MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS ALIMENTARIOS. VENTAJAS Y

LIMITACIONES

Vidal N.P., Yusta A.M., Manzanos M.J., Goicoechea E., Guillén M.D.*

Tecnología de los Alimentos. Facultad de Farmacia. Centro de Investigación Lascaray. Universidad del País Vasco (UPV/EHU). Paseo de la Universidad 7, 01006 Vitoria

*E-mail: mariadolores.guillen@ehu.es

Palabras clave: Matrices alimentarias; Bligh & Dyer; disulfuro de carbono; RMN de 1H RESUMEN

Los lípidos alimentarios son una familia muy heterogénea de compuestos que cumplen

funciones muy importantes en los alimentos. Presentan como característica común su hidrofobicidad y se suelen definir como los compuestos que se disuelven en disolventes orgánicos. Este grupo de compuestos, además de contribuir a las propiedades organolépticas (aroma, textura) de los alimentos, tiene gran influencia en sus propiedades nutritivas y a veces también en su seguridad. Es por ello que el estudio cualitativo y cuantitativo de los lípidos de los alimentos es imprescindible para conocer la calidad y seguridad de éstos. El

primer paso para su estudio exige su extracción de la matriz alimentaria. Se han propuesto diferentes métodos de extracción basados en el empleo de mezclas de disolventes orgánicos de diferente polaridad. En la mayoría de los estudios de alimentos se siguen empleando los métodos propuestos por Folch et al. (1957) y por Bligh & Dyer (1959). En este trabajo se compara el método de Bligh & Dyer con otro que emplea disulfuro de carbono en la extracción de lípidos de origen animal; esta comparación se refiere no sólo a las características del método, sino también al rendimiento de extracción y a la

representatividad de los lípidos extraídos en relación a los contenidos en el alimento. La caracterización de los lípidos extraídos se llevó a cabo mediante Resonancia Magnética

Nuclear de Protón (RMN de 1H). Asimismo, se comentan las ventajas y limitaciones de ambos métodos. INTRODUCCIÓN

Para llevar a cabo la extracción de lípidos de matrices alimentarias se han propuesto diversos métodos, la mayoría basados en el uso de mezclas de disolventes orgánicos de diferente polaridad. Los más usados son los de Folch et al. (1957) y Bligh & Dyer (1959), en los que se emplea una mezcla de cloroformo, metanol y agua. Puede decirse que en las últimas cinco décadas el método Bligh & Dyer (1959) ha sido el más utilizado para la extracción de lípidos de muestras de pescado y de alimentos variados (Iverson et al, 2001; Manirakiza et al,

2001). Sin embargo, estos métodos son muy laboriosos, requieren mucho tiempo para eliminar los disolventes y a veces presentan problemas de reproducibilidad. Asimismo y dado que los disolventes cloroformo y metanol tienen cierta toxicidad (Potts &

Johnson, 1952; Weisburger, 1977), se han propuesto otros métodos que emplean disolventes menos tóxicos o libres de toxicidad, tales como: hexano, isopropanol y agua (Hara & Radin, 1978); heptano, etanol y agua (Burton et al, 1985); y hexano, acetona y agua (Honeycutt et al, 1995).

En este contexto, en este estudio se compara el método clásico de Bligh & Dyer con otro que emplea disulfuro de carbono (CS2) y hace uso de ultrasonidos para la extracción de los lípidos de algunas matrices alimentarias de origen animal; esta comparación se refiere no sólo a las características del método, sino también al rendimiento de extracción, a la representatividad de los lípidos extraídos en relación a los contenidos en el alimento y a los efectos degradativos que el método de extracción puede provocar en los lípidos objeto de

estudio.

MATERIALES Y MÉTODOS Muestras Las matrices de origen animal empleadas en este estudio fueron tejido adiposo de cerdo y lubina cultivada que poseen una composición lipídica muy diferente. Las muestras de tejido

adiposo de cerdo (n=6), denominadas T1-T6, y las muestras de lubina (n=6), denominadas L1-L6, fueron adquiridas en supermercados locales. La piel del tejido adiposo de cerdo fue eliminada por completo. Las lubinas fueron evisceradas, lavadas, fileteadas y peladas. Extracción de lípidos

La extracción de los lípidos de las diferentes muestras (n=12) se realizó mediante dos métodos: el método clásico de Bligh & Dyer (1959) (B&D) y otro basado en el empleo de disulfuro de carbono (CS2) que hace uso de ultrasonidos; este último se ha venido utilizando en algunos estudios previos (Guillén & Ruiz, 2004; Vidal et al, 2012). La extracción de lípidos mediante cada uno de los dos métodos se realizó por duplicado en todos los casos.

Adquisición del espectro de Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RMN de 1H) Los lípidos extraídos se caracterizaron mediante la información obtenida de su espectro de RMN de 1H. Los espectros se obtuvieron en un espectrómetro Bruker Avance 400 operando a 400 MHz. La preparación de la muestra se realizó como en estudios previos y lo mismo puede decirse en relación a los parámetros de adquisición del espectro (Guillén et al, 2004;

2008). Tanto los porcentajes molares de ciertos grupos acilo, como la concentración de colesterol y fosfatidilcolina se determinaron utilizando aproximaciones desarrolladas

previamente (Guillén et al, 2008; Guillén & Uriarte, 2012; Vidal et al, 2012). Cada muestra fue analizada por duplicado.

Análisis estadístico El análisis del grado de significación estadística de las diferencias encontradas en los parámetros de composición obtenidos por RMN de 1H de los lípidos extraídos mediante ambos métodos fue realizado mediante el test t de Student con un nivel de confianza del 95 % (p<0.05). Para realizar este análisis estadístico se empleó el paquete Statgraphics Plus (versión 5.1). Las diferencias de los datos mostrados en la Tabla 1, señalados con letras

distintas, son estadísticamente significativas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Aspectos metodológicos

Como se ha mencionado anteriormente, a pesar de ser ampliamente utilizado, el método B&D presenta ciertos inconvenientes. Entre ellos cabe destacar por un lado, que se trata de un método largo, que implica numerosas etapas, lo cual provoca que gran parte del éxito y repetibilidad de los resultados recaiga en la pericia del personal que lo realiza, y por otro, que se emplean elevados volúmenes de disolventes (por cada 20 g de muestra 60 ml de

cloroformo, 40 ml de metanol y 20 ml de agua, mientras que en el método alternativo aquí propuesto por cada 20 g de muestra se emplean sólo 40 ml de CS2). El empleo de tanta cantidad de disolventes, además de ser poco recomendable desde el punto de vista medioambiental, complica el proceso de extracción, ya que se necesita más tiempo para poder eliminar todos los restos de disolventes.

Por todo ello el método de extracción aquí propuesto basado en el empleo de disulfuro de carbono podría resultar una alternativa interesante, ya que al implicar menos etapas es

mucho más rápido y sencillo; además, utiliza un volumen de disolvente tres veces menor (40 ml vs. 120 ml) que el de B&D, lo cual facilita su posterior eliminación, que por otra parte es

sencilla debido al bajo punto de ebullición del disolvente. A estas ventajas se suman otras,

como que no se generan señales en RMN de 1H. 2. Rendimientos de extracción

La Tabla 1 muestra los rendimientos promedio de extracción de lípidos, expresados en peso húmedo (g/100 g), obtenidos a partir de las muestras de tejido adiposo de cerdo (n=6) y

lubina (n=6) mediante los métodos B&D y CS2. En ambos tipos de muestras los rendimientos obtenidos son significativamente diferentes para cada uno de los métodos empleados. Extracción de los lípidos de tejido adiposo de cerdo. Los rendimientos de extracción de las muestras de tejido adiposo (T1-T6) empleando el método B&D (66,6±7,9 %) son significativamente menores a los obtenidos por el método que emplea CS2 (79,7±1,7 %). Estos resultados ponen de manifiesto que para este tipo de matriz lipídica el segundo método

tiene mayor capacidad extractiva que el primero y refuerzan los resultados de estudios

previos, referidos a extracción de lípidos en carne y derivados cárnicos, en los que también se ha evidenciado que el método B&D subestima el contenido total de lípidos en muestras de alto contenido graso (Pérez-Palacios et al, 2008) o lo que es lo mismo, que este método no tiene capacidad para extraer todos los lípidos presentes en la matriz objeto de estudio. Esto podría ser debido a que en este tipo de matriz la cantidad de lípidos es muy elevada y además se trata fundamentalmente de lípidos no polares cuya extracción sería quizá más

eficiente con el empleo de disolventes de muy baja polaridad o no polares. Por otra parte se observa que aunque se han tomado para extraer muestras similares en todos los casos, la desviación entre muestras en el caso del método de B&D es muy superior a la que se ha obtenido empleando CS2; esto indica que el segundo método proporciona una reproducibilidad mayor que el primero en este tipo de matriz.

Tabla 1. Rendimientos promedio de extracción de lípidos, expresados como porcentaje en peso húmedo (%), de las muestras de tejido adiposo de cerdo (T) y de lubina (L), obtenidos mediante los métodos Bligh & Dyer (B&D) y empleando CS2.

Muestras B&D (%) CS2 (%)

Tejido adiposo (T1-T6) 66,6±7,9a 79,7±1,7b

Lubina (L1-L6) 8,1±2,6a 5,1±1,6b Datos con letra diferente en la misma fila son significativamente diferentes (p<0.05).

Extracción de los lípidos de lubina. Por el contrario, los rendimientos de extracción obtenidos de las muestras de lubina por el método B&D son significativamente mayores

(8,1±2,6 %) que los obtenidos empleando CS2 (5,1±1,6 %). A este resultado pueden contribuir diferentes factores. Por una parte y aunque la lubina cultivada tiene un contenido mucho más alto en lípidos que

la lubina salvaje, su contenido en lípidos es mucho más bajo que en el tejido adiposo de cerdo; algunos autores cifran el porcentaje de lípidos en lubina cultivada en un intervalo entre 5 y 10% (Alasavar et al, 2002; Fuentes et al, 2010) en concordancia con los resultados

obtenidos en este estudio por cualquiera de los dos métodos. Debido a que el contenido en lípidos en lubina es muy inferior al contenido del tejido adiposo de cerdo, sería de esperar que el método de B&D fuera más eficiente en la extracción de los primeros; sin embargo, algunos autores indican que en muestras de pescado el método de B&D se considera adecuado cuando el porcentaje de lípidos es menor del 2% (Iverson et al, 2001) y no es este el caso. Por otra parte, la naturaleza de los lípidos de lubina cultivada es muy diferente de la

naturaleza de los lípidos de tejido adiposo de cerdo, siendo los primeros más polares y ricos en fosfolípidos (Mannina et al, 2008; Vidal et al, 2012); debido a esto, los disolventes empleados en el método B&D podrían mostrar una mayor eficiencia en la extracción de estos lípidos que el CS2, lo que podría explicar el mayor rendimiento obtenido mediante el método B&D.

Sin embargo, también hay que tener en cuenta que la dificultad para eliminar totalmente los disolventes en el método de B&D de los extractos de matrices pobres en lípidos, como es el

caso, puede conducir a una sobreestimación del rendimiento de extracción y podría explicar en parte el resultado obtenido.

Por último, únicamente queda comentar que, al igual que en la extracción de tejido adiposo

de cerdo, en la extracción de lubina cultivada se observa mayor variación en los rendimientos obtenidos con el método B&D que empleando CS2, lo que podría interpretarse como que el segundo método proporciona una reproducibilidad mayor que el primero también en esta matriz. 3. Representatividad de los lípidos extraídos

Con objeto de tener información sobre la naturaleza de los lípidos extraídos por ambos métodos en las dos matrices estudiadas, éstos se estudiaron mediante Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RMN de 1H). En las Figuras 1-3 se recogen los valores promedio de los porcentajes molares de los principales grupos acilo y la concentración de colesterol y fosfolípidos en los lípidos extraídos de tejido adiposo de cerdo y de lubina mediante ambos

métodos. Estos datos han sido obtenidos a partir de sus espectros de RMN de 1H. Esta

determinación se realizó tal y como se ha descrito en estudios previos (Guillén et al, 2008; Guillén & Uriarte 2012; Vidal et al, 2012). Lípidos extraídos por ambos métodos del tejido adiposo de cerdo. Los espectros de RMN de 1H de los lípidos obtenidos por ambos métodos son muy similares, lo que indica que cualquiera de ellos proporciona extractos representativos del conjunto de lípidos del tejido adiposo. A la misma conclusión se llega tras la determinación cuantitativa de los porcentajes

molares de los distintos tipos de grupos acilo de los lípidos extraídos que se ha representado en la Figura 1a.

Puede observarse que las proporciones molares de los distintos tipos de grupos acilo de los extractos obtenidos por ambos métodos son muy parecidas y están también en total concordancia con los resultados de otros autores que han estudiado este tipo de matrices empleando otros métodos (Monziols et al, 2007). Aunque la eficiencia en la extracción

empleando CS2 es superior a la del método B&D, la determinación de porcentajes molares no viene afectada por el rendimiento de la extracción. En la Figura 1b se muestra el contenido en colesterol, expresado en mmol/mol de triglicérido, de los lípidos extraídos por ambos métodos, observándose que apenas existe diferencia entre las concentraciones encontradas en ambos extractos. Asimismo, se aplicó el test t de Student, para analizar si existían diferencias significativas

entre los datos que caracterizan a los lípidos obtenidos por ambos métodos con resultados negativos reiterando lo ya comentado, es decir, que los lípidos extraídos del tejido adiposo de cerdo con cualquiera de los dos métodos son representativos del conjunto de lípidos contenidos en esta matriz aunque el rendimiento de extracción sea diferente con ambos

métodos. De hecho hay que señalar que las desviaciones en los resultados promedio obtenidos por ambos métodos son menores que las desviaciones entre muestras dentro del mismo método.

Lípidos extraídos por ambos métodos de lubina cultivada. En este caso aunque los espectros de RMN de 1H de los lípidos obtenidos por ambos métodos son muy similares, una

Figura 1. a) Porcentajes molares promedio y desviaciones estándar, determinados mediante RMN de 1H, de los grupos acilo de los lípidos de tejido adiposo de cerdo extraídos mediante el método de B&D y empleando CS2. L: Linoleico; MU: Monoinsaturados; S: Saturados; Ln: Linolénico. b) Contenido promedio de colesterol expresado en mmol/mol de triglicérido, determinado mediante RMN de 1H, en los lípidos de tejido adiposo de cerdo mediante el método de B&D y empleando CS2. TG: triglicérido.

ampliación de los mismos permite observar algunas diferencias que se aprecian en las

determinaciones que se comentan a continuación.

Tal y como se observa en la Figura 2a los valores promedio de los porcentajes molares de algunos de los principales grupos acilo presentes en los lípidos extraídos por ambos métodos son muy parecidos; de hecho las desviaciones en los resultados promedio obtenidos por ambos métodos son menores que las desviaciones entre muestras dentro del mismo método. Asimismo, el test t de Student no encuentra diferencias significativas entre los resultados obtenidos por ambos métodos.

Figura 3. Concentración de fosfatidilcolina expresada en mmol/L de aceite, determinada mediante RMN de 1H de los lípidos de lubina obtenidos mediante B&D y empleando CS2.

Sin embargo, sí se observaron diferencias en cuanto a la concentración de componentes minoritarios presentes en los lípidos de lubina extraídos por ambos métodos. Como se puede

observar en la Figura 2b, se encontraron concentraciones significativamente superiores de colesterol en los extractos obtenidos mediante el método B&D que en los obtenidos mediante CS2. También se encontraron concentraciones significativamente superiores de fosfatidilcolina, como se puede observar en la Figura 3, en los extractos obtenidos mediante el método

B&D. La diferente eficiencia de ambos métodos para extraer estos componentes minoritarios se puede deber a la polaridad de los disolventes empleados en ambos métodos. En resumen, independientemente de los rendimientos de extracción, ambos métodos extraen lípidos representativos del conjunto de lípidos de cada matriz. Sin embargo hay que señalar que el método de B&D es más eficiente en la extracción de los lípidos minoritarios de lubina que el que emplea CS2, aunque éste ultimo también es capaz de extraer esos compuestos si

bien en una proporción inferior. 4. Capacidad de ambos métodos para degradar por oxidación las muestras objeto

de extracción Hay que destacar que algunos extractos de lípidos de lubina obtenidos mediante el método

de B&D contienen presumiblemente hidroperóxidos.

Figura 2. a) Porcentajes molares promedio y desviaciones estándar, determinados mediante RMN de 1H, de los principales grupos acilo de los lípidos de lubina cultivada extraídos mediante el método de B&D y empleando CS2. ω-3: Omega-3; Di-ω6: Diinsaturados Omega-6; S: Saturados. b) Contenido promedio de colesterol expresado en mmol/mol de triglicérido, determinado mediante RMN de 1H, en los lípidos de lubina cultivada mediante el método de B&D y empleando CS2. (TG: triglicérido).

Este hecho se puso de manifiesto por la aparición en el espectro de RMN de 1H de estos

lípidos de una señal centrada a 8.7 ppm asignable a grupos hidroperóxido (-OOH) de compuestos primarios de oxidación (Guillén & Ruiz, 2005). En la Figura 4 se muestra la citada región de los espectros de los lípidos extraídos de la misma lubina mediante ambos métodos. Puede observarse que la señal a 8,7 ppm solamente está presente en el espectro de los lípidos extraídos mediante el método de B&D. Esto indica que el proceso de extracción de B&D puede provocar la oxidación de los lípidos de lubina, que por otra parte son muy susceptibles de sufrir oxidación. Este hecho ha sido también

observado en estudios previos por otros autores (Undeland et a, 1998). En cambio, en ninguno de los espectros de los extractos lipídicos de lubina obtenidos mediante el empleo de CS2 se detectó esta señal, de lo que se infiere que este segundo método no provoca degradaciones oxidativas.

Figura 4. Región comprendida entre 8.3 y 9.3 ppm del espectro de RMN de 1H de los extractos lipídicos de la muestra de lubina L1, obtenidos mediante los métodos B&D (L1BD) y empleando CS2 (L1CS).

CONCLUSIONES El rendimiento de extracción de lípidos de matrices alimentarias ricas en lípidos no polares es superior cuando se emplea el método que usa disulfuro de carbono que cuando se usa el método clásico de Bligh & Dyer. Sin embargo el rendimiento obtenido por este último método

es superior al primero en la extracción de lípidos con polaridad intermedia o alta presentes

en matrices con bajo contenido en lípidos. Independientemente de los rendimientos de extracción, los porcentajes molares de los grupos acilo de los lípidos, extraídos con ambos métodos, de las dos matrices estudiadas y determinados a partir de sus espectros de RMN de 1H, son muy parecidos, lo que significa que estos lípidos son representativos del conjunto. Sin embargo, el rendimiento de extracción de colesterol y de fosfatidilcolina es superior con el método de Bligh & Dyer que con el que emplea disulfuro de carbono.

No obstante, hay que destacar que el método de extracción Bligh & Dyer puede provocar la oxidación de los lípidos extraídos cuando se trata de lípidos susceptibles de sufrir este proceso. En definitiva, el método de extracción de lípidos que emplea disulfuro de carbono es más sencillo, rápido y práctico que el de Bligh & Dyer y se considera de gran interés especialmente para muestras alimentarias ricas en lípidos y para todas aquellas cuyos lípidos se oxidan con facilidad.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (MCINN, AGL2009-09904), por el Gobierno Vasco (EJ-GV, GIC10/IT-463-10) y por la Universidad el País Vasco (UPV/EHU, UFI-11/21- Calidad y Seguridad Alimentaria). A.M. Yusta y N.P. Vidal agradecen al EJ-GV y MICINN respectivamente la concesión de una beca predoctoral.

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