Mycobacterium Tubercolosis Mce3E Suprime Inmunorespuestas Innatas Del Huésped

7/23/2019 Mycobacterium Tubercolosis Mce3E Suprime Inmunorespuestas Innatas Del Husped...

1/19

Mycobacterium tubercolosisMce3E suprime la inmunorespuesta

innata del hospedador dirigiendo la sealizacin ERK1/2

La capacidad para subvertir las defensas inmunitarias del husped para promover su supervivencia

intracelular es crucial para la patognesis de la tuberculosis (TB) patgeno causante Mycobacterium

tuberculosis. La protena 3E de entrada de clulas de mamferos (Mce3E), situada en la regin de

diferencia 15 del genoma de M. tuberculosis y ausente en Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gurin,

tiene un papel esencial en la facilitacin de la internalizacin de clulas de mamfero por micobacterias.

Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre el papel de Mce3E en la modulacin de la respuesta

inmune innata de acogida. En este estudio, se demuestra que Mce3E inhibe la activacin de la va de

sealizacin ERK1 / 2, dando lugar a la supresin de la expresin TNF e IL-6, y la promocin de la

supervivencia de micobacterias dentro de los macrfagos. Mce3E interacta y se colocaliza con ERK1 / 2

en el retculo endoplsmico en un motivo de DEF (un motivo de ERK-docking) de manera dependiente, se

traslada ERK1 / 2 desde el citoplasma al retculo endoplasmtico, y finalmente reduce la asociacin deERK1 / 2 con MEK1 y bloquea la translocacin nuclear de fosfato ERK1 / 2. Una forma mutante del motivo

DEF de Mce3E (F294A) pierde su capacidad para suprimir la expresin TNF y IL-6 y para promover la

supervivencia intracelular de las micobacterias. La inhibicin de la va ERK1 / 2 en macrfagos utilizando

U0126, un inhibidor especfico de la va de ERK, tambin conduce a la expresin suprimida de TNF e IL-6 y

mejora la supervivencia intracelular de micobacterias. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren

que M. tuberculosis Mce3E explota la va de sealizacin ERK1/2 para suprimir la respuesta inmune innata

de acogida, proporcionando un objetivo potencial Mce3E- ERK1/2 basado en la interfaz de medicamentos

contra M. tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis sigue siendo una de las principales amenazas para la salud a nivel

mundial, lo que resulta en una vctima anual de ~ 2 millones de personas en todo el mundo.Aunque casi un tercio de la poblacin humana est infectada con M. tuberculosis, slo ~ 10% de

los individuos infectados desarrollan la enfermedad activa durante su vida. La patognesis de M.

tuberculosis en gran medida, ya que puede escapar del sistema de defensa inmune del

hospedador y por lo tanto sobrevivir en el entorno hostil de los macrfagos humanos. La

coevolucin prolongada de M. tuberculosis con sus ejrcitos lo ha llevado a mltiples estrategias

de supervivencia para interferir con una amplia gama de procesos de husped celular, como la

produccin de citoquinas, la biognesis de fagolisosoma, y la modulacin de la supervivencia de

los macrfagos. La mayora de los frmacos disponibles en la actualidad slo son parcialmente

eficaces debido a la naturaleza impermeable de la pared celular micobacteriana y la propensin de

que M. tuberculosis desarrolle resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, es urgente paradesentraar los detalles moleculares subrayando que M. tuberculosis interacta con los

macrfagos, que podran ser de utilidad para identificar nuevas dianas para el desarrollo de

frmacos antituberculosis (TB). La inmunidad innata constituye la primera lnea de defensa contra

la infeccin por patgenos. Dos de las principales vas de sealizacin inmunes, incluyendo NF-kB y

MAPK, median en la regulacin de las respuestas inmunes innatas mediante el control de sntesis

de diversas citoquinas tales como TNF e IL-6, etc .. Mientras tanto, el aumento de la evidencia


2/19

sugiere que los patgenos bacterianos se dirigen y manipulan esas vas de sealizacin por sus

beneficios. Por ejemplo, Yersinia enterocolitica fue indicada para suprimir la produccin de TNF

mediante la inhibicin de las actividades de ERK1 / 2, p38, y JNK. Los macrfagos infectados con

Mycobacterium avium mostraron disminucin de la activacin de MAPK en comparacin con las

clulas infectadas con micobacterias no patgenas. Las vas de sealizacin de NF-kB y MAPK

tambin pueden regular la produccin de un nmero de citoquinas por los macrfagos infectadoscon hM. tuberculosis. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los que los efectores

especficos de micobacterias modulan las vas de sealizacin inmune innata anfitrionas

permanecen en gran medida poco claros.

El genoma de M. tuberculosis H37Rv alberga cuatro copias homlogas de los operones

denominados mce grupo de genes (mce1-4), que incluye 6 genes mce y 2 yrbE (MCEA-F). Las

protenas de entrada de clulas de mamferos (MCE), se caracterizaron inicialmente como

protenas de invasin-como consecuencia de seal de exportacin putativa en el extremo del

terminal N. Estudios previos sugieren que las perlas de ltex recubiertas con Mce1A, Mce3A y

Mce3E son internalizadas por las clulas HeLa nofagociticas. Otros estudios han demostrado quelas cadenas de M. tuberculosis con interrupcin del operon mce fueron atenuadas en ratones.

Entre los 4 operones mce, el operon mce3 se encuentran en la regin de la diferencia 15 del

genoma de M. tuberculosis, que es de especial inters debido a que est ausente en la cepa de la

vacuna de Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gurin (BCG). Sin embargo, se sabe

relativamente poco sobre el papel del operon mce3 en la modulacin de la respuesta inmune

innata de acogida.

Estudios anteriores han demostrado que las seis proteinas MCE codificadas por el operon mce3,

especialmente Mce3A, Mce3D, y Mce3E, se expresan en M. tuberculosis durante la infeccin en

los seres humanos y son inmunognicas. Pero entre todas las protenas operon mce3, solamente

la regin de diferencia 1504 (Mce3A) demostr que era capaz de inducir un fuerte sesgo Th1 en

sujetos sanos y un dbil sesgo Th1 en los enfermos de tuberculosis, mientras que otras protenas

operon mce3 slo indujeron sesgos Th1 de moderados a dbiles, tanto en pacientes con

tuberculosis y sujetos saludables, lo que sugiere que otras protenas entre el operon mce3 podran

tener potenciales efectos moduladores inmunes. A pesar de la funcin potencial de las protenas

MCE en la supervivencia intracelular de M. tuberculosis, se ha avanzado poco para definir los

mecanismos funcionales especficos de cada protena Mce. En este estudio, nos centramos en el

Mce3E, con el objetivo de dilucidar su posible papel en la modulacin de la respuesta inmune

innata de acogida. Se demuestra que Mce3E regula la baja la expresin de citoquinas y promueve

la supervivencia de las micobacterias en los macrfagos a travs de la inhibicin de la activacin dela va de sealizacin ERK1 / 2. Adems, muestran que Mce3E podra ser secretada a partir de

micobacterias fagocitadas por los macrfagos y luego llevada al citosol para localizarse en el

retculo endoplasmtico (ER). Adems, Mce3E interacta con ERK1 / 2 en un motivo de DEF (un

motivo de ERK-docking) de manera dependiente, atrapa ERK1 / 2 en ER y bloquea la interaccin de

ERK1 / 2 con MEK1 y la translocacin nuclear de p-ERK1 / 2, resultando en la inhibicin de la va de

sealizacin ERK1 / 2. Nuestros resultados no slo revelan los mecanismos especficos por los


3/19

cuales Mce3E modula ordenadores de la respuesta inmune innata durante el curso de la infeccin

micobacteriana, sino que tambin proporcionan un blanco potencial Mce3E ERK1 / 2 basado en la

interfaz de medicamentos contra M. tuberculosis.

Materiales y METODOS

Cepas bacterianas

Escherichia coli DH5, E. coli BL21 (DE3), Mycobacterium smegmatis mc2155, y M. bovis BCG

(Pasteur) se utilizaron para la manipulacin gentica de la expression de la protena E. coli. DH5

and E. coli BL21 (DE3) se cultivaron en matraces utilizando medio LB. Las cepas de micobacterias

se cultivaron en caldo Middlebrook 7H9 (271.310; BD Difco) suplementado con 10% de Tween-

cido oleico albmina dexrose-catalasa y 0,05% 80 (Sigma-Aldrich), o en Middlebrook 7H10 agar

(262.710; BD Difco) suplementado con 10% de cido oleico-albmina dexrose-catalasa. El vector

pMV261 de transporte de Mycobacterium (proporcionado por W. Jacobs de Albert Einstein

College) se utiliz para expresar M. tuberculosis Mce3E en M. smegmatis o BCG. El vector de

expresin de micobacterias con la etiqueta GFP pSC300 (Addgene) se utiliz para expresar GFP-Mce3E en M. smegmatis or BCG. La expresin de Mce3E en las clulas RAW264.7 de micobacterias

infectadas se examin por anlisis de PCR cuantitativo.

Plsmidos, Abs y reactivos

El gen Mce3E se amplific a partir del genoma de M. tuberculosis H37Rv. Para la expresin en

clulas de mamfero, el gen se clon en pcDNA6A, p3xFLAG-CMV-14, o pEGFP-C1,

respectivamente. Los plsmidos de expresin bacterianos se construyeron mediante la insercin

de los genes en pGEX-6P-1, pMV261, o pSC300, respectivamente. Los plsmidos de ensayo de

luciferasa para Gal4-Elk, Gal4-Luc, PRL-TK, PFA-cJun, PBII-Luc, RacL61, RasV12, v-Raf, constitutiva

mutante MEK1 activa (DN3 / S218E / S222, MEK1-ED), as como los plsmidos para la protena de

unin a maltosa (MBP), MBP-ERK2, y myc-MEK1 fueron proporcionados por F. Shao (Instituto

Nacional de Ciencias Biolgicas, Pekn, China). ERK2 tambin se subclon en vectores p3XFLAG-

CMV-14 y pET30a. El gen p38 se amplific a partir del cDNA total obtenido de HEK293T y se insert

en el vector pET30a. El gen Mce3A fue sintetizado por Generay Biotecnologa y se clon en vector

pEGFP-C1. Las formas mutantes de Mce3E fueron generadas por extensin de solapamiento. La

Tabla I suplementaria enumera la informacin detallada sobre las cepas, plsmidos y

oligonucletidos utilizados en este estudio. Los siguientes Abs se utilizaron en este estudio: anti-

ERK1 / 2 (9102; CST), anti-p-ERK1 / 2 (9101; CST), anti-p-MEK1 / 2 (9121; CST), anti-calnexina ( H-

70) (sc-11397; Santa Cruz), anti-GST (TA-03; ZSGB-BIO), anti-Myc (sc-40; Santa Cruz), anti-Flag(F3165; Sigma-Aldrich), anti GFP (AG281; Beyotime), anti-Giantin (ab24586; Abcam), anti-M.

tuberculosis Rv3134 (sc-52108; Santa Cruz), anti-atubulin (T6199, Sigma-Aldrich), y anti-poli (ADP-

ribosa) Ab de polimerasa (9542; CST). Resina de amilosa (E8021) era de New England Biolabs;

glutatin Sepharose 4B era de GE Healthcare; Resina Ni-NTA de Qiagen era. Gel de ratn anti-Flag

M2 afinidad (F3165), U0126 etanolato (U120), factor de crecimiento epidrmico (EGF) (E9644), y

LPS (L4391) fueron de Sigma-Aldrich.


4/19

Cultivo celular, transfeccin, anlisis de inmunotransferencia e inmunoprecipitacin

Las clulas HEK293T y RAW264.7 se cultivaron en DMEM (Life Technologies) suplementado con

10% (v / v) de FBS inactivado por calor. La transfeccin transitoria se realiz con el mtodo de

polietilenimina o el mtodo de fosfato de calcio estndar para clulas HEK293T y Lipofectamina

2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para las clulas RAW264.7, de acuerdo con las instrucciones del

fabricante. Para el anlisis de inmunotransferencia, clulas transfectadas HEK293T se lisaron en el

tampn de lisis celular para Western e inmunoprecipitacin (P0013; Beyotime), o en un tampn

que contiene HEPES 10 mM (pH 7,5), NaCl 50 mM, EDTA 1% de Triton X-100 mM, 2, y una mezcla

inhibidora de proteasa (Roche Molecular bioqumicos). Las protenas fueron separadas por SDS-

PAGE y transferidas a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Las transferencias

se bloquearon con 5% de leche en polvo sin grasa en TBS durante 1 h a temperatura ambiente y

posteriormente se incubaron durante la noche a 4C con Abs primarios en TBS-Tween 20 (1%, v /

v) (TBST) con 5% (w / v) BSA. Despus de tres lavados de 10 min cada uno con TBST, las

transferencias se incubaron con IgG de cabra anti-ratn o IgG de cabra anti-conejo conjugado con

HRP a una dilucin de 1: 5000 en tampn de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.

Despus de tres lavados con TBST, las transferencias fueron desarrollados por Immobilon

occidental quimioluminiscente HRP Sustrato (WBKLS0500; Millipore) y expuestos a rayos x. Para la

inmunoprecipitacin, las clulas HEK293T se cosecharon 24 h despus de la transfeccin y se

lisaron en un tampn que contena Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, y una

mezcla inhibidora de proteasa. Los lisados celulares se incubaron con perlas de Flag M2 (Sigma-

Aldrich), seguido por un extenso lavado con el tampn de lisis. Las protenas unidas se sometieron

a anlisis de Western Blot.

Ensayo de luciferasa

El ensayo de luciferasa Dual se realiz segn lo descrito por Li et al. usando el sistema informador

de luciferasa Promega. Por la va ERK, las clulas RAW264.7 cultivadas en 12 placas se

cotransfectaron con 0,6 mg Gal4-Elk, 0,6 mg Gal4-luc, 50 ng PRL-TK y 10 ng RasV12, o 100 ng v-Raf

o 100 ng constitutiva MEK1 activa (MEK1-ED) en presencia o ausencia de 1 mg Mce3E. Para medir

la activacin de JNK, las clulas RAW264.7 se cotransfectaron con 0,3 mg PFA-cJun, 0,9 mg Gal4-

luc, RacL61 0,5 mg, y 50 ng pRLTK con o sin 1mg plsmido Mce3E. Para la ruta de NF-kB, las clulas

RAW264.7 se cotransfectaron con 1 mg PNF-kB-Luc y 50 ng pRL-TK en presencia o ausencia de

plsmido 1 mg Mce3E. Veinticuatro horas ms tarde, las clulas fueron tratadas con LPS 100 ng /

ml (Sigma-Aldrich) durante 5 h para estimular la activacin de NF-kB.

Purificacin de protenas y en ensayo de unin in vitro

La cepa de E. coli BL21 (DE3) se utiliz como husped para la expresin de GST, GST-Mce3E, GST-

Mce3E (F294A), MBP, MBP-ERK2, Su-ERK2, y Su-p38. La expresin proteica fue inducida a 30C o

16C con 0,1 a 0,2 mm isoproplico-BD-tiogalactopiransido despus DO600 alcanz 0,6-0,8. GST

protenas etiquetadas, protenas de fusin MBP, y sus protenas de fusin se purificaron por


5/19

cromatografa de afinidad (resina de amilosa para las protenas de fusin MBP; glutatin Sefarosa

4B para las protenas GST-etiquetadas; resina de Ni-NTA para Sus protenas de fusin), seguido por

cromatografa de exclusin molecular en una columna Superdex. Para el ensayo de pulldown, las

cepas deproteina se inmovilizaron en perlas de amilosa (MBP y MBP-ERK2) o glutatin Sefarosa 4B

(GST, GST-Mce3E y GST-Mce3E [F294A]), seguido de incubacin con protenas presa

correspondientes en un tampn que contena 20 mM HEPES, NaCl 200 mM, y 1% Nonidet P40 (pH7,4) suplementado con completos inhibidores de la proteasa a 4 C durante 2 h. Despus de la

incubacin, las perlas se lavaron extensivamente con el tampn de unin, y las protenas unidas se

analizaron mediante anlisis de inmunotransferencia.

Tincin de clulas y microscopa confocal

Se sembraron clulas RAW264.7 en cubreobjetos de vidrio y se transfectaron con Lipofectamina

2000. Veinticuatro horas despus de la transfeccin, las clulas se fijaron con paraformaldehdo al

4% en PBS durante 10 min, se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 10 min, se

bloquearon con leche 1% en PBS durante 30 min, y se marcaron con Abs primarios y secundarios.

Imgenes confocales fueron tomadas con un sistema confocal Leica SP8.

Cuantificacin de las clulas infectadas RAW264.7 con localizacin nuclear de fosfo-ERK

A las 24 h despus de la transfeccin de Flag-ERK2, las clulas RAW264.7 se infectaron durante 4 h

con pSC300-BCG, pSC300-Mce3E-BCG, o pSC300-Mce3E (F294A) -BCG en multiplicidad de

infeccin (MOI) de 100 y luego las clulas se sometieron a tincin, como se describi

anteriormente. Con respecto a la cuantificacin del nmero de clulas RAW264.7 infectadas con la

localizacin nuclear de p-ERK, se contaron slo RAW264.7 clulas que fueron infectadas con

marcado con GFP BCG. Al menos 100 clulas infectadas se marcaron ciegas en cada experimento,

y todos los experimentos se repitieron tres veces.

La infeccin de macrfagos, recuento CFU, anlisis cuantitativo PCR, y ELISA

Las clulas RAW264.7 se sembraron a una densidad de 5 * 10 5 -1 * 10 6 clulas / pocillo en placas

de 6 pocillos y se cultivaron durante 12 h antes de la infeccin. Cepas micobacterianas congeladas

se descongelaron y se centrifugaron, y el sedimento se resuspendi en DMEM suplementado con

0,05% de Tween 80 por agitacin. Luego, las clulas fueron infectadas con cepas micobacterianas

durante 2 horas a una MOI de 10. Despus de incubar durante 2 h, las clulas se lavaron tres veces

con PBS para eliminar cualquier bacteria no fagocitada, seguido del cultivo en medio fresco que

contiene 20 g / ml de gentamicina. En varios puntos de tiempo despus de la infeccin, se

obtuvieron medios de cultivo celular para ELISA; las clulas se lavaron con PBS tres veces y se

recogieron para la medicin de CFU o ensayo de PCR cuantitativo. Para la determinacin de CFU,

los macrfagos fueron solubilizados con 0,025% (v / v) SDS. Entonces la supervivencia intracelular

se determin mediante siembra de cultivos diluidos en serie en 7H10 placas, y las colonias se

enumeraron despus de 3 d para M. smegmatis y 3 semanas para BCG. Para el ensayo de PCR

cuantitativo, el ARN total fue extrado de las clulas recogidas y la transcripcin inversa en ADNc

mediante el uso de kits disponibles comercialmente de acuerdo con las instrucciones del


6/19

fabricante. El ADNc obtenido se someti a un anlisis cuantitativo de PCR en tiempo real (PCR

cuantitativo) con KAPA Kit SYBR qPCR RPIDO (KAPA Biosystems) en el sistema ABI 7300 (Applied

Biosystems). GAPDH mRNA se utiliz como gen de mantenimiento de referencia para la

normalizacin. Para ELISA, los sobrenadantes de cultivo libres de clulas fueron cosechados por

centrifugacin a 13.000 rpm durante 1 min para eliminar las clulas en suspensin y las

micobacterias. Los niveles de protena TNF y IL-6 en los sobrenadantes se cuantific por ELISA (kitsRayBio ratn TNF ELISA kit: ELM-TNFa-001; ratn IL-6 ELISA kit: ELM-IL6-001; TNF ELISA Kit

Humano: ELH-TNFa-001; IL-6 humana ELISA Kit: ELH-IL6-001), de acuerdo con las instrucciones del

fabricante. Cada muestra se realiz por

triplicado.

FIGURA 1 La Inhibicin de la senda de ERK1/2 por M.

tuberculosis Mce3E. (El un-C) Luciferase ensaya de RasV12 -,

V-Raf-, y activacin de ERK1/2 MEK1-Ed-inducido en la

ausencia o presencia de Mce3E. Mce3E bloquea laactivacin de ERK1/2 en clulas macrfago RAW264.7

estimuladas por RasV12 (UN), V-Raf (Raf activo constitutivo)

(B), o MEK1-ED (constitutivo MEK1 activo) (C). (D) el anlisis

por Westernblot mostr que la secrecin de Mce3E en el

cytosol de clulas macrfago RAW264.7 infect con la

expresin de BCG la M. tuberculosis Mce3E. La protena de

la membrana que Rv3134 se us como un mando negativo

para la secrecin. Las polimerasas Un-Tubulin y poly(ADP-

ribose) se usaron como los marcadores de los fragmentos

nucleares y citosolicos, respectivamente. (E y F) la Expresin

de tuberculosis de M. Mce3E en M. smegmatis(el smeg de

M.) (E) o BCG (F) reduce fosforilacin de ERK1/2 en clulasmacrgafos RAW264.7 infectadas por 024 h con las

tensiones micobacterial indicadas como se analiza a travs

de examen immunoblot. (G) el Analisis inmunoblot

Fosfoespecifico de inhibicin de activacin de ERK1/2

MEK1-Ed-inducido por Mce3E en las clulas de HEK293T. (H)

Anlisis fosfoespecfico immunoblot de MEK1 RasV12-

inducido o activacin de ERK1/2 en la presencia de Mce3E. Los datos son representativos de por lo menos tres

experimentos independientes (malo y SEM en el UN-C). * * p, 0.01 (dos-fue detrs del examen T unpaired).

Aislamiento de PBMC y la diferenciacin de los monocitos en macrfagos

PBMC humanas se obtuvieron a partir de sangre entera por centrifugacin Ficoll-Hypaque engradiente de densidad y cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 4 MML-

glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina durante 2 h a 37C con 5% de CO2 para permitir la

adherencia de los monocitos. Despus de 2 h de adherencia, PBMCs se lavaron cinco veces con

PBS calentado para eliminar las clulas no adherentes, incluyendo linfocitos, y despus se

cultivaron con medio intercambiado cada 3 d hasta que las clulas se diferenciaron de macrfagos.

Los macrfagos derivados de PBMC fueron infectados con cepas de micobacterias y se sometieron

a recuento de CFU, anlisis cuantitativo de PCR, y ELISA, como se describe anteriormente.


7/19

Fraccionamiento celular de macrfagos infectados

Las clulas RAW264.7 infectadas con pSC300-Mce3E-BCG a una MOI de 100 fueron sometidas a

tampn de lisis hipotnico que contiene HEPES 10 mM (pH7.9), 1,5 mM MgCl2, KCl 10 mM, 0,34 M

de sacarosa, 10% de glicerol, inhibidores de la proteasa, y 0,1% de Triton X-100. La mezcla de lisis

se centrifug a 1300 * g durante 10 min para sedimentar los ncleos de macrfagos y BCG. Elsobrenadante se recogi como la fraccin citoslica de macrfagos infectados para el anlisis de

inmunoblot.

Anlisis estadstico

El Test t disparejo de dos colas se utiliz para el anlisis estadstico. Cada valor de p


8/19

FIGURA 2 La Expresin de M. tuberculosis Mce3E en BCG

disminuye la expresin de TNF e IL-6, y aumenta la

supervivencia de BCG en los macrfagos de RAW264.7 durante

el curso de infeccin. (A y B) la Expresin de tuberculosis de M.

Mce3E en BCG disminuye la expresin del mRNA de Tnf (A) e IL-6 (B) en las clulas de RAW264.7 como fue examinado por PCR

cuantitativo. Se infectaron las clulas macrfago por 024 h con

las tensiones micobacterial indicadas. (C y D) ELISA mostr que

Mce3E a la expresin de M. tuberculosis en BCG disminuy la

protena de TNF (C) y liber la protena IL-6 (D) por clulas de

RAW264.7 infectadas como en (A) y (B). (E) la Expresin de M.

tuberculosis Mce3E en BCG aumenta la supervivencia de BCG

en clulas de RAW264.7 infectadas como en (A) y (B). Se

presentan los resultados de PCR Cuantitativos relativo a la

expresin del control del gen Gapdh (A y B). Los Datos son

representativos de por lo menos tres experimentos

independientes (malo y SEM en UN-E). * p, 0.05, * * p, 0.01(Test T unpaired de dos colas).

M. tuberculosis Mce3E inhibe la produccin de citoquinas y promueve la supervivencia de las

micobacterias en macrfagos

La infeccin bacteriana incita la activacin de vas de sealizacin inmune del husped y por lo

tanto induce la produccin de diversas citoquinas tales como TNF e IL-6. Tales mediadores son

esenciales para el reclutamiento y la activacin de las clulas inmunes para responder a la

infeccin bacteriana. En contraste, los patgenos bacterianos se dirigen a la va MAPK con

frecuencia para suprimir la produccin de citocinas para contrarrestar la defensa del husped. La

activacin de la va alterada ERK1 / 2 por M. tuberculosis Mce3E por lo tanto, plante laposibilidad de que la expresin de ciertas citoquinas podra ser alterada en macrfagos infectados

con M. tuberculosis Mce3E que expresan una cepa micobacteriana. Para examinar la capacidad de

M. tuberculosis Mce3E en la modulacin de la expresin de citoquinas independientemente de

otras protenas del efector de M. tuberculosis, se analiz la expresin de una serie de citoquinas

en los macrfagos infectados con cepas de M. smegmatis Mce3E o Mce3E-BCG por anlisis de PCR

cuantitativo y ELISA de la expresin de M. tuberculosis Mce3E en cualquiera de M. smegmatis

(datos no mostrados) o BCG (Fig. 2) que inhibieron en gran medida la expresin de TNF e IL6 y

promovieron la supervivencia bacteriana en clulas de macrfagos RAW264.7 durante la infeccin

micobacteriana. Estos resultados establecen que M. tuberculosis Mce3E por s sola puede reprimir

eficazmente la expresin de ciertas citoquinas inflamatorias y promover la supervivencia de las

micobacterias en macrfagos.

Mce3E interacta con ERK de una manera dependiente DEF

Para dilucidar los mecanismos subyacentes de la supresin mediada por Mce3E de acogida de

respuesta inmune innata, se intent buscar sus objetivos de acogida a lo largo de la va ERK1 / 2.

Basado en la observacin de que Mce3E bloquea la activacin de la va ERK1 / 2 MEK1-ED-


9/19

mediadas, analizamos si Mce3E interactu con MEK1 o ERK1 / 2. Cuando Mce3E y MEK1 se

coexpresan en clulas HEK293T, Mce3E es capaz decoimmunoprecipitar con ERK1/2 endgeno,

pero no se expresa MEK1 (Fig. 3A). Consistentemente, flag-ERK2 tambin podra

coimmunoprecipitar con Myc-Mce3E cuando se coexpresa en las clulas HEK293T (Fig. 3B). Por lo

tanto, hemos propuesto que Mce3E interacta con ERK1 / 2, pero no MEK1. Varios efectores de

bacterias patgenas tales como efectores de Legionella muestran dominios eucariotas distintivos,entre los que destacan los dominios de la protena quinasa o fosfatasa. En nuestros esfuerzos de

bsqueda de los dominios funcionales/motivos dentro Mce3E, se identific un motivo DEF

potencial, un motivo ERK-docking que posee una secuencia de consenso de FXFP, en Mce3E (FPFP)

mediante el anlisis in silico. Debido a que el ex residuo Phe es ms crtico entre los tres

aminocidos conserva el motivo DEF, por lo tanto la mutacin de la Mce3E Phe294 en Ala (F294A),

y encontramos que este mutante apenas poda unirse a ERK in vitro (Fig. 3C). Debido a los

informes existentes sugieren que el dominio de DEF tambin media la interaccin con p38 MAPK,

que por lo tanto realiz ms experimentos para examinar si este motivo DEF en Mce3E tambin

interacta con p38 MAPK. Como se muestra en la Fig. 3D, Mce3E tiene poca afinidad de unin a

P38A, mientras que la mutacin F294A suprime completamente tal unin dbil.Consistentemente, tal mutacin aboli casi completamente la inhibicin mediada por Mce3E de la

fosforilacin de ERK1 / 2 en clulas HEK293T (Fig. 3E) y la activacin de sealizacin de ERK en las

clulas de macrfagos RAW264.7 (Fig. 3F). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que

Mce3E interacta con ERK en manera del motivo DEF dependiente para inhibir la va de activacin

de ERK.

Mce3E se localiza en el aparato de ER, atrapando as ERK en el aparato ER

A continuacin se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para investigar si Mce3E colocaliza

con ERK en vivo. Curiosamente, el anlisis de inmunofluorescencia de forma exgena expres

Mce3E fusionado a GFP en las clulas RAW264.7 lo que revel un patrn de tincin que

especficamente se superpona con el marcador ER calnexina, pero no el marcador de Golgi

Giantin. La distribucin subcelular de Mce3E sigue siendo el mismo patrn cuando se usa

etiquetas GFP, Flag, o Myc en su trmino C en varias lneas celulares (datos no mostrados).

Adems, el mutante F294A Mce3E comparte el mismo patrn de localizacin con la protena de

tipo salvaje. A diferencia de la localizacin concentrada de Mce3E, Mce3A codificada por los

operones mce3 despliega un modo de distribucin difuso (Fig. 4A). Por lo tanto, estos resultados

indican que Mce3E especficamente reside en el aparato de ER de una manera independiente del

motivo DEF.

En las clulas en reposo, ERKs se distribuyen difusamente en el citoplasma, debido a sus

interacciones con protenas de anclaje, tales como sus activadores de corriente MEK. Tras la

estimulacin, ERK desprende las protenas de anclaje y vuelve a sus lugares de accin,

principalmente al ncleo. Teniendo en cuenta la distinta localizacin de Mce3E as como su

interaccin con ERK, por lo que se ha tratado de investigar si Mce3E podra regular la localizacin

celular de ERKs. Cuando se cotransfectaron con Mce3E, pero no su mutante F294A, en clulas en

reposo RAW264.7, la mayora de ERKs se transloc al aparato de ER y exhibi colocalizacin casi


10/19

completa con Mce3E (Fig. 4B), consistentes con nuestros resultados de coimmunoprecipitacin y

ensayos de pulldown . Adems, la colocalizacin de Mce3E con ERK que pareca ser especfica para

ERK, porque Mce3E no tuvo impacto en la localizacin de MEK1 (Fig. 4B). Tomados en conjunto,

Mce3E se encuentra en y atrapa ERK al aparato de ER en clulas husped.

Figura 3 M. tuberculosis Mce3E liga a ERK1/2 en un motivo DEF de manera dependiente. (A) -Flag-Mce3E coprecipita con elendgeno de ERK1/2, pero no

el endgeno expresado Myc -

MEK1 de las clulas de

HEK293T. (B)

Coimmunoprecipitacin de

M. tuberculosis Mce3E y

ERK2 en lisado de las clulas

cotransfectadas HEK293T con

la M. tuberculosis Mce3E y

ERK2. (C) WT Mce3E, pero no

su mutante de F294A, acta

recprocamente con ERK2como es analizado por el MBP

ensayo. (D) Mce3E despliega

el motivo DEF muy bien

basado la afinidad obligatoria

a ERK2 y la afinidad

obligatoria pequea al p38.

(E) la mutacin de F294A

abole la inhibicin de Mce3E

mediado de fosforilacin de

ERK1/2 como es indicado por

el ensayo de immunoblot. (F)

El ensayo de Luciferasasmostr que esa mutacin de

F294A atena la inhibicin

Mce3E-mediada de activacin

de ERK1/2 en clulas

macrfago RAW264.7

estimuladas por MEK1-ED.

Los datos son representativos

de por lo menos tres

experimentos independientes

(malo y SEM en F). * * p, 0.01

(dos-fue detrs del unpaired t

prueban).

Mce3E bloque la

interaccion entre

ERK y MEK e

interrumpe la translocacin nuclear de p-ERK


11/19

Debido Mce3E podra interactuar con ERK1 / 2 y atrapar ERK1 / 2 a la ER, de este modo la hiptesis

de que las interacciones Mce3E-ERK1 / 2 pueden competir por las interacciones entre ERK1 / 2 y

MEK1. Hemos abordado este problema mediante el ensayo coimmunoprecipitacin con diversos

niveles de expresin de Mce3E. Las interacciones entre ERK1 / 2 y Mce3E se aumentaron al

aumentar la expresin de Mce3E, concurrente con la disminucin de las interacciones entre ERK1

/ 2 y MEK1 (Fig. 5A). Del mismo modo, Mce3E (F294A) no poda afectar a la asociacin entre laERK1 / 2 y MEK1 (Fig. 5B). Estos datos sugieren que Mce3E, a travs de secuestro de ERK1 / 2 en el

ER, reduce la accesibilidad de ERK1 / 2 para MEK1 y en consecuencia bloquea la sealizacin de

MEK a ERK. Debido a que la translocacin nuclear de p-ERK es estimulado por muchos estmulos,

tales como EGF y podra ser modulada por efectores de patgenos, entonces se examin si Mce3E

podra afectar la translocacin nuclear de p-ERK1 / 2. Hemos encontrado que Mce3E, pero no su

mutante F294A, tambin colocaliza con bloques de p-ERK1 / 2 y por lo tanto la translocacin

nuclear de p-ERK1 / 2 en las clulas RAW264.7 estimuladas con EGF (Fig. 5C). Consistentemente,

las clulas infectadas con RAW264.7 pSC300-Mce3E-BCG mostraron una menor localizacin p-

ERK1 / 2 en el ncleo que sus contrapartes infectadas con pSC300-BCG o pSC300-Mce3E (F294A) -

BCG en los puntos de tiempo idntico despus de la infeccin (Fig 5D. , 5E).

En conjunto, estas observaciones revelan que Mce3E se localiza exclusivamente en el aparato de

ER y podra inhibir la activacin de ERK secuestrando especficamente ERK1 / 2 citoplsmica en el

aparato de ER y antagonizar con ello las interacciones entre ERK1 / 2 y MEK1. Adems, a travs de

colocalizacin con p-ERK1 / 2, Mce3E tambin bloquea su translocacin nuclear, as atena an

ms la sealizacin de ERK.


12/19


13/19

FIGURA 4. M. tuberculosis Mce3E el colocaliza con ERK1/2 al aparato de ER en las clulas de RAW264.7. (A) M.

tuberculosis Mce3E se localiza especficamente al ER en un motivo DEF de manera independiente. Las clulas de

RAW264.7 fueron transfectados con GFP-Mce3E o el mutante F294A o GFP-Mce3A (verde). se etiquetaron Los ER,

Golgi, y los ncleos celulares por Calnexin (rojo), Giantin (rojo), y DAPI (azul), respectivamente. (B) M. tuberculosis

Mce3E se colocaliza con ERK1/2 en las clulas de RAW264.7. Las clulas de RAW264.7fueron transfectados con los

plasmidos indicados y siguieron por la inanicin de suero. La Coexpresin de Mce3E, pero no su formulario mutante

F294A, causa la translocacion de ERK1/2 del citosol a ER. Se mancharon las clulas con los Abs anti - ERK1/2 o anti-Myc,luego se etiquet con el anti-conejo / ratn Alexa594 o Abs anti-ratn FITC (las Sondas Moleculares). Despus de

etiquetar los Abs, los ncleos de clulas DAPI fueron contados y teidos(azul). Las barras de la Balanza, 10 mm. Datos

son representativos de por lo menos tres experimentos independientes.

Se requiere la interaccin ERK para Mce3E para regular a la baja TNF e IL-6 expresin y para

mejorar la supervivencia intracelular de las micobacterias. Adems, se examin si la interaccin a

travs del ERK el dominio Mce3E DEF es esencial para la supresin mediada por Mce3E de

expresin de citoquinas en clulas RAW264.7 y clulas de macrfagos derivados de monocitos

humanos primarios durante el curso de la infeccin micobacteriana. Hemos encontrado que la

expresin de Mce3E en M. smegmatis o BCG disminuye de manera eficiente el nivel de expresin

de TNF e IL6 en ambas clulas de macrfagos y clulas RAW264.7 de macrfagos derivados demonocitos humanos primarios durante la infeccin micobacteriana (Suplementarios Figs. 1A-D,

2A-D, las Figs. 6A-D, 7A-D). Consistentemente, la expresin de Mce3E tambin promovi la

supervivencia intracelular de las micobacterias en macrfagos. En contraste, la mutacin F294A

aboli la supresin mediada por Mce3E de la produccin de citoquinas proinflamatorias, as como

la promocin de la supervivencia intracelular de las micobacterias (Suplementarios figuras. 1E, 2E,

figuras. 6E, 7E). A continuacin se examin adems si la inhibicin qumica de la va de

sealizacin ERK 1/2 podra afectar a la expresin de citocinas proinflamatorias y la supervivencia

intracelular bacteriana durante la infeccin micobacteriana. Se Pretrataron clulas RAW264.7

durante 2 h con U0126, un inhibidor especfico de la va ERK, y luego los sometieron a la infeccin

por M. smegmatis o BCG.

La infeccin de clulas RAW264.7 U0126 pretratadas suscit menor expresin de-TNF e IL-6 que

hizo infeccin de las clulas no tratadas (RAW264.7 Suplementario Fig. 3A-D, Fig. 8A-D). Adems,

un pretratamiento con U0126 promovi la supervivencia de M. smegmatis o BCG en clulas

RAW264.7 (Suplementario Fig. 3E, Fig. 8E). Colectivamente, estos datos sugieren que Mce3E

podra suprimir la produccin de citoquinas y mejorar la supervivencia intracelular de las

micobacterias a travs de la inhibicin de la activacin de ERK1 / 2 de una manera dependiente del

motivo DEF.


14/19

FIGURA 5 M. tuberculosis Mce3E bloquea la interaccin de ERK1/2-MEK1 y la translocacion nuclear de Fosfo-ERK1/2.

(A y B) Mce3E, pero no su formulario mutante F294A, interfiere con

la interaccin entre ERK1/2 y MEK1. Las clulas de HEK293T fueron

temporalmente transfectadas con los plasmidos indicado. El

etiquetado de Flag- ERK2 fue immunoprecipitado, y el Mce3E ERK2-

asociado y MEK1 fueron analizados por el anlisis del immunoblot.

(C) Mce3E bloquea EGF estimulado por translocacion nuclear de p-ERK1/2 en las clulas de RAW264.7, como es mostrado en los

ensayos del immuno teido. Las clulas trasnfectadas RAW264.7

con GFP-Mce3E (o su formulario mutante F294A, verde) se trat con

EGF (100 ng/ml) por 5 min y entonces se manch con el Ab anti-p-

ERK1/2 y el Ab anti-conejo Alexa 594 (rojo). Despus de etiquetar

Abs, las clulas fueron contados y teidos con DAPI para ncleos

(azul). Las barras de la Balanza, 10 mm. (D) la Expresin de M.

tuberculosis Mce3E en BCG, pero no su formulario mutante F294A,

bloquea la translocacion nuclear de p-ERK1/2 en las clulas

macrfago RAW264.7 durante la infeccin. Se infectaron las clulas

macrfago RAW264.7 con las tensiones micobacterial indicadas

para 4 h y entonces se mancharon con el Ab anti-p-ERK1/2 y el Abanti-conejo Alexa 594 Ab (rojo). Despus de etiquetar Abs, las

clulas fueron teidas con DAPI para ncleos (azul). Las barras de la

Balanza, 10 mm. Datos son representativos de por lo menos tres

experimentos independientes. (E) el Fragmento (%) de clulas de

RAW264.7 infectadas con la localizacin nuclear de p-ERK1/2. los Datos son representativos de por lo menos tres

experimentos independientes (malo y SEM en E). * * p, 0.01 (dos-fue detrs del unpaired t prueban).

Discusin

El patgeno intracelular humano de M. tuberculosis puede persistir en los macrfagos de acogida

durante largos perodos, incluso en un sistema inmunolgico que funcione plenamente. Entre el

repertorio de estrategias que M. tuberculosis tiene, ha evolucionado para evadir, desviar, o

subvertir respuestas inmunes, los mejor documentados son los que regulan el anfitrin de vas de

sealizacin inmune innata para evitar la eliminacin de los bacilos dentro de los macrfagos.

Muchas citoquinas reguladas por las vas de sealizacin de NF-kB y MAPK han estado implicadas

en las interacciones husped-micobacterias. Hay un nmero creciente de ejemplos de bacterias

patgenas que producen y secretan molculas efectoras que amortiguan la produccin de

citoquinas inflamatorias. Por ejemplo, la Yersinia efector YopJ, que es una cistena proteasa

ubiquitina, que objetiva y regula tanto el NF-kB como vas de MAPK. El efector Shigella flexneri

OspG, que es una protena quinasa, dirige enzimas ubiquitina-conjugadas, lo que afecta la

degradacin de FosfoI- kB y la posterior activacin de NF-kB. OSPF, otro efector Shigella tipo III,

tambin se muestra para inactivar MAPKs, incluyendo ERK1 / 2, JNK, y p38, mediante la

eliminacin irreversible de grupos de fosfato desde el fosfotreonina, pero no a partir del residuo

de fosfotirosina en el bucle de activacin de MAPKs. Pero hasta ahora, los pocos efectores

micobacterianos, as como sus mecanismos moduladores del hospedador han sido revelados. En

este estudio, hemos demostrado que Mce3E, protena efectora secretada de M. tuberculosis,

puede inhibir la activacin de la va ERK2 concurrente con disminucin de la expresin de un grupo


15/19

especfico de citoquinas inflamatorias, incluyendo Tnf e IL-6, que a su vez conduce a la inhibicin

del desarrollo de respuestas inmunes eficaces contra las micobacterias.

FIGURE 6.La expresin de M. tuberculosis Mce3E, pero no Mce3E (F294A), en M. smegmatis disminuye la produccin de

TNF e IL-6 y aumenta la supervivencia de M. smegmatis en los macrfagos de los monocitos derivados humanosprimarios durante el curso de infeccin. (A y B) El anlisis de PCR Cuantitativo mostr Mce3E que la expresion de M.

tuberculosis , pero no Mce3E (F294A), en M. smegmatis disminuye la expresin mRNA de Tnf (A) e IL6 (B) en los

macrfagos primarios derivados de monocitos humanos. Se infectaron las clulas del macrfago por 024 h con las

tensiones micobacterial

indicadas. (C y D) ELISA mostr

Mce3E a la expresin de M.

tuberculosis , pero no Mce3E

(F294A), en M. smegmatis

disminuy la protena de TNF (

C) e IL-6 (D) liberada por el

monocito humano primario

derivado de macrfagosinfectados como en (A) y (B). (E)

la Expresin de M. tuberculosis

de M Mce3E, pero no Mce3E

(F294A), aumenta la

supervivencia de M. smegmatis

en monocitos humanos

primarios derivados de

macrfagos infectados como en

(A) y (B). Se presentan los

resultados de PCR Cuantitativo

relativos a la expresin del gen

del mando Gapdh (en UN y B).los Datos son representativos

de por lo menos tres

experimentos independientes

(malo y SEM en UN-E). * p,

0.05, * * p, 0.01 (dos-fue detrs

del unpaired t prueban).

Estudios previos que

implican Mce3E y otras protenas MCE se centraron principalmente en su papel potencial para

facilitar la absorcin de las micobacterias por los macrfagos, aunque se sabe relativamente poco

sobre cmo Mce3E y otras protenas MCE funcionan despus de entrar el patgeno en las clulas

de macrfagos de acogida. El hecho de que la inactivacin de los operones mce podra atenuar la

virulencia de M. tuberculosis en el modelo murino proporciona una evidencia convincente de que

las protenas MCE son esenciales para la supervivencia intracelular de las micobacterias; por lo

tanto en este estudio se ha tratado de investigar el papel potencial de Mce3E en la modulacin de

la respuesta inmune innata de acogida durante la infeccin por micobacterias de macrfagos.

Mce3E presumiblemente fue definida como una lipoprotena y anclada en la membrana externa

de M. tuberculosis. Estudios previos sugieren que las Mce3 se localizan extracelularmente, y, en


16/19

funcin de su topologa, lo ms probable es o bien participan en la actividad de transporte o en las

funciones que implican la interaccin con el medio ambiente o el anfitrin. Pero hasta ahora,

todava no est claro si Mce3E podra ser secretada en el citosol de las clulas husped durante la

infeccin micobacteriana. En este trabajo, basado en nuestro estudio, proponemos que Mce3E es

probable que sea secretada fuera de las micobacterias y tener acceso al citosol de los macrfagos

infectados, lo que lleva a la manipulacin de las actividades celulares del husped, incluyendo vasde sealizacin inmune, lo cual es consistente con nuestros datos que demuestran que la M.

tuberculosis Mce3E inhibe la activacin de ERK y disminuye la expresin de ciertas citocinas

proinflamatorias.

FIGURE 7. La expresin de M. tuberculosis Mce3E, pero no Mce3E (F294A), en la BCG disminuye la produccin de TNFe IL-6 y aumenta la supervivencia de BCG en monocitos humano primarios derivados de macrfagos durante el curso de

infeccin. (A y B) El anlisis de PCR Cuantitativo

mostr Mce3E a la expresin de M. tuberculosis

de M, pero no Mce3E (F294A), en BCG disminuye

la expresin mRNA de Tnf (UN) e Il6 (B) en los

monocitos humanos primarios derivados demacrfagos. Se infectaron las clulas del

macrfago por 024 h con las tensiones

micobacterial indicadas. (El C y D) ELISA mostr

expresin de M. tuberculosis Mce3E, pero no

Mce3E (F294A), en BCG disminuye la protena

de TNF (el C) e IL-6 (D) liberadas por monocitos

humanos primarios derivado de macrfagos

infectados como en (A) y (B). (E) La Expresin de

M. tuberculosis Mce3E, pero no Mce3E (F294A),

aumenta la supervivencia de BCG en los

monocitos humanos primarios derivados de

macrfagos infectados como en (A) y (B). Sepresentan los resultados de PCR Cuantitativo

relativos a la expresin del gen del mando Gapdh

(en UN y B). Los Datos son representativos de

por lo menos tres experimentos independientes

(malo y SEM en UN-E). * p, 0.05, * * p, 0.01,

(dos-fue detrs del unpaired t prueban).

Los patgenos microbianos han desarrollado mecanismos para subvertir funciones ER, lo queinfluye en la respuesta inmune del husped. La ER es uno de los orgnulos de la clula huspedque est dirigido por patgenos intracelulares. Ciertas toxinas bacterianas tambin reclutan ERpara la entrada y la supervivencia intracelular. Adems, en la cascada de sealizacin Ras / Raf /

MEK / ERK, varios mediadores dentro de esta va estn exquisitamente regulados por lacompartimentalizacin subcelular. Por ejemplo, la arrestina podra funcionar como una protenade andamiaje para dirigir el complejo de protenas MAPK al endosoma temprano. Se inform quela quinasa Raf puede ser reclutada al Golgi por la quinasa Raf atrapando al Golgi, y que dicharegulacin espacial inhibe la activacin de Raf-1 y reduce la asociacin de Raf-1 con Ras y MEK,bloqueando as la va de ERK. En este estudio, hemos revelado otro aspecto de la funcin ER quereclutan las micobacterias para mantener la infeccin. Nuestro estudio revela que M. tuberculosisMce3E modula la va de sealizacin de ERK travs de la regulacin espacial de la localizacin


17/19

subcelular de ERK / p-ERK. Como el anlisis de hidrofobicidad indic Mce3E no contiene dominiostransmembrana, por lo tanto se da la hiptesis de que Mce3E se localiza en aparatos ER mediantela interaccin con cierta protena residente ER. Actualmente se est realizando en el laboratoriouna identificacin adicional de dicha protena (s).

FIGURE 8. La Inhibicin de la va de sealizacin ERK1/2 causa una disminucin de la expresin de Tnf e IL6 y lapromocin de la supervivencia de BCG en las clulas macrfago RAW264.7 durante el curso de infeccin. (A y B) la

Inhibicin de activacin de ERK1/2por las causas de U0126 disminuyla expresin de Tnf (UN) e IL6 (B)en las clulas macrfagoRAW264.7 con BCG-infectadocomo fue examinado por PCRcuantitativo. Se infectaron lasclulas macrfago por 024 h conlas tensiones micobacterialindicadas. (C y D) ELISA mostr

que la inhibicin de activacin deERK1/2 por U0126 disminuye laprotena de TNF (el C) e IL-6 (D)liberadas por clulas de RAW264.7infectadas como en (A y B). (E) laInhibicin de activacin de ERK1/2por U0126 promueve lasupervivencia de BCG en clulas deRAW264.7 infectadas como en (A)y (B). Se presentan los resultadosde PCR Cuantitativo relativos a laexpresin del gen del mandoGapdh (en UN y B). Los Datos sonrepresentativos de por lo menos

tres experimentos independientes(malo y SEM en UN-E). * p, 0.05, ** p, 0.01 (dos-fue detrs delunpaired t prueban).

La fosforilacin desempea un papel importante en la regulacin de numerosos procesos celulares

eucariotos, incluyendo la progresin del ciclo celular, el trfico vesicular, y la respuesta inmune

innata. Varias protenas efectoras de bacterias patgenas, mostraron imitar protenas del husped

tales como fosfatasas o quinasas al evadir las defensas inmunitarias del husped. Debido a que

Mce3E tiene un motivo de DEF y podra interactuar con ERK1 / 2 directamente, inicialmente se

examin si Mce3E podra ser capaz de desfosforilar p-ERK directamente, pero no fueron capaces

de demostrar la actividad fosfatasa de Mce3E hacia en p-ERK in vitro. Tambin se realiz unensayo de dos hbridos de levadura para identificar el potencial de la fosfatasa Mce3E

interactuante(s) que pueden ser llevadas a la p-ERK1 / 2 para funcionar de manera ms eficiente,

pero la nica fosfatasa Mce3E-interactuando que identificamos fue Ptpn23, y la inhibicin de

Mce3E que media la activacin de ERK1 / 2 no se vio afectada en las clulas desmontadas Ptpn23

(datos no mostrados). As que acudimos a otras explicaciones para los mecanismos que subyacen a

la regulacin negativa mediada Mce3E de la fosforilacin de ERK1 / 2 en las clulas husped.


18/19

Debido a que Mce3E no slo se localiza en ER, pero tambin interacta directa y especficamente

con el anfitrin ERK1 / 2 y p-ERK1 / 2 a travs de un motivo DEF, por lo tanto se plantea la

hiptesis de que Mce3E podra antagonizar las interacciones entre ERK1 / 2 y MEK1. Adems, a

travs de la colocalizacin con p-ERK1 / 2, Mce3E podra tambin bloquear la translocacin

nuclear p-ERK1 / 2, por lo tanto atenuar an ms la sealizacin de ERK.

Hemos encontrado que es necesaria la interaccin Mce3E-ERK basada en el motivo de DEF para

Mce3E para inhibir la activacin de sealizacin ERK1/2, regular negativamente la expresin de

citoquinas, y mejorar la supervivencia intracelular de las micobacterias. Cabe destacar que el

motivo DEF identificado en M. tuberculosis Mce3E comparti una reserva de restos con motivos

DEF tpicos de las molculas de las clulas eucariotas. Adems, de acuerdo a la anterior conclusin

de que el motivo DEF promueve la orientacin por ERK2 y, en menor medida, P38A, pero no

p38b2, encontramos que Mce3E muestra fuerte afinidad de unin basada en el motivo de DEF a

ERK2 y poca afinidad de unin a P38A. Tal descubrimiento podra ayudar a explicar el ligero, si

alguno, efecto inhibidor sobre la activacin de JNK / p38 inducida por RacL61-Mce3E. Nuestro

descubrimiento de este nuevo motivo DEF en M. tuberculosis Mce3E podra conducir a una mayoridentificacin de los motivos DEF similares en micobacterias y quizs otras bacterias patgenas.

Nuestros resultados sugieren que, a pesar de las estrategias para reducir la inflamacin perjudicial

y facilitar la reparacin de tejidos, por lo tanto podra ser til en el aumento de los regmenes

estndar de medicamentos antituberculosos, el gran cuidado podra ser necesario en la

orientacin de la va de sealizacin ERK1 / 2 en acogida ya que puede conducir a la exacerbacin

no deseada, o el aumento de la susceptibilidad a ciertas infecciones bacterianas, como la infeccin

por M. tuberculosis. En cambio, el motivo DEF de M. tuberculosis Mce3E podra proporcionar un

objetivo ms eficiente y selectivo para el desarrollo de terapias anti-TB novedosos.

FIGURE 9. Se propuso un modelo para el mecanismo deM. tuberculosis Mce3E medi al organizador la supresin

inmune innata. Mce3E acta recprocamente con y

colocaliza con ERK1/2 al aparato de ER de un motivo DEF

de manera dependiente. A travs de la asociacin con

ERK1/2, Mce3E cambia la localizacin subcelular de

ERK1/2 del citoplasma al aparato ER, reduce la asociacin

de ERK1/2 con MEK1, y bloquea lal translocacin nuclear

de fosfo - ERK1/2, llevando a la inhibicin dela activacin

de la va de sealizacin ERK1/2, la supresin de la

expresin Tnf e IL6, y la promocin de la supervivencia

del micobacterial dentro de los macrfagos.


19/19

En resumen, este estudio revela una funcin de M. tuberculosis Mce3E hasta ahora desconocida,

pero importante en la explotacin de la va de sealizacin ERK1/2 acogida para evadir la defensa

inmune del husped frente a la infeccin por micobacterias. Se demuestra que Mce3E se localiza

en ER, interacta con ERK de una manera dependiente del motivo DEF, y atrapa la interaccin ERK

en el ER y compromete la asociacin entre ERK y MEK, as como la translocacin nuclear de p-ERK,

aboliendo as la activacin de ERK. Estos resultados sugieren que M. tuberculosis Mce3E podraexplotar la va de sealizacin ERK1 / 2 para suprimir la respuesta inmune innata de acogida y

promover la supervivencia intracelular de las micobacterias, proporcionando un nueva diana

potencial ERK Mce3E 1/ 2 basada en la interfaz de medicamentos contra las enfermedades de TB.

Documents

Mycobacterium Tubercolosis Mce3E Suprime Inmunorespuestas Innatas Del Huésped