATTCCTGC 171 AGGTTCAGGG TTCTTAAATC TGTTTCTCTA TAAGAACACT CATTTTTCAC GCTTTCTGTC TTCTTTCTTC CAGGGCTCTC CCCTTGCCCT

QNIF4 NV1LCR

COG2R QNIF2

HAV240

HAV68

NVGG1p

HAV150-

QNIFS

Centro

Nacional de

Alimentación

RNA UltraSense™ One-Step Quantitative RT-

PCRSystem

RT

1 hora 55ºC

PCR

5 min 95ºC 15 seg 95ºC

1 min 60ºC x45 1 min 65ºC

x45

3. RT-PCR en tiempo real. Condiciones

Centro

Nacional de

Alimentación