Obtención de suero Mono-específicoAnti-IgG preparado con antígenospurificados por electroenfoque

INTRODUCCIONEl siguiente trabajo tiene por ob-

jeto presentar y discutir la técnica deobtención de sueros mono-específi-cos Anti-Inmunoglobulina G prepa-rados con antígenos purificados porElectroenfoque.

MATERIALES Y METODOS

Antígenos:La Inmunoglobulina G. uti1izada

como antígeno fue obtenida y puri-ficada a partir de una mezcla desueros de personas supuestamentesanas.

Animales de Experimentación:Para la producción de los sueros

mono específicos se utilizaron cone-jos adultos.

Portadores de AnJolitosPara la separación y purificación

del antígeno (IgG) se utilizó un an-folito de un espectro de pH 7-10 co-mercialmente obtenido.

Sueros Hiperinmunes:El ontisuero humano total fue ob-

tenido en cabra, según la técnicadescrita por Proom '.

• jefe Sub-Grupo Microbiología e Inmunolog!aINPES; Profesor Asociado, Inmunología Fac.Med. U. Na!'

•• jefe Grupo Bioquímica INPES; Profesor Aso-ciado Bioquímica, Fac. Med. U. Na!'

Doclores: MIGUEL A. GUZMAN'ERNESTO BARBOSA"

Suero Normal:

El suero humano norma1 utilizadopara obtener la IgG fue una mezclade muestras de sueros de 50 volun-tarios supuestamente sanos.

Estudio InmunoeIectroforético:

Los estudios inmunoelectroforéti-ces realizados fueron hechos en unsistema LKB de acuerdo a la téc-nica de Grabar y Williams '.

Columna Electrofocal:

Para los estudios de electroenfo-que se utilizó una columna Electro-focal LKB 8101 de 11O ml, de capa-cidad y una fuente de poder Beck-mano

La obtención de suero normal sehizo mediante la toma de 10 mi desangre de cada uno de 50 volunta-rios, después de la retracción delcoágulo los sueros fueron colectados,centrifugados y mezclados; de dichamezcla se retiró una cantidad iguala 3 ml, para ser usada en el estu-dio Electrofocal, el resto de suerofue guardado en el congelador a-209 C. para ser usado posterior-mente.

La columna fue montada, de acuer-do a las especificaciones dadas porHaglund 3. El gradiente de pH jun-to con la proteína fue obtenido me-diante un dispositivo mecánico, un

REV. FAC. MED. U. N. COLOMBIA. VOL. 38, No 2. ABRIL-JUNIO 1972

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total de 3 ml, de la mezcla de suerosfue puesto en columna, los electro-dos fueron dispuestos en forma talque el cátodo quedase en el electro-do central con el obj eto de que enla parte .f.inal de la columna que-dasen los puntos Isoeléctricos entre7 y 10 y así poder obtener las frac-ciones de Inmunoglobulina G evi-tando su contaminación al descargarla columna. Una vez montada lacolumna se sometió a una corrientecontinua de 500 voltios por 72 horas,tiempo considerado como óptimo pa-ra obtener un buen electroenfoque;al término de este tiempo, la colum-na fue desocupada en fracciones de1 ml. mediante un colector automá-tico de fracciones.

El pH de todas las fracciones ob-tenidas fue determinado en un po-tenciómetro Beckman de investiga-ción con microeledrodcs usando unacámara termomática a 18? C. Lasfracciones con pH entre 7.62 - 8.92(25 fracciones) fueron separadas pa-ra analizarse .inmunoeledroforética-mente con el objeto de determinar sicontenían Inmunoglobulina G. Unavez realizados estos estudios, lasfracciones fueron mezcladas y usa-das para la obtención de antisueroen conejos adultos, un total de <1

conejos fue inoculado 1.M. 2 vecespor s smono con 0.5 rnl. de la mezclaen adyuvante incompleto de Freunddurante 4 semanas, al término delas cuales Se tomó una muestra desangre en la vena de la orej a paraobtener suero y determinar anmuno-electroforéticamente si contenían ni-veles adecuados de anti-inmunoglo-bulinos G. Posteriormente los cone-jos fueron sangrados a muerte, elsuero obtenido asépticamente fueadicionado de Merthiolate 011:10.000y guardado en congelador a -20? C.para ser usado posteriormente.

RESULTADOS

Como puede verse en la tabla N?el pH de las fracciones Nros. 12

a 36 están comprendidas entre 7.62-8.92 rango que cubre el punto iso-eléctrico de la Inmunoglobulina G.,la figura N° 1 muestra claramenteel gradiente de pH obtenido. Cornopuede verse, en la figura N° 2 el es-tudio inmuno - electroforético de lamezcla de estas fracciones frente aun suero antihumano y comparadocon un control de suero humano to-tal muestra una banda nítida de In-munoqlobu'ino G pura. Los suerosde los conejos estimulados usandocomo antígeno dicha mezcla de frac-

CUADRO N~1VALORES DE pH DE LAS FRACCIONES 12-36 QUE CONTIENEN IgG

Gradiente de pH de fracciones -positivas para inmumoqobulincr G.-------

Fracci6n N9 pH Fracci6n N9 pH Fracci6n N9 pH

12 7.62 21 8.17 30 8.6913 7.65 22 8.19 31 8.7114 7.70 23 8.20 32 8.7415 7.92 24 8.29 33 8.8716 7.99 25 8.42 34 8.8917 8.06 26 8.42 35 8.9018 8.14 27 8.54 36 8.9219 8.16 28 8.5720 8.17 29 8.57

OBTENCION DEL SUERO MONO-ESPECIFICO ANTI-IgG 145

ciones dieron una respuesta de an-ticuerpo altamente específico, comopuede verse en la figura N9 3 enque un suero humano normal fue es-tudiado inmunoelectroforéticamenteusando como antisuero, suero obte-nido en la forma anteriormente des-crita, puede verse por comparacióncon ontisuero humano total que elsuero anti-Inmunoglobulina G es cla-ramente monoespecífico toda vezque solo se ve una banda de pre-cipitación correspondiente a la zo-na de la Inmunoglobulina G.

GRAFleA DEL GRADIENTE DE pH

FiguraGráfica que muestra el gradiente de pH.

Figura 2Inmunoelectroforesis de la mezcla de frac-ciones positivas para IgG frente a suero anti-humano total. Nótese que la banda de pre-

cipitación de la mezcla es IgG pura.

Figura 3La parte inferior muestra una inmunoelec-troforesis de suero humano total con el anti-suero obtenido, nótese que es claramentemonoespecifico para IgG, identificada porcomparación en la inmunoelectroforesis su-

perior con suero antihumano total.

DISCUSION

El múltiple uso de ros sueros mo-noespeciíicos an ti-Inmunoglobulinashumanas, tiene actualmente granimportancia para la determinaciónde estas Inmunoglobulinas tanto enclínica humana "', como en es-tudios inmunológicos básicos 7 •• ,.,

por tanto se hace indispensableque se cuente con procedimien-tos de obtención de dichos anti-sue-ros en forma sencilla. El trabajo aquípresentado demuestra la ventaja delsistema electrofocal en la obtenciónde antígenos para preparación de

sueros homólogos específicos en for-ma ciertamente más sencilla que losprocedimientos usuales 11 ". En unprevio estudio" se demostró queel anfolito no interfería para na-da la reacción antígeno-anticuerpo,en el presente trabajo se demuestraademás que este no afecta en nadala respuesta inmunitaria del hués-ped no siendo por lo tanto necesa-rio remover dicho anfolito por diá-lisis, crítica que algunos 14 15 hacenal uso de los anfolitos.

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RESUMEN

REVISTA DE LA FACULTAD DE MEDICINA

La obtención y purificación de In-munoglobulina G humana por el pro-cedimiento de electro-enfoque; y suuso como antígerro en la produc-

SUMMARY

Obtention and purification of IgGby electrofocusing column and itsuse as an antigen to elicite homolo-

cien de suero específico homólogose presenta en este trabajo, kr ven-taja de este procedimiento frente alos usuales se discute.

gous antibodies in rabbits are pre-sented in this paper. The advantagesof this procedure are discussed,

AGRADECIMIENTOS

Queremos expresar nuestro agra-decimiento a la señorita Elizabeth

Castañeda por su valiosa coopera-ción.

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