Nueva serie de UHPLC Baños de Disolución. 1200 infinity · ¿Qué se Requiere para Trabajar a ... Por volumen de retardo del gradiente 2) Por volumen de retardo del gradiente y

1220

Infinity LC

1260

Infinity LC

1290

Infinity LC

Nueva serie de UHPLC

1200 infinity:

- Mejore 10 veces la sensibilidad y

productividad de sus HPLC.

- Amplie su rango de aplicación con

los nuevos:

- SFC (cromatógrafo de fluidos supercríticos)

- RRLC-Bioinerte

Isidre Masana

Agilent Technologies

Especialista Productos UHPLC/MS

Seminario: Últimas

Novedades en UHPLC,

Cromatografía Flash y

Baños de Disolución.

Agenda1. Introducción: ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?.

2. Posibilidades de la Nueva Serie 1200

Infinity RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.

•Ejemplos de rendimiento.

3. Conversión de Métodos de HPLC a

UHPLC/RRLC:

•Estrategias de Traspaso de Métodos.

•Columnas Poroshell-120: UHPLC con HPLC‟s

convencionales.

4. NUEVO 1260 Infinity Bio-inert.

5. NUEVO 1200 Infinity SFC System.

6. Conclusiones.

Página: 2


2. Posibilidades de la Serie 1200 Infinity

RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.



UHPLC/RRLC:



convencionales.



6. Conclusiones.

Página: 3

¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC /

RRLC?El poder de separación de elevadas velocidades lineales

Cromatogramas con escala de tiempo alineada a primer y último picoI.D. & I.M - Waldbronn 5/2009

Columna: ZORBAX RRHD SB-C18 2.1 x 100mm 1.8 µm

Gradiente: ACN/H2O 30/70 a 100/0 a 40ºC Cromatogr. A: 0.5mL/min en 3.0min // B: 0.833mL/min en 1.8min

Inyección: 1µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens).

P máx. grad. A= 590bars. B= 905 bars

A 0.5mL/m gr.. 3.0min

K„ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

FxTg = 0.5x3 = 0.833x1.8 = 1.5

B 0.833mL/m

gr. 1.8min

3min Si el producto de Flujo x Tgrad se mantiene

constante el poder de separación no variará (utlizando la misma columna y sin variar los %

solvente orgánico)

1.8min

↑Flujo: Reduce tiempo análisis y mejora

capacidad de separación en gradientes

A 0.5mL/m gr.. 3.0min

B 0.833mL/m

gr. 1.8min

Columnas RRHD & RRHT permiten subir el

flujo SIN reducir resolución para:

- Reducir tiempos (subiendo flujo)

- Aumentar resolución (sin sacrificar tiempo)

Página: 4

¿Qué se Requiere para Trabajar a

Velocidades Lineales Elevadas?• No perder eficacia al aumentar el flujo.

+

EFI

CA

CIA

-

S.T.M.: Sub Two Microns

UHPLC / RRLC

HEPT = A+ B/u + C u

4.6mm d.i.

UHPLC/RRLC permite velocidades elevadas sin pérdida de información

• Poder trabajar a flujos y presiones elevadas.

∆P = f (η .u .L / dp2)

Página: 5

0

200

400

600

800

1000

1200

0 1 2 3 4 5

1290 Infinity

1200 Infinity Series: Aumentado los Estándares

y Compatibilidad en HPLC y UHPLC

bar

ml/min

Standard LC

Vendor A1.7µm columns

Agilent RRLC: 1220 & 1260

Infinity Series Columnas 1.8µm

Vendor B1.9µm columns

Vendor C

Vendor D

1290 Infinity le permitirá la máxima reducción de sus tiempos de

análisis y/o aumento de la resolución de sus aplicaciones

52

1200

HPLC Estándar

RRLC

Agilent 1100 y 1200

600

Página: 6






UHPLC/RRLC:



convencionales.



6. Conclusiones.

Página: 7

Página: 8

1260

Infinity LC

Modular

600bar

80Hz

2-10x Sensibilidad UV

Precio HPLC–Prestaciones RRLC

100% Compatible con HPLC

1220

Infinity LC

Integrado

600bar

80Hz

2-10x* Sensibilidad UV

Most affordable

HPLC and RRLC

1290

Infinity LC

Modular

1200bar

160Hz

Las Mejores Prestaciones

Máxima FlexibilidadCostes Mantenimiento de HPLC

*2x for build-in VWD, 10x via add-on 1260/1290 DAD

Nueva Serie LC Agilent 1200 Infinity: Mejorando los

Estándares en HPLC – Mayor Valor para Cualquier Presupuesto

NUEVAS LINEAS 1200 Infinity

1260

Infinity LC

Modular

Flexibilidad

en configuración

Analytical

SFCGPC

SEC

Preparative LC & LC/MS

Bio-inert

HPLC

Isocratic

LC

Nano & Cap LC

Nuevo Nuevo

Multi-method and

Method Development

Nuevo

RRLC al precio de HPLC

Página: 9

Hasta 8 columnas y 15 disolventes Desde 100 nL/min hasta 100mL/min

1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario Prestaciones RRLC para TODOS LOS LABORATORIOS

Resolución optimizada

3x100mm, 1.8µm

Resolución pico 5 = 7.16

Tiempo análisis: 7 min

Velocidad y Resolución optimizadas

3x50mm, 1.8µm


Tiempo análisis: 1.1min

Convencional

4.6x150, 5µm


Tiempo análisis: 11 min

min0 2 4 6 8 10

min0 2 4 6 8 10

min0 2 4 6 8 10

10 x PRODUCTIVIDAD mayor nº de datos y de mejor calidad!

Página: 10

1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario 100% Compatibilidad con Métodos HPLC

Reemplazo Sin Riesgo

1260/1220 Infinity LC

Sistema Cuaternario

1100/1200 Series

Sistema Cuaternario

Columna: 4.6 x 150mm, 5µm

Gradiente: 0 min 20 % B

10min 95 %

Flujo: 1 mL/min

min0 2 4 6 8 10

Ejecute sus actuales métodos de HPLC y obtenga los mismos resultados

Página: 11

Serie 1200 Infinity: Compatibilidad de

Columnas

Sistema

1200 Infinity

STM-cortas1.8µm 30-50 mm long.

STM-largas1.8µm >100 mm long

Convencionales

(3.0-4.6mmID,

150-300mm)Partículas 3 - 5µm

Superficialmente

porosaPartículas 2.7µm 2.1 3.0 4.6 2.1 3.0 4.6

1290 Binario

1260 Binario 2)

1220 Bin/1260 Cuat 1) 2)

1220 /1260 Isocrático 1) 2)

Cualquier columna convencional de HPLC, RRLC o UHPLC

se puede utilizar en un sistema 1220/1260/1290 Infinity,

independientemente de su dimensión, tipo o tamaño

de partículas o mecanismo de separación.

STM-cortas: partículas sub-2µm , 30 – 50mm long.

STM-largas: partículasub-2µm, >100 – 150mm long.

Convencionales: partícula 3-5 µm

1) Por volumen de retardo del gradiente

2) Por volumen de retardo del gradiente y presión (para ≥150mm).

Página: 12

Preparación Muestra en Inyector Automático. Ejemplo Derivatización precolumna: Aminoácidos (OPA + FMOC)

Dosificador de Muestra

Unidad de

Muestreo

deshecho

Bomba

a columna

Muestra Reactivo

VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\095-0101.D)VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\003-0201.D)VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\007-0401.D)

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

ASP

GLU

SER

THR

TYRCYS-CYS

VAL

METPHE

ILE

ASN

TRP

ORN

ROJO: muestra AAS libres

GLY

HIS

ARG

ALA

LEULYS

PRO

DERIVATIZACION AMINOACIDOS

1.-Toma 5 µl tampón Borato (vial 2)

2.-Toma 1 µl reactivo OPA (vial 3)

3.-Toma O µl agua (vial 1) - lavado exterior aguja

4.-Toma 1 µl muestra AAS (vial X)

5.-Toma O µl agua (vial 1) – lavado aguja

6.-Mezclar 7 µl 6 veces – Derivatiza AAS PRIMARIOS

7.-Toma O µl agua (vial 1) - lavado exterior aguja

8.-Toma 1 µl reactivo FMOC (vial 3)

9.-Mezclar 8 µl 3 veces – Derivatiza AAS SECUNDARIOS

10.-INYECTAR

También es útil para mezclar patrones durante la puesta a punto de métodos o p.e. para automatizar la

derivatización con FMOC en el análisis de Glifosato y AMPA por LC/MS

Página: 13

Agilent 1290 Infinity

El más Versátil

UHPLC:

• Cualquier tipo de columnas:

UHPLC, LC, Solid Core, Monolitics,…

• Columnas de 1 a 8 mm d.i..

• Longitudes hasta 25cm x1.8µm.

• UHPLC & UFLC con CH3OH.

• ….

• ..

•.

Infinitas Posibilidades !!

1290 Infinity – ¿Qué aporta al mundo del UHPLC?

1290 Infinity NO sólo es un equipo capaz de proporcionar unos

rangos mayores de Flujo y de Presión…

1290 Infinity es un equipo INNOVADOR

1290 Infinity incorpora grandes avances en todos sus módulos,

que una vez más, marca la diferencia tecnológica.

Página: 15

1220/1260 “versus” 1290 Infinity Binary Pumps- Los más bajos volumen muerto y ruido de mezcla

1220/60 Series

Channel A

Passive Damper

0 - 300 µl

Passive Mixer

400 µl (opcional 200)

1220/60 Series

Channel B

1290 Inifinity

Chanel A

1290 Inifinity

Chanel B

Very Low Noise

~ 800 µl

+ =Active Damping

10µl

Jet Weaver Mixer

35µl

Lowest Noise

• min. 50% lower

Delay Volume

• 10µl / 45µl

• 80x / 20x lower

1290 Infinity

Página: 16

Precision Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 3 Peak 5 Peak 6 Peak 7 Peak 8 Peak 9

% RSD RT 0.016 0.0077 0.0052 0.0058 0.0058 0.0054 0.0059 0.0057 0.0080

% RSD Area

0.5 µl 0.40 0.39 0.43 0.47 0.40 0.46 0.44 0.52 0.56

RT RSD = 0.005% !!!

Phenone Standard, 10 Consecutive Runs

2.1 x 50mm RRHD SB C18, 1.8µm

1.2ml/min, 0.5ul, 40C

80Hz, 245/10nm, REF 360/80nm

5 - 95% ACN in 0.5min

1290 Infinity UHPLC: Precisión del Tiempo

de Retención en modalidad UFLC

Página: 17

Muestra de tranquilizantes

Columna: Porosa superficial

Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um

Flujo 3.5ml/min, ~ 700 barGradiente 2-92% ACN en 0.4min

T= 80 °C

0.095sec PW 0.140secPW

Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de

separación con todo tipo y marcas de columnas

Columnas Superficialmente Porosas: permiten

muy elevadas velocidades lineales con elevada

resolución y menor presión (↓40-50%)

0.5 s

Núcleo

Sólido

1.7um

} 0.5µm

2.7µm

Página: 18

10 s

eg

un

do

s!!

2 s

egu

nd

os!!

Nuevas Celdas Diode Array “Max-Light Cartridge“- Guía de ondas Optofluídica

Beneficios: La más alta sensibilidad (S/N) con pequeños volúmenes de celda (mínima dispersión).

Fácil selección de celdas: una para todas las aplicaciones principales.

Más fiable y robusta integración automática de picos, debido a la “quasi”

NO influencia de cambios de IR y de temperatura del disolvente.

Diseño en cartucho para un muy fácil intercambio y manejo de la celda.

Sílice fundida libre de recubrimiento (sin efectos sobre línea de base) y sin mantenimiento.

La Solución: Fibra no recubierta (sílice fundida)

V

VmD

LFr

24

42

~100% eficiencia transmisión de luz debido a principio de reflexión interna total (TIR).

2 Versiones: -10 mm x Vol.σ: 1 µL (x2.5 sensib.) -60 mm x Vol. σ: 4 µL (x10 sensibilidad)

Página: 19

1 ó 6 cm

1290 Infinity DAD: Mejora hasta x10 Sensibilidad-1290 Infinity DAD: 11.4 x 1200 Series DAD SL

1290 DAD

60 mm

1200 DAD SL

10mm

Height [mAU] 28.87579 4.93845

Noise [mAU] 0.009806 0.01908

Signal/ noise 2944 259

Sensitivity

increase

+11.4

min0 1 2 3 4 5

mAU

0

5

10

15

20

25

30

Columns: 150 x 4.6mm Zorbax SB C18, 5µm

Sample: Anthracene: 835 pg/µL

Mobile phase: A: Water, B: Acetonitrile

Elution: isocratic 80 % B

Injection volume: 5 µL

Flow: 1.5 mL/min

DAD: 251/4nm, Ref= 450/80nm,

2.5Hz, slit width 4nm

1290 Infinity DAD

1200 Series DAD SL

1290 DAD

60 mm

1200 VWD

10mm

Height [mAU] 28.87579 4.79998

Noise [mAU] 0.009806 0.01894

Signal/ noise 2944 253

Sensitivity

increase

+11.6

1290 Infinity DAD

el detector UV/VIS más sensible del mercado

Página: 20

1290 Infinity UHPLC + 6460 QQQ Jet StreamProductividad: Análisis 250 Pesticidas en 8 min - Dynamic MRM.

Columna 100x2,1mm x 1.8µm Zorbax Eclipse Plus C18

500ppt, dynamic MRMVentana tiempo de retención = 12 seg.

Ancho de los picos ~ 1 segundo

Zorbax Eclipse Plus C18

2.1 x 100mm (1.8μm)

1290 Infinity

el UHPLC ideal para LC/MS

Página: 21

x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1

Cycle time

Rt

QqQ-dMRM “Dynamic Multiple Reaction Monitoring”:

Mayor Sensibilidad en “Screenings”

= nº Concurrent dMRM

dMRM: • MRM Dinámico con ventanas de

monitorización individuales creadas

automáticamente a partir del tiempo

de cada compuesto.

• Permite mejorar la sensibilidad(↑ dwell time) o la frecuencia de

adquisición de datos.

dMRM

RSD%

requeridoPtos./pico

necesarios

<1% 15

1-3% 12

10-12% 8

QqQ

Video Quality

Página: 22

200 zeptomoles90 atogramos

VerapamilInjectados en-columna

Acquisition Time (min)

+ MRM (455.3 -> 164.9)

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1x10

4.2

4.3

4.4

4.5

Página 23

¿Límites Actuales UHPLC-QqQ?: UHPLC-

1290/QqQ-6490 con Tecnología i-FunnelLimites Detección Zeptomolares

¿Qué es un Zeptomol?

¿¿¿¿ Zepto ???FACTOR POR EL QUE HAY QUE MULTIPLICAR

LA UNIDADMULTIPLO PREFIJO

ABREVIATU

RA

0,1 mol 10-1 mol decimol dM

0,01 mol 10-2 mol centimol cM

0,0001 mol 10-3 mol milimol mM

0,0000001 mol 10-6 mol micromol μM

0,0000000001 mol 10-9 mol nanomol nM

0,0000000000001 mol 10-12 mol picomol pM

0,0000000000000001 mol 10-15 mol femtomol fM

0,0000000000000000001 mol 10-18 mol attomol aM

0,0000000000000000000001 mol 10-21 mol zeptomol zM

0,0000000000000000000000001 mol 10-24 mol yoctomol yMPage

24

602 moleculas

< 1molécula

Página: 24

6 Órdenes de magnitud de rango dinámico

lineal

Y = 65283 x – 0.390412

R2 = 0.9976

Femtograms

Are

a R

esp

on

se

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

10000000

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

100 Attogram to 100 Picogram verapamil on column

Página 25

1290 Infinity/6540-UHD-QTOF: Fast UHPLC

“Screening” 250 Pesticidas en 90 segundos.

Fenpyroximate EMass [M+H]+ = 422.20806Resolution = 38636-0.25ppm

1290/6540 90seg análisis250 pesticidas (125pg on-column)MS con masa exacta

1-naphthol Mass [M+H]+ = 145.06489Resolution = 249090.06 ppm

Spinosad AMass [M+H]+ = 732.4687

Resolution = 47094-0.77ppm

90s

LC/MS-TOF(/QTOF): “Screening” de

cualquier compuesto ionizado

6540-QTOF

Resolución

espectral: 25-47K

2.1 x 50 mm x 1.8µm Eclipse Plus C18

1.2 mL/min, 60 ºC

Página: 26






UHPLC/RRLC:



convencionales.



6. Conclusiones.

Página: 27

Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:

1.- Estrategias en el Traspaso de Métodos

Reducción de Tiempo:

• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (o 3.5 μm).

• Aumentar el flujo.

• Aumentar la temperatura.

Mejora de Resolución :

• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (o 3.5 μm)..

• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.

• Acoplar varias columnas en serie de 5μm.

32-28

1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.

5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)

Página: 28

Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC/RRLC

www.agilent.com/chemInstruments

Liquid Chromatography

Buscar: Method translator

Para 1290: http://www.chem.agilent.com/en-US/Products/Instruments/lc/Pages/1290infinity_method_translator_cost_calculator.aspx

Página: 29

http://www.agilent.com/chem

Traspaso de Métodos Isocráticos a UFLC.

Columna referente: 5µm x 150mm (12.500 platos)

Reducción del Tiempo de Análisis*

Flujo Constante Flujo x 2 Flujo x 3

1.8µm x 50mm

(12.000 platos)

1/3

30min10min

1/6

30min5min

1/9

30min3.3 min

3.5µm x 75mm

(10.500 platos)

1/2

30min15min

1/4

30min7.5min

1/6

30min5 min

3.5µm x 100mm

(14.000 platos)

2/3

30min20min

1/3

30min10min

2/9

30min6.7 min

La resolución será semejante a la original. La misma proporción aplica a D.I. 2.1 y 3mm*Nota: Reducción del tiempo de análisis calculada con respecto a columna de 150x4.6mm 5µm

**Nota: Incremento presión: +35% para 10cm x 3.5µm +150% para 5cm y 1.8µm (∆P = f (η . u . L / dp2))

• Mantener: composición y nº puntos muestreo pico (↑ Hz).

• Subir Flujo (hasta p.e. 80% presión máxima instrumento).

• Reducir volumen inyección (proporcionalmente a. reducción volumen columna).

Página: 30

Traspaso de Métodos con Gradientes

•S: definirá la “sensibilidad” del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico.

•Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula

2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas)

•Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su “sensibilidad” a cambios de composición del eluyente.

K„ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Parámetro dependiente de:

• Analito

• Modificador Orgánico

Volumen muerto de la columna

% de incremento de Modificador OrgánicoTiempo del gradiente (min)

Flujo (ml/min)

“Factor de Capacidad ó Retención” en Gradientes

Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8

4.6x50, 3.5µm

Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min

Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3

B: Metanol

Flujo: 2 y 3 mL/min

Temperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam

2. Dipyradamole 3. Nifedipina

4. Lidoflazina 5. Flunarizina

EJEMPLO 1 - REDUCCIÓN TIEMPO ANÁLISIS: Reducir Tg Aumentando F

Al mantener TG x F = constante el perfil de la separación NO varía

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)

F = 2.0 mL/min

Tg = 3 min

3min

1

23

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)

F = 3.0 mL/min

Tg = 2 min

2min

Si K‟ se mantiene constante el poder de separación no variará

Página: 31

Comparación Estrategias Mejora de la Resolución

k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Columna: ZORBAX SB-C8

Gradiente: 20 – 60% B en 10 min o 60 min

Fase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2

B: Acetonitrilo

Flujo: 1.0 mL/minTemperatura: 35°C

Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine

5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor

Tg = 10 min

4.6 x 150 mm, 5 µm

N = 12,000

V0=1.5ml

15min

1,2

34 5

6

7

8

0 5 10 15Time (min)

• Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican )1

Tg = 60 min a 1mL/min 4

2

0 25 50Time (min)

3

5

8

6

7 40min

4.6 x 150 mm, 5 µm

N = 12,000

V0=1.5ml

Tradicional

• Reducir V0 y Subir Flujo4.6 x 75 mm, 3.5 µm V0=0.75ml

N = 10,000

Tg = 15 min a 2mL/min

“Moderna”:

Si K‟ se aumenta (↑Tg, ↑F, ↓V0) el poder de separación mejorará.

Página: 32

Time (min)0 5 10

2

3

45

67

8

1

7min

1x10/1.5= 6,7

2x15/0.75= 40

1x60/1.5= 40

¡¡¡Se reduce Tiempo análisis

a 1/6 pero se mantiene la

Separación !!!

¿Cómo mejorar?

¿Partículas Superficial o Totalmente Porosas?

Superficial Totalmente Porosa

Poroshell-120 reduce 40-50% de presión con similar resolución

2.7µm (capa porosa: 0,5µm)

1.8µm

Ventajas Poroshell 120:

• Reducir la presión para aumentar el flujo.

Importante con HPLC de 400 bars

• Mejorar la resolución en Métodos USP

con 5µm (2.7µm <50% en disminución

del tamaño de partícula)

Ventajas 1.8µm Totalmete Porosas:

• Mayor surtido de fases.

• Zorbax 1.8-3.5-5µm con idéntica

selectividad.

• 10-20% más eficacia/cm.

Página: 33

48-12

Comparación Eficacia Partículas Superficial

“versus” Totalmente Porosas

Poroshell 120 proporciona:

• Eficacia muy similar* (>80-90%.) a partículas 1.8µm totalmente porosas.

• Curva de Van Deemter plana en un amplio rango de flujos.

• Su mayor permeabilidad le permite trabajar a flujos más elevados.

* También su capacidad de carga

Poroshell -120

Mínimo flujo recomendado (columna 4.6mm d.i.) ↓P↑F

Página: 34






UHPLC/RRLC:



convencionales.



6. Conclusiones.

Página: 35

Agilent 1260 Infinity

Bio-inert Quaternary LC: superior separation for more

confidence in large bio-molecule

analytics

Página: 36

HPLC-Based Characterization

of Therapeutic Biologics

• Witnessing a move from traditional pharma (NCE) to biopharma (NBE*).

• Now over 2,500 biotech drugs in the discovery phase.

• Predicted by 2014 that 50% of top 1000 products will be biotech.

They include:

• monoclonal antibodies (Mabs)

• recombinant proteins, insulin, erythropoeitin (EPO)

• peptide hormones

• peptide antibiotics

• cytokines

• oligonucleotides

• BioPharmaceuticals can be produced: in biological environments

or by synthetic routes.

• Higher order characterisation is needed for these complex molecules.

Light Chain

Fc

Fab

Antigen

binding

Hinge

Glycosylation

siteTruncation

(lysine)

Disulfide

shuffling

Pyroglutamat

e

Deamidation/

oxidation

Heavy Chain

EvaluatePharma (12May 2009) * NBE: New Biological Entity

Página: 37

Agilent‟s Solutions

for Biologic Characterization

• For size separations of dimers, aggregates and degradation products

Agilent Bio SEC-3 and Bio SEC-5

• For charge isoform separations

Agilent Bio IEX and Bio Mab

• For protein primary sequence* analysis

Poroshell 300 and Porosell 120

For use with the Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC

* Secuencia de aminoácidos

Página: 38

It is critical to confirm that the biologic

has the correct intact molecular weight

and identify variants and other potential

post translational modifications.

Degradation products must be identified

and monitored

Aggregation causes immunoresponse issues

which in turn cause death and injury during

patient treatment

Polymeric coated silica :

minimises non-specific binding

Optimized for use in low salt (150mM phosphate)

Particle

Size

3 m particle size 5 m particle size

Pore Sizes 100Å 100Å (0.1 – 100 kDa)

150Å 150Å (0.5 – 150 kDa)

300Å 300Å (5 – 1,250 kDa)

500Å (15 – 5,000 kDa)

1000Å (50 - 7,500 kDa)

2000Å (>10,000 kDa)

Feature Highest resolution High stability and long

column lifetime

Benefit Faster SEC Good reproducibility

SEC Separations: Size separations of

Dimers, Aggregates and Degradation products

Página: 39

Monitoring Dimers, Aggregation and ImpuritiesA

U

-0.005

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

Minutes

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00

Column: Agilent Bio SEC-3 300Å, 7.8x300mm

Mobile phase: 150 mM Phosphate, pH 7

Flow rate: 1.0 mL/min

Temperature: Ambient

Sample: Monoclonal antibody (10 L, 5 mg/mL)

Buffer/Excipients

MAb

DimerMAb

Aggregates

Low Molecular

Weight Impurities

Página: 40

Ion Exchange Separations

Non-porous PS/DVB particles with a uniform

polymeric coating

Available in SCX, WCX, SAX, WAX phases,

Designed for protein and peptide separations

10 µm, 5 µm, 3 µm, 1.7 µm particle sizes

Multiple ion exchange functional groups for higher

surface area and capacity

Particle has a dense, weak cation exchange

(WCX) mono-layer with excellent selectivity for

basic monoclonal antibodies

• Separation based on differences in a charge state

• Changes in glycosylation and deamidation

• Application specific media

Página: 41

Charge Isoform Analysis of Monoclonal AntibodiesA

U

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

Minutes

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00

(Acidic

Isoforms)weakly bound

(Basic

Isoforms)Strongly bound

Isoforms are commonly deamidated

and glycosylated forms of the MAbColumn: Agilent Bio MAb, NP5, 4.6mm x 250mm

Buffer A: 10 mM Sodium Phosphate, pH 7.50

Buffer B: A + 100 mM NaCl, pH 7.50

Gradient: 15-95% B in 60 min

Flow rate: 0.8 mL/min.

Sample: 5 L, 5 mg/mL, mAb

Página: 42

Reverse Phase Separation

• Reverse phase HPLC is used for the analysis of both

intact proteins and also protein peptide maps for:

• Detailed information about the primary structure.

• Including disulphide shifting

• Most RP methods require (or cause) denaturing of the protein

•The pore size of the media must be matched to the size of the

molecule:

• Intact Protein Analysis 300Å (5µm)

• Peptide Mapping 120Å (2.7µm)

SOLID

CORE

Porous Shell

5 ó 2,7 µm

Página: 43

Protein separation - Effect of Increasing Flow

Aligned

min0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

mAU

0

200

400

600

800

1000

min*0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

mAU

0

200

400

600

800

1000

min*0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

mAU

0

200

400

600

800

1000

min*0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

mAU

0

200

400

600

800

1000

3 mL/min0-100%B0.67 min

1. Neurotensin

2. Rnase A

3. Lysozyme

4. Myoglobin

12 3

4

Mobile Phase: A= 95% H2O, 5% ACN with 0.1%TFA; B= 5% H2O, 95% ACN, with 0.07%TFA

2 mL/min0-100%B1 min

1 mL/min0-100%B2 min

0.5 mL/min0-100%B4 min

Sustained Efficiency and Resolution

Resolution is maintained when using superficially porous particles at high flow rates

3 min

Poroshell 300SB-C182.1x75mm, 5µm

0.5 min

Página: 44

Heavy and Light Chain Characterization

Light Chain

Fc

Fab

Antigen

binding

Hinge

Glycosylation

siteTruncation

(lysine)

Disulfide

shuffling

Pyroglutamate

Deamidation/

oxidation

Heavy Chain

Página: 45

Why a dedicated Bio-inert?

HPLC1260 Infinity Bio-inert HPLC

What´s new ?

No corrosion due to high salt

Sample management completely metal-free

No usage of MP35N capillaries with cobalt,

nickel, chromium…

pH-range 1-13, shortterm pH 14

low and high pressure possible

large volume injections

• Widest pH range

• High salt tolerance

• Lowest surface activity

no passivation needed !!

Página: 46

1260 Infinity Bio-inert HPLC

600 bar (UHPLC) for fast or high

resolution bio-separations without

any compromises!

What is similar to standard 1260

Infinity?

Based on proven technology

System performance specification

System Robustness

Página: 47

Capillary design to ensure Bio-inertness

Capillaries

Metal cladded PEEK capillary

Newest fitting design: Hybrid technique

New capillary technolgy

enabeling 600 bar but

completely metal free !!

Página: 48

G1315 DAD or MWD

with bio-inert Detector

Flow-cell

Bio-inert

Quaternary Pump

Components of the 1260 Infinity bio-inert HPLC

base configuration

Bio-inert High Performance

Autosampler

G1316 C Column

Compartment with Bio-inert

Solvent Heater

Bio-inert materials

used:

PEEK, PEKK,

ceramic, titanium

(only in solvent

delivery), gold,

saphire, PTFE

Página: 49

Bio-inert

Fraction Collector

For small-scale prep and semi-prep

Purification (up to 10 ml/min)

Bio-inert

Manual Injector

For large volume injection

Bio-inert flow cell for

fluorescence detector

Modular Flexibility - More bio-inert choices

For bio-inert fluorescence detection

Página: 50






UHPLC/RRLC:



convencionales.



6. Conclusiones.

Página: 51

The New Agilent

1200 Infinity Series

Analytical SFC System

Aurora Fusion A5 SFC Module

Página: 52

What is Supercritical Fluid Chromatography?

Supercritical Fluid Chromatography

• Form of normal phase chromatography used for the analysis of low to

moderate molecular weight molecules

• Frequently used for the separation of chiral compounds

• Separation principles are similar to HPLC

• SFC utilizes carbon dioxide as the mobile phase; therefore the entire

chromatographic flow path must be pressurized

• Modifiers such as methanol, ethanol, isopropanol are added to the

mobile phase as modifiers

Definition

Página: 53

The Supercritical state of a solvent

Página: 54

The Agilent 1200 Series Analytical SFC SystemThe New Standard in Performance, Cost-efficiency, Reliability and Ease-of-Use

Highest Analytical SFC Performance.... Ever HPLC-like Sensitivity, Precision and Dynamic Range

>10,000 for accurate quantitation of 0.01% level impurities

Lowest Operating Cost, Green Chemistry 10-15x lower operating costs by compatibility with standard

grade CO2 instead of liquid SFC grade CO2

Lowest solvent consumption and waste generation

Ease of use, Flexibility and Reliability Highest investment protection by modular, reversible

design. Customers can reconfigure their SFC system for

HPLC.

Upgrade option* for pre-exisiting Agilent 1100 and 1200 LC

systems (*incluye bomba binaria SFC).

ChemStation control, data analysis and reporting

Agilent warranty and service quality

Single Vendor Solution – Single Vendor Support

Makes routine analytical SFC a reality!

Página: 55

The Agilent 1200 Analytical SFC System –

Modular Design

Page 56

• Aurora SFC Fusion A5 Module

for delivering preconditioned supercritical CO2

for maintaining the correct backpressure & recycle it

for washing the autosampler loop

• Modified RRLC pump especially adapted for SFC performance.

• Modified Standard Autosampler to perform fixed loop injection.

• Diode Array Detector SL or Multi-Wavelength Detector SL

• Thermostatted Column Compartment

• High-pressure flow cell

• ChemStation control for all the HPLCcomponents and SFC Fusion A5

SFC Fusion does not replace any part of the HPLC !!!

Vapor Phase CO2 is delivered to the Fusion A5

Fusion A5 delivers preconditioned CO2 to the Agilent pump

Fusion A5 delivers wash solvent

Effluent is returned to Fusion A5 for back-pressure regulation

and waste collection

Aurora A5 Fusion

A5 Fusion eliminates compression requirements from the HPLC

pumps resulting in pulseless pump metering and low baseline noise !!!

Output

“Tee”

BPR

Input

“Tee”Wash

pumpFrom Detector

To Agilent Pump

From wash

solvent bottle

To ALS

To waste

Página: 57

Typical Applications for SFC

• Chiral Analysis:

> Chiral purity analysis

> Chiral column screening

• Quantitation of enantiomeric purity of starting materials, intermediates, and bulk drugs Impurity analysis (EE)

• High throughput HPLC-SFC(MS) library QC and pre-preparative analysis

• Natural product separations

• A-chiral separations in Environmental, Food and Industrial

• Typical Normal Phase or RP phase small molecule applications

• UHPLC like separations with standard columns

Página: 58

Rango Aplicabilidad SFC

Separaciones quirales, no quirales y productos naturales en todo tipo de industrias:

farmacéuticas, químicas, medioambientales, alimentación,….

Página: 59

0.025-0.03 mAU

Noise Detail

0.08 %

1a

2a

3a

4a

HPLC-like Sensitivity!: Impurities and Enantiomeric Excess

Determination now Below 0.1% of your Main Peak

Página: 60

Excellent Repeatability of analyses

N=10 runsFlurbiprofen,

Theophyllin, Caffeine,

Cortisone,

Hydrocortisone,

Prednisolone

The analysis was

performed at 2

ml/min, isocratic

CO2/methanol

(85/15, v/v).

Data courtesey

RIC

Página: 61

Enantiomeric Excess (Impurities)Racemic mixture of each R- 1,1‟-bi-2-naphthol and S– 1,1‟-bi-2-naphthol

OH

OH

Column

ChiralCel OD-H, 4.6 ID x 250

mm, 5 µm (Chiral

Technologies)

Supercritical

Fluid

CO2

ModifierMeOH w. 0.1% TFA + 0.1%

DEA

Outlet Pressure 150 bar

Flow Rate 2.0 mL/min

Isocratic% modifier

25%

Temperature 30°C

Injection Volume 5 µL

Detection DAD, 220 nm

Example 1:

Impuritiy analysis below 0.05% possible !!!

Página: 62

2

34

51

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

1718

19

20 21

22

Non Quiral Example:

High resolution separation “22 Component Mix”

30°C

Fusion A5 &1200 SL

22 peaks

3.5ml/min, 150bar, gradient separation, Princetons HA dipyridyl, 5μm 4.6x250mm

Caffeine•Theophyline•Theobromine•Ibuprofen•Flurbiprofen•Adenine•Thymine •Uracil•Hypoxanthine •Cytosine •Cortisone

•Prednisone•Hydrocortisone•Prednisilone•Estriol•Suflamethoxazole •Sulfamerazine

•Sulfamethoxine•Sulfanilamide•Sulfaquinoxaline•Sulfaguanidine•Sulfamethazole

Página: 63






UHPLC/RRLC:



convencionales.



6. Conclusiones.

Página: 64

Resumen Traspaso de Métodos a UHPLC/RRLC

• Reducir Tiempo Análisis sin perder Resolución:

– Reducir tamaño de partícula y longitud de la columna pero manteniendo constante nº

platos columna (15cm x 5µm = 10cm x 3.5µm = 5cm x 1.8µm).

– Las columnas TP de 1.8µm o SP de 2.7µm permiten trabajar a flujos elevados para reducir

tiempo de análisis sin perder resolución.

• Maximizar la Resolución:

– Sin aumentar tiempo de análisis: Reducir tamaño de partícula y mantener la longitud de la

columna (p.e. 150mm x 1.8µm).

– Aumentado tiempo de análisis: acoplar varias columnas en serie de 5µm requieren un equipo

de alta presión como el Agilent 1200-RRLC (SL).

• Columnas Poroshell 120 (superficialmente porosas):

– Le permiten trabajar en RRLC con HPLC‟s convencionales.

– Poder trabajar a mayores flujos para:

• reducir sus tiempos de análisis

• incrementar la capacidad de separación en gradiente

Página: 65

Prestaciones UHPLC/ RRLC:

Hasta +60% más de resolución que un HPLC convencional.

Hasta 20 veces más rápido que un HPLC convencional

(hasta 2000 muestras / día).

Hasta 10 veces más sensible.

Cromatógrafo Líquido Universal:

Flujo de 0,05 a 5 ml./min.

Hasta 3 columnas de 1,5 a 30 cm. de longitud de todo

tipo de tamaños de partícula (1.8 a 10µm) y diámetros

internos (1-8 mm).

Columnas Zorbax de 1.8, 3.5 y 5µm con igual selectividad

para una fácil, rápida y segura transferencia de métodos de

HPLC a UHPLC/RRLC y viceversa.

Serie 1200 Infinity: un HPLC Convencional y UHPLC ó RRLC en 1 sólo sistema.

Página: 66

Muchas

Gracias

por su

Atención

Estamos a su disposición en

tel.: 901.11.6890

[email protected] www.agilent.com/chem

Agilent 1290 Infinity UHPLC

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Nueva serie de UHPLC Baños de Disolución. 1200 infinity · ¿Qué se Requiere para Trabajar a ... Por volumen de retardo del gradiente 2) Por volumen de retardo del gradiente y