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OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS
POLICLONALES EN HUEVOS DE GALLINA DIRIGIDOS
CONTRA PARVOVIRUS CANINO
JOHANNA PINTO DELGADO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
BOGOTA D.C. JUNIO DE 2001
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OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS
POLICLONALES EN HUEVOS DE GALLINA DIRIGIDOS
CONTRA PARVOVIRUS CANINO
Presentado como requisito parcial
para optar el título de
MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
BOGOTA D.C. JUNIO DE 2001
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NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la Resolución Nº13 de Julio de 1946: “La Universidad no
se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus tesis de grado”.
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OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS
POLICLONALES EN HUEVOS DE GALLINA DIRIGIDOS
CONTRA PARVOVIRUS CANINO
JOHANNA PINTO DELGADO
______________________ ________________________ DIRECTOR DE TESIS CODIRECTOR Dr. Orlando A. Torres G. Dr. Hugo Diez ______________________ ________________________ ASESOR JURADO Dr. Jaime Castellanos Dra. Olga Mariño ______________________ ________________________ JURADO DECANO ACADÉMICO Dra. Claudia Valdivieso Dr. Carlos Corredor ______________________ DIRECTOR CARRERA Dra. Aura Rosa Manascero
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Dedicado a:
Todas aquellas personas que aman la ciencia como el arte
máximo de la vida, y una de esas personas es mi padre, Augusto Pinto Díaz, quien siempre
estará conmigo en el fondo de mi alma hasta el final.
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AGRADECIMIENTOS
Presentamos nuestros agradecimientos a los doctores: Doctora Carmenza
Alarcón, grupo de Neurociencias, Instituto Nacional de Salud, Bogotá D.C.;
Doctora Concepción Puerta, grupo de Parasitología, Pontificia Universidad
Javeriana, Bogotá; Doctor Jairo Tovar, grupo Neuroquímica, Pontificia
Universidad Javeriana, Bogotá, por su valiosa colaboración en el desarrollo
de este trabajo, a Fabio Muñoz por el cuidado y manejo de las aves en el
bioterio de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, y a mi amigo y
compañero Eduardo Malagon Puentes por su gran apoyo.
Y a todas las personas que de una u otra manera permitieron que este
trabajo se llevara a término.
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TABLA DE CONTENIDO
Página
RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 3
2.1. Anticuerpos 3
2.1.1. Estructura general de las inmunoglobulinas 5
2.1.2. Función de las inmunoglobulinas 15
2.2. Producción de anticuerpos 18
2.2.1. Sistema inmunológico aviar 19
2.2.2. Mecanismos de inmunidad aviar 22
2.2.3. Características de la IgY 26
2.2.4. Esquemas de inmunización 28
2.2.5. Técnicas de extracción y purificación de
anticuerpos 31
2.3 Parvovirus canino (como antígeno) 33
2.3.1. Etiología 33
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y
JUSTIFICACIÓN 41
3.1. Planteamiento del problema 41
3.2. Justificación 42
4. OBJETIVOS 44
4.1. Objetivo general 44
4.2. Objetivos específicos 44
5. MATERIALES Y MÉTODOS 45
5.1. Tipo de estudio 45
8
5.2. Hipótesis 45
5.3. Esquema de inoculación 45
5.4. Equipos 48
5.5. Técnicas de deslipidación a partir
de yema de huevo 48
5.5.1. Agua según Burdon, 1987 48
5.5.2. Metanol-cloroformo según Wessel, 1984 49
5.5.3. Agua-cloroformo según Svendsen, 1996 50
5.6. Técnicas de precipitación de IgY 51
5.6.1. Precipitación de proteínas por salting-out 51
5.6.2. Polietilenglicol según Johnstone, 1995 53
5.6.3. kit comercial de extracción de IgY
EGGstract IgY Purification Sistem de
PROMEGA 54
5.7. Cuantificación de proteínas por el método
Bradford 55
5.8. Titulación por inhibición de la
hemoaglutinación 57
5.9. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%
según Laemmli 59
5.10. Técnica de difusión simple en dos
dimensiones en tubo 61
6. RESULTADOS 63
6.1. Método de inmunización 63
6.2. Técnicas de deslipidación 64
6.3. Técnicas de extracción de IgY (por
precipitación) 64
6.4. Cuantificación de proteínas y titulación de
anticuerpos 66
9
6.5. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% 69
6.6. Técnica de difusión simple en dos
dimensiones en tubo 70
7. DISCUSIÓN 71
7.1. Esquema de inmunización 71
7.2. Técnicas de precipitación de IgY a partir
de yema de huevo 72
7.2.1. Métodos de deslipidación 73
7.2.2. Precipitación de proteína IgY 76
7.2.3. Cuantificación y titulación de IgY 79
8. CONCLUSIONES 81
9. RECOMENDACIONES 83
10. ANEXOS 84
10.1. Técnica de deslipidación con
metanol-cloroformo según Wessel 84
10.2. Técnica de deslipidación con
agua-cloroformo 84
10.3. Precipitación de proteínas con
polietilenglicol según Johnstone 85
11. BIBLIOGRAFÍA 86
10
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
1. Estructura de una molécula de inmunoglobulina 6
2. Comparación entre los órganos linfoides
de aves y de mamíferos 22
3. Diferencia entre la estructura de IgG de
mamíferos y de IgY de aves 28
4. Mapa genómico de Parvovirus canino 35
5. Huevos recolectados del lote A (intramuscular)
y del lote B (subcutánea) 46
6. Grupo A y B de gallina, raza Loman empleadas
en este estudio 46
7. Adyuvante completo de Freud y vacuna
de Parvovirus canino 47
8. Prueba de deslipidación con agua tamponada 49
9. Técnica de deslipidación metanol-cloroformo 50
10. Técnica de deslipidación agua-cloroformo 51
11. Diálisis de las técnicas de salting-out 53
12. Kit comercial de extracción de IgY de
PROMEGA 54
13. Esquema de extracción de IgY kit PROMEGA 55
14. Lectura de cuantificación con la técnica de
Bradford 56
15. Lectura de estándares y de muestras con
la técnica de cuantificación de Bradford 57
16. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% 60
11
17. Técnica de difusión simple en 2 dimensiones
en tubo 62
18. Inoculación subcutáneas de una gallina, raza
Loman con el inóculo que se empleó en este
estudio 63
19. Titulación por inhibición de la
hemoaglutinación de anticuerpos contra
Parvovirus canino 67
20. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%
de IgY contra Parvovirus canino 70
21. Técnica de difusión simple en dos dimensiones
en tubo 72
22. Técnicas de precipitación y extracción de IgY
contra Parvovirus canino 72
12
ÍNDICE DE TABLAS
Página
1. Diferencia entre IgG de mamíferos e IgY de aves 28
2. Esquema de inoculación 47
3. Resultados de las técnicas de precipitación
y titulación de proteínas 68
13
RESUMEN
La producción de anticuerpos como herramienta de la inmunología hoy en
día, no solo se ha limitado al empleo de mamíferos tales como ratones,
cobayos, ovejas, conejos, entre otros, como fuentes de producción de los
mismos, sino que en este proceso ya se han involucrado las aves, como las
gallinas, patos y otras, con muy buenos resultados en la producción de
estos.
Este trabajo, muestra como mediante la inmunización de dos grupos de
gallinas de raza Loman con antígenos vacunales de parvovirus canino, se
obtuvieron preparaciones rica en anticuerpos en yema de huevo, específicos
contra este antígeno.
Para este efecto se probaron dos métodos de precipitación salina (sulfato de
sodio y sulfato de amonio), uno de precipitación metanólica y uno de
precipitación con Polietilenglicol (PEG 6000); se usó como prueba de oro el
kit de aislamiento EGGstract IgY Purification System® de PROMEGA.
14
Los resultados permiten concluir que es posible obtener anticuerpos contra el
virus de la Parvovirus canino en yema de huevo de gallina con una pureza
aceptable comparada con los obtenidos con el kit de PROMEGA.
15
INTRODUCCIÓN
La mayoría de anticuerpos son obtenidos de manera “casera” basados en
modelos de “inoculación animal” donde la obtención de anticuerpos, ya sea
policlonal o monoclonal dependen de los esquemas de inmunización, la
escogencia del animal, el inóculo, y otros factores importantes para que la
respuesta antígeno-anticuerpo sea específica y la activación del sistema
inmune sea rápida y óptima, teniendo en cuenta que ésto trae algunos
inconvenientes haciendo que la obtención de los anticuerpos de interés,
frente a un antígeno determinado no sea apropiado. Por tanto, es importante
buscar modelos alternativos de obtención de anticuerpos por métodos más
sencillos de manipulación y de alto rendimiento, como lo son el empleo de
aves, para la obtención de inmunoglobulina tipo IgG o mejor conocida, IgY.
Los métodos de inmunización y de obtención de inmunoglobulinas en
animales de laboratorio, como conejos, ratones, cobayos, entre otros, son
más complejos que en aves, ya que los métodos de obtención son invasivos
y en la mayoría de los casos llevan a la muerte del animal; también se ha
observado que se obtiene mayor cantidad de IgY en un huevo que al
sangrar uno de estos animales. Los esquemas de inmunización son más
reducidos en aves, que los aplicados en mamíferos y con un resultado de
16
título más rápido (antes de 25 días) y alto. La IgY es más estable que la IgG
de mamíferos. Se reportan concentraciones más elevadas de IgY en
miligramos / mililitro y con menos posibilidad de presentar reacciones
cruzadas con anticuerpos mamíferos que con anticuerpos tipo IgG. Los
rendimientos son mayores pues una gallina en periodo de postura produce
un huevo/día con un promedio de 50 a 80mg de Ac / huevo y en los
mamíferos es de tan solo 200mg de IgG por sangrado (40ml sangre) (Goueli,
1990).
Para la purificación de anticuerpos, los métodos utilizados son los que se
emplean comúnmente en el fraccionamiento proteico, tales como
cristalización, precipitación salina, precipitación metanólica, cromatografía de
intercambio iónico, electroforesis preparativa, entre otros. Generalmente se
los emplea en forma combinada para obtener una pureza cercana al 100%
(Bollag, 1993; Margni, 1993).
El trabajo busca obtener anticuerpos tipo IgY contra Parvovirus canino a
partir de huevos puestos por gallinas inmunizadas con este mismo antígeno
mediante técnicas convencionales de deslipidación, precipitación de
inmunoglobulinas y purificación.
17
2. MARCO TEÓRICO.
La obtención de anticuerpos específicos en animales de experimentación
(conejos, cabras, ratones, etc), ya sea contra proteínas completas o
fracciones de las mismas, generadas por cortes enzimáticos u obtenidas por
síntesis químicas (péptidos sintéticos), ha permitido verificar que sólo
pequeños fragmentos de pocos residuos de aminoácidos de una proteína,
sólo reconocidos en la reacción antígeno-anticuerpo tipo específica, son
útiles en la respuesta inmune (Warr, 1995).
2.1. ANTICUERPOS.
Los anticuerpos son proteínas, llamadas también inmunoglobulinas,
producidas por las células plasmáticas y capaces de reaccionar con un
antígeno. El organismo produce un anticuerpo distinto para cada antígeno,
por lo cual la reacción antígeno-anticuerpo es específica.
Las inmunoglobulinas son moléculas que a diferencia de las demás
proteínas, tienen dos regiones funcionales diferentes, una encargada del
reconocimiento de antígenos, que posee gran variabilidad por cuanto tiene la
18
capacidad de reconocer un número casi ilimitado de moléculas diferentes. La
otra región, tiene una función efectora, su constitución es mas o menos
constante y tiene la capacidad de fijar el complemento, de obrar como
opsonina, de facilitar el paso de anticuerpos a través de ciertas barreras
como la placenta, y en general, de ser efectora de los mecanismos de
inmunidad humoral (Rojas, 1990).
Los anticuerpos representan entre un 10 y un 20% de las proteínas totales
del plasma. Son de varias clases, que se reconocen con el nombre de
Inmunoglobulina A, Inmunoglobulina G, Inmunoglobulina M, Inmunoglobulina
E e Inmunoglobulina D. Su estructura básica es similar en todas estas clases,
con variaciones propias de cada una y con diferencias moleculares a
determinados niveles, que le confieren la especificidad de reacciones con
determinado antígeno y no con otros (Paul, 1989).
En condiciones normales un organismo adulto sintetiza de 2-4 gramos diarios
de anticuerpos y cataboliza por lo general una cantidad igual. La vida media
de cada inmunoglobulina es distinta y varia de 20 días para la IgG y de 4 a 5
días para la IgA e IgM. Parte del catabolismo de los anticuerpos se hace por
el sistema reticuloendotelial del hígado, pero algunas cantidades se pierden,
a través de la saliva, la secreción de los tractos respiratorio, digestivo y
gastrointestinal, del calostro y de la leche, sin haber sido desintegrados en
19
aminoácidos. La concentración de anticuerpos dentro del organismo tiene
variaciones muy considerables. La IgG, dado su peso molecular de 150.000
daltons, pasa fácilmente del torrente circulatorio hacia los tejidos y se
encuentra en buenas cantidades en el humor acuoso, en el líquido
cefalorraquídeo, en el líquido sinovial, en el líquido amniótico, en el líquido
peritoneal, así como también en los líquidos intersticiales. La IgM, que tiene
un peso molecular de 900.000 daltons, no sale del torrente circulatorio a los
tejidos, sino en condiciones excepcionales y su mayor concentración es
intravascular (Sunshine, 1989). En las secreciones como la saliva, las
lagrimas, el moco nasal y traqueobronquial, los líquidos intestinales, la bilis,
la orina, el calostro y la leche, la inmunoglobulina más abundante es la IgA
pero pueden presentarse pequeñas cantidades de IgG (Rojas, 1990).
2.1.1. Estructura general de las inmunoglobulinas.
Por la electroforesis de proteínas del plasma, se pueden separar varias
bandas, de las cuales la gamma y la beta, las de menor movilidad
electroforética, representan los sitios en donde se concentra la mayor parte
de los anticuerpos. Sólo unas pocas moléculas alcanzan a migrar hasta las
fracciones alfa 2 y alfa 1 (Tizard, 1984).
Hay características generales comunes de todas las inmunoglobulinas, ya
sean específicas y propias de cada clase. La general y más importante, se
20
basa en la unión de dos cadenas pesadas con 440 aminoácidos cada una, y
dos cadenas livianas de 220 aminoácidos cada una. Estas cuatro cadenas
forman una especie de pinza (gozne), encargada de atrapar al antígeno
(Figura No. 1) (Rojas, 1990).
Figura No.1. Esquema de la estructura de una molécula de inmunoglobulina.
La porción larga de las cadenas pesadas cumple otras funciones biológicas
importantes como es la liberación de un organismo de la presencia de la
molécula antigénica. Esta estructura básica de las dos cadenas pesadas
unidas a dos cadenas livianas, que a su vez se unen entre si, constituyen
una estructura tetramérica que es la presentación mas común de la IgG, la
IgD e IgE. La IgM suele presentarse en forma pentamérica, gracias a la cual
cinco moléculas básicas se unen por medio de una cadena adicional o
cadena J para formar una macromolécula de 900.000 daltons de peso
molecular. La IgA puede circular en el plasma en forma monomérica, pero a
21
nivel de las mucosas es secretada en un dímero constituido por la unión de
dos moléculas básicas, una cadena J y una pieza adicional llamada pieza
secretora. Su peso molecular es de 360.000 daltons aproximadamente
(Abbas, 1994).
- La cadena liviana.
Gracias a puentes disulfuro, forma dos asas que permiten dividir la cadena
en dos segmentos de 107 a 110 aminoácidos cada uno, llamados dominios,
uno de los cuales termina en un grupo amino (NH2), en tanto que el otro
termina en un grupo carboxílico (COOH). El primer segmento o dominio
recibe el nombre de segmento variable de la cadena liviana (VL), debido a
que la secuencia de aminoácidos cambia de un anticuerpo a otro, siendo
idéntica en todas las moléculas de anticuerpos destinadas a reaccionar con
determinado antígeno. El segundo segmento de la cadena liviana de los
anticuerpos recibe el nombre de segmento constante (CL), debido a que la
secuencia de aminoácidos es prácticamente igual en todos los anticuerpos
que actúan frente a un mismo antígeno (Rojas, 1990; Sunshine, 1989; Tizard,
1984).
- Cadena pesada.
Debido a puentes disulfuro, las cadenas pesadas formadas por 420 a 440
aminoácidos forman igualmente asas que permiten identificar de cuatro a
22
cinco dominios, según las clases de inmunoglobulina. El primero de estos
segmentos de 100 a 110 aminoácidos se conoce como segmento variable
(VH) y corresponde al segmento variable de las cadenas livianas, situado
exactamente al frente. La secuencia de aminoácidos en este caso es
idéntica para las moléculas de anticuerpos que deben reaccionar con un
antígeno especifico; de ahí la especificidad del anticuerpo. Esta secuencia
varía para otros anticuerpos encaminados a reaccionar con otros antígenos.
Los segmentos o dominios restantes tiene una secuencia de aminoácidos
que es igual para todas las moléculas de una misma clase, y que se
denominan CH1, CH2, CH3 y CH4. Las inmunoglobulinas G, A y D tienen
tres segmentos constantes, mientras que la M y la E poseen cuatro (Rojas,
1990; Otsen, 1979).
- Fragmentos de una molécula de anticuerpo.
Con el empleo de enzimas y de otros procedimientos químicos ha sido
posible dividir las moléculas de anticuerpos en diferentes fragmentos, lo cual
ha permitido estudiar la estructura y el funcionamiento de cada segmento de
la molécula. Los fragmentos más importantes son los que reaccionan con el
antígeno (Rojas, 1990).
La papaína ataca la molécula a nivel de la bisagra (gozne) y produce tres
fragmentos. Dos de ellos, que se conocen en la literatura como fragmentos
23
Fab, representan la unión de las cadenas livianas con los dos primeros
segmentos o dominios de la cadena pesada y constituyen los lugares por
donde el anticuerpo reacciona con el antígeno. El otro, que se conoce con el
nombre de fragmento cristalizable o Fc, está constituido por los restantes
segmentos constantes de las cadenas pesadas unidas entre si (Tizard,
1984).
La tripsina actúa sobre las cadenas pesadas a nivel del primer puente
sulfídrico, liberando un fragmento de gran tamaño que constituye los dos
segmentos Fab unidos a una pequeña porción de ambas cadenas pesadas,
en tanto que el resto de las cadenas pesadas son parcialmente degradadas
(Sunshine, 1989).
Si se emplea ácido propiónico 1N o urea 8N, se logrará romper los fuertes
enlaces covalentes que unen las cadenas pesadas a las livianas. Por lo
tanto, se producirá una división longitudinal de la molécula de
inmunoglobulina, formando dos mitades; cada una de estas mitades está
compuesta por una cadena pesada completa y una cadena liviana completa.
Bajo determinadas condiciones y mediante procedimientos de acidificación,
es posible la separación de las cadenas, obteniéndose así dos cadenas
livianas y dos cadenas pesadas (Zola, 1990).
24
- Segmentos variables.
Tanto el VL como el VH tienen en su secuencia de aminoácidos regiones
hipervariables, que se intercalan con segmentos constantes. Los tres
segmentos hipervariables de la cadena liviana están colocados entre los
aminoácidos 28 a 38, 50 a 56 y 88 a 97, en tanto que en la cadena pesada,
estos segmentos son cuatro y se ubican entre los aminoácidos 31 a 35, 49 a
66, 84 a 91 y 101 a 110 (Paul, 1989).
La función de los segmentos variables, como ya se dijo, es la de unirse
directamente con las moléculas antigénicas por asociación no covalente que
incluye fuerzas electrostáticas, uniones hidrógenas e interacción de tipo
Vander Walls y que presentan un cambio de energía de unos 6 a 17 kcal/mol.
El segmento de esta unión con el antígeno está representado por un nicho no
polar de unas dimensiones que están alrededor de 16 Å x 7 Å x 6 Å (Rojas,
1990).
- Segmentos CL y CH.
Como ya se mencionó, la secuencia de aminoácidos de estos segmentos es
prácticamente idéntica para cada clase de Ig. Por lo tanto, todo anticuerpo de
los muchos existentes contra los distintos antígenos tienen una secuencia de
aminoácidos similar en los segmentos CL y CH. La función de estos
segmentos no es aun clara, pero parece que tiene importancia para
25
estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria de la molécula y para facilitar y
hacer más estable la reacción de los segmentos variables con el antígeno
(Paul, 1989).
- Gozne.
Representa una zona de transición en la cadena de aminoácidos, que se
encuentra intercalada entre el primer dominio de segmentos constantes y el
segundo. Está compuesta por una cadena de 8-15 aminoácidos. Cumple una
función importante al permitir la movilidad de los dos primeros segmentos de
la cadena pesada, a los cuales están adheridas las cadenas livianas, y
facilitar el que estos puedan unirse a dos terminaciones antigénicas que
estén mas o menos separadas (Roitt, 1991).
Gracias a esta movilidad, las fracciones Fab de las moléculas de anticuerpos
pueden juntarse o abrirse formando una Y o una T para reaccionar con el
antígeno. Esta región es diferente para cada clase y subclase de Ig. El
número de puentes disulfuro varia en cada subclase de IgG. Son dos para la
IgG1 y la IgG3, 4 para la IgG2 y de 7 a 15 para la IgG4 (Roitt, 1991 y Rojas,
1990).
26
- Segmentos CH2.
Constituye el primer dominio del segmento Fc de la molécula de anticuerpos.
En él se unen lateralmente algunas cadenas de carbohidratos y son la base
de una de las funciones biológicas más importantes de las moléculas de
anticuerpos. A su nivel se activa el sistema del complemento, una vez que ha
tenido lugar la reacción Ag-Ac. Esta reacción se debe a una modificación en
la estructura o configuración espacial de la cadena pesada de las
inmunoglobulinas o anticuerpos a este nivel, para permitir que ella pueda
reaccionar con la molécula C1q del sistema del complemento (Tizard, 1984).
Si la Ig no se ha unido al antígeno, el C1q, aun cuando este presente lado a
lado a la Ig, no logra unirse a ella (Rojas, 1990).
Los anticuerpos de clase IgG y todos los tipos de IgM activan el sistema de
complemento por la llamada vía clásica, en tanto que unas cuantas
moléculas de IgG, de IgA y posiblemente algunas de IgE e IgD activan el
sistema por la llamada vía alterna (Rojas, 1990; Paul, 1989).
Por otra parte, la remoción de las terminaciones de ácido ciálico en las
cadenas laterales de oligosacáridos situadas en este lugar, facilita el que las
moléculas de anticuerpos sean fagocitadas por las células
reticuloendoteliales del hígado, haciendo posible el catabolismo de las
27
mismas. Por lo tanto el control homeostático de las Igs parece estar
controlado por este segmento (Sunshine, 1989).
- Segmentos CH3.
Cumple un papel muy importante desde el punto de vista de la opsonización,
gracias a que los macrófagos poseen un receptor especial de membrana
para los extremos distales de las cadenas pesadas de las moléculas de
anticuerpos (Rojas, 1990). En el caso de la IgG parece que estos receptores
reaccionan directamente con el segmento CH3, lo cual permite que la
molécula de Ig se fije a los macrófagos y facilite la fagocitosis del antígeno
que está unido por el otro extremo a la molécula de Ig (Morilla, 1989).
A nivel de la placenta, los trofoblastos tienen igualmente receptores para este
segmento de la IgG, y debido a su interacción, se logra el transporte activo
de los anticuerpos e IgG de la madre al feto. El segmento CH3 de la
molécula de IgD es el responsable de que ésta pueda adherirse a la
membrana de los linfocitos B (Tizard, 1984).
- Segmento CH4.
Este dominio no esta presente sino en la IgE y en la IgM. Gracias a él, la
molécula de IgE se fija solidamente a los mastocitos, que tienen receptores
para este segmento. En cuanto a la IgM , este segmento participa en la
28
activación del sistema del complemento. Además, a través de él se une a los
receptores Fc de los macrófagos (Paul, 1989).
- Cadenas laterales de carbohidratos.
En varios niveles de la cadena, y en distintos sitios de acuerdo con la clase
de Ig, se encuentran adheridas cadenas de carbohidratos en forma lateral.
Algunas de estas cadenas son complejas y tienen terminaciones de ácido
ciálico y fucosa, en tanto que otra, de estructura más simple, contiene
manosa o hexosaminas. Estas cadenas parecen servir para estabilizar y
proteger la cadena proteica; algunos de estos residuos, muy fuertes
polarmente, como el ácido ciálico, mantendrían los segmentos de la cadena
polipeptídica en una orientación adecuada para que puedan ser reconocidos
por los receptores Fc (receptores para el extremo distal, contacto de las
cadenas pesadas) presentes en células fagocitarias y en linfocitos. Estas
cadenas controlan también el metabolismo del calcio, necesario en las
reacciones de la molécula de anticuerpo con el complemento. En la IgA, las
cadenas de carbohidratos facilitan el acoplamiento de la pieza secretora a la
molécula de Ac. Las modificaciones en algunas de estas cadenas parecen
tener influencia en el proceso catabólico de las Igs. La remoción de las
terminaciones de ácido ciálico descubre residuos de galactosa, que
reaccionan con receptores presentes en las células del parénquima hepático.
29
Las inmunoglobulinas así captadas por el hígado, son degradadas a
aminoácidos (Rojas, 1990, Paul, 1989 y Sunshine, 1989).
- Configuración tridimensional.
Una molécula de Ig tiene 3 regiones globulares, 2 para la parte FAB y 1 para
la parte FC, unidas por el gozne. Esta conformación globular permite poner
en contacto la Ig con el medio en el cual circula y así mismo, ciertas partes
de la molécula, como la región hipervariable o idiotipo que reaccionan con el
antígeno y la zona constante de la cadena pesada que reacciona con el
complemento (Abbas, 1994; Rojas, 1990).
2.1.2. Función de las inmunoglobulinas.
Los anticuerpos tiene dos funciones específicas: la primera, localizar y fijarse
a un antígeno; la segunda, desencadenar una serie de reacciones biológicas
encaminadas a destruir a un agente invasivo determinado. La primera la
cumple la porción Fab de todos los anticuerpos, y es muy específica en el
sentido que para cada antígeno el organismo produce un anticuerpo
determinado, que se diferencia de otros por la secuencia de aminoácidos de
las zonas hipervariables de los segmentos o dominios variables de las
cadenas livianas y pesadas (Morilla, 1989; Paul, 1989; Tizard, 1984).
30
La segunda función, o función efectora de los anticuerpos, se cumple por
medio de diferentes procesos biológicos, que ocurren una vez que la
molécula de Ig se ha unido al antígeno. Los principales son los siguientes:
- La activación del complemento.
Puede ser bien, por la vía clásica o por la vía alterna. La reacción del
anticuerpo contra el antígeno induce cambios conformacionales, que dejan al
descubierto parte de la molécula de Ac, previamente oculta, y a la cual se
puede unir una molécula de C1q del complemento.
En la IgG, las posiciones 274 a 281 de las cadenas pesadas, son las
importantes para iniciar la activación del complemento. La parte de la cadena
está compuesta por Lis-Phe-Asn-Tre-Tyr-Val-Asp-Gly. La lisina parece ser el
aminoácido más esencial para ésta función de la IgG1. En la IgG2 ésta lisina
se encuentra reemplazada por una Gly. En la IgG4 la Hys de la posición 268
está reemplazada por la Gln y en consecuencia no existen las características
moleculares que permiten la fijación del C1q (Rojas, 1990 y Paul, 1989).
- La unión de los anticuerpos, tipo IgG, a los receptores especiales que para
su fracción Fc existen en células como macrófagos, granulocitos, linfocitos y
células del sistema reticuloendotelial. Esta unión de la molécula de Ac con
los receptores de membrana de estas células, incrementa notoriamente la
31
fagocitosis y estimula las distintas poblaciones de linfocitos para que inicien
la respuesta inmune encaminada a destruir el antígeno.
La IgM también activa la fagocitosis, pero posiblemente sea a través de un
complejo que forma con el factor C3b del complemento, para el cual existen
receptores especiales en los macrófagos. La IgE sirve como opsonina, al
adherirse a algunos parásitos (Fracer, 1993; Rojas, 1990; Tizard, 1984).
- El traspaso de la Ig a través de ciertas membranas o tejidos está controlado
por la parte Fc de las moléculas de Ac. Así, el traspaso de la IgG de la madre
al feto, que es un proceso pasivo, se cumple gracias a los receptores para
esta Ig. Algo similar parece ocurrir con la IgG y la IgA a nivel de glándula
mamaria (Sunshine, 1989; Olsen, 1979).
- La formación de complejos inmunes son precipitados o fagocitados por el
sistema reticuloendotelial (Rojas, 1990; Paul, 1989; Tizard, 1984).
- Inmovilización. Pueden unir flagelos y en esta forma inmovilizar gérmenes y
disminuir su capacidad invasora (Roitt, 1991; Paul, 1989 ).
- Neutralización. Los anticuerpos reaccionan con toxinas o partículas virales,
impidiendo así su fijación a membranas celulares (Rojas, 1990).
32
- Quimiotaxis. Por activación del complemento con la liberación de las
partículas C5a (Rojas, 1990; Paul, 1989).
- Degranulación de mastocitos. Acción importante dentro del proceso de
inflamación y con lo cual se produce la liberación de los mediadores
primarios de la inflamación. Esta acción esta a cargo primordialmente de la
IgE (Abbas, 1994; Paul, 1989).
2.2. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS.
La defensa contra las infecciones es la función esencial del sistema inmune y
en las aves los mecanismos de defensa se dividen en 2 grupos. El primero
de ellos conocido como no especifico, constituye la primera línea de defensa
contra la invasión de agentes. Tal mecanismo incluye la barrera mecánica
compuesta por la piel, membranas mucosas, cilias vibrátiles y moco, acidez
en el proventrículo, microorganismos comensales en el intestino, sistema del
complemento, células asesinas naturales y fagocitos inespecíficos. El
segundo mecanismo es el sistema inmune específico que tiene la capacidad
de responder contra los antígenos en general y en forma específica puede
memorizar contactos previos. Las aves reaccionan, contra los agentes
infecciosos, con células especializadas tales como macrófagos, células
dendríticas, células asesinas naturales, granulocitos, linfocitos T y linfocitos
33
B. Los anticuerpos también juegan un papel importante, ya que tienen la
capacidad y especificidad para unirse a antígenos y neutralizarlos. En las
aves son conocidos tres tipos de anticuerpos que son las inmunoglobulinas
A, M y G, anticuerpos que no sólo son sinónimos de defensa sino que
metabolicamente tienen la propiedad de ser eliminados en la yema de los
huevos, razón por la cual se les denominó anticuerpos inmunoglobulina Y
(yema), particularidad que hace de este tejido aviar, un sitio rico en
anticuerpos que le dan un carácter de zona inmunológica y estéril
privilegiada, y a la vez sirven como fuente para la obtención de los mismos,
ya que este fenómeno in vivo, puede ser reproducido al utilizar el ave como
un animal de experimentación e inocular un antígeno X en un momento
determinado. Este fenómeno fisiológico se puede explotar con el fin de
extrapolar hacia fines diagnósticos al utilizar dichos anticuerpos (Hernández,
1998; Ossa, 1990; Zola, 1990).
2.2.1. Sistema inmunológico aviar.
Desde el punto de vista de la inmunología propiamente dicha, las aves han
jugado un papel protagónico en la consolidación de la ciencia, sirviendo de
modelo animal para definir la dicotomía entre la inmunidad humoral y la
inmunidad celular, enunciada teóricamente desde el siglo XIX, y para
determinar el carácter de los linfocitos, de la Bursa y del timo (Ossa, 1990).
34
El sistema inmunológico aviar se clasifica en tejidos linfoides primarios, que
incluyen el timo y la bolsa de Fabricio y en estructuras linfoides secundarias,
en las cuales se encuentran las placas de Peyer, tonsilas cecales, glándula
de Harder, glándulas conjuntivales, tejido linfoide asociado a los bronquios y
al bazo (Hernández, 1998; Noden, 1990).
El timo se localiza en la región del cuello y tiene como función procesar
linfocitos, originados en la médula ósea, para transformarlos en linfocitos T.
Este órgano permanece funcional durante toda la vida de las aves y
evoluciona con la edad a un órgano linfoide secundario (Hernández, 1998;
Klasing, 1994).
La bolsa de Fabricio localizada dorsalmente a la cloaca, es el órgano
primario de la linfopoiesis de linfocitos B; esta glándula crece hasta lograr su
máximo peso entre la décima y décimo-quinta semana de vida del ave y
empieza luego un descenso atrófico que continua hasta la semana 23 o 24,
quedando sólo como un botón fibroso (Hernández, 1998; Marsh, 1994).
Los órganos linfoides secundarios, contienen zonas timo y
bursodependientes. La glándula de Harder localizada detrás del tercer
párpado tiene como principal tipo celular los plasmocitos y es responsable de
la función inmunológica de la tráquea, órbita de los ojos, cavidad nasal y
35
tracto respiratorio superior. Las glándulas conjuntivales se localizan en los
párpados y en la región paraocular. El tejido linfoide de asociación a los
bronquios está unido a los bronquios primarios y secundarios y es el
responsable de la inmunidad local del tracto respiratorio superior (Hernández,
1998; Noden, 1990).
Las glándulas o placas de Peyer localizadas en el interior de la mucosa
intestinal principalmente en el íleon y las tonsilas cecales localizadas a la
entrada de los ciegos son los responsables de la función inmunológica en el
intestino. El bazo es otro órgano que cumple con funciones inmunológicas ya
que filtra la sangre, proceso durante el cual se extraen partículas antigénicas
(Hernández, 1998; Tizard, 1995).
El suero de las aves y la yema de los huevos presentan los mismos
anticuerpos puesto que las hembras transfieren anticuerpos sanguíneos a los
huevos durante su periódo de maduración en el oviducto, y así proveen de
una fuente de anticuerpos para los polluelos en caso que ocurra la
fecundación, de manera similar a como ocurre con el traspaso de los
anticuerpos a través de la placenta en los mamíferos (Figura No.2)
(Gassman, 1990).
36
Figura No. 2 Comparación entre los órganos linfoides de las aves y de los mamíferos.
2.2.2. Mecanismo de inmunidad aviar.
Las aves reaccionan contra los agentes infecciosos con células
especializadas tales como los macrófagos, células dendríticas, células
asesinas naturales, granulocitos, linfocitos T y linfocitos B (Hernández, 1998).
Los macrófagos son barreras móviles ampliamente distribuidas por todo el
cuerpo y son considerados la primera línea de defensa contra los organismos
infecciosos, ya que los destruyen por medio de la fagocitosis y mediante ésta
función inician la inmunidad humoral y celular debido a que actúan como
células presentadoras de antígeno, los que fueron degradados con
anterioridad allí mismo por enzimas citoplasmáticas, intermediadores
37
reactivos del nitrógeno y del oxígeno (Hernández, 1998; Tizard, 1995;
Mohanty, 1983).
Las células dendríticas son una población de células que tienen receptores
para anticuerpos y el complemento; hacen parte del grupo de células
presentadoras de antígeno y se encuentran especialmente en los órganos
linfoides y la piel. Los basófilos, eosinófilos y heterófilos pertenecen al grupo
celular de los granulocitos, su función es la de envolver agentes infecciosos y
destruirlos por medio de enzimas intracelulares y también participar en
reacciones alérgicas (Hernández, 1998; Noden, 1990).
Las células asesinas naturales son consideradas la primera barrera contra
los tumores. Estas células ejercen dos tipos de efectos citotóxicos; uno de
ellos, es estimulado por los linfocitos T y el otro mecanismo de citotoxicidad
es la mediada por anticuerpos puesto que tiene receptores contra los
mismos, en éste caso el anticuerpo sirve como indicador y puente entre la
célula infectada y la asesina natural (Hernández,1998; Tizard, 1995).
En relación a los linfocitos T, existen varios tipos, los cuales interactúan entre
ellos mismos y además reconocen selectivamente otras células debido a los
antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad que tiene la función de
servir como marcador biológico de la individualidad de un sujeto y de ésta
38
forma permite que el sistema inmune diferencie entre lo propio y lo no propio
(Hernández, 1998; Ossa, 1990).
Se conocen dos tipos de linfocitos T que son los ayudadores y los citotóxicos.
Los ayudadores reconocen los antígenos de los agentes infecciosos
presentes en la superficie de las células presentadoras de los mismos y
estimulan la proliferación de los linfocitos T citotóxicos, los cuales identifican
células que han sintetizado antígenos de superficie o membrana y las
interpreta como infectadas, por lo tanto, debe destruirlas antes que produzca
nuevos antígenos y los libere. El linfocito unido a la célula blanco secreta
proteínas citotóxicas, llamadas perforinas o proteínas solubles, y linfotoxinas.
Las perforinas se polimerizan y forman estructuras tubulares llamadas
poliperforinas, que se insertan en las membranas celulares que forma
canales transmembranosos, proceso en el cual las células sufren una
disrupción por lisis osmótica. En algunos casos los linfocitos citotóxicos no
necesitan entrar en contacto directo con la célula blanco y en su lugar liberan
linfotoxínas en el líquido que rodea dichas células (Hernández, 1998; Tizard,
1995).
El otro tipo celular son los linfocitos B que tienen la capacidad de reconocer
antígenos procesados por las células presentadoras de antígeno, aunque
también pueden reconocerlos de forma aislada; luego se dividen de manera
39
repetida y bajo la influencia de los linfocitos T nuevamente se dividen en dos
poblaciones morfológicas y funcionalmente diferentes. Una de estas
poblaciones adquiere la capacidad de fabricar y secretar grandes cantidades
de anticuerpos contra el antígeno que existía en el linfocito B original y se
conoce con el nombre de células plasmáticas o plasmocitos; la segunda
población corresponde a un grupo que permanece sin cambios estructurales
y funciona como células de memoria (Hernández, 1998).
Los anticuerpos también se conocen como gammaglobulinas o
inmunoglobulinas (Ig) que tienen la capacidad y especificidad para unirse a
antígenos y neutralizarlos aunque pueden presentar especificidad cruzada.
En las aves son conocidos tres tipos de inmunoglobulinas, la IgA, IgM y la
IgG.
La IgA se encuentra a nivel de las mucosas y secreciones, especialmente la
bilis, fluido intestinal y secreciones respiratorias. La IgM es la primera
inmunoglobulina en aparecer en la respuesta inmune pero no la más
abundante, ya que después de el estímulo antigénico comienza a producirse
IgG también conocida como IgY. Esta última es la responsable de la
transmisión de la inmunidad pasiva a los pollitos porque es la única que
puede acumularse en el vitelo en concentraciones mayores que las
40
existentes en el suero de gallina (Hernández, 1998; Tizard, 1995; Noden,
1990).
2.2.3. Características de la IgY.
La IgY es más resistente a la temperatura, el pH y la carga iónica que la IgG
de mamíferos. Esta no reacciona contra anticuerpos de mamíferos (Fc-
receptores, RBCs). Las inmunoglobulinas de los mamíferos pueden
presentar reacciones cruzadas a diferencia de las inmuglobulinas de aves
(Schade, 1996).
Las moléculas de IgG de gallina tiene algunas similitudes fisicoquímicas a las
IgG de los mamíferos, pero se ha determinado que existen dos clases: una
macroglobulina y una globulina de bajo peso molecular. En la naturaleza la
IgY se encuentra en dos formas: una completa y otra trunca; ambas pueden
coexistir en un individuo como sucede en algunas tortugas y en algunas aves
como los patos. En otras especies solo se encuentra una forma como es el
caso de las gallinas que solo producen la forma completa y de algunas
tortugas que solo producen la forma trunca. La forma completa de IgY tiene
una masa molecular de 180 kDa y como todas las IgG de bajo peso
molecular tiene dos cadenas H y dos cadenas livianas. Las cadenas H
poseen una región variable y una región constante con cuatro dominios de
inmunoglobulinas, razón que explica su gran tamaño. La forma trunca tiene
41
un peso molecular de 120 kDa, pues ha perdido los dos dominios
carboxiterminales (Cv3 y Cv4) de las cadenas H, convirtiéndose en una
molécula semejante a un fragmento F(ab’)2; por lo cual se sugiere darle el
nombre de IgY y se clasifica como una isoforma (Magor, 1994).
La importancia de la obtención de anticuerpos en los huevos es bien
conocida. La yema contiene de 8-20 miligramos por mililitro de IgY. La
obtención de anticuerpos representa un gran potencial para la investigación
inmunológica (Klemperer, 1893).
Los dominios Cv2 y Cv3 de las IgG de mamíferos tienen un alto grado de
similitud con las regiones Cv3 y Cv4 de las IgY, mientras que el dominio
correspondiente a Cv2 está ausente. Se cree que el dominio Cv2 de las IgY
de los anfibios, reptiles y aves fue condensado para formar la región de la
bisagra de las inmunoglobulinas en los vertebrados superiores, otorgándole a
la molécula la característica de flexibilidad de las inmunoglobulinas. En
consecuencia la IgY carece de bisagra molecular, pero a su vez, entre los
dominios Cv1-Cv2 y Cv2-Cv3, la IgY posee gran cantidad de residuos de
prolina y glicina que dan un suficiente grado de flexibilidad a la molécula para
la óptima realización de sus funciones (Warr, 1995).
42
Las principales diferencias entre la IgY de aves y la IgG de mamíferos se
muestra en la siguiente tabla (Figura No. 3).
Tabla No. 1. Diferencia entre IgG de mamíferos e IgY de aves.
IgG MAMÍFEROS IgY AVES Anticuerpos muestra Método invasivo Método no invasivo Cantidad de anticuerpos 200 mg IgG por sangrado (40
ml sangre) 50-100 mg IgY por huevo (5-7 huevos por semana)
Cantidad de anticuerpos por mes
200 mg 1500 mg o más
Cantidad de anticuerpos específicos
5% o más 2-10%
Unión a la proteína A/G si No Interferencia con IgG mamíferas
si No
Interferencia con el factor Reumatoideo
si No
Activación de complemento mamífero
si No
Figura No.3. Diferencia entre la estructura de IgG de mamíferos y de IgY de aves.
2.2.4. Esquemas de inmunización.
La inmunización y el sangrado de animales para la obtención de anticuerpos
es una herramienta muy útil para la investigación. Los tipos de intervenciones
pueden ser divididos en dos categorías: realizar modificaciones del antígeno
o alternativas de condiciones de inyección. En general, estos métodos deben
43
ser únicamente empleados después de una metodología de inmunización. La
segunda clase de intervención incluye la escogencia del animal, la dosis, la
forma en que se va a aplicar el antígeno, el uso de adyuvantes, la cantidad y
número de inoculaciones y el periódo de espera entre una inoculación y otra
(Martínez, 1981).
- Selección del animal.
La selección del animal para la inmunización es determinada por 4 puntos, la
cantidad de suero que se va a necesitar, el tipo de especie del antígeno
aislado, que tipo de anticuerpos se necesita y si la viabilidad del antígeno es
compatible con el animal.
- Dosis del antígeno.
Existen dos diferentes criterios que son importantes para considerar en la
determinación de la dosis: primero, la óptima dosis debe activar la respuesta
de los estrógenos, y la segunda, la mínima dosis probable para inducir la
obtención de anticuerpos o de animales donadores de la fusión de
hibridomas. Muchos de los métodos de inoculación pueden ser catabolizados
o purificados antes de estimular el tipo apropiado de células. La eficiencia de
estos procesos varia con los factores del hospedero, la ruta de la inoculación,
el uso de adyuvantes y la vía intrínseca del antígeno.
44
La mínima cantidad de antígeno capaz de inducir la respuesta inmune será
dependiente de la naturaleza del antígeno y del hospedero. Se recomienda
que se aplique mas de una dosis con el fín de mantener la respuesta inmune
latente durante un tiempo prolongado, teniendo en cuenta que la vía de
inoculación siempre debe ser la misma. Los virus como el Parvovirus canino
son partículas proteicas que se aplican subcutáneamente en dosis de 50-
1000 µg.
- Forma del antígeno.
Las partículas virales son los mejores inmunógenos. La valencia de un
antígeno puede tener un efecto fuerte sobre estos métodos de inmunización.
Esto depende del tipo de inmunógeno que se emplea y de su rápida acción
en el sistema inmune del animal.
- Rutas de inoculación.
Las rutas de inoculación son dirigidas para tres puntos básicos: primero, qué
volumen es el más apropiado; segundo, qué buffer y otros componentes
serán inyectados con el inmunógeno y tercero, qué tan rápido entra el
inmunógeno vía linfática o circulatoria. Si el adyuvante o las partículas de
interés son incluidas en la inoculación, el inmunógeno no debe ser aplicado
intravenosamente ya que se puede causar un choque anafiláctico. Si se
desea una reacción lenta del inóculo, la inoculación debe ser intramuscular o
45
intradermal. Si la reacción debe ser inmediata se usa la inoculación
intravenosa (Zola, 1990; Harlow, 1988).
2.2.5. Técnicas de extracción y purificación de anticuerpos.
- Almacenamiento de anticuerpos.
Una de las ventajas de trabajar con moléculas de anticuerpos es que son
compactas y sus dominios son estables haciéndolos resistentes a un gran
rango de condiciones medias de denaturación. Son necesarios buffers como
suplementos de estabilización como lo es el glicerol. El único problema
comúnmente encontrado en el almacenamiento de anticuerpos, es la
contaminación de estas soluciones con bacterias u hongos, que pueden ser
prevenidos con azida de sodio al 0,02%. Si los anticuerpos son necesarios
para pruebas in vivo, no se debe aplicar azida de sodio sino mejor esterilizar
la solución.
Los anticuerpos pueden ser almacenados a –20°C en el suero, cultivo de
tejido o fluidos, en donde éstos se encuentren presentes. Los métodos de
conservación más empleados son con azida de sodio y concentración de
sales entre 0 y 150 mM. La solución de anticuerpos no se debe exponer a
cambios de temperatura bruscos ya que alteran su estructura y finalmente se
denaturan (Harlow, 1986).
46
- Purificación de anticuerpos.
Se debe tener en claro inicialmente, cual es la técnica en la que se van a
emplear los anticuerpos con el fín de determinar el grado de pureza, y que
los reactivos que se emplean en la extracción y en la purificación no
intervengan en la técnica final.
La correcta escogencia del método de purificación dependerá de un número
de variables, que incluyen el uso de los anticuerpos, la especie del animal
con el que se trabaje, el tipo de anticuerpo y la obtención de los mismos.
Los anticuerpos obtenidos a partir de suero pueden ser purificados usando
métodos convencionales que involucran la precipitación acompañados de
cromatografía en columna. Para los anticuerpos que se encuentran en
sobrenadantes de cultivos de tejidos, éstos pueden ser purificados usando
fragmentos de proteína A o anti-inmunoglobulinas de Mycobacterium; ésta
técnica se conoce con el nombre de cromatografía de afinidad.
Entre las técnicas más usadas se encuentran las siguientes: Precipitación
con sulfato de amonio, Purificación de anticuerpos usando ácido caprílico,
Purificación de anticuerpos usando DEAE-matríz, Cromatografía de
intercambio iónico, Filtración en gel de afinidad, Purificación de anticuerpos
47
por gel filtrador, Electroforesis en agarosa y Ultracentrifugación (Harlow,
1986).
2.3. PARVOVIRUS CANINO (como antígeno).
2.3.1. Etiología.
El agente etiológico de la parvovirosis canina (Parvovirus canis) es un virus
de DNA que pertenece a la Familia Parvoviridae, género Parvovirus, cepa
780916/916 ó PVC 916 que se comporta como antígeno soluble (Fields,
1996).
El PVC posee un virión pequeño de simetría icosaédrica y un genoma
formado por DNA de cadena sencilla negativa; contiene 32 capsómeros de
5.2 Kb de tamaño (Fenner, 1987); su coeficiente de sedimentación es de 15
a 18S y en condiciones alcalinas su peso molecular es de 1.5 a 2.2 x 106
Daltons.
La composición de bases para el Parvovirus es, G: 19.5-22.8; Å:22.0-26.8;
T:29.0-33.4; C:21.4-22.9 (Castro, 1990).
48
- Replicación Viral.
El sitio de acumulación de las proteínas virales es el núcleo celular,
precisando de algunas funciones celulares que se generan al final de la fase
S o al principio de la fase G2 del ciclo mitótico. 3 RNA’s mensajeros,
derivados de unidades de sobreposición transcripcional, pueden identificarse
en células infectadas con el virus. Estos RNAm tienen en común un 3’
terminal, son poliadenilatados y en el género Parvovirus ocurre
frecuentemente en forma empalmada. El RNA más abundante codifica
proteínas estructurales que aparecen al final de la infección y su información
más importante se localiza en la región 5’ a 3’ del genoma, mientras que la
información para la proteína no estructural que interviene en la replicación de
DNA se localiza en la región 3’ a 5’ del genoma (Fenner, 1987). La
replicación del DNA se produce a través de una forma replicativa de doble
cadena, iniciada mediante un mecanismo autoiniciador por la secuencia
palindrómica terminal. Tras la replicación del DNA se ensamblan las cápsides
víricas dentro de las cuáles se localiza el DNA de cadena sencilla de la
progenie. Los Parvovirus producen grandes corpúsculos de inclusión
intranuclear ( figura No. 4) (Castro, 1990; Mogollon, 1981).
49
Figura No. 4. Mapa genómico de Parvovirus canis.
Los virus como el Parvovirus atacan al sistema inmune, alteran su función y
destruyen sus células. La formación de los cuerpos de inclusión en las
células es la primera etapa de la infección viral. Los anticuerpos son capaces
de presentar un virus no infectivo siendo específicamente adsorbido por los
componentes sobre la superficie de las partículas virales. Las moléculas de
anticuerpos adicionan en una combinación irreversible, una de las partes del
virus que interferirán en la unión específica del virus con las células del
hospedero interrumpiéndose la iniciación de la infección. (Burnet, 1955)
La respuesta de defensa inmunológica se perfecciona gracias a un proceso
de aprendizaje que tiene lugar durante el primer contacto del huésped con el
agente patógeno. Mediante este contacto se programan grupos de linfocitos
para iniciar una respuesta inmune en caso de que el mismo agente patógeno
50
ingrese por segunda vez en el organismo. Esos mecanismos se conocen con
el nombre de inmunidad adquirida (Castro,1990).
La inmunidad adquirida puede ser activa o pasiva. La inmunidad activa se
desarrolla durante el curso de una enfermedad infecciosa. La inmunidad
pasiva es un proceso de defensa contra determinado agente patógeno,
mediante el empleo de anticuerpos protectores, siendo posible controlar una
infección sin que el sistema inmune del individuo haya tenido contacto
previamente con el agente patógeno (Langeveld,1994).
Las reacciones inmunes que involucran a los virus son mecanismos de
defensa humoral por anticuerpos y mecanismos mediados por células.
- Mecanismos de defensa humoral.
Los anticuerpos constituyen uno de los mecanismos más importantes de la
resistencia del huésped a la infección viral. Las reacciones virus-anticuerpo
encontradas incluyen la neutralización (con o sin complemento), lisis,
opsonización e inhibición de enzimas. Las inmunoglobulinas son las
moléculas proteicas que tienen actividad de anticuerpos. Los anticuerpos se
originan como respuesta a las sustancias extrañas introducidas en el cuerpo.
Hay cinco clases de inmunoglobulinas designadas IgG, IgA, IgM, IgD e IgE,
51
con igual arquitectura molecular básica, pero con especificidad de antígeno y
diferentes actividades biológicas (Burnet, 1955).
El linfocito es la célula de mayor importancia dentro del sistema inmune. Se
han identificado dos poblaciones principales de linfocitos designados como
linfocitos T y linfocitos B, que representan poblaciones separadas (Castro,
1990; Burnet, 1955).
Los linfocitos T se derivan del timo o son influidos por él durante su
desarrollo. Los linfocitos B o bursodependientes llamados así porque migran
desde la médula ósea a la Bursa de Fabricio de las aves o su equivalente en
otros animales, constituyen la base de la inmunidad humoral (Rojas, 1990).
También, otras células participan en el proceso de defensa como los
polimorfonucleares y monocitos (Castro, 1990).
Para que el PVC pueda invadir el organismo, la carga viral infectante debe
ser la ideal teniendo en cuenta que el individuo debe carecer de la IgA
secretora, específica contra el PVC, eliminada en gran cantidad por la saliva
(Burnet, 1955).
52
Luego de la replicación en tonsilas, en la fase de viremias, sensibilizan los
linfocitos T y linfocitos B y ocurre una expansión clonal de ambas
poblaciones comenzando con una cooperación entre los linfocitos T y B,
producción de linfocitos T y B de memoria y por ultimo la producción de
células efectoras de linfocitos T y células B productoras de anticuerpos
(Rojas, 1990).
Después de la infección natural, se inicia, en el curso de cuatro días, la
formación de anticuerpos que alcanzan su máximo al cabo de tres semanas.
Los anticuerpos pertenecen inicialmente a la clase de IgM. A partir de la
tercera semana post-infección, los anticuerpos son de la clase IgG
específicos (Mockett, 1996).
La duración de la inmunidad contra PVC, la consideran ciertos autores como
desconocida pero otros, en cambio, consideran que dura más de un año o
más de 18 meses, o que probablemente es permanente (Castro, 1990).
Bajo condiciones de campo, se presume que se reciben descargas naturales
del Parvovirus canino, especialmente en perros que tienen un contacto
regular con otros, lo que provee una protección por largos periódos. En los
perros en que se ha confirmado que han padecido la infección por PVC, son
inmunes completamente, probablemente de por vida. Los perros que se han
53
recobrado de una infección experimental con PVC y se han mantenido
aislados, se mantienen inmunes a una nueva descarga, aún 20 meses
después de la primera (Mockett, 1996).
Los virus estimulan la formación de anticuerpos, a la vez que regulan la
latencia de los mismos. Los trastornos de este equilibrio pueden repercutir a
favor del aumento viral. Además, dada la afinidad de los Parvovirus por el
sistema linfático, actúan como inmunosupresores (Burnet, 1955).
Es posible la persistencia del virus en animales portadores después de la
convalecencia, eliminando el virus intermitentemente.
Es aconsejable la vacunación del perro adulto con el objeto de mantener su
inmunidad estable. Esta no impide la presencia del virus en células
intestinales, pero si muy probablemente la viremia.
En mamíferos, los anticuerpos se transfieren de la madre a la descendencia
a través de la placenta y/o el calostro ; la importancia de estas dos rutas varia
según la especie y se relaciona con la arquitectura de la placenta. En los
caninos, los anticuerpos provenientes de la madre se adquieren en un 90% a
través del calostro y tiene un papel importante en la protección de los
neonatos contra la PVC, sin embargo, también interfieren con la inmunidad
54
activa independientemente del tipo de vacuna aplicada (Castro, 1990; Burnet,
1955).
Las camadas pequeñas presentan títulos de anticuerpos más altos que las
camadas grandes, presumiéndose el porque el calostro disponible para cada
cachorro es menor en estas ultimas (Castro, 1990). Después de la lactancia
los cachorros poseen títulos inhibidores de la HA en promedio equivalente al
50% del título de la madre (Burnet, 1955).
Los anticuerpos transferidos de la madre poseen una vida media de 9,7 días
en el cachorro, mayor de la reportada para los anticuerpos contra distemper
canino de 8,4 días y hepatitis infecciosa canina de 8,6 días. El periódo crítico
de bloqueo de la inmunidad activa por los anticuerpos maternos se ha
estimado en 2-5 semanas. Estos títulos de anticuerpos declinan
exponencialmente con la edad (Castro,1990).
Los cachorros con títulos IHA mayores o iguales a 1:80, son inmunes a la
descarga oronasal del PVC virulento, pero títulos IHA menores o iguales a
1:10 interfieren con la inmunización activa por vacunas a virus vivo
(Castro,1990).
55
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
La obtención de anticuerpos policlonales a partir de yema de huevo se ha
empleado desde la década de los 60s. Se han creado diferentes técnicas en
donde el mayor problema es la deslipidación, ya que si se usan reactivos lo
bastante concentrados, pueden llegar a dañar a las proteínas o a
precipitarlas con las grasas de la yema.
Sin embargo, pese a que existen en el mercado varios kits de extracción de
IgY, estos resultan ser costosos e incrementan los precios de producción en
gran escala; por lo tanto, se debe procurar implementar una técnica de
fácil acceso, que produzca resultados de pureza aceptable y a bajos
costos, de modo que sea asequible a todo aquel que le pueda ser de
utilidad.
56
3.2. JUSTIFICACIÓN.
El proyecto se justifica a partir de los siguientes aspectos:
1. Metodológico.
La inmunología aviar ha aportado grandes descubrimientos en la
inmunología.
El uso de aves para producir anticuerpos contra un antígeno determinado es
un método que usa técnicas semi – invasivas para la producción y obtención
de éstos, ya que las inmunoglobulinas se obtienen en gran concentración en
la yema de huevo, haciendo de éstos una fuente de obtención a gran escala,
sin causar estrés y donde se le respeta la vida al animal; además, dentro de
las ventajas que éste método ofrece, están las características de resistencia
de la IgY al ambiente, no presenta reacciones cruzadas con anticuerpos de
tipo IgG de mamíferos, ni contra las proteínas A y G de Mycobacterium entre
otras.
Los esquemas de inmunización son lo suficientemente rápidos si se emplea
adyuvante de Freund, como lo sustentan algunos reportes que demuestran
que a partir de la segunda semana post-inoculación se encuentran títulos de
IgY contra el agente patógeno de estudio y se pueden conservar estos títulos
hasta 15 meses después.
57
2. Socioeconómico.
La metodología empleada para la purificación de anticuerpos tipo IgY en este
trabajo, reduce los costos de obtención que se ven reflejados posteriormente
en la aplicación o en el uso de los mismos.
Por lo tanto se uso esta metodología para obtener anticuerpos contra
Parvovirus canino.
58
4. OBJETIVOS.
4.1. OBJETIVO GENERAL.
Obtener anticuerpos tipo IgY contra Parvovirus canino a partir de huevos de
gallinas previamente inmunizadas con virus vacunal.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
? Inmunizar gallinas de la raza Loman, por el método de inoculación de
Punción intramuscular (pechuga) y subcutánea, según protocolo de
Schade, 1996.
? Aislar y purificar anticuerpos policlonales obtenidos en yema de huevo
usando extractantes lipídicos y precipitando proteínas con métodos
salino-alcohólicos y de polietilenglicol, utilizando como patrón de
obtención y purificación el kit EGGstract IgY Purification System® de
PROMEGA.
? Cuantificar la proteína extraída mediante el método colorimétrico de
Bradford.
? Evidenciar la integridad y la pureza de la IgY por electroforesis en
SDS-PAGE según Laemmli, 1970.
? Titular la inmunoglobulina IgY por Inhibición de la hemoaglutinación.
59
5. MATERIALES Y MÉTODOS.
5.1. Tipo de estudio.
Estadísticamente este estudio es descriptivo, transversal y prospectivo.
5.2. Hipótesis.
Hipótesis nula:
Se obtienen anticuerpos policlonales de tipo IgY en yema de huevo de
gallinas previamente inmunizadas con virus vacunal de Parvovirus canino.
Hipótesis alterna:
No se obtienen anticuerpos policlonales de tipo IgY en yema de huevo de
gallinas previamente inmunizadas con virus vacunal de Parvovirus canino.
5.3. Esquema de inoculación.
Se tomaron dos grupos experimentales de 5 gallinas ponedoras, raza
Loman, de 16 semanas de edad, de mismo origen genético, alimentación y
ubicación en el mismo hábitat en unidades de aislamiento de 1,30 mts X
1,50 mts (Figura No.6), bajo las mismas condiciones ambientales, a las
cuales se les inoculó como antígeno virus vacunal de tipo vivo atenuado de
60
Parvovirus canino (vacuna Pfizer con título de 106,5 por 1 mililitro y una
concentración de proteína total de 0.378 mg/ml), utilizando para este
propósito el esquema propuesto por Schade (1996), en el cual se usaron dos
vías de inoculación y para cada grupo una vía en particular (intramuscular,
grupo A y subcutánea, grupo B); se aplicaron 4 dosis de 150 µg / dosis de
proteína viral a cada ave (Schade, 1996).
Figura No. 5. Huevos recolectados del lote A (intramuscular) y del lote B (subcutáneo).
Figura No.6. Grupo A y B de gallinas raza Loman empleadas para este estudio.
61
La primera dosis, aplicada el día 0, se conjugó volumen / volumen con
adyuvante completo de Freund, inoculándose un volumen final vacuna /
adyuvante de 0.8 ml por ave, las 2 siguientes inoculaciones con adyuvante
incompleto en la misma proporción que el anterior y la última sin adyuvante
(Figura No. 7). El esquema de inoculación fue el siguiente:
Tabla No. 2. Esquema de inoculación.
FECHA DE INOCULACIÓN
TIPO DE INOCULACIÓN
Día 0 24 de noviembre de 2000
Antígeno 150mg/dosis + adyuvante completo de Freund Vf 0,8ml por ave
Día 7 1 de Diciembre de 2000
Antígeno 150mg/dosis + adyuvante incompleto de Freund Vf 0,8ml por ave
Día 14 14 de Diciembre de 2000
Antígeno 150mg/dosis + adyuvante incompleto de Freund Vf 0,8ml por ave
Día 21 21 de Diciembre de 2000
Antígeno 150mg/dosis + S.S. Vf 0.8ml por ave
Figura No.7. Adyuvante completo de Freund y vacuna de Parvovirus canino.
Los huevos fueron recolectados diariamente, trabajándose con los huevos
(Figura No. 5) del día 56 ± 5 post-inoculación, pues es donde se espera la
más alta concentración de anticuerpos contra Parvovirus canino.
62
5.4. Equipos.
? Centrífuga IEC centra MP4R, capacidad 8 tubos.
? Potenciómetro Corning pH meter 430.
? Cámara de electroforesis Mighty small SE245 Dual gel caster Hoefer,
fuente de poder Power Sopply CPS 600.
? Baño serológico Memmert, hasta 100?C.
? Nevera Haceb superstar a 4?C, congelador Phillips polaroid a -20?C.
? Agitador magnético Fisher scientific.
? Vortex Thermolyne Maxi mix plus TM.
? Micropipetas de 20-100 y de 100-1000? l marca Pipetman y Eppendorf.
? Cámara fotográfica Canon EOS 1000FN.
? Shaker Rotator Dinamic.
? Lector de ELISA Bio – Rad Model 3550 Microplate Reader.
? Balanza analítica Scientech SA80.
5.5. Técnicas de deslipidación a partir de yema de huevo.
5.5.1. Agua según Burdon, 1987.
Se tomaron entre 12-15 ml de la yema de un huevo previa remoción de el
vitélo, y se le adicionaron 9 volúmenes de agua pH 7 (98-135ml). Se llevó a
congelar a –20?C por una hora. Posteriormente se descongeló a temperatura
63
ambiente y se centrífugo por 10 minutos a 3000 g; luego se filtró el
sobrenadante con gasa estéril y se centrífugo nuevamente a 3000 g durante
10 minutos. Finalmente se colectó el sobrenadante en un tubo de ensayo de
15 ml . Este procedimiento permite separar la parte lipídica de la yema de las
proteínas solubles (Figura No. 8).
Figura No. 8. Prueba de deslipidación con agua pH 7.
5.5.2. Metanol-cloroformo según Weesel, 1984.
Esta metodología permite separar los lípidos de las proteínas solubles
aprovechando el efecto de solvente orgánico que tiene el cloroformo, y el
metanol como solubilizador de proteínas.
Con este método se procedió de la siguiente manera: primero se separó la
yema de la clara y posteriormente se le quita la membrana que la recubre,
con una pinza; se tomaron 12-15ml de yema y se adicionaron 3 volúmenes
de metanol-cloroformo (36-45ml). Después se homogenizó la mezcla
64
fuertemente con vortex y se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Luego el sobrenadante fue colectado en un tubo
estéril. En este sobrenadante se encuentran las proteínas solubles, entre
ellas la IgY; para remover las proteínas del metanol, se colocó esta solución
a 25°C por toda la noche, de esta forma se evaporó el metanol. Las
proteínas obtenidas se resuspendieron en un volumen igual al inicial de la
yema (12-15ml) en PBS pH 7,2 (Figura No. 9) (Anexo No.10.1).
Figura No.9. Técnica de deslipidación con metanol-cloroformo.
5.5.3. Agua-cloroformo según Svendsen, 1996.
Se tomaron 12-15 ml de yema y se adicionaron 2 volúmenes de agua y 1
volumen de cloroformo (36-45 ml). Se homogenizó con vortex durante 3
minutos y se centrífugo a 3000 g, por 10 minutos a temperatura ambiente
para obtener las proteínas solubles en el agua (Figura No. 10) (Anexo
No.10.2).
65
Figura No.10. Técnica de deslipidación con agua-cloroformo.
5.6. Técnicas de precipitación de IgY.
Los sobrenadantes obtenidos por las anteriores técnicas de deslipidación
fueron sometidos a diferentes técnicas de precipitación para obtención de
IgY. Los procedimientos usados fueron los siguientes:
5.6.1. Precipitación de proteínas por salting-out.
La precipitación con sales remueve de forma no específica las proteínas
teniendo una alta efectividad. El principio por el cual esto ocurre se debe a la
hidratación de un gran número de iones de sal que requiere una considerable
parte de solvente, por tanto baja la solubilidad de las proteínas y
consecuentemente aumentan las interacciones proteína-proteína que
inducen la precipitación de éstas. La concentración de sal para la
precipitación es específica para cada tipo de proteína. Factores adicionales
66
como el pH, temperatura y concentración de proteína son importantes para la
precipitación con sales (Bollag, 1991).
La precipitación de inmunoglobulinas requiere que las sales tengan un pH
entre 7 y 8. La temperatura depende del tipo de proteína y de la sal, ya que
el punto de saturación de las sales varía y en su mayoría requieren de altas o
de bajas temperaturas para evitar la cristalización (Crosby, 1994).
- Sulfato de amonio (NH4)2SO4 según Harlow, 1988.
Para este método se tomaron 5ml de sobrenadante al cual se le agregó
1,57gr de (NH4)2SO4 para obtener una concentración final del 50% de
saturación; se colocó en agitación lenta toda la noche a 4?C. Para colectar el
precipitado fue necesario centrifugar la mezcla a 3000 g/10minutos a 4°C. El
pellet obtenido fue resuspendido en un volumen igual al inicial (5ml) con PBS
y dializado contra buffer de cloruro de sodio (NaCl 0,15M pH 7.2), por 24
horas, cambiando el buffer de diálisis periódicamente.
- Sulfato de sodio Na2SO4 según Burdon, 1987.
Se adicionó Na2SO4 lentamente a uno de los sobrenadantes obtenidos por
deslipidación hasta tener una concentración del 17% p / v en agitación lenta
a 37?C por 30 minutos. El precipitado se obtuvo por centrifugación a 3000 g/
67
10 minutos a 20?C; el pellet obtenido se resuspendió en un volumen igual al
inicial con PBS pH 7,2; luego se procedió a una segunda precipitación con
sulfato de sodio a una concentración final del 15% p / v a 37?C. El pellet se
obtuvo por centrifugación como la primera vez y éste se resuspendió en PBS
pH 7,2 al mismo volumen inicial. Para librarlo del exceso de sales se dializó
contra un buffer salino (NaCl 0,15M, pH 7,2) por 6 horas (Figura No. 11).
Figura No.11. Diálisis de las técnicas de salting-out en Buffer salino .
5.6.2. Polietilenglicol según Johnstone, 1997.
Se tomaron 5 ml de sobrenadante de proteína en agua y se le agregó 1,4 ml
de PEG al 50% para obtener un volumen final de 6,4 ml con una
concentración final del 12% (Jonstone, 1997; Polson, 1980) (p/v). Se
homogenizó por inversión/eversión y se llevo a 4°C por media hora. Se
centrifugó a 3000 g durante 20 minutos a 4?C. Finalmente se descartó el
68
sobrenadante y se resuspendió el pellet en un volumen igual al inicial con
PBS a pH 7,2 (Anexo No. 10.3).
5.6.3. Kit comercial de extracción de IgY EGGstract IgY Purification System®
de PROMEGA.
Se tomaron 5ml (equivale a 5gr de yema) de yema y se colocaron en
agitación constante con un magneto y lentamente se le agregaron 15 ml de
solución A, se dejó en agitación por 10 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente se llevó a centrifugación a 4000 g , durante 10 minutos a 4°C.
El sobrenadante obtenido se filtró a través de una gasa estéril y el filtrado fue
colectado en un vaso de precipitado de 50 ml, el cual se sometió a agitación
con una barra magnética, mientras se le adicionaba lentamente 5ml de
solución B y se dejó en agitación por 10 minutos a temperatura ambiente.
Para obtener el precipitado fue necesario centrifugar esta última mezcla a
4000 g por 10 minutos a 4°C (Figura No. 12).
Solución Solución
Deslipidante precipitadora de IgY
Figura No.12. Kit comercial de extracción de IgY de Promega.
69
El protocolo sugiere repetir los últimos 3 pasos para obtener una pureza del
95% de la inmunoglobulina IgY. El proceso de deslipidación de yema lo
realiza inicialmente la solución A, y posteriormente la solución B hace la
precipitación de la IgY (Figura No. 13).
Figura No.13. Esquema de extracción de IgY Kit PROMEGA.
5.7. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford
Las muestras obtenidas con los métodos de extracción de IgY anteriormente
descritos, fueron sometidas a cuantificación proteica para determinar la
concentración de proteína total en cada uno de éstos extractos.
70
La prueba colorimétrica de Bradford se fundamenta en la unión del azul
brillante de Coomassie G-250, a los grupos aminos de las proteínas,
formándose una coloración azul que es directamente proporcional a la
concentración de proteína; la lectura se debe hacer en un espectrofotómetro
a 595 nm y extrapolar la lectura de absorbancia de los estándares de
albúmina bovina a una curva de calibración para determinar la concentración
de las proteínas (Bradford, 1976).
Cada una de los sobrenadantes obtenidos por las diferentes técnicas de
precipitación de proteínas fue montado por triplicado para su cuantificación.
El Bradford se prepara según el siguiente protocolo: Se tomaron 25 mg de
Coomassie Blue G250 en un frasco de Schott estéril de 250 ml al cual se le
adicionaron 12,5 ml de etanol al 95%, posteriormente, se adicionaron 25 ml
de ácido fosfórico al 35% y se completó a 250 ml (volumen final) con agua
H2O dd. El colorante fue preservado a 4°C en frasco ámbar, después de ser
filtrado a través de un filtro Wattman (Figura No. 14).
Figura No.14. Lectura de cuantificación con la técnica de Bradford.
71
Para la cuantificación de la muestra se siguió este procedimiento: se
prepararon los estándares de albúmina bovina al 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg/ml de
concentración. Se hicieron diluciones de 1:5 y 1:10 de cada una de las
muestras que se trabajaron con solución salina al 0,15 M. El blanco se
realizó tomando 20 ? l de solución salina al 0,15 M y 180 ? l de Bradford para
obtener un volumen final de 200 ? l. En una placa de fondo plano de 96
pozos, se colocó cada uno de los estándares y de las muestras por duplicado
de la siguiente manera: 20 ? l de los estándares y de las muestras, más 180
? l de Bradford para tener un volumen final por pozo de 200 ? l. Finalmente se
leyó a 595 nm (Figura No. 15).
Figura No.15. Lectura de estándares y muestras con la técnica de cuantificación de Bradford.
72
5.8. Titulación por inhibición de la hemoaglutinación.
Aprovechando las características hemoaglutinantes de algunos virus
(Parvovirus canino) se puede titular la cantidad de anticuerpos contra estos
antígenos utilizando la técnica de la inhibición de la hemoaglutinación (HI) la
cual se fundamenta en la inhibición de hemoaglutinación que causa el
antígeno al unirse a un anticuerpo especifico, evitando que el indicador
(Glóbulos rojos de cerdo) se aglutine en presencia del virus (Parvovirus
canino) (Paul, 1989).
Para evitar reacciones de fondo que interfieran con la inhibición de la
hemoaglutinación (hemoaglutinaciones indeseables), se sometieron los
anticuerpos a una previa hemoadsorción. Este procedimiento se hizo
tomando 50 µl de anticuerpos y enfrentándolos a 50 µl de suspensión de
glóbulos de cerdo por 24 horas en agitación suave.
El procedimiento de esta técnica fue el siguiente: Se tomaron 50 ? l de Buffer
HI (para hemoaglutinación) en una placa en U de 96 pozos. Se dejó la
columna 1 para el control positivo y la 11 para el control negativo.
Posteriormente se adicionaron 50 ? l de anticuerpos problema en la fila A
obteniéndose una dilución de 1:2 y se hicieron diluciones adicionando 50 ? l
por duplicado desde 1:4 hasta 1: 2048, teniendo en cuenta el descarte de las
73
puntas en cada dilución. En la fila H se descartó los últimos 50 ? l. Luego se
adicionaron 50 ? l de antígeno (Parvovirus canino) en todos los pozos. Se
colocó a incubar durante 1 hora en agitación constante a 37?C.
Posteriormente se adicionaron 50 ? l de Glóbulos rojos de cerdo en toda la
placa. Se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 5 horas para
leerse finalmente. La prueba es positiva si se observa un botón rojo en el
centro indicando que hubo unión antígeno – anticuerpo. Es negativo si se
observa hemoaglutinación en el pozo indicando que hubo unión antígeno –
glóbulos rojos ya que no hay presencia de anticuerpos.
5.9. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% según Laemmli.
La electroforesis se fundamenta en el siguiente principio: “Bajo la influencia
de un campo eléctrico, moléculas y partículas cargadas migran en dirección a
un polo opuestamente cargado”. Durante este proceso, las sustancias están
en una solución acuosa, debido a que las cargas y las masas de diferentes
partículas en una mezcla varían de carga y por lo tanto migraran a diferentes
velocidades y por ende, podrán ser separadas unas de la otras en fracciones
simples (Laemmli, 1970).
El Gel separador se preparó de la siguiente manera: Se preparó un volumen
final de 5ml, teniendo en cuenta una concentración del 6%. Se tomó en un
74
vaso de precipitado 0,728ml de acrilamida al 40%. Luego se adicionó
0,407ml de Bis-acrilamida al 2%. Se adicionó 0,728ml de Buffer separador al
4x y finalmente se agregó 0,291ml de Glicerol al 87%. Se completó con H2O
dd a 5ml. Se agregaron 30 ? l de persulfato de amonio al 10% y 10 ? l de
TEMED. Se sirvió con una jeringa estéril el gel hasta ¼ de la placa y se dejó
solidificar durante 10 minutos.
El Gel Concentrador al 3,6% se hizo de la siguiente manera: Se preparó un
volumen final de 5ml. En un vaso de precipitado de 50 ml se adicionó 0,45 ml
de acrilamida al 40%. Se adicionó 0,22 ml de Bis-acrilamida al 2%. Luego se
agregó 0,625 ml de Buffer Stack 8x y se completó a 5ml con H2O dd.
Finalmente se adicionaron 30 ? l de persulfato de amonio al 10% y 10 ? l de
TEMED. Se sirvió el gel con una jeringa estéril hasta el tope de la placa y se
dejó solidificar por 10 minutos.
Para la preparación de las muestras se siguió el siguiente procedimiento: Se
sembraron 15 µl (70 µg de proteína) de anticuerpos problema en buffer de
carga (1X) no denaturante y se corrió en SDS - PAGE por 1 hora a 100 V,
50 mA y 15 W (Figura No. 16). En el mismo gel se sembraron las mismas
muestras denaturadas con Beta-mercaptoetanol y calentándolas por 3
minutos a 95°C. Se uso como patrón el peso molecular para proteínas de
SIGMA de 36 a 207 kD.
75
Figura No.16. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%.
Posteriormente el gel fue coloreado con azul de Coomasie R-250 el cual se
preparó de la siguiente manera: se tomó azul brillante G250 al 0.25%. Se
adicionó ácido acético glacial al 10%. Luego se agregó metanol al 30% y se
completó con H2O dd a 250 ml. Se adicionaron 10 ml de colorante al gel y se
dejó en agitación constante durante 3 minutos. Se descartó el colorante y se
adicionaron 10 ml de decolorante (ácido acético glacial al 10%, metanol al
30% y se completa con H2O dd a 250 ml) para dejarlo finalmente en agitación
constante 8 horas a temperatura ambiente. Se observaron las bandas de
acuerdo al marcador de peso molecular empleado.
5.10. Técnicas de difusión simple en dos dimensiones en tubo.
Es una técnica cualitativa que se fundamenta en el principio de reacción
antígeno-anticuerpo. Esta técnica se realiza en un tubo de 13 x 10 mm en
donde se colocó una dilución (1:2) de anticuerpo en agarosa al 0,5% en PBS
pH 7,2; el anticuerpo se debe fundir a 50°C; una vez gelificado, sobre este se
agregó un volumen igual al primero de agarosa al 0,5%; una vez gelificado
sobre esta capa se agregó una dilución (1:2) de antígeno en agarosa al 0,5%
76
en PBS y se llevó a incubar a 37°C por 12 horas, al cabo de las cuales la
reacción se leyó por la formación de un anillo de precipitación en la fase
intermedia; si el anillo está cercano a la dilución del antígeno se dice que hay
más anticuerpos que antígeno, si el anillo se ubica en el centro de la capa
intermedia, se dice que la cantidad de anticuerpos y antígeno está en
equilibrio, y si el anillo se forma cercano a la capa de dilución de anticuerpos
se dice que hay más antígeno que anticuerpos. (Figura No.17) (Paul, 1989).
Figura No.17. Técnica de difusión simple en dos dimensiones.
77
6. RESULTADOS.
6.1. Método de inmunización.
El método de inmunización resultó satisfactorio y práctico de utilizar. Se
logró inmunizar las aves con muy poco traumatismo; en cuanto a las vías
(intramuscular y subcutánea) utilizadas para el inóculo, resultaron ser viables
y no mostraron diferencia significativa entre una y otra.
Las aves, aparte del estrés de manipulación del momento, no mostraron
ningún otro inconveniente, hecho que se vio reflejado en la postura y en el
mantenimiento del peso corporal. El inóculo resultó ser totalmente inocuo
para las aves (Figura No. 18).
Figura No.18. Inoculación subcutánea de una gallina raza Loman con el inóculo que se
emplea en este estudio.
78
Las dosis usadas y la concentración de proteína en el inóculo (antígeno)
resultaron ser suficientes para desencadenar una respuesta inmune en las
aves, lo que permitió obtener anticuerpos contra el Parvovirus canino en un
tiempo relativamente corto comparado con otros esquemas de inoculación.
6.2. Técnicas de deslipidación.
De las siguientes técnicas, agua, metanol-cloroformo y agua-cloroformo, se
encontró que las técnicas más prácticas y rápidas de deslipidación en éste
trabajo resultaron ser las que tenían dentro de sus componentes el
cloroformo, como fueron, el metanol-cloroformo (1:1) y agua-cloroformo (4:1),
pues ellas lograron deslipidar totalmente la muestra ya que el sobrenadante
obtenido era transparente.
La técnica de agua pH 7, no siempre resultó ser efectiva para deslipidar la
muestra, porque se logró la deslipidación de las muestras en un 40%,
mostrándose lechosos los sobrenadantes.
6.3. Técnicas de extracción de IgY (por precipitación).
Todas la técnicas de extracción, sulfato de sodio (17% y 15% p/v), sulfato de
amonio (50% de saturación) y polietilenglicol (12% p/v), fueron efectivas para
la precipitación de las proteínas solubles de la yema de huevo.
79
La diferencia entre una y otra radica principalmente en el procedimiento
empleado. Las técnicas de salting-out (Na2SO4 y (NH4)2SO4) fueron más
dispendiosas con respecto a la de polietilenglicol y obviamente con respecto
a la prueba comercial de PROMEGA. Lo dispendioso de éstas dos técnicas
son los tiempos de precipitación que pueden emplear, desde 2 horas hasta
24 horas (Sulfato de sodio y sulfato de amonio respectivamente) y además,
la indispensable necesidad del uso de la diálisis para la purificación de las
proteína solubles de la yema (liberación de excesos de sal), que puede llevar
entre 6 a 24 horas más, convirtiéndose en 24 a 48 horas para la purificación
total de la proteína; además la exigencia misma de los buffers empleados en
estos procedimientos, como son el pH y las concentraciones de Molaridad o
mili-Molaridad demandadas, las hacían aún más exigentes; por otro lado, una
diferencia entre las dos técnicas, es que la de sulfato de sodio precisa de
temperaturas altas, entre 37°C y 50°C, para obtener una buena precipitación,
mientras que el sulfato de amonio para el mismo efecto requiere de una
temperatura de 4°C en constante agitación.
Se encontró en este trabajo que usando la técnica de polietilenglicol se
redujeron sustancialmente los tiempos de procedimiento, empleándose
máximo 1 hora y 15 minutos, para la obtención de una proteína relativamente
pura. Por tanto, para este trabajo, ésta fue la técnica empleada una vez
80
ajustados los procedimientos en el laboratorio, para la obtención de
proteínas. Esta técnica se consideró muy cercana en eficiencia y
procedimiento al método comercial de PROMEGA, con el inconveniente que
es más dispendioso eliminar el polietilenglicol excedente, que eliminar las
sales de los anteriores procedimientos, ya que la diálisis no elimina el exceso
de polietilenglicol. Sin embargo, éste no resulta ser una interferencia para el
objetivo de este trabajo.
En cuanto a la prueba comercial de PROMEGA se puede decir que es la
prueba de oro, pues tiene un promedio de aplicación de 40 a 45 minutos y
las condiciones ambientales no son exigentes salvo la temperatura de
centrifugación que exige el protocolo (4°C). El kit de PROMEGA provee de
dos soluciones que ya están preparadas y sólo es seguir unos pocos pasos
que son sencillos haciendo la prueba rápida. El único inconveniente que esta
técnica presenta es su alto costo.
6.4. Cuantificación de proteínas y titulación de anticuerpos.
La técnica de cuantificación por el método de Bradford resulto muy útil, ya
que se ajusta a las necesidades de este trabajo, siendo a su vez rápida y
muy clara para su lectura con espectrofotometría.
81
Los datos de cuantificación para cada uno de los métodos mencionados
anteriormente se obtuvieron hallando la media de las concentraciones de
proteína de los triplicados después de la lectura en el espectrofotómetro.
Gracias a las características hemoaglutinantes del virus, resultó práctico el
uso de la técnica de inhibición de la hemoaglutinación para titular los
anticuerpos obtenidos en yema de huevo contra Parvovirus canino.
Figura No.19. Titulación por inhibición de la hemoaglutinación de anticuerpos contra
Parvovirus canino.
En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos de concentración
de proteínas solubles de yema y el título de anticuerpos contra Parvovirus
canino, para cada una de las técnicas empleadas (Figura No.19).
82
Tabla No.3. Resultados de las técnicas de precipitación y titulación de anticuerpos.
TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN DE
PROTEÍNAS TOTALES
CONCENTRACIÓN TOTAL DE PROTEÍNA
(mg/ 5 ml)
TÍTULO DE ANTICUERPOS
Kit PROMEGA
3,73 1:2048
Metanol – Cloroformo
21,70 1:256
Na2SO4
17 1:32
(NH4)2SO4
12,7 1:16
PEG 6000
14,25 1:1024
En la tabla se puede observar la eficiencia para la obtención de proteína de
cada uno de los métodos.
Se observa claramente la diferencia entre una técnica y otra en cuanto a la
pureza de la IgY, ya que el título no es congruente con la concentración de
proteínas (mg/ml) obtenidas para cada uno de estos procedimientos.
Los métodos de salting-out son eficientes para la obtención de proteínas,
pero de alguna manera están interfiriendo con la extracción de IgY ya sea
porque se denatura o se pierde durante el proceso de extracción mismo esta
inmunoglobulina; a pesar de que existe un título, este es muy bajo,
comparado con los otros métodos.
83
Es fácil de evidenciar, que ninguno de los métodos, a excepción obviamente
del comercial, son capaces por si sólos de obtener una IgY purificada, libre
de otras proteínas, puesto que su grado de precipitación de IgY no es del
100% , como lo muestra la tabla No.2.
Pese a que los títulos de las técnicas de metanol-cloroformo y de
polietilenglicol son relativamente altos, no igualan a los obtenidos por el kit
comercial (1:2048 vs. 1:256 y 1:1024).
Se obtuvieron anticuerpos contra Parvovirus canino con todas las técnicas
empleadas, unos en más cantidad que otros, dependiendo de la técnica de
extracción utilizada. Esto corrobora aun más la eficiencia del esquema de
inmunización.
6.5. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%.
La electroforesis (Figura No. 20) corrobora la presencia de proteínas
deseables además de la IgY, con todos los procedimientos, inclusive con el
de PROMEGA manejado con un porcentaje de pureza del 75%.
84
Figura No.20. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% de IgY contra Parvovirus
canino.
6.6. Técnica de difusión simple en dos dimensiones en tubo.
En ésta prueba se evidencia la presencia, de forma preliminar, de
anticuerpos IgY dirigidos contra Parvovirus canino.
Figura No.21. Técnica de difusión simple en dos dimensiones en tubo.
85
7. DISCUSIÓN.
7.1. Esquema de inmunización.
El uso de aves para la obtención de anticuerpos contra un patógeno
específico ha sido una modalidad de investigación muy efectiva para poder
crear diferentes métodos diagnósticos. La obtención de IgY de gallina es un
modelo inmunológico que está muy relacionado con las reacciones antígeno-
anticuerpo, y se recolectan fácilmente a partir de la yema sin ser necesaria
una metodología de obtención de suero (Svendsen, 1996; Camenisch, 1999).
La mayoría de estudios para obtención de anticuerpos contra un antígeno
determinado, se llevan a cabo en animales como conejos, ratones, cobayos,
entre otros, donde la obtención de anticuerpos puede ser un poco traumática
ya que los métodos de inoculación y sangrado son complejos y pueden
acarrear generalmente la muerte del animal, sin contar, que son esquemas
de inoculación largos (entre 2 a 5 meses) y con numerosas inoculaciones
(Vainio, 1995; Larson, 1988). El esquema de inmunización que se empleó en
este trabajo con aves es de tan solo 70 días máximo, con 4 inoculaciones, y
resultados de obtención de anticuerpos contra Parvovirus canino a la
segunda semana post-inoculación (Shade, 1996).
86
Diferentes métodos de inmunización en gallinas son reportados en la
literatura, intramuscular (Akita & Nakai, 1993), intrabursal, subcutáneo
(Svendsen, 1995) y oral, en donde se pueden llegar a presentar
inflamaciones y granulomas en las áreas de inoculación (Svendsen, 1996).
En éste estudio no se observó ningún trauma durante el proceso de
inoculación, teniendo en cuenta que se generó un estado febril de corta
duración por el adyuvante de Freund, el cual fue bien dosificado de acuerdo
a la talla del animal (0,4 ml de adyuvante de Freund); esto es un punto a
favor, ya que los granulomas y los procesos inflamatorios son clara evidencia
de traumatismos por efecto de adyuvante o de algunos inoculados de tipo
proteico de alto peso molecular (bacteriano o fúngico), que resultan ser más
traumáticos para las aves; esto mismo fue reportado por Gassman en 1990,
quien plantea que, la inoculación con adyuvante incompleto de Freund en
aves es bien tolerado por éstas y no se producen inflamaciones locales o
alguna otra reacción.
7.2. Técnicas de extracción de IgY a partir de yema de huevo.
Figura No.22. Técnicas de precipitación y extracción de IgY contra Parvovirus canino.
87
En la literatura se encuentran varios métodos de purificación de anticuerpos
tipo IgY teniendo en cuenta que todos deben seguir cuatro pasos
fundamentales: remoción total de la albúmina, extracción de la membrana de
la yema, extracción de las lipoproteínas y lípidos de la yema y aislamiento de
la IgY (Alarcón et al., 2000). En éste estudio también se siguieron estos
pasos y no se presentó ninguna variación.
7.2.1. Métodos de deslipidación.
Agua. Teniendo en cuenta el protocolo de extracción de lípidos de Burdon en
1987, el agua tamponada (con buffer fosfato a pH 7) permite disolver las
grasas antes de emplear cualquier método de precipitación de proteínas.
Este procedimiento requiere de congelación, descongelación y centrifugación
en un rango entre 6000 a 10000 rpm, lo que permite obtener un clarificado
libre de grasas sólo en un 40% (Akita & Nakai, 1993; Yokoyama, 1992;
Jensenius, 1981).
Se encontró en éste trabajo, un hecho similar al reportado por Jensenius y
colaboradores (1981), observando que no había un clarificado puro, si no una
suspensión lechosa por las grasas, lo que implicó el uso de otros
procedimientos como filtraciones, y en el peor de los casos, más veces de
88
congelación y centrifugación para obtener un clarificado libre de grasas. Por
todo ésto, el método resultó dispendioso para deslipidar la yema de huevo.
Existen dos modalidades en el uso de la metodología de deslipidación con
agua, la modalidad de congelación y el uso de agua en combinación con
Dextran-sulfato (Bauwens, 1987; Jensenius, 1981). Sin embargo, en este
caso no se usó el Dextran-sulfato por ser un reactivo costoso.
Metanol – cloroformo, es una metodología rápida y efectiva que separa los
lípidos de las proteínas; con estos dos compuestos se observa un
clarificado con el cuál se trabaja fácilmente teniendo en cuenta que la
evaporación permite que el pellet de proteínas quede totalmente libre de
metanol (Yokoyama, 1992; Wessel, 1984).
Durante el procedimiento, la aplicación de ésta técnica resultó sencilla, muy
efectiva en cuanto a la deslipidación misma se refiere, logrando unos
clarificados libres de grasas hasta en un 100%, pero el método por si sólo
tiene la desventaja que precipita todas las proteínas solubles de la yema
haciéndola poco específica para extracción de IgY como se observó en la
cuantificación de proteína total en mg/ml.
89
Cloroformo. Se usó finalmente este reactivo para deslipidar la yema, ya que
permite su combinación con agua, o con buffers salinos como TBS o PBS, en
los cuales se obtuvo una proteína soluble más fácil de precipitar. Esta técnica
tiene la ventaja que no requiere ambientes exigentes, y que con un volumen
relativamente bajo de cloroformo con respecto al volumen total de la yema
(1:1) se puede obtener un 100% de deslipidación sin causarle daño a las
proteínas de interés.
No es usual ver esta metodología en conjunto , aunque en la mayoría de los
artículos en los cuales se ha trabajado la extracción de IgY, combinan los
pasos iniciales de la extracción de lípidos con agua destilada des-ionizada a
pH 7 para ser luego tratado el sobrenadante con sales, polietilenglicol,
cloroformo, metanol-cloroformo y Dextran sulfato (Svendsen, 1996;
Ntakarutimana, 1992).
El cloroformo puede llegar a reemplazar a un componente muy empleado en
la extracción de IgY, el cual es el Dextran sulfato ya que su porcentaje de
pureza es muy similar (70-90%) (Ntakarutimana, 1992).
90
7.2.2. Precipitación de proteína IgY.
Se puede decir que no existe diferencia significativa entre los dos métodos
de salting-out empleados para la precipitación de proteínas; ambos métodos
resultaron ser eficientes para precipitar proteínas solubles con relativa
pureza; sin embargo, los dos métodos son dispendiosos en su aplicación,
haciendo que el proceso tarde hasta 48 horas para su obtención.
Ciertamente hay que abonarles que resultan ser los más económicos.
El sulfato de amonio se emplea generalmente entre un 30 y un 36% de
concentración (Akita & Nakai, 1993). Se considera que éstas sales funcionan
efectivamente cuando se llega al tope máximo de saturación el cuál es del
50% para el sulfato de amonio ( Crosby, 1994). Autores como Crosby,
recomiendan usar PEG 6000 con sulfato de amonio ya que reporta una
pureza cercana al 100% de IgY (Akita & Nakai, 1993; Yokoyama, 1992;
Jensenius, 1981).
El sulfato de sodio presenta pocas ventajas ya que su uso implica trabajar a
temperaturas de 20 a 50?C, y a pesar de esto, las altas concentraciones en
las cuales se debe usar, hacen que se cristalice muy rápido; así mismo, no
se obtuvo un alto rendimiento en la extracción de IgY, como se observó en la
titulación (1:32). Crosby y colaboradores, 1994, emplearon varias técnicas
91
para precipitar IgY y argumentan que el uso de sulfato de sodio presenta un
rendimiento muy bajo debido en parte a los grandes volúmenes de solución
que emplearon, lo que disminuye la concentración de proteínas y dificulta la
recuperación posterior por técnicas de precipitación; también tienen en
cuenta su rápida cristalización y así mismo su trabajo a una temperatura
mayor a los 20?C, por lo tanto todo esto lleva a que se pierda un 50% de la
proteína con respecto a otros métodos como PEG 6000 / (NH4)2SO4 (Crosby,
1994). Eso mismo se evidenció en éste estudio.
Es importante tener en cuenta que el uso de sales siempre requiere de
diálisis en PBS para poder remover completamente el sulfato de sodio y el
sulfato de amonio y así estos no intervengan en la lectura de la
concentración de IgY (Crosby, 1994; Burdon, 1987).
Tanto el sulfato de sodio como el sulfato de amonio presentan
concentraciones de proteína total muy similares, entre unos 12 y 14 mg/ml,
demostrando que ambas son favorables para la extracción de proteínas
totales más no de IgY pura.
Polietilenglicol (PEG 6000). Este es el método más empleado para la
extracción de IgY (Hassl, 1987; Jensenius, 1981). Esta técnica permite
obtener la inmunoglobulina con una alta concentración y una pureza de casi
92
el 90% ya que se usan fácilmente los anticuerpos para pruebas tales como
análisis de inmunoblot directo entre otros (Gassman, 1990; Atha, 1981).
Se recomienda usar concentraciones bajas como 3% de PEG 6000 y luego
aumentar a una concentración entre el 12 y el 14% respectivamente, para
poder tener un buen porcentaje de purificación de la IgY (Crosby, 1994;
Zola, 1990).
Se corroboró en este trabajo, los resultados obtenidos por los autores
anteriores (Crosby, Zola, Gassman y Polson). Resultó de más utilidad esta
técnica, pues con ella se pudo obtener una IgY más pura con respecto de
los otros métodos usados, y por ende un mejor título. Fue la más rápida y
menos dispendiosa de usar, dado que requiere únicamente centrifugaciones
a 4°C como única exigencia.
Kit PROMEGA. En la literatura ya se encuentran varios reportes del uso de
kits de extracción de IgY que tienen una alta efectividad y pureza de casi el
100%. La casa PROMEGA nos facilita una sencilla técnica en la cual con el
uso de solo 2 soluciones, A y B, y en un intervalo de 1 hora máximo, a
temperatura ambiente, se obtiene IgY pura en un 95%. No obstante, la
limitante del kit está en su elevado costo.
93
Una concentración de 3,73 mg/ml se obtuvo en éste estudio, con una pureza
de IgY cercana al 95% (Figura No.21).
Se ha observado con el paso de los años, que el estudio de la inmunología
aviar ha aportado grandes descubrimientos para la ciencia, pero la obtención
de anticuerpos a partir de yema tiene procesos más largos que en muestras
de suero ya que la separación de lípidos no es una metodología fácil.
La obtención de anticuerpos es más alta en aves que en otros animales
según las técnicas que se han empleado hasta ahora, ya que una ave pone
un huevo diario con una concentración de IgY más alta que la obtenida por
sangrado total de animales como conejos, ratones, etc. (Svendsen, 1996;
Bauwens, 1987). La IgY de las aves es más resistente a la temperatura, pH y
fuerza iónica del ambiente que la IgG de los mamíferos, además, esta
inmunoglobulina aviar no presenta reacciones cruzadas con la parte Fc-
receptora o RBCs de los anticuerpos de los mamíferos. Se ha comprobado
por varios métodos que la yema del huevo contiene entre 8-20 mg de IgY por
ml (Akita, 1993).
7.2.3. Cuantificación y titilación de IgY.
Las técnicas para precipitar proteínas fueron eficientes como se muestra en
las concentraciones obtenidas, pero en relación a la pureza de IgY no fueron
94
altamente eficientes puesto que con la IgY, además, se precipitaban otras
proteínas.
El título de IgY más alto que se observo fue en el kit comercial y el de
polietilenglicol con respecto a los otras técnicas empleadas.
95
8. CONCLUSIONES.
El esquema de inmunización es adecuado, para desencadenar una
respuesta inmune rápida, contra Parvovirus canino.
La deslipidación de la yema de huevo en este estudio resultó ser más
eficiente usando cloroformo como reactivo deslipidante, lográndose
extracción de grasas entre el 95 y el 100%, observado en el clarificado
del sobrenadante.
La concentración más alta de proteína soluble de yema se obtuvo por la
técnica de metanol-cloroformo, volumen 3:1 con respecto a la yema,
debido a que ésta no utiliza ningún otro mecanismo de separación entre
las diferentes proteínas solubles y la IgY contra Parvovirus canino, ya
que solo la purifica entre un 1-10%.
Se obtuvo IgY contra Parvovirus canino con un relativo grado de pureza
usando la técnica de polietilenglicol (6000) al 12% p/v.
El título de anticuerpo contra Parvovirus canino, más alto obtenido por
técnicas de tipo no comercial (salting-out y polietilenglicol) fue de
1:1024 y dado por el método de precipitación con polietilenglicol (6000)
al 12%.
No existe correlación entre la cuantificación de la concentración de
proteína soluble obtenida y el título de anticuerpo obtenido, dado que la
cuantificación por Bradford mide la concentración total de proteína en
96
donde se encuentra la IgY, por lo tanto, no se puede decir que el titulo
de anticuerpos obtenidos es el total de la lectura anterior, ya que
depende del grado de precipitación de IgY de cada técnica empleada
en este estudio.
La técnica de inhibición de la hemoaglutinación utilizada, resulta
adecuada en este trabajo, para la titulación de anticuerpos contra
Parvovirus canino aprovechando la característica hemoaglutinante de
este virus.
La obtención de anticuerpos contra Parvovirus canino usando la
metodología empleada en el trabajo, resulta más asequible por costos,
comparada con otras metodologías, ya que la concentración de
anticuerpos por mililitro de yema es superior a la concentración de
anticuerpos por mililitro de suero en otras especies. Esto beneficia la
obtención en masa de estas inmunoglobulinas para fines diagnósticos
contra este virus.
97
9. RECOMENDACIONES
Se recomienda almacenar los huevos a 4?C hasta el momento de su
uso. Empleando este tipo de almacenamiento, los huevos pueden
conservarse hasta un año.
Se recomienda la vía de inoculación subcutánea ya que esta es
menos riesgosa de ocasionar granulomas o procesos inflamatorios.
Se requiere utilizar la técnica de ELISA para una mejor titulación de
los anticuerpos obtenidos.
Se deben caracterizar los anticuerpos obtenidos en este trabajo por
métodos inmunoquímicos para su posterior aplicación diagnóstica.
98
10. ANEXOS.
10.1. Técnica de deslipidación con metanol-cloroformo según Weesel.
1. Se toma una yema de huevo (12-15ml) y se le adicionan 3 volúmenes
de metanol-cloroformo (v/v). Se centrifuga a 3000 rpm (6000 g)
durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2. Se separa el sobrenadante en un tubo estéril.
3. Se centrifuga de nuevo a 6000 rpm (3000 g) por 10 minutos a
temperatura ambiente.
4. El sobrenadante se coloca en un tubo estéril.
5. Este sobrenadante se somete a alguna técnica de precipitación de
proteínas.
10.2. Técnica de deslipidación con agua-cloroformo.
1. A una yema se le adicionan 2 volúmenes de agua tamponada,
destilada, desionizada y estéril y 1 volumen de cloroformo.
2. Se centrifuga a 3000 rpm, por 10 minutos a temperatura ambiente.
3. El sobrenadante se filtra con una gasa estéril.
4. Este sobrenadante se somete a alguna de técnica de precipitación de
proteínas.
99
10.3. Precipitación de proteínas con polietilenglicol según Johnstone,
1997.
1. Se diluye la yema (12-15 ml) con 4 volúmenes de PEG 6000 al 4.4%
en TBS; se incuba por 20 minutos a 4?C.
2. Se centrifuga a 6000 rpm por 20 minutos a 4?C.
3. Se colecta el sobrenadante y se le adiciona PEG en una
concentración final del 12% (p/v).
4. Se incuba por 20 minutos a 4?C.
5. Se centrifuga a 6000 rpm durante 20 minutos a 4?C.
6. Se descarta el sobrenadante y se resuspende el pellet en un volumen
similar al de la yema en TBS.
100
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