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Resumen
En este informe se registraron los
resultados obtenidos de la
observación e identificación de
hongos y bacterias, partiendo de los
cultivos sembrados en la Práctica No
4 (Aislamiento de hongos y bacterias
Fitopatógenos a partir de material
vegetal enfermo), se tomaron
improntas y muestras del material que
creció a partir de la siembra de
Sphaerotheca pannosa de hojas de
fresa (Fragaria ananassa),
Sphaerotheca pannosa de hojas de
una planta ornamental de jardín,
Colletortichum spp de fruto de fresa (F.
ananassa), Fusarium oxiporum en
tallo de clavel (Dianthus caryophyllus
L.) y Xanthomonas spp en follaje de
fresa (F. ananassa). Para la
identificación y observación de
Hongos y Bacterias, es indispensable
observar las estructuras reproductivas
y el uso de claves taxonómicas para
su descripción. Para observar las
estructuras reproductivas se hizo una
coloración con Azul de lactofenol, las
improntas se tomaron con cinta
transparente y su montaje en seco y
con una gota de agua, las claves
taxonómicas para la descripción
morfológica utilizadas Barnett y Hunter
(1998). Este trabajo se llevó a cabo en
el laboratorio de fitopatología de la
universidad de Cundinamarca
extensión Facatativá, teniendo en
cuenta las normas de bioseguridad.
Palabras clave: Impronta, tinción,
claves taxonómicas, observación,
identificación.
Abstract
In this report the results of the
observation and identification of fungi
and bacteria were recorded, based on
crops planted in Practice No 4
(Isolation of fungi and bacteria from
sick Phytopathogenic plant material)
imprints and material samples were
taken which grew from the seed of
Sphaerotheca pannosa leaves of
strawberry (Fragaria ananassa),
Sphaerotheca pannosa leaves of an
ornamental garden plant,
Colletortichum spp fruit strawberry (F.
ananassa), Fusarium oxiporum in
stem carnation (Dianthus caryophyllus
L.) and Xanthomonas spp in foliage of
strawberry (F. ananassa). For the
identification and observation of fungi
and bacteria, it is essential to observe
the reproductive structures and the
use of taxonomic keys to their
description. To observe the
reprouctive structures made a
Lactophenol blue staining, the imprints
were made with transparent tape and
mounting in dry and with a drop of
water, taxonomic keys used for
morphological description Barnett and
Hunter (1998). This work was
conducted in the laboratory of plant
pathology at the University of
Cundinamarca, Facatativá extension,
taking into account biosafety
standards.
Keywords: Imprint, staining,
taxonomic keys, observation,
identification.
Introducción
Los hongos fitopatógenos son de gran
importancia debido a que reducen el
valor del producto en el mercado. La
mayoría de los hongos fitopatógenos
afectan cultivos de gran importancia
económica, debido a esto se aplican
miles de toneladas de agroquímicos
en todo el mundo, con la necesidad de
establecer un sistema de control, sin
conocer el agente causal de la
enfermedad. (Becerra, Sosa, & Lopez,
2010)
Para controlar una enfermedad es de
vital importancia reconocer el agente
causal, si no se reconoce es probable
que los métodos de control sean
infructuosos. Para evitar esto es
indispensable realizar un correcto
diagnostico que provea de una
cantidad de información básica y
verídica, con la cual podemos
seleccionar el método de control
acorde con el agente cusal. (Deras,
2014).
Materiales
1. Cámara de flujo laminar.
2. Nevera.
3. Mecheros.
4. Incubadora.
5. Plantas enfermas o anormales.
6. Lupas.
7. Bisturí y cuchillas.
8. Servilletas.
9. Marcadores.
10. Pinzas estériles.
11. Papel vinipel.
12. Cajas de Petri con los
microorganismos aislados en medios
de cultivo (Agar – agua y PDA).
13. Láminas y laminillas
14. Tinciones de Gram y azul de
lactofenol.
15. Microscopio
16. Hipoclorito de sodio (Clorox).
Tener en cuenta los siguientes
materiales para así cumplir las
normas de bioseguridad:
1. Protector naso-bucal.
2. Bata manga larga, cerrada color
blanco.
3. Zapato cerrado en suela anti-
deslizante.
4. Pantalón largo holgado.
5. Gorro desechable.
6. Gafas de laboratorio.
7. Guntes de nitrilo o vinilo.
Metodología
Esta práctica se llevó a cabo en el
laboratorio de Fitopatología de la
Universidad de Cundinamarca
extensión Facatativá, a una altura de
2.586 msnm. Esta localidad presenta
una temperatura promedio de 19°C y
una humedad relativa promedio de 60-
90%, la precipitación media anual es
de 200 - 300 mm (IDEAM, 2015).
En primer lugar se realizó la
desinfección de los mesones y de la
cámara de flujo con la ayuda de
hipoclorito, agua y las toallas estériles.
Ya con el espacio desinfectado, se
tomaron los medios de cultivo PDA y
Agar Nutritivo esterilizados y
preparados en la práctica anterior, se
colocaron en la cámara de flujo
mientras se realizaban los repiques
para purificar las muestras.
Luego de esto se realizaron los
montajes de hongos y bacterias para
observaciones microscópicas en los
que se hicieron:
Montaje coloreado directo con
azul de lactofenol y una porción
del hongo con aguja de
disección y se observó a 4X,
10X y 40X
Montaje de impronta con cinta
transparente con ayuda de
azul de lactofenol, observando
a 4x, 10X y 40X)
Cortes de cuerpos fructiferos
cortes a mano alzada, en los
que se realizaron cortes
transversales para observar la
forma y ubicación interna de las
esporas, con ayuda de azul de
lactofenol. Se observa al
microscopio.
Cuestionario
1. Por qué hay que hacer
tinciones para observar al
microscopio?
Las técnicas de tinción destacan las
características morfológicas de los
microorganismos para lograr ser
vistas con mayor nitidez en el
microscopio y lograr observar todos
sus detalles, aunque los
microorganismos vivos se pueden
observar directamente en fresco al
microscopio óptico, la mayoría de las
veces es necesario teñirlos para que
por medio del uso de colorantes, sea
mucho más fácil su identificación,
Existe una gran variedad de tinciones
que pueden ser aplicadas dentro de
este campo. Las tinciones están
compuestas por un colorante la cual
es capaz de dar color a células, tejidos
o fibras. (López , Hernández, Colín, &
Cendejas, 2013)
Químicamente, el colorante está
constituido de un componente
cromóforo y un auxócromo. El
cromóforo tiene la capacidad de que
sus electrones absorban energía o luz
visible y emitan diversos colores de
acuerdo con la longitud de emitida
como resultado del cambio en el nivel
energético. Los auxócromos son
grupos funcionales o radicales que
constituyen una molécula y poseen
carga parcial positiva; tienen la función
de intensificar la formación de color
mediante la acción de grupos de
átomos no saturados; su función es
desplazar a los cromóforo hacia
longitudes de ondas largas para
aumentar la intensidad. (López ,
Hernández, Colín, & Cendejas, 2013)
Los colorantes tienen las siguientes
funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos
microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamaño.
3. Muestran la presencia de
estructuras internas y externas.
4. Produce reacciones químicas
específicas.
2. Realice una descripción de los
géneros fúngicos encontrados
y mencione por lo menos dos
cultivos en los que causan
enfermedades, diferentes al
cultivo del que fueron aislados.
La descripción de los géneros se
encuentra en las tablas de análisis de
muestras (ver tablas de análisis de
muestra)
En cuanto a los cultivos que son
afectados por las enfermedades
encontramos.
Para phytophthora fragarie.
fresa y mora
Para Xanthomonas:
Ornamental (Begonia dregei),
Árbol de caucho (Ficus
elástica), Filodendro de hoja
acorazonada. (Philodendron
scandens)
Para Colletotrichum, tomate de
arbol (Solanum betaceum),
tomate de guiso (Lycopersicon
esculentum L.), aguacate
(Persea americana. Mill.)
El hongo de marchitamiento
bascular (Fusarium oxysporum)
causa infección en plantas de
clavel y de rábano, tomate.
Tabla 1. ANÁLISIS DE MUESTRAS
1. Observación de Colletortichum spp
Observaciones
Luego del aislamiento del hongo
Colletortichum sp, (Identificado por los síntomas en el fruto y formas de colonia) a través de los explantes de fruto en papa dextrosa agar (PDA), (ver figura 1) , en los que se forman colonias
blancas, variando a gris salmón, se realizaron improntas para ver las estructuras de los hongos y confirmación la identificación del hongo.
La producción de conidios es característicamente abundante y muestran en masa un color salmón-anaranjado (Farrera , Zambrano, & Ortiz , 2007) (Cordero, Muñoz, Onorato, & Contreras), lo que se puede corroborar con lo observado en el microscopio a 40 x (Ver figura 2) Conidios lisos, unicelulares, aseptados, fusiformes y de aproximadamente 10-14 x 4- µm. (Cedeño & Carrero, 2000), conidios que se pudieron observar en la impronta del micelio de Colletotrichum, además de confirmar la forma fusiforme de sus conidios a través del microscopio a 40 x, además de la observación de la posible formación de un haustorio (ver figura 3) Por lo anterior y según la literatura se confirma que el aislamiento realizado del hongo pertenece al género Colletotrichum
Figura 2. Agrupación de conidios fusiformes
(tomado por Alarcón, 2015)
Figura 3. forma fusiformes de conidios
encontrados en Colletotrichum (tomado por
Alarcón, 2015) Hifas sin septos, presencia de poros
Formación de haustorios
Figura 1. Aislamiento de Colletotrichum en
fresa, tomado por (Barrantes 2015)
Agrupación de conidios
Tabla2. ANÁLISIS DE MUESTRAS
1. Fresa (Fragaria ananassa) - Xanthomonas sp.
Fotografía Observaciones
Se puede observar en la figura 4 manchas irregulares, necróticas en el follaje de la planta de un color café a rojizo oscuro. Por lo general localizadas al borde de las hojas (foliolos). Según lo observado corresponde a síntomas provocados por Xanthomonas, en fresa la enfermedad es “bacterial leaf blight” o en español “tizón bacteriano”. Siendo sus síntomas manchas foliares necróticas de color café (secas) (Figura 1) y lesiones grandes en forma de “V” a lo largo del borde de la hoja (Ustun et al., 2007). Aún no se tiene información disponible sobre las vías de diseminación de la enfermedad, sin embargo la diseminación a grandes distancias ocurre con la movilización de material propagativo entre países. (EPPO, 2011). En la caja Petri con el medio nutritivo se observa el crecimiento de las colonias de la bacterias Xanthomonas sp, identificada anteriormente gracias a las rutas taxonómicas de la enfermedad y la forma de la colonia, (ver figura 5) a las cuales se les hicieron una impronta para observar sus estructuras al microscopio.
Figura 5, medio de cultivo nutritivo con
crecimiento de colonias de Xanthomonas
sp, para realizar las improntas en el
microscopio. (Atuesta 2015).
Figura 4, daño provocado por
Xanthomonas spp, en foliolos de fresa
(Atuesta 2015).
Observación en el microscopio
Se observa en la figura 6 la gran cantidad de bacilos pertenecientes al género de Xanthomonas que aunque sin aplicar ningún tipo de colorante para hacer tinción muestran una coloración entre amarilla y rojiza vista al microscopio en el objetivo 40x. Posición Taxonómica: Dominio: Bacteria. Phylum: Proteobacteria. Clase: Grammaproteobacteria. Orden: Xanthomonadales. Familia: Xanthomonadaceae. Género: Xanthomonas. (CAB International, 2011). Según BACMAP Genome Atlas, las Xanthomonadaceae son una familia de bacterias Gram negativas pertenecientes a los Xanthomonadales orden del Grammaproteobacteria. Por lo general se caracterizan como organismos ambientales que se encuentran en el suelo y el agua, así como en tejidos vegetales. Son Bacilos en forma de bastones rectos que pueden llegar a medir 0.4 a 1.0 x 1.2 a 3 um. Se han reportado observaciones hechas al microscopio y lo que se ha podido observar son bacterias en forma de bacilos con un flagelo polar la cual es una característica propia del genero de las Xanthomonas (Janse et al., 2001). (Figura 7). También se ha observado que este tipo de bacterias tiene un tipo de pigmentación basado en carotenos llamados “Xanthomonadins”, estos pigmentos son bromados y compuestos por un grupo arilo-polieno los cuales, son compuestos orgánicos que componen conjugados como los carotenos, en este caso amarillos, insolubles en agua y que están asociados a la membrana externa de la pared celular de las bacterias. Estos pigmentos son marcadores
Figura 6, Xanthomonas sp observadas al
microscopio en 40x por medio de una
impronta al medio de cultivo anteriormente
mencionado (Atuesta, 2015).
Figura 7, Micrografía de
Xanthomonas arborícola pv.
fragariae, que muestra la forma de
bacilo de la bacteria y su flagelo
polar. (Fuente: Janse et al., 2001).
quimiotaxonómicos útiles para la identificación de estas bacterias, según sus características, por medio de diferencias y similitudes de sus componentes bioquímicos. La producción de Xanthomonadins, es una característica principal de las Xanthomonas spp. (American Physical
Society, 2002). Entre las especies de este género hay grandes similitudes, se ha reportado que en 1993 se llegó a confundir algunas cepas de Xanthomonas arboricola pv. fragariae fueron identificadas como Xanthomonas fragariae (Janse et al.,
2001; Weller et al., 2007).
Tabla 3. ANÁLISIS DE MUESTRAS
1. Fresa (Fragaria ananassa) - Sphaerotheca pannosa
Fotografía Observaciones
Se observan en la Figura 8 principalmente manchas de color café necróticas en las hojas de fresa. Aunque también las manchas se pueden observar en algunas partes localizadas de toda la planta, también se observan manchones blancos, amarillos crema o grisáceos de forma continúa. Según lo observado corresponde a lesiones provocadas por el hongo Mildeo polvoso (Sphaerotheca pannosa), que
causa manchas polvorientas en un principio blancas, amarillas color crema y en el transcurso que se manifiesta mas la enfermedad comienzan a tornarse colores cafés o grises muy oscuros en la planta de fresa (Villate, 2014). Posición taxonómica de Sphaerotheca pannosa más conocido como Mildeo Polvoso Reino: Fungí División: Ascomycota Clase: Leotiomycetes Orden: Erysiphales Familia: Erysiphaceae
Figura 8. Ataque de Sphaerotheca
pannosa, en los hojas de fresa
(Calderón, 2015).
Género: Sphaeroteca Especie: Sphaerotheca pannosa (Bayer, 2014). Se observa la caja Petri con el medio PDA ( ver figura 9) este medio incluye dextrosa e infusión de papa blanca (Solanum tuberosum), haciendo que los hongos crezcan más y se reproduzcan fácilmente (Pérez, 2012). Con la muestra de Sphaerotheca pannosa conocido como Mildeo polvoso en este se observa el crecimiento del hongo, su apariencia fue algodonosa color blanca y color amarillo crema.
Morfología microscópica del hongo Sphaerotheca pannosa
Se puede observar el crecimiento del hongo, Mildeo polvoso (Sphaerotheca pannosa), donde se observa el micelio un poco algodonoso, con una superficie pareja y un borde liso. (ver figura 9) En la impronta se observan Hifas que son estructuras filamentosas cilíndricas, (ver figura 10), que son característica principal de los hongos de tipo vegetativo, donde la reunión de estas hifas forma el micelio (Rodríguez, 2014)
Figura 9, observación de Sphaerotheca
pannosa, en medio de cultivo PDA
(Calderón, 2015).
Figura 10. Morfología microscópica
de Sphaerotheca pannosa.
(Calderón, 2015).
Tabla 4. ANÁLISIS DE MUESTRAS
1. Fusarium oxysporum
Generalidad
Fusarium oxysporum es un hongo cosmopolita que existe en muchas formas patogénicas, parasitando más de 100 especies de plantas Gimnospermas y Angiospermas, gracias a los diversos mecanismos que tiene el hongo para vencer las defensas de muchas plantas. Se caracteriza por producir colonias de rápido crecimiento, con una tasa diaria cercana a un centímetro en medio papa- dextrosa agar (PDA) a 25ºC (Garcés et al., 2001)
Se presenta principalmente como saprófito en el suelo, o también como patógeno especializado, denominado forma especial (f. sp.), según la planta hospedante u hospedantes relacionados que afecte. Es posible distinguir patotipos o razas fisiológicas de una misma forma especial (Bosland, 1988) Esta enfermedad es la más limitante y la más importante en el cultivo del clavel en Colombia (Figura 11), debido a la fácil propagación del patógeno a través de esquejes infectados, a la resistencia del hongo a condiciones adversas y al alto costo y relativa baja eficiencia de las medidas de control utilizadas (Garcés et al., 2001)
Figura 11. Ataque de Fusarium
oxysporum, en tallo de clavel.
2. Fusarium oxysporum en cultivo PDA
Observaciones
En el medio de cultivo PDA (Figura 12), se observó un crecimiento micelial aéreo, su apariencia fue algodonosa, de coloración entre blanco a rosado salmón. También se puede observar que el crecimiento que tuvo fue concéntrico (Booth, 1970)
3. Morfología microscópica de Fusarium oxysporum. Azul lactofenol, 40x. Observaciones
Se observan hifas ramificadas hialinas y septadas, (ver figura 13) clamidosporas hialinas esféricas y grandes corroborado por (Amaro, 2014). Se observan macroconidios, en forma elipsoidal, hialinos y septados (C., 2011).
Figura 12. Cultivo de Fusarium
oxysporum, en medio de cultivo
PDA.
Figura 13. Morfología
microscópica de Fusarium
oxysporum. Azul lactofenol, 40x.
Tabla 5. ANÁLISIS DE MUESTRAS
Aislamiento de hojas de fresa
Observaciones
De acuerdo con las caracteristicas del sintoma y de micelio, presentado en informes anteriores, esta muestra se habia identificado como mildiu en fresa. Pero observando las estructuras vistas se puede determinar que posiblemente es Phytophthora fragrarie. Dado que:
1. Según la autora (Echemedina, 2004) En los medios de cultivo el micelio se presenta aéreo, el cual puede ser marcadamente radiado o ligeramente estrellado, presentándose los bordes de la colonia redondeados o sinuosos y sumergido en el medio siendo. (ver figura 14 ).
2. Muestra del micelio visto al microscopio
El autor (Bolda, 2010) menciona que las hifas no son septadas, además de ser hialinas. (Ver figura 15). Todas las especies del género poseen un micelio hialino, continuo, de paredes paralelas o irregularmente calibradas, donde pueden observarse abundantes gotas oleaginosas. El micelio es cenocítico, observándose solo raramente la presencia de algunos tabiques que normalmente se encuentran separando las partes viejas carentes de protoplasma. (Echemedina, 2004).
Figura 14: aislamiento de hoja enferma de
fresa (Alarcon, 2015)
Figura 15: hifas de Phytophthora fragrarie.
(Bolda, 2010)
3. Morfología microscópica. Azul lactofenol, 40x. Observaciones
En esta grafica se puede observar que las hifas no presentan septos. No se pudo observar otras estructuras del hongo (ver figura 16)razón por la cual no se pude dar afirmar la especie de hongo que sea aunque se supone que por la apariencia sea Phytophthora fragrarie
Conclusiones:
Gracias a la observación de los
signos, la planta y la parte de la
planta que está afectada por el
patógeno, y las rutas taxonómicas
para identificar la enfermedad, se
puede dar un estimado del
patógeno que está atacando, pero
en muchos casos estos se
parecen, hasta el punto de tejer la
misma forma y color de la colonia,
por eso es indispensable
complementar estas labores con
la observación de las estructuras
de los hongos y bacterias al
microscopio, logrando así realizar
una mejor identificación del
patógeno casi llegando al géneros
a los que pertenece.
Para lograr una buena
observación de las estructuras
tanto de hongos como de
bacterias, es necesario realizar
tinciones, de acuerdo al tipo de
organismo que se quiera observar
y hasta donde se quiera llegar a
identificar, como es el caso de la
tinción de gran, utilizada para la
clasificación de bacterias gran
positivas y gran negativas,
practicas indispensables para la
identificación del patógeno.
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