Neisserias Haemophilus Listeria

BACTERIAS Y ENFERMEDADES EN EL HOMBRE LABORATORIO INFECCIONES EN SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

Neisseria-Haemophilus-Listeria

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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA ESCUELA DE MICROBIOLOGA

PROGRAMA MICROBIOLOGA Y BIOANLISIS

BACTERIAS Y ENFERMEDADES EN EL HOMBRE 4509236 BACTERIOLOGA Y LABORATORIO- 4509252

Stella Restrepo G.

Neisseria

I. Introduccin

Las Neisserias son cocos gram negativos agrupados en pares con los lados adyacentes aplanados dando la apariencia de rin o de granos de caf; las clulas individuales tienen un tamao que vara de 0.6 a 1.5 micras segn la especie, el origen del microorganismo y la edad del cultivo. Son inmviles y no esporulados, algunas especies son capsuladas y otras producen un pigmento amarillo-verdoso. Las Neisserias pertenecen a la familia Neisseriaceae que comprende los gneros: Moraxella, Kingella y Acinetobacter. Las especies reconocidas hasta el momento son: N. meningitidis, N. gonorrhoeae, N. lactamica, N. sicca, N. mucosa, N. subflava, N. canis, N. cinrea, N. denitrifacans, N. flavescenns y N. elongata. La mayora de estos microorganismos son flora normal de las mucosas de animales de sangre caliente. Solamente N. gonorrhoeae y N. meningitidis se consideran patgenos primarios y ambas especies infectan exclusivamente al humano, las dems especies son consideradas saprofitas y se han asociado a enfermedad en el hombre de manera excepcional. Las Neisserias son aerobios estrictos, requieren humedad para su crecimiento, la temperatura ptima para las especies patgenas est entre 35 y 37C, son catalasa y citocromo oxidasa positiva. N. meningitidis y N. gonorrhoeae a diferencia de las otras especies tienen requerimientos nutricionales exigentes, por lo que necesitan medios ricos para su desarrollo y degradan pocos carbohidratos. En N. gonorrhoeae (gonococo) la produccin de pilis est relacionada con el tipo de colonia y con la virulencia, pero en el caso de N. meningitidis esta asociacin no est clara; en esta ltima especie se consideran como factores de patogenicidad la produccin de cpsula, con 13 tipos diferentes de polisacridos identificados hasta la fecha, siendo las de mayor frecuencia en enfermedad A, B, y C; el lipopolisacrido o endotoxina que puede jugar un papel importante en la reaccin de choque en la meningococcemia y las proteasas Ig A1. En este captulo slo se revisa N. meningitidis o meningococo; sobre su fisiopatologa puede decirse que se adhiere a las microvellocidades de las clulas no ciliadas de la nasofaringe ubicndose all en los estados de portador sano; la transmisin se hace persona - persona por contacto directo con secreciones respiratorias y por gotas de saliva contaminadas con la bacteria. En un pequeo porcentaje de las personas colonizadas ocurre diseminacin hematgena a partir de la nasofaringe produciendo



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meningococcecimia y/o meningitis; tambin puede ser el agente etiolgico de otitis, conjuntivitis, endocarditis, neumona y artritis. Existe evidencia de que el miningococo puede encontrarse en crvix, vagina, ano y uretra masculina como microorganismo colonizante. Es importante hacer diagnstico diferencial con Branhamella catarrhalis (colocada actualmente como subgnero de Moraxella) cuando se asla un diplococo gram negativo de vas respiratorias superiores, dado que el 30% de los nios pueden ser portadores de este germen; se puede igualmente encontrar en mucosas genitales femeninas, explicando casos raros de oftalmia neonatal, se estima que entre un 6 y un 9% de las otitis peditricas son debidas a ella, tambin se ha asociado a sinusitis, rinofaringitis y laringitis; en pacientes inmunosuprimidos puede causar neumona y a partir de all desarrollarse una septicemia, como tambin focos metastsicos (meningitis, artritis y endocarditis).

II. Toma de muestras

Las muestras para asilamiento de miningococo son LCR, sangre, liquido articular, escobillones nasofaringeos y conjuntivales, esputo o aspirado transtraqueal y material de lesiones en piel (petequias); las muestras deben tomarse siguiendo las instrucciones para estos procedimientos.

III. Examen microscpico

En las muestras clnicas teidas con gram el meningococo aparece como un diplococo Gram negativo en forma de granos de caf; se encuentran generalmente intracelulares en los PMN, aunque tambin en forma extracelular. La presencia de reaccin inflamatoria tiene correlacin con la respuesta del hospedero, por lo que es importante informar su presencia, as como tambin la localizacin de las bacterias. Cuando se trata de LCR, la muestra se centrifuga a 3.000 rpm durante 10 minutos y del sedimento se realiza el Gram y la siembra en los diferentes medios de cultivo. Cuando no se observan bacterias a pesar de la presencia de PMN es recomendable realizar la prueba de aglutinacin con ltex o aglutinacin del sobrenadante de dicho lquido para descartar antgenos especficos de H. influenzae tipo b, N. meningitis, S. pneumoniae y S. agalactiae lo que permite un diagnstico etiolgico rpido aunque no suprime la necesidad de los cultivos microbiolgicos pues de todas maneras es imperativo el antibiograma.



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IV. Aislamiento y cultivo

Cuando la muestra no presenta flora asociada las Neisserias pueden recuperarse en agar sangre, agar chocolate o en un caldo de enriquecimiento, en estos medios las colonias son redondas, convexas, de superficie lisa y borde regular, dimetro de 1mm aproximadamente y grisceas. En muestras con flora asociada se utilizan medios selectivos como el Thayer Martin o New York City y siempre la incubacin se hace con CO2, humedad y una temperatura entre 35 y 37C. Las Neisserias saprfitas crecen bien en medios simples tipo agar nutritivo o Muller Hinton.

V. Identificacin

La identificacin del genero se basa en el Gram y en la deteccin de la enzima citocromo oxidasa. La identificacin de especie se establece por el estudio de diferentes caracteres metablicos (tabla N1). Tabla N1. Identificacin de especies de Neisseria.

Especie Reduccin de nitratos

Hidrlisis de

tributyrina

Glutamil transferasa

Glucosa Maltosa Lactosa Sacarosa Fructosa ONPG

N. gonorrhoeae

N. meningitidis N. lactamica

N. sicca N. flavescens B. catarrhalis

- - - - - +

- - - - - +

- + - + - -

+ + + + - -

- + + + - -

- - + - - -

- - - + - -

- - - + - -

- - + - - +

Como puede observarse la reduccin de nitratos y la hidrlisis de la tributyrina permiten diferenciar las especies de Neisseria de B. catarrhalis, y a su vez la O.N.P.G diferencia B. catarrhalis de las dos especies patgenas: meningococo y gonococo; para estas dos ltimas especies de Neisseria es de utilidad emplear la gama de Glutamyl transferasa ya que las separa con una sola reaccin. Para la prueba de hidrlisis de la tributyrina se debe hacer una suspensin densa de la bacteria en 0.25 ml de solucin salina estril, agregar la tableta e incubar a 37C por 4 horas. La reaccin positiva presenta una coloracin amarilla. La gama Glutamyl transferasa se realiza como la prueba anterior pero con incubacin de una hora y el resultado positivo presenta una coloracin amarilla. La fermentacin de los azcares se hace preparndolos igual a la D-Manosa descrita en el captulo de Estafilococos. Para la prueba de reduccin de nitratos y O.N.P.G ver captulo de Pruebas de Identificacin de bacilos Gram negativos. Existen en el mercado mtodos miniaturizados y rpidos para la especiacin de Neisserias, como Gonochek, Quad-Ferm, Vitec-NHI Card y el estuche de Neisserias del Instituto Pasteur; a su vez existen



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los antisueros especficos de grupo para N. meningitidis que permiten clasificarlo de acuerdo a su polisacrido capsular, que es de enorme importancia epidemiolgica.

VI. Antibiograma

Las pruebas de susceptibilidad para los meningococos no son necesarias porque estos microorganismos siguen siendo muy sensibles a los antibiticos de eleccin: penicilina, cloranfenicol y cefalosporinas de tercera generacin, pero cuando el paciente no responde adecuadamente al tratamiento se recomienda realizar una prueba de deteccin de betalactamasa.

VII. Bibliografa

Trunkel Ar and Scheld. En: Mandell D and Bennets. Principles and practice of infectious Diseases. 4 Ed. Churchill Livingstone, New York 1995; pp 831 864. Koneman, E. color Atlas and Textbook of diagnostic Microbiology. 3ed, J.B. Lippincott, Philadelphia, 1988. Pp. Knapp JS, Rice RJ. Neisseria and Branhamella. En: Murray PR et al. Manual of Clinical Microbiology. 6Ed, Washington, A.S.M. 1995, pp 34 340. Daly J, Seskin KC, Pesslo M. Procecessing and Interpretation os Cerebroespinal Fluid. En: Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Wasington, 1992. Pp 1.9.1 1.9.7.



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Haemophilus

I. INTRODUCCION Haemophilus spp. son bacilos filamentosos gram-negativos no esporulados, presentan un marcado pleomorfismo y a menudo su forma es cocobacilar, son inmviles, dependientes de hemino y/o NAD, son aerobios o anaerobios facultativos y realizan metabolismo respiratorio o fermentativo; se cultivan a 37C, todas las cepas poseen nitrato reductasa y su relacin G + C est entre 37 y 44 m%. Pertenecen a la familia Pasteurellaceae y hasta el momento estn descritas y aprobadas 16 especies; siendo 9 de ellas flora normal o patgenos en el hombre y las restantes de animales, entre las primeras estn: H. influenzae, H. aegyptius, H. haemolyticus , H. parainfluenzae, H. aphrophilus, H. seginis, H. drucreyi, H paraphrohaemolyticus. Son parsitos estrictos de las mucosas del hombre y de numerosos vertebrados de sangre fra y caliente, no han sido encontrados en la naturaleza y aunque son habitantes normales del tracto respiratorio superior humano pueden ser invasores primarios o secundarios. H. influenzae es patgeno de gran importancia en humanos, presenta cpsula polisacrida de 6 tipos antignicos diferentes que permiten su clasificacin desde la a hasta la f, siendo el tipo b el responsable de la mayora de las infecciones causadas por Haemophilus en nios de 6 meses a 3 aos de edad como son meningitis, epiglotitis, osteomielitis, artritis y celulitis, mientras que las cepas no capsuladas estn implicadas en bronquitis crnicas, sinusitis, conjuntivitis, otitis media y en las infecciones del rbol respiratorio bajo en pacientes con fibrosis qustica. Adems de poseer cpsula con funcin antifagocitaria, estas bacterias producen proteasas IgA que cliva esta inmunoglobulina presente en secreciones, neuroaminidasa, proseen protenas M y P de pared y fimbrias que facilitan la adhesin a las clulas del epitelio respiratorio y conjuntival. Ms recientemente se han clasificado los H. influenzae en 6 bio-variedades (I VI) con las base en los resultados de la produccin de indol, urea y descarboxilacin de la ornitina. La mayora de las cepas que producen infecciones invasivas pertenecen al biotipo I, los biotipos II y III generalmente colonizan la nasofaringe de personas sanas. Haemophilus aegyptius ha sido considerado como un biotipo de H. influenzae por su gran similitud, aunque no se le ha demostrado cpsula; se ha aislado en casos de conjuntivitis aguda y subaguda, como tambin en individuos sanos. Haemophilus ducreyi es el agente del chancro blando, una enfermedad de transmisin sexual. Otras especies de este gnero se asocian con diferentes enfermedades, aunque su carcter parece ser el de oportunista. Haemophilus parainfluenzae ocasionalmente causa endocarditis. Haemopilus aphrophilus es miembro de la microflora de la placa dental y puede causar endocarditis, absceso cerebral, infectar heridas y producir infecciones mandibulares; H. paraphrohaemolyticus se ha aislado de garganta, lceras en cavidad oral y secrecin uretral pero su significado patgeno se



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desconoce; H. paraphrophilus es miembro de la flora normal de la boca y faringe y puede causar endocarditis subaguda, paroniquia, absceso cerebral y osteomielitis; H. segnis se asla de faringe y microflora de placa dental, ha sido aislado de absceso pancretico; H. haemolyticus se ha asilado de nasofaringe en adultos sanos pero hasta el momento no ha sido implicado en infecciones. II. TOMA DE MUESTRAS Al tomar muestras del tracto respiratorio superior es muy importante obtenerlas con el mnimo de contaminacin, sobre todo de la cavidad oral (ver captulo sobre toma de muestras). Los escobillones farngeos y nasales deben humedecerse en caldo antes de proceder al frotis y los obtenidos de lesiones supurativas y conjuntiva deben inocularse inmediatamente en los medios a temperatura ambiente para evitar la desecacin de la muestra. Existe cierta evidencia de que los Haemophilus sobreviven mejor a temperatura ambiente que a 4C, por lo tanto cuando existe demora entre la toma de la muestra y la siembra de ella debe evitarse la refrigeracin. III. EXAMEN MICROSCPICO Dado el pleomorfismo que presenta los Haemophilus y la captacin inconsistente de los colorantes, la lectura del Gram puede llevar a errores en la interpretacin, por ello debe tenerse en cuenta que pueden observarse como formas cocobacilares a filamentosas, o bacilos ovalados, es frecuente encontrar coloracin bipolar. En los casos de meningitis por esta bacteria se observan al Gram innumerables PMN como corresponde a las infecciones en SNC de carcter agudo. I. AISLAMIENTO, CULTIVO E IDENTIFICACION El gnero Haemophilus deriva su nombre de la necesidad para su crecimiento in vitro de ciertos factores que se encuentran en la sangre, como: 1. La porcin Heme de la hemoglobina o ferroprotoporfirina II, llamada tambin factor X; es un

componente de numerosas enzimas de la cadena respiratoria, catalasa y peroxidasa de las bacterias. Se consigue como una solucin de clorhidrato de hemina con 200 ug/ml.

2. El dinucletido de nicotinamida y adenina (NAD) o en su forma NADP, conocido como factor V, est presente intraeritrocitariamente, en ciertas bacterias como S. aureus y Neisserias, en extractos de levaduras, en bases pricas y pirimdcas, vitaminas y otros factores de crecimiento.

Ciertas especies de Haemophilus en condiciones aerobias son incapaces de sintetizar ambos o alguno de estos dos factores y por lo tanto ellos deben ser aadidos a los medios de cultivo.



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Especie

Requerimiento factores

X V

Hem

lisi

s Oxida

sa

Catalasa CO2

estimula crecimient

o Gluco

sa

Fruc

tosa

Sacarosa

Lactos

as

Maltosa

H. influenzae H. parainfluenzae H. haemolyticus H. parahaemolyticus H. aphrophilus H. aegyptius H. drucreyi

+ + - + + + - + - - + + + -

- - + + - - -

+ + + + - + +

+ V - V + - -

- V - V + - -

+ + + + + + -

- + W + + - -

- + - + + - -

- - - - + - -

- + - - + - -

+: el 90% de las cepas o ms positiva. V: se observan reacciones variables -: el 90% de las cepas es negativa W: reacciones dbilmente positivas. Para determinar el requerimiento de los factores V y X se dispone comercialmente de discos de papel filtro impregnados con los factores V, X y XV. Para realizar las pruebas se hace una suspensin densa de la cepa de Haemophilus crecida en agar sangre o agar chocolate en medio BHI, sta suspensin se incuba por 4 horas a 37C y a partir de esta suspensin se hace una siembra en tripticasa soya agar (TSA); los discos con los factores X y V se colocan sobre la superficie del agar con una distancia de 1 a 2 cm; si tambin va a usarse el disco con factores X y V, los discos deben colocarse ms espaciados; las cajas se incuban en 3 a 5% de CO2 a 35C durante 18 a 24 horas y se observan los patrones de crecimiento alrededor de los discos; luego se hace la diferenciacin de especie de Haemophilus determinando el requerimiento de los diferentes factores por el crecimiento de alrededor de los discos; el crecimiento rodea por completo el disco con el factor V y el disco con factores X y V, pero no el disco con factor X, indica que la especie requiere slo factor V; el crecimiento rodea por completo el disco con factor X y el disco con factores X y V, pero no el disco con factor V, indica que la especie requiere slo el factor X; crecimiento slo alrededor del disco con factores X y V indica que la especie requiere de ambos factores para su crecimiento (ver esquema).

Requiere slo factor V Requiere slo factor X Requiere factores X y V



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Para la serotipificacin de H. influenzae se utilizan mtodos de aglutinacin en placa con antisueros especficos contra cada uno de los seis serotipos (a, b, c, d, e y f), al efectuarla debe tenerse presente utilizar una suspensin densa del germen en solucin salina. Dado que H. influenzae tipo b es el ms comnmente encontrado en LCR y sangre, los Haemophilus aislados en estas muestras deben primero aglutinarse con el antisuero b. II. DETECCIN DE ANTGENOS CAPSULARES TIPO b Para establecer un diagnstico rpido de infeccin sistmica por H. influenzae tipo b, se dispone de varias tcnicas como la deteccin del antgeno de polirribosa-ribitol-fosfato de tipo b en LCR, suero y orina. Estas tcnicas comprenden: Controinmunoelectroforesis (CIE), aglutinacin con ltex, coaglutinacin y ELISA. Con respecto a la sensibilidad y especificidad de estas pruebas, algunos estudios indican que la aglutinacin con ltex y coaglutinacin son ms sensibles y detectan menor cantidad de antgeno que la CIE. Actualmente las pruebas de aglutinacin con ltex son las ms utilizadas por su versatilidad, sencillez y disponibilidad. III. ANTIBIOGRAMA La resistencia determinada por plsmidos hace necesario que se realicen pruebas de susceptibilidad a las cepas de H. influenzae aisladas de empiemas, LCR u otro sitio normalmente estril, donde su papel como acusante de enfermedad es claro. El antibiograma por Kirby Bauer debe hacerse en agar HTM (Haemophilus Test Medium) utilizando los discos ampicilina, cloranfenicol, amoxacilina, tetraciclina y kanamicina. Tambin se han detectado cepas productoras de betalactamasa. IV. BIBLIOGRAFIA Campos JM. Haemophilus. En Murray PR et al. Manual of Clinical Microbiology. 6 Ed. Washington ASM, 1995. Pp. 556 .- 565. Daly J, Seskin KC, Plezzlo M. processing and Interpretation of Crebrospinal Fluid. En: Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington, 1992. Pp 1.9.1 1.9.7. Koneman E. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 3 Ed. J.B. Lippincott Philadelphia, 1988. Pp. Tunkel AP, Scheld. En: Mandell D and Bennetts. Principles and Practice of Infectious Disease. 4 Ed. Churchill Livingstone, New York, 1995. Pp. 831 864.



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Listeria

I. INTRODUCCIN

Las listerias son bacilos gram positivos no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos, catalasa positiva y morfolgicamente muy similares a los difteroides, su relacin G + C es menor de 50%. El gnero Listeria presenta similitud taxonmica y qumica con el gnero Brochotrix y ambos ocupan una posicin, entre Bacillus y Lactobacillus. Hasta la fecha se han identificado 8 especies de este gnero, siendo la L. mococytogenes la principal patgena para hombres y animales, de ella los serotipos Ia, Ib, y IVb son los responsables del 90% de las enfermedades que se producen en humanos, la serotipificacin se basa en los 5 antgenos flagelares y tiene utilidad epidemiolgica. En este captulo slo se revisa lo concerniente a esta especie. L. mococytogenes se ha aislado de tierra, polvo, agua vegetales en descomposicin, alimentos procesados y silos, se sabe que causa epizootias en ovejas y bovinos, gran variedad de animales domsticos pueden albergar este microorganismo, tambin puede ser aislado de crustceos, truchas, moscas y piojos. Esta bacteria es un parsito intracelular facultativo y la inmunidad depende en gran parte de linfocitos T los cuales median la activacin de fagocitos mononucleares va linfoquinas, especialmente el interfern gama y la interleuquina 2. L. mococytogenes produce una hemolisina (listeriosina) a la que se le atribuye un papel virulento ya que se une irreversiblemente al colesterol de las membranas celulares lo que puede finalmente llevar a la destruccin de los macrfagos, como tambin aumentar la disponibilidad de hierro. La infeccin por este microorganismo puede manifestarse en diferentes sndromes como: 1. Infecciones del embarazo, 2. Granulomatosis infantiseptica, 3. Sepsis de origen desconocido, 4. Meningoencefalitis. Adems de producir enfermedad en embarazadas y nios, la listeriosis es una infeccin de pacientes cancerosos, trasplantados, inmunosuprimidos artificialmente y ancianos, en quienes se presenta principalmente como infeccin local (endoftalmitis, artritis, osteomielitis y peritonitis) probablemente como resultado de una fase inicial bactermica.

II. TOMA DE LA MUESTRA

Las muestras a partir de las cuales puede aislarse este microorganismo comprenden las estriles como LCR, sangre, liquido articular, amnitico y biopsias y las acompaados de flora normal como por ejemplo placenta, meconio, aspirado gstrico y piel, principalmente.



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III. EXAMEN MICROSCOPICO

La listeria presenta dificultades para su correcta identificacin microscpica ya que a partir de muestras clnicas puede presentarse en formas cocoides pudindose confundir estreptococos, otras veces, se decolora observndose como Haemophilus y como ya se anot, semejar difteroides visualizndose en empalizadas o cadenas cortas. En muestras de LCR puede encontrarse intracelular en PMN y monocitos.

IV. AISLAMIENTO Y CULTIVO

Las muestras procedentes de sitios estriles se siembran en agar sangre y en un caldo de enriquecimiento como BHI, tripticasa y tioglicolato, incubndose a 35C entre 5 y 7 dias, examinando el crecimiento cada 24 horas. Para la bsqueda en sangre se siguen las indicaciones del captulo hemocultivos. Las muestras con flora asociada requieren de medios selectivos para lo cual comercialmente se consiguen diferentes caldos o agares. Cuando se utiliza el medio de agar Mc Bride modificado, despus de 24 horas de incubacin a 37C se examina microscpicamente por transiluminacin oblicua en bsqueda de colonias pequeas, grises, de borde regular y levantadas. En agar sangre las colonias son de aproximadamente 1 mm, trasparentes, de borde irregular y las especies L. monocytogenes, L. sleegeri y L. ivanovii presentan beta hemlisis.

V. IDENTIFICACION

A las colonias ya descritas (beta hemolticas) y a las grisceas en agar Mc Bride realizar:

1. Gram para observar las formas pleomrficas. 2. Catalasa, que en este gnero da positiva y lo diferencia de los gneros Corynebacterium y

Erysipelothrix. 3. Microscopa de examen fresco donde se observan los microorganismos con movimiento

rotatorio cuando han sido incubados a menos de 30C e inmviles cuando lo han sido a temperaturas superiores; esto los diferencia de Lactobacillus y Brochotrix.

4. Observar beta hemolisis. 5. Movilidad a 30C, es positiva con formacin de sombrilla por debajo de la superficie del medio. 6. Prueba de CAMP que es positiva para L. monocytogenes y L. sleegeri (ver captulo de

estreptococos) 7. Prueba de Esculina y Voges-Proskauer, ambas son positivas para L. monocytogenes (ver

captulo de pruebas de identificacin) 8. Pruebas de utilizacin de carbohidratos para la identificacin de las otras especies, midiendo la

produccin de cido a partir de la L-ramnosa, xilosa y manitol. 9. Adicionalmente para probar la capacidad invasiva de la cepa puede hacerse la prueba de

Anton (inoculacin de la bacteria en conjuntiva de conejos y posterior desarrollo de querato-conjuntivitis).



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Recientemente con fines epidemiolgicos se ha investigado la tipificacin de L. monocytogenes por medio de pruebas de restriccin de DNA, electroforesis de enzimas y tipificacin de RNA.

VI. ANTIBIOGRAMA

Los patrones de sensibilidad de L. monocytogenes a diferentes antibiticos han sido relativamente estables a travs del tiempo, presentando una buena sensibilidad a penicilina, ampicilina, gentamicina, eritromicina, tatraciclina, rifampicna, cloranfenicol y una marcada resistencia a las cefalosporinas.

VII. BIBLIOGRAFIA

Bala S, rocourt J, Bille J. Listeria. En: Murray PR et al. Manual of Clicical Microbiology. 6 Ed. Washington ASM, 1995. Pp 341 348. Daly J, Seskin KC, Pezzlo M. Processing and interpretation of Cerebrospianal Fluid. En: Isesnberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington, 1992. Pp. 1.9.1 1.9.7. Koneman E. Color Atlas and Texrbook of Diagnostic Microbiology. 3 Ed. Lippincorr Philadelphia, 1988. Pp. Tunkel Ar, Scheld. En: Mandell D and Bennetts. Principles and Practice of Infrectrious Didease. 4 Ed. Churchill Livingstone, New York, 1995. Pp. 831 864.

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